La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Elle est la cause principale de mortalité liée au cancer chez les enfants due à un groupe de patient ne répondant pas au traitement. Les patients peuvent aussi souffrir de plusieurs toxicités associées à un traitement intensif de chimiothérapie. Les études en pharmacogénétique de notre groupe ont montré une corrélation tant individuelle que combinée entre les variants génétiques particuliers d’enzymes dépendantes du folate, particulièrement la dihydrofolate réductase (DHFR) ainsi que la thymidylate synthase (TS), principales cibles du méthotrexate (MTX) et le risque élevé de rechute chez les patients atteints de la LAL. En outre, des variations dans le gène ATF5 impliqué dans la régulation de l’asparagine synthetase (ASNS) sont associées à un risque plus élevé de rechute ou à une toxicité ASNase dépendante chez les patients ayant reçu de l’asparaginase d’E.coli (ASNase). Le but principal de mon projet de thèse est de comprendre davantage d’un point de vue fonctionnel, le rôle de variations génétiques dans la réponse thérapeutique chez les patients atteints de la LAL, en se concentrant sur deux composants majeurs du traitement de la LAL soit le MTX ainsi que l’ASNase. Mon objectif spécifique était d’analyser une association trouvée dans des paramètres cliniques par le biais d’essais de prolifération cellulaire de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs, n=93) et d’un modèle murin de xénogreffe de la LAL. Une variation génétique dans le polymorphisme TS (homozygosité de l’allèle de la répétition triple 3R) ainsi que l’haplotype *1b de DHFR (défini par une combinaison particulière d’allèle dérivé de six sites polymorphiques dans le promoteur majeur et mineur de DHFR) et de leurs effets sur la sensibilité au MTX ont été évalués par le biais d’essais de prolifération cellulaire. Des essais in vitro similaires sur la réponse à l’ASNase de E. Coli ont permis d’évaluer l’effet de la variation T1562C de la région 5’UTR de ATF5 ainsi que des haplotypes particuliers du gène ASNS (définis par deux variations génétiques et arbitrairement appelés haplotype *1). Le modèle murin de xénogreffe ont été utilisé pour évaluer l’effet du génotype 3R3R du gène TS. L’analyse de polymorphismes additionnels dans le gène ASNS a révélé une diversification de l’haplotype *1 en 5 sous-types définis par deux polymorphismes (rs10486009 et rs6971012,) et corrélé avec la sensibilité in vitro à l’ASNase et l’un d’eux (rs10486009) semble particulièrement important dans la réduction de la sensibilité in vitro à l’ASNase, pouvant expliquer une sensibilité réduite de l’haplotype *1 dans des paramètres cliniques. Aucune association entre ATF5 T1562C et des essais de prolifération cellulaire en réponse à ASNase de E.Coli n’a été détectée. Nous n’avons pas détecté une association liée au génotype lors d’analyse in vitro de sensibilité au MTX. Par contre, des résultats in vivo issus de modèle murin de xénogreffe ont montré une relation entre le génotype TS 3R/3R et la résistance de manière dose-dépendante au traitement par MTX. Les résultats obtenus ont permis de fournir une explication concernant un haut risque significatif de rechute rencontré chez les patients au génotype TS 3R/3R et suggèrent que ces patients pourraient recevoir une augmentation de leur dose de MTX. À travers ces expériences, nous avons aussi démontré que les modèles murins de xénogreffe peuvent servir comme outil préclinique afin d’explorer l’option d’un traitement individualisé. En conclusion, la connaissance acquise à travers mon projet de thèse a permis de confirmer et/ou d’identifier quelques variants dans la voix d’action du MTX et de l’ASNase qui pourraient faciliter la mise en place de stratégies d’individualisation de la dose, permettant la sélection d’un traitement optimum ou moduler la thérapie basé sur la génétique individuelle. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most frequent malignancy of childhood. It is the principal cause of cancer–related mortality in children due to a persistent group of patients who does not respond to standard anti-cancer treatment. Susceptible patients may also suffer from number of toxicities associated with intensive chemotherapy treatment. Pharmacogenetic studies of our group, showed that particular genetic variants of the folate dependent enzymes, particularly, dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidylate synthase (TS), major targets of methotrexate (MTX), correlate both individually and combined with increased risk of relapse in patients with childhood ALL. Furthermore, variations of ATF5 gene involved in asparagine synthetase (ASNS) regulation and of ASNS gene were associated with higher risk of ALL relapse or with ASNase related toxicity in patients who received E.coli asparaginase (ASNase). The major goal of my doctoral research project was to further understand from the functional point of view the role of genetic variations underlying therapeutic responses of childhood ALL, by focusing on two major components of ALL treatment, MTX and ASNase. My specific goal was to analyze associations found in clinical setting using cellular proliferation assay in lymphoblastoid cell lines (LCLs, n=93) and xenograft mice model of ALL. Genetic variation in TS polymorphism (homozygosity for triple repeat allele, 3R) and of DFHR haplotype *1b (defined by particular allelic combination derived from six polymorphic sites in the major and minor promoter of DHFR), on MTX sensitivity was assessed using cellular proliferation assay. Similar in vitro assay in response to E.coli ASNase was used to access the T1562C variation in the ATF5 5’UTR and particular haplotypes of ASNS gene (defined by two genetic variation and arbitrarily named haplotype *1). Xenograft mouse model was used to access the effect of TS 3R3R genotype. Analysis of additional polymorphisms in ASNS gene revealed diversification of haplotype *1 of ASNS gene in 5 subtypes, two polymorphisms (rs10486009 and rs6971012,) defining particular subtypes correlated with in vitro sensitivity to ASNase and one of them (rs10486009) seems particularly important for reducing sensitivity to ASNase in vitro, possibly providing mechanistic explanation for lower sensitivity of haplotype *1 observed in clinical setting. No association between ATF5 T1562C variation and cellular proliferation assay in response to E.coli ASNase was found. We did not observe genotype-related association when in vitro sensitivity to MTX in LCLs was analyzed. In contrast, in vivo results using xenograft mouse model demonstrated the relationship between the TS 3R/3R genotype and the resistance to MTX treatment in dose-dependent manner. Obtained results provided function explanation for the significantly higher risk of relapse seen in 3R/3R ALL patients and suggest that these patients might benefit from increase dose of MTX. Through these experiments we also showed that xenogeneic mice model can serve as a preclinical tool to explore individualized treatment options. In conclusion, the knowledge acquired through my doctoral work confirmed and/or identified some functional variants in MTX and ASNase action pathway which may facilitate dose individualization strategies, allowing for optimal treatment selection or tailoring childhood ALL therapy based on individual genetics.

Le syndrome de l'intestin irritable (SII) touche près de 10% de la population. Nous avons utilisé un modèle animal de SII induit par le butyrate développé au laboratoire afin de décortiquer les mécanismes de l'hypersensibilité colique (HSC) dans le SII. Le blocage du NGF par des anticorps anti-NGF prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée par le test de distension colorectale. Le NGF, quantifié par immunohistochimie (IHC), est surexprimé dans les ganglions rachidiens dorsaux (GRD) innervant le côlon des rats butyrate. Le blocage des canaux ASIC par amiloride prévient l'HSC induite par le butyrate. L'expression des ARNm ASIC1a et ASIC1b, évaluée par RT-PCR, est augmentée dans les GDR des rats butyrate. Cette augmentation est corrélée à une augmentation de l'expression de la protéine ASIC1A dans les neurones nociceptifs, quantifiée par IHC. Le blocage du NGF par des anticorps anti-NGF prévient la surexpression de ASIC1A dans les GRD. L'absence de variation d'expression du NGF et de ASIC1A au niveau colique suggère que ces moléciles ont une implication dans l'élément présynaptique plutôt que dans les terminaisons libres coliques. L'étude de l'expression spinale de la protéine Fos après stimulation des fibres coliques a montré que l'HSC induite par le butyrate est associée à une activation spécifique des segments thoraciques T10-T11-T12 de la moëlle épinière (MEp). Le blocage spinal du canal ASIC1A par la PcTx1 prévient l'HSC induite par le butyrate. L'expression de ASIC1a, évaluée par RT-PCR et Western blot, est augmentée dans la MEp des rats butyrate. Comme à la périphérie, l'expression de ASIC1a est modulée par le NGF puisque le blocage du NGF prévient la surexpression des ARNm et de la protéine ASIC1A dans la MEp des rats butyrate. En conclusion, ce travail de thèse suggère que le NGF et le canal ASIC1A jouent un rôle critique dans le développement de douleurs viscérales en contribuant à la fois à la sensibilisation périphérique et centrale.

La douleur articulaire associée à l’arthrose est un problème clinique majeur, spécialement chez les personnes âgées. L’intensité de la douleur est souvent amplifiée lors de mouvement de l’articulation et principalement lors du soutien de la charge corporelle sur le membre lésé. Malheureusement, les traitements pharmacologiques proposés sont trop souvent associés à des effets secondaires néfastes et à une inefficacité pour le soulagement de la douleur à long terme. Divers modèles murins sont utilisés en laboratoire de recherche pour des études précliniques de molécules aux propriétés analgésiques. Une évaluation comparative de la réponse comportementale douloureuse des animaux d’un modèle d’instabilité articulaire induit par le sectionnement du ligament croisé antérieur accompagné d’une méniscectomie partielle (le modèle ACLT+pMMx) et d’un modèle de dégénérescence articulaire induite par le monoiodoacetate (le modèle MIA) a permis de sélectionner un modèle approprié pour la continuité du projet. Les deux modèles ont démontré des lésions tissulaires, mais le modèle MIA a démontré une réponse douloureuse plus prononcée que le modèle ACLT+pMMx. Par l’analyse de la démarche, le modèle MIA a démontré une boiterie claire dans le patron de la démarche des animaux qui est associée à une lésion unilatérale. Le modèle MIA a donc été choisi pour la suite du projet. La problématique principale dans la recherche sur la douleur associée à l’arthrose est une compréhension incomplète des mécanismes de douleur responsables de l’induction et du maintien de l’état de douleur. Il devient donc nécessaire d’améliorer nos connaissances de ces mécanismes en effectuant une caractérisation plus approfondie des modèles animaux employés pour l’évaluation de stratégies pharmacologiques analgésiantes. Afin de bien comprendre le modèle MIA, une caractérisation des événements moléculaires centraux lors de la progression du processus dégénératif des structures articulaires de ce modèle s’est effectuée aux jours 3, 7, 14, 21 et 28 post injection. Des mécanismes hétérogènes qui modulent l’information nociceptive en fonction de la progression temporelle de la pathologie ont été observés. Les changements du contenu i spinal des neuropeptides sélectionnés (substance P, CGRP, dynorphine A et Big dynorphine) ont débuté sept jours suivant l’injection de MIA. L’observation histologique a démontré que les dommages structuraux les plus importants surviennent entre les jours 14 et 21. C’est entre les jours 7 et 21 que les lésions démontrent le plus de similarités à la pathologie humaine. Cela suggère que lors d’une évaluation préclinique d’un traitement pharmacologique pour pallier la douleur articulaire utilisant le modèle MIA, l’étude doit tenir compte de ces événements afin de maximiser l’évaluation de son efficacité. Puisque les traitements pharmacologiques conventionnels proposés pour le soulagement de la douleur ne font pas l’unanimité en terme d’efficacité, d’effets non désirés et de coûts monétaires parfois onéreux, les molécules de dérivés de plante deviennent une alternative intéressante. L’eugénol, le principal constituant de l’huile de clou de girofle, a été administré oralement pour une période de 28 jours chez des rats ayant reçu l’injection intra-articulaire de MIA afin d’évaluer son efficacité pour le traitement de la douleur articulaire. L’eugénol à une dose de 40 mg/kg s’est révélé efficace pour l’amélioration du patron de la démarche des animaux ainsi que pour la diminution de l’allodynie mécanique secondaire. De plus, les concentrations spinales de neuropeptides pronocicepteurs ont diminué chez les animaux traités. Par une évaluation histopathologique, l’eugénol n’a démontré aucune évidence d’effets toxiques suite à une administration per os quotidienne pour une période prolongée. Ces résultats suggèrent le potentiel thérapeutique complémentaire de la molécule d’eugénol pour le traitement de la douleur articulaire. / Pain is the most predominant clinical symptom associated with osteoarthritis (OA), mostly among older people. Joint movement and weight bearing often increase the pain intensity. Unfortunately, the proposed pharmacological treatments are frequently associated with side effects and ineffective for pain alleviation for long time periods. Many murine models are used in laboratories for preclinical studies evaluating analgesic compounds. A comparative evaluation of the behavioral pain responses of animals with a joint instability model induced by the transection of the anterior cruciate ligament followed by a partial menisectomy (the ACLT+pMMx model) and of an articular degenerative model induced by an intra-articular injection of monoiodoacetate (the MIA model) was conducted to select an appropriate model for the continuation of the project. Both models demonstrated articular lésions, however the MIA model demonstrated a clearer behavioral pain response over the ACLT+pMMx model. The gait pattern of the MIA model revealed a clear limping gait similar to that observed with unilateral OA in humans. The MIA model was chosen for the subsequent studies. An unresolved issue in pain OA research is the lack of understanding of the pain mechanisms responsible for the induction and maintenance of the pain. Therefore, there is an urgent clinical need to improve the characterization of animal models to effectively discover novel pain relief pharmacological treatment stratégies for OA patients. A characterization of the spinal pain molecular events during the progression of the joint degenerative process in the MIA model was performed on days 3, 7, 14, 21 and 28 post injection. Heterogeneous nociceptive central molecular events were observed in respect to the time course of the pathology’s progression. Changes in selected spinal neuropeptide content (substance P, CGRP, dynorphin A, Big dynorphin) began 7 days following the MIA injection. Most severe joint structural damage on histology occured between days 14 and 21 post injection. These results suggest that preclinical drug evaluation employing this model should be conducted between 7 and 21 days post injection when the lesions resemble most those of human OA. iii As current pharmacological therapy for the alleviation of joint pain does not achieve the unanimity in respect to efficacy, side effects and cost, plant derivate compounds are now interesting alternatives to improve the situation. Eugenol, the main constituent of clove oil, was evaluated for its efficacy for alleviation of joint pain in rats who previously received an intra-articular injection of mono-iodoacetate to induce the MIA model. Eugenol, administered orally for 28 consecutive days at a dose of 40 mg/kg, improved gait pattern and reduced secondary mechanical allodynia. Furthermore, spinal concentrations of pronociceptive neuropeptides were also decreased in the treated animals. No toxic effects of the compoud were identified on histopathological assessment of the various tissues. These results suggest that eugenol could be a potential therapeutic option for alleviating OA joint pain.

La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection fongique opportuniste la plus commune chez les individus infectés par le VIH-1. La production des cytokines Il-17 et Il-22 par les lymphocytes Th17 est importante lors de la résolution de la COP, puisque ces cytokines induisent la production de peptides antifongiques et le recrutement des neutrophiles polymorphonucléaires. Toutefois, les lymphocytes Th17 sont préférentiellement déplétés chez les individus infectés par le VIH-1. Le modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMutA, exprimant les gènes nef, env et rev du VIH-1, permettra de déterminer si des altérations quantitatives et/ou fonctionnelles des sous-populations de lymphocytes T CD4+ causent la sensibilité à la candidose. Les sous-populations Th1, Th2, Th1Th17, Th17 et Treg, ainsi que leurs précurseurs, les lymphocytes T CD4+ naïfs, sont sévèrement déplétées dans les ganglions cervicaux de la souris Tg. Cependant, les lymphocytes T CD4+ naïfs conservent la capacité à se différencier in vitro en présence de cytokines polarisantes et à produire les cytokines typiques des diverses sous-populations. De plus, les cytokines requises pour la polarisation des lymphocytes T CD4+ naïfs n’étaient pas réduites dans les ganglions cervicaux des souris Tg, 7 jours après le début de l’infection. Les gènes S100a8, Ccl20, Il17 et Il22 étaient surexprimés en réponse à la COP chez la souris non-Tg, mais pas chez la souris Tg. Le traitement de souris Tg infectées à l’aide de la combinaison des cytokines Il-17 et Il-22 réduit significativement la charge fongique buccale de C. albicans et le nombre d’hyphes dans l’épithélium de la langue et restaure la capacité à surexprimer des gènes S100a8, Ccl20 et Il22. Ces résultats démontrent que la perturbation de l’induction de l’immunité innée par l’Il-17 et l’Il-22 augmente la susceptibilité à la COP chez la souris Tg. / Oropharyngeal candidiasis (OPC) is the most common opportunistic fungal infection in HIV-infected individuals. OPC resolution involves Il-17 and Il-22 production by Th17 cells through oral antifungal peptide production and polymorphonuclear neutrophil recruitment. Conversely, Th17 cells are preferentially depleted in HIV-infected individuals. The OPC model in transgenic (Tg) mice expressing nef, env and rev from the HIV-1 genome enables the study of the quantitative and functional defects of the CD4+ T-cell subpopulations. The Th1, Th2, Th1Th17, Th17 and Treg subpopulations, as well as naïve CD4+ T-cell precursors, are severely depleted in the cervical lymph nodes (CLNs) of Tg mice. However, the differentiation capacity of naïve CD4+ T-cells in response to polarizing cytokines was maintained in vitro in Tg mice, as well as their ability to produce the signature cytokines of the various subpopulations. Moreover, the polarizing cytokines were not reduced in the CLNs of Tg mice, 7 days after infection. The S100a8, Ccl20, Il17 and Il22 genes were up-regulated in response to OPC in non-Tg mice, but not in Tg mice. Treatment of infected Tg mice with a combination of Il-17 and Il-22 cytokines significantly reduced the oral fungal burdens of C. albicans as well as the number of hyphae in the tongue epithelium. Treatment also restored S100a8, Ccl20 and Il22 up-regulation in Tg mice. These results show that defective induction of innate immunity, normally mediated by Il-17 and Il-22, increases the susceptibility to OPC in these Tg mice.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) touche un garçon sur 3500, contraint à l'usage du fauteuil roulant à l'âge de 10 ans, et entraîne le décès à une vingtaine d'années. Cette maladie demeure incurable, et les pistes thérapeutiques envisagées nécessitent d'être validées en amont, dans les modèles murins, puis au stade pré-clinique, dans les modèles canins.L'un d'eux, le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), est le plus largement utilisé, et présente l'intérêt de partager, avec le patient qu'il modélise, de nombreuses similitudes génotypiques et phénotypiques. Les différentes fonctions touchées doivent donc pouvoir faire l'objet de mesures objectives et quantitatives, à l'aide d'outils dédiés. Par ailleurs, une problématique inhérente à l'utilisation de ce modèle est sa grande variabilité sur le plan phénotypique.L'objectif du travail mené ici a été de développer des outils d'évaluation du chien GRMD, afin de mieux connaître et maîtriser cette hétérogénéité clinique.La mesure de force de flexion du tarse a permis de démontrer que la force tétanique maximale pouvait être utilisée comme indice d'évaluation à différents stades de la maladie, sans que le déficit de force musculaire puisse être relié à l'atteinte motrice globale. De plus, la relaxation s'est avérée altérée chez les chiens GRMD, en corrélation avec leur atteinte motrice.La locomotion, évaluée par accélérométrie tri-dimensionnelle, a pu montrer des altérations multiples, mesurées par différentes variables. Certaines variables sont altérées de manière précoce, tandis que d'autres anomalies s'installent durant les premiers mois, traduisant l'aggravation de la fonction locomotrice.La dysfonction respiratoire, évaluée par spirométrie en respiration de Tidal, et cinématique diaphragmatique sur images radioscopiques, a également pu être objectivée par différents indices. Une moindre mobilité diaphragmatique, une rétraction caudale du diaphragme, et un effondrement du débit expiratoire en fin d'expiration, s'installent au cours des premiers mois.Afin de contrôler l'hétérogénéité clinique ainsi mesurée, une recherche de marqueurs prédictifs de l'évolution clinique a été menée. Différents indices histologiques et cliniques ont été évalués sur leur valeur pronostique à un stade précoce. La fréquence des cycles locomoteurs à 2 mois et le défaut de relaxation à 4 mois se sont avérés prédictifs de formes accélérées.Enfin, les différents outils mis en place ont été évalués dans le cadre du suivi d'animaux au cours d'un essai thérapeutique, qui a, de plus, permis de disposer d'une population de référence sous traitement immunosuppresseur. Une amélioration fonctionnelle des animaux traités a pu être démontrée par nombre des indices mesurés.Ces résultats démontrent que les outils développés sont utilisables au cours d'essais pré-cliniques, et permettent, malgré l'hétérogénéité clinique qu'ils mesurent, de démontrer un bénéfice fonctionnel. Plus largement, ces données permettent d'optimiser l'utilisation pré-clinique du modèle GRMD. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) affects one boy over 3500 at birth. The affected individuals are wheelchair-bound at about 10 years, and death occurs in the early twenties. DMD remains incurable, and therapeutic strategies need to be validated in murine models, and, subsequently, at the preclinical stage, in canine models.Among the existing canine models, the GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy) dog is the most widely used. The strong genotypic and phenotypic similarities it shares with DMD patients make this model of great interest. The many affected functions must therefore be reliably measured using dedicated tools, providing objective and quantitative evaluation. Moreover, the wide phenotypic heterogeneity peculiar to this model may compromise its use in preclinical studies.The aim of the present work was to develop evaluation tools for the GRMD dog, in order to better know and handle this clinical variability.The measurement of the contraction force generated by tarsal flexion has shown that the maximal tetanic force could be used as an evaluation index, at different stages of the disease. However, no correlation with the global motor impairment could be found. Conversely, the relaxation has shown to be altered in GRMD dogs, and correlated with the motor impairment.The locomotion was evaluated using three-dimensional accelerometry. This method allowed the measurement of several variables, some of which being early impaired, and some others being altered in a more progressive fashion, reflecting the degradation of the locomotor function.The respiratory impairment has been evaluated by diaphragmatic kinematics using radioscopic acquisitions and by Tidal-breathing spirometry. The diaphragm was shown to be less mobile, and to be caudally displaced. The end-expiration flows were decreased. These abnormalities progressed during the first months.In order to better handle the clinical heterogeneity, some markers able to predict the clinical evolution were looked for. The prognostic value of many histological and clinical indexes at an early stage has been evaluated. The stride frequency at the age of 2 months, as well as the relaxation impairment at the age of 4 months succeeded in predicting severe accelerated forms.Finally, the developed tools have been tested in the context of a clinical follow-up during a therapeutic trial. This trial also aimed to provide a reference-group of GRMD dogs treated with immunosuppressive drugs. Several indexes have demonstrated a clinical improvement of the treated animals.These results show that the developed tools are useable during preclinical trials and allow to quantitatively highlight a functional improvement, despite the clinical heterogeneity. More widely, these data will lead to an optimization of the preclinical use of GRMD dogs.

Chez les patients asthmatiques, on retrouve un remodelage de la matrice extracellulaire des poumons, caractérisé par une augmentation du collagène ou fibrose de la couche sous-épithéliale des voies respiratoires. Le souffle, maladie inflammatoire chronique des voies respiratoires inférieures des chevaux matures, présente des similarités physiopathologiques avec l’asthme humain, incluant le remodelage. Ceci nous conduit à l’hypothèse que la fibrose de la couche sous-épithéliale pourrait être une composante des lésions pulmonaires chez les chevaux affectés, ce que notre étude avait pour objectif d’évaluer. Des biopsies pulmonaires périphériques réalisées par voie thoracoscopique ont été obtenues chez 5 chevaux témoins et 6 chevaux atteints du souffle, avant (T0) et après une stimulation antigénique de 30 jours avec du foin moisi et de la paille. Avant le début de l’étude, les sujets étaient en rémission clinique et ne démontraient aucun signe clinique de maladie. Un examen microscopique des échantillons prélevés a été réalisé après traitement au picrosirius-rouge, colorant spécifique des fibres de collagène. La surface du collagène de la couche sous-épithéliale a été mesurée et corrigée en fonction de la taille de la voie respiratoire en utilisant des techniques morphométriques standards. Les chevaux atteints de souffle ont une surface de collagène plus grande dans la couche sous-épithéliale (p<0.1) en comparaison avec les chevaux témoins. La fibrose de la couche sous-épithéliale demeure inchangée chez les chevaux malades après la stimulation antigénique de 30 jours. À T0, la fibrose de la couche sous-épithéliale est associée positivement aux variations maximales de pression pleurale et à la résistance pulmonaire chez les chevaux atteints de souffle. Les résultats de cette étude suggèrent qu’une fibrose de la couche sous-épithéliale est présente dans les voies respiratoires périphériques des chevaux atteints de souffle et contribue au déficit de fonction résiduel pulmonaire observé lors de rémission clinique. / Extracellular matrix remodelling is present in the human asthmatic lung, and is characterized by increased collagen or fibrosis of the subepithelial area of the airway. Heaves, a naturally occurring chronic lower airway inflammatory condition in horses shares aspects of pathophysiology with asthma, including features of airway remodelling. We thus hypothesize that airway fibrosis is a characteristic of remodelling in heaves. The aim of this study was to evaluate the presence of fibrosis in the subepithelial area of the peripheral airways of heaves-affected horses. Peripheral lung biopsies acquired under thoracoscopic guidance were obtained from 5 control and 6 heaves-affected horses, both before (T0) and after a 30 day antigenic challenge with mouldy hay and straw. Prior to the study, diseased horses were in clinical remission and exhibited no clinical signs of disease. Obtained samples were microscopically examined using picrosirius-red, a collagen specific histological staining technique. Collagen area in the subepithelial layer, e.g. the region between the airway smooth muscle and the epithelial layer was measured, and corrected for airway size using standard morphometric techniques. In comparison with controls, heaves-affected horses had an increased collagen content in the airway subepithelial area (p<0.1). No change in fibrosis of the subepithelial area was observed in diseased horses after the 30 day antigenic challenge. Peripheral airway subepithelial collagen at baseline was positively associated with maximal changes in transpulmonary pressure and pulmonary resistance in horses with heaves but not in controls. Results of this study indicate that fibrosis of the subepithelial area is present in the peripheral airways of heaves-affected horses, and may play a role in residual lung function deficits observed in diseased horses even while in clinical remission.

Les modèles animaux d’arthrose sont utilisés sur le rat depuis des décennies pour évaluer l’efficacité analgésique de nombreux composés. Cependant, la méthodologie utilisée, en particulier les protocoles d’évaluation de la douleur, est très différente d’une étude à une autre, rendant difficile la comparaison entre chaque projet. Afin d'améliorer le transfert des résultats précliniques vers la recherche clinique, ce projet propose d'établir un protocole d'évaluation de la douleur fiable et pertinent, et de le valider à l’aide du modèle d’arthrose expérimental le plus populaire, soit l’injection intra-articulaire de mono-iodoacétate de sodium (MIA). La répétabilité et la fiabilité inter-évaluateur de diverses méthodes d’évaluation de la douleur ont été évaluées, et le protocole d'acclimatation le plus fiable a été déterminé. Ensuite, les méthodes les plus intéressantes ont été testées pour leur sensibilité à détecter les altérations douloureuses induites par l’injection de MIA, ainsi que leur réponse au traitement analgésique, soit une injection intra-articulaire de lidocaïne. Une période d'acclimatation adéquate associée à un protocole d'évaluation combinant des mesures réflexes, des comportements spontanés ainsi que des tests opérants ont témoigné avec succès des changements douloureux liés à l'injection de MIA. Le test opérant fut la méthode la plus sensible pour détecter l'effet analgésique de la lidocaïne. Cette étude a permis d’établir le protocole d’acclimatation et les méthodes de l’évaluation de la douleur les plus fiables et sensibles. Aussi, il a démontré la pertinence du test opérant pour détecter la composante affective de la douleur chez les rongeurs. / Animal models of osteoarthritis pain have been used for decades in rats to test the analgesia response of numerous compounds. Study methodology, in particular the pain assessment methods, is quite variable, making the comparison between each project difficult and sometimes simply impossible. In order to improve the translation of new therapies from the preclinical research to the clinical field, this study proposed to establish the reliability and concurrent validity of a panel of pain assessment methods. The concurrent validation was performed in the most popular osteoarthritis rat model, i.e. using the intra-articular injection of monosodium iodoacetate (MIA). The repeatability and inter-observer reliability of various pain assessment methods were evaluated, and the most reliable acclimatization protocol was determined. Then, the most reliable methods were tested comparatively in the rat MIA osteoarthritis model for their sensitivity in detecting painful changes related to the MIA injection. Their responsiveness to treatment, i.e. an intra-articular injection of lidocaine, was also assessed. A complete pain evaluation protocol and reliable acclimatization period, combining reflexive and spontaneous behavior measures as well as operant testing, successfully demonstrated the pain related changes of the MIA injection. Operant testing was the most responsive to the analgesic effect of lidocaine. This study established the most reliable and sensitive methods of pain assessment and optimized acclimatization protocol. Moreover it defined the operant testing as a highly relevant tool to demonstrate the affective component of pain in rodent.

L’hypertension pulmonaire (HTP) est définie par une valeur de pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPm) supérieure à 25 mmHg au repos. Il existe des formes sévères d’HTP (HTPs) avec des valeurs de PAPm encore plus élevées associées à des symptômes plus marqués et à l’apparition de lésions anatomo pathologiques spécifiques. Le diagnostic et le développement de nouvelles thérapies sont des enjeux majeurs pour une meilleure prise encharge de ces patients À l’aide de la tomodensitométrie, nos travaux observationnels chez l’homme atteint debroncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) ont montré une corrélation de l’HTP avec le remodelage bronchique et non pas avec l’emphysème. L’HTPs peut être une complication rare mais grave de la BPCO. L’évaluation in vivo des modifications du lit vasculaire pulmonaire a permis de confirmer l’existence d’un phénotype particulier chez les patients atteints de BPCO compliquée d’HTPs. De plus, la définition d’un score combiné comprenant des paramètres non invasifs tomodensitométriques devrait permettre de sélectionner plus finement les patients devant subir un cathétérisme cardiaque droit.En parallèle, dans nos travaux expérimentaux, nous avons complété la caractérisation d’un modèle d’hypertension artérielle pulmonaire chez le rat développant un phénotype sévère(HTAPs) et présentant des lésions artérielles pulmonaires caractéristiques de la maladie humaine. Ce modèle, ainsi que des modèles animaux plus classiques d’HTP, nous ont permis d’identifier un rôle du facteur de croissance des nerfs NGF dans cette pathologie, dont le ciblage pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Pulmonary hypertension (PH) is defined by a mean pulmonary arterial pressure (mPAP) at or above 25 mmHg at rest. Severe forms of PH (sPH) are characterized by a stronger elevation of mPAP, more marked symptoms and specific pulmonary vascular lesions. Real challenges come from a better diagnosis for these patients and identification of new therapeutic targets to improve their therapeutic care. Our results show by computed tomography that PH associated to chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is correlated to airway remodeling and not to emphysema. Severe PH is a rare and serious complication of COPD. We confirmed existence of a phenotype in COPD patients with sPH, by evaluating in vivo modifications of the pulmonary vascular bed in these patients. Moreover, we defined a combined score, which may be a non-invasive tool to select patients for right heart catheterization In parallel, we completed the characterization of a rat model of severe pulmonary arterial hypertension (sPAH) that developed a severe phenotype with pulmonary arterial specific and human-like lesions. In this model, as well as in more classical PH models, our results demonstrated an increased expression of the nerve growth factor NGF and its role in PH and sPAH pathophysiology. These results therefore suggest that NGF may be an interesting target to develop new therapeutic perspectives in this disease.

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une complication fréquente de la grossesse qui se traduit à la naissance par un poids et/ou une taille inférieurs au dixième percentile par rapport à l’âge gestationnel. Il représente un problème majeur de santé publique avec une augmentation de la morbi-mortalité néonatale et un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires et un diabète à l’âge adulte. Le RCIU humain est une pathologie complexe et multifactorielle avec une physiopathologie incomplètement élucidée dans près de 30 à 40% des cas. L’objectif de ce travail a été de progresser sur la physiopathologie du RCIU humain et de proposer des gènes candidats impliqués. J’ai analysé les perturbations d’expression génique dans des placentas issus de grossesses avec et sans RCIU, participé à la caractérisation d’un modèle animal de rate gestante soumise à un régime hypoprotidique, mis au point et validé un modèle cellulaire de cellules JEG-3 transformées par surexpression du gène PDX1 et/ou déplétées en acides aminés constituant un modèle important des effets du RCIU. J’ai étudié le rôle et l’implication de plusieurs gènes candidats : IMP3, les Cullines et PDX1. J’ai enfin participé à l’identification de nouveaux gènes soumis à empreinte dans le placenta. Ce travail de thèse a confirmé le rôle essentiel de l’apoptose et des régulations épigénétiques, plus particulièrement les modifications de profil de méthylation de l’ADN, dans le RCIU. L’analyse transcriptomique des placentas humains de grossesse avec RCIU a confirmé le rôle essentiel de 3 gènes : la leptine, IGFBP1 et RBP4. Enfin l’utilisation de notre modèle cellulaire a permis de confirmer l’implication de PDX1 dans le RCIU, PDX1 contrebalance les effets transcriptomiques de la déplétion en acides aminés sur les cellules JEG en culture. En extrapolant ces résultats à la pathologie humaine, on peut émettre l’hypothèse que l’induction placentaire de PDX1 en situation de RCIU permettrait de contrebalancer ou de limiter les effets délétères du RCIU pour la survie du fœtus. La leptine, IGFBP, RBP4 et PDX1 sont de bons candidats à la fois pour l’origine du RCIU et également pour la prédiction de l’évolution possible vers un syndrome métabolique chez les adultes anciens RCIU. Des études complémentaires sur le rôle et l’implication de ces 4 gènes dans la physiopathologie du RCIU ainsi que dans la programmation fœtale des pathologies cardiovasculaires, de l’obésité et de l’intolérance glucidique à l’âge adulte restent nécessaires. / Intra-uterine growth restriction (IUGR) is a frequent complication of pregnancy that leads to a baby with a birth weight and/or size below the 10th percentile for a given gestational age. IUGR represents a major public health problem associated with neonatal increased morbidity and mortality and an increased risk to develop cardiovascular pathologies and diabetes in adulthood. Human IUGR is a complex and multi-factorial pathology with an incompletely characterised physiopathology in up to 30 to 40% of cases. The goal of this work was to improve the knowledge on the physiopathology of IUGR and to propose implicated candidate genes.I analysed modulations of gene expression in placentas from pregnancies with and without IUGR, participated to the characterisation of an IUGR animal model of female rat fed with a hypoprotidic diet during gestation, set up and validated a cellular model of JEG-3 cells transformed by over-expression of the PDX1 gene and/or depletion of amino acids to provide a handy model of IUGR effects. I studied the role and implication of candidate genes: IMP3, the Cullin family and PDX1. Finally I participated to the identification of new imprinted genes in the human placenta. This thesis work confirmed the essential role of apoptosis and epigenetic regulations, in particular modifications of DNA methylation profiles, in IUGR. Transcriptomic analysis of human placentas from IUGR and control pregnancies confirmed the crucial role of 3 genes: leptin, IGFBP1 and RBP4. Finally, the use of our cellular model strengthened the role of PDX1 in IUGR, where it counterbalances the transcriptomic effects of amino acid depletion in cultured JEG-3 cells. By extrapolating these results to the human pathology, we can suggest the hypothesis that the placental induction of PDX1 in IUGR could counterbalance or limit the deleterious effects of IUGR on the foetus’ survival. Leptin, IGFBP1, RBP4 and PDX1 are good candidates to explain the origin of IUGR as well as to predict the potential evolution towards a metabolic syndrome in adults that suffered from IUGR. Complementary studies on the role and function of these 4 genes in IUGR physiopathology and also in foetal programming of cardiovascular pathologies, obesity and glucidic intolerance in adulthood remain necessary.

No description available.