The skeletal muscle has a remarkable regenerative capacity upon injury, due to the presence of the satellite cells, which remain quiescent in the tissue, but, when required, they are able to proliferate and form and/or repair myofibers. Moreover, satellite cells are important to muscle growth and maintenance. However, in many neuromuscular disorders, the amount, function, and proliferative capacity of these cells are impaired. Centronuclear myopathies (CNM) are a group of muscle diseases characterized by generalized muscle weakness and myofibers with central nuclei. The autosomal dominant form (AD-CNM) is caused by mutations in the DNM2 gene. Dynamin 2 protein is ubiquitously expressed and is involved in membrane remodeling, intracellular trafficking, and cytoskeleton dynamics. Therefore, the pathophysiological mechanisms are equally diverse e not completely understood, mainly the fact to be a muscle-specific disease. In the present Ph.D. thesis, we sought to investigate the satellite cells in the context of centronuclear myopathy. For this, we used the mouse model KI-Dnm2R465W, bearing the most frequent mutation found in human patients. Since in centronuclear myopathy there is no evident degenerative process ongoing, we induced muscle lesion by electrical shock, a protocol developed for this thesis, comparatively to cardiotoxin injection. We verified that the number of satellite cells in gastrocnemius muscle is reduced in the KI-Dnm2R465W mouse in relation to wild-type animals. As a result, the regenerative potential of the mutant mouse is decreased and the muscle is not able to fully recover. In addition, we investigated the functional consequences of two mutations, p.R465W and p.E650K, in immortalized myoblasts. We examined the myogenic potential in vitro, the migratory property, and the endocytosis capacity. We found that both mutations impact on the myogenic potential, but in different ways. We also show that both mutations impair the migratory capacity of myoblasts that justify, in parts, the alterations in their myogenic potential. Finally, we verified that the endocytosis capacity is affected in a mutation-dependent manner, which may also indirectly disturb the myogenic differentiation efficiency / O músculo esquelético possui grande capacidade regenerativa após sofrer lesões, por causa da presença das chamadas células-satélite, que permanecem no tecido em estado quiescente, mas que, na presença de uma lesão, são capazes de proliferar e formar e/ou reparar miofibras. As células-satélite são importantes para o crescimento e manutenção do músculo adulto. Porém, em diversas doenças neuromusculares, a quantidade, a função e a capacidade proliferativa destas células podem estar comprometidas. As miopatias centronucleares (CNM) são um grupo de doenças musculares caracterizadas por fraqueza muscular generalizada e o posicionamento dos núcleos na porção central da miofibra. A forma autossômica dominante (AD-CNM) é causada por mutações no gene DNM2. A proteína dinamina 2 é expressa ubiquamente e está envolvida no remodelamento de membranas, no tráfego intracelular e na dinâmica do citoesqueleto. Consequentemente, os mecanismos fisiopatológicos também são diversos e não completamente compreendidos, principalmente o fato de ser uma doença músculo-específica. Nesta tese de doutorado, buscamos investigar as células-satélite no contexto da miopatia centronuclear. Para isto, utilizamos o camundongo modelo KI-Dnm2R465W, portador da mutação mais frequente em pacientes humanos. Como na miopatia centronuclear não há um processo degenerativo em atividade, induzimos nos camundongos a lesão muscular por choque elétrico, em protocolo desenvolvido nesta tese, comparativamente a injeção de cardiotoxina. Verificamos que o número de células satélite no músculo gastrocnêmio do camundongo KI-Dnm2R465W é reduzido em relação aos animais selvagens. Em consequência disto, o potencial regenerativo do animal mutante é reduzido e o músculo não se recupera completamente. Investigamos também os efeitos funcionais de duas mutações, p.R465W e p.E650K, em mioblastos imortalizados. Examinamos o potencial miogênico in vitro, a propriedade migratória e a capacidade de endocitose. Verificamos que o potencial miogênico destas células é afetado pelas mutações, porém de maneiras distintas. Mostramos também que ambas as mutações impactam negativamente na capacidade migratória dos mioblastos, o que em parte justifica as alterações no potencial miogênico dos mesmos. Por fim, verificamos que a capacidade endocítica em mioblastos é alterada a depender da mutação, o que indiretamente também pode afetar a capacidade de diferenciação miogênica

A distrofia muscular de cintura 2B (LGMD2B) é uma doença neuromuscular causada pela redução ou ausência da proteína sarcolemal disferlina. A disferlina está envolvida no reparo de membrana por atuar no tráfego e fusão de vesículas após estresse mecânico e, quando deficiente, as alterações nesta via levam à degeneração progressiva e irreversível das fibras musculares. A disferlina também tem sido implicada na inflamação e na miogênese durante a degeneração e regeneração muscular. Recentemente, identificou-se um tricomplexo formado pela disferlina com duas proteínas citoplasmáticas, FAM65B e HDAC6, no início da diferenciação de mioblastos. Investigar a regulação destas interações é importante para avançar na compreensão das funções da disferlina e seu papel na função muscular. Neste estudo, a miogênese e o reparo muscular foram investigados in vivo e in vitro em modelos com deficiência de disferlina. Para estudar o processo regenerativo in vivo, utilizamos um modelo de eletroporação para induzir degeneração/regeneração no músculo distrófico levemente afetado do camundongo disferlina-deficiente SJL/J. A avaliação histopatológica e a expressão relativa dos genes Pax7, Myf5, MyoD e miogenina foram acompanhadas durante a recuperação muscular em diferentes tempos após a lesão. Além disso, investigamos os efeitos da deficiência de disferlina na expressão dos genes Fam65b e Hdac6. Observamos um curso de tempo alterado do processo de degeneração e regeneração, com notável capacidade regenerativa nos camundongos disferlina-deficientes, caracterizada por uma resposta mais rápida e eficaz nos primeiros dias após a lesão, em comparação com os camundongos normais. Além disso, Fam65b e Hdac6 foram ativados nos estágios iniciais da regeneração muscular, também com expressão mais elevada de ambos os genes no camundongo SJL/J. Esses resultados podem estar relacionados à uma possível condição pré-ativada do processo regenerativo no músculo de camundongos distróficos jovens. Para os experimentos in vitro, utilizamos células musculares humanas de pacientes com LGMD2B, com deficiência total de disferlina. A diferenciação muscular induziu a formação de miotubos mais finos e com menor frequência de núcleos por miotubo, sugerindo uma progressão retardada da formação de miotubos em células com LGMD2B. A expressão de mRNA de MYOD e FAM65B não foi aparentemente afetada pela deficiência de disferlina durante a diferenciação, enquanto HDAC6 apresentou um pico transitório após 24 horas, apenas nas células normais. Além disso, o pico da miogenina ocorreu mais cedo nas células normais. Portanto, sugerimos que a disferlina estaria menos envolvida nos eventos iniciais de formação de pequenos miotubos, mas poderia desempenhar um papel importante nos estágios posteriores de diferenciação, que envolvem crescimento e alongamento de miotubos. Estes resultados fornecem dados interessantes para investigações adicionais de como a deficiência de disferlina afeta os reguladores miogênicos durante a diferenciação. Em conjunto, nossos dados sugerem que a deficiência de disferlina provoca alterações temporais na progressão dos eventos de regeneração muscular e de miogênese. A identificação de uma possível regulação dos componentes do tricomplexo pela disferlina pode indicar novas direções para investigar esta via como um potencial alvo para terapias / Limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) is a neuromuscular disease caused by reduction or absence of the sarcolemmal protein dysferlin. Dysferlin is involved in membrane repair by acting on vesicular traffic and fusion after mechanical stress and, when deficient, changes in this pathway lead to progressive and irreversible degeneration of muscle fibers. Dysferlin has also been implicated in inflammation and myogenesis during muscle degeneration and regeneration. Recently, a tricomplex formed by dysferlin with two cytoplasmic proteins, FAM65B and HDAC6, was identified at the earlier stages of myoblast differentiation. Investigating the regulation of these interactions is important to advance in the understanding of the functions of dysferlin and its role in muscle function. In this study, myogenesis and muscle repair were investigated in vivo and in vitro in models with dysferlin deficiency. To study this effect in the regenerative process of muscle in vivo, we used a model of electroporation inducing muscle degeneration/regeneration in the mildly affected dystrophic muscle of dysferlin-deficient SJL/J mouse. The histopathological evaluation and the relative expression of the genes Pax7, Myf5, MyoD and myogenin were accompanied during muscle recovery at different time points after injury. In addition, we investigated the effects of dysferlin deficiency in the expression of genes Fam65b and Hdac6. We observed an altered time course of the degeneration and regeneration process, with remarkable regenerative capacity in dysferlin-deficient mice, characterized by a faster and effective response in the first days after injury, as compared to normal mice. Moreover, Fam65b and Hdac6 were activated at the early stages of muscle regeneration, also with higher expression of both genes in the SJL/J mouse. These results may have been due to a possible pre-activated condition of the regenerative process in the muscle of young dystrophic mice. For the in vitro experiments, we used human muscle cells from patients with LGMD2B, with total deficiency of dysferlin. The muscular differentiation induced the formation of thinner myotubes and reduced frequency of myonuclei per myotube, suggesting a delayed progression of myotube formation in LGMD2B cells. mRNA expression of MYOD and FAM65B was not apparently affected by dysferlin deficiency during differentiation, while HDAC6 exhibited a transient peak, only in healthy cells, after 24 hours. In addition, the myogenin peak occurred earlier in healthy cells. Thus, we suggested that dysferlin would be less involved in the first events of formation of early small myotubes, but could play an important role in the later stages of differentiation, which involves myotube growth and elongation. These results provide interesting data for further investigation of how dysferlin deficiency affects myogenic regulators during differentiation. Taken together, our data suggest that dysferlin deficiency causes temporal changes in the progression of the muscle regeneration and myogenesis events. The identification of possible regulation of tricomplex components by dysferlin may indicate new directions for investigating this pathway as a potential target for therapies

Foi utilizado na presente pesquisa o ultra-som pulsado de baixa intensidade, com a finalidade de avaliar, experimentalmente, seus efeitos físicos sobre a regeneração do músculo esquelético de ratos. Foram empregados no experimento 10 animais de ambos os sexos. Após eleição do músculo glúteo maior, foram feitas incisões perpendiculares (pós anestesia) às suas fibras, alcançando aproximadamente dois terços de sua espessura. Seguinte às incisões, realizou-se síntese do músculo e dos planos superficiais. Foi convencionado estudar os efeitos do ultra-som pulsado após 3, 6 e 10 dias de estímulo. Antes do sacrifício dos animais foi-lhes administrado Colchicina, com a finalidade de bloquear a células em divisão. Mediante análise histopatológica comparativa dos músculos, constatou-se que enquanto nos animais não estimulados desenvolveu-se, aos 3 dias, áreas de necrose e inflamação, naqueles estimulados houve uma diminuição das mesmas. Além disso, nos animais estimulados, ocorre intensa neovascularização nas áreas de lesão. Observou-se também uma migração de células miogênicas (satélites) para restos de bainhas remanescentes de fibras musculares regeneradas. Constatou-se um aumento de mioblastos com núcleos em metáfase. Aos 10 dias, os animais estimulados exibiam inúmeros miotubos com formação de miofibrilas, caracterizando células musculares em franca maturação. Longe da área estimulada, o ultra-som foi capaz de induzir mitoses em células satélites. Notou-se que os efeitos do ultra-som pulsado aceleram a regeneração de fibras musculares mediante uma intensa neoformação vascular, acelerando a reparação da necrose e formação de mioblastos, os quais agregam-se em miotubos formando novas células. / It was used in the present research the low intensity pulsed ultrasound with aim of evaluating, experimentally, its physical effects on the regeneration of rats skeletal muscle. Ten male and female animals were used in this experiment. After election of the gluteus maximus muscle, perpendicular incisions were made (after anesthesia) in its fibers, reaching approximately two thirds of its thickness. After the incisions, a synthesis of the muscles and superficial plans was performed. It was established to study the effects of the pulsed ultrasound after 3, 6 and 10 day-stimuli. Before sacrificing the animals Colchinine was given aiming to block cells in division. By means of comparative histopathological analysis of the muscles, it was verified that in non-stimulated animals an area of necrosis developed in three days, while in those that were simulated there was a decrease of the same. Moreover, on the stimulated animals, there is intense neovascularization in the damaged area. A migration of myogenic cells (satellites) to rests of remaining sheaths from regenerated muscle fiber was also observed. It was verified an increase of myoblasts with nuclei in metaphase. In ten days, the stimulated animals showed countless myotubes with formations of myofibrils, characterizing mature muscle cells. Far from the stimulated area, the ultrasound was able of inducing mitosis to satellite cells. It was noticed that the effects of the pulsed ultrasound accelerate muscle fiber regeneration by means of an intense vascular neoformation, accelerating the restoration of the necrosis and the formation of myoblasts, which aggregates in myotubes forming new cells.

O envelhecimento é caracterizado por diversas alterações no organismo, as quais acarretam em fragilidade, maior susceptibilidade a quedas, perda de autonomia e piora da qualidade de vida. O músculo esquelético também é afetado pelo envelhecimento, levando a alterações na locomoção, adaptação metabólica e em sua plasticidade. Alterações na plasticidade - prejudicam a capacidade regenerativa do músculo esquelético, desencadeando modificações em todos os estágios desse processo. Uma estratégia que tem sido bastante utilizada para minimizar/reverter o impacto do envelhecimento na função e plasticidade muscular é o treinamento físico aeróbico (TFA), o qual promove diversos benefícios à musculatura esquelética. Dessa forma, na presente dissertação investigamos a contribuição do TFA de 4 semanas em esteira rolante na capacidade regenerativa do músculo tibial anterior de camundongos jovens e idosos após lesão mecânica. A capacidade regenerativa foi avaliada por métodos histológicos e de imunofluorescência em tecido aos 2, 4 e 15 dias após a indução da lesão mecânica. Os níveis de RNAm de fatores relacionados à resposta regenerativa muscular foram avaliados por PCR em tempo real. Para confirmar a eficácia do TFA e função muscular, avaliamos a capacidade aeróbica, a deambulação e a produção de força ex vivo. Observou-se que o TFA melhorou a função muscular e a capacidade aeróbica dos animais jovens e idosos. No que diz respeito ao processo de regeneração muscular, os resultados obtidos sugerem, aumento da área necrótica, da inflamação, da deposição de colágeno e redução da área de secção transversa das fibras nos animais idosos sedentários ao longo do curso temporal estudado. Adicionalmente, observou-se redução na expressão de genes envolvidos na ativação de células satélites e atraso no processo de diferenciação dessas células nesses animais. OTFA contribuiu para a redução da área necrótica, da inflamação, levando a menor deposição de colágeno e aumento da distribuição das fibras centro nucleadas nos animais idosos. No entanto, não se observou modificações na expressão dos genes com o TFA nesses animais. Portanto, os dados sugerem que o TFA contribui para melhora do processo de regeneração muscular em camundongos idosos / Aging is a biological process characterized by a progressive impairment in physiological systems, which leads to general frailty and reduced exercise tolerance and performance in daily living activities. Skeletal muscle is directly affected by aging, displaying changes in locomotion, metabolic adaptation, and muscle plasticity. Altered muscle plasticity affects muscle regeneration capacity in elderly. Aerobic exercise training (AET) has been used as a strategy to minimize/reverse the impact of aging on muscle function and regenerative function. Thus, we have investigated the contribution of 4-week AET (running on the treadmill) for tibialis anterior muscle regenerative response from mechanical injury in young and old muscle, which were randomly assigned into untrained and trained groups. The regenerative capacity was evaluated by histology and immunofluorescence at 2, 4 and 15 days after the mechanical injury induction. Muscle mRNA levels of regulatory genes involved in muscle regeneration were evaluated by real time PCR. To verify the effectiveness of AET and muscle function, we assessed the aerobic capacity, step length in ambulation test and ex vivo muscle force production. We observed that AE improved muscle function and aerobic capacity of young and old mice. Regarding the muscle regeneration process, our data suggest an increase in necrotic area, inflammation and collagen deposition paralleled by a reduced fiber cross sectional area in sedentary old mice. These responses were associated with changes in gene expression suggesting reduced satellite cells activation and delayed differentiation. AET contributed to reduction in both necrotic area and inflammation, leading to reduced collagen deposition and increased centronucleated fibers, suggesting improved regeneration process. However no changes were observed in mRNA levels of genes studied after AET. Altogether, our data provide evidence for AET improved regeneration process in muscle of old mice

Foi utilizado na presente pesquisa o ultra-som pulsado de baixa intensidade, com a finalidade de avaliar, experimentalmente, seus efeitos físicos sobre a regeneração do músculo esquelético de ratos. Foram empregados no experimento 10 animais de ambos os sexos. Após eleição do músculo glúteo maior, foram feitas incisões perpendiculares (pós anestesia) às suas fibras, alcançando aproximadamente dois terços de sua espessura. Seguinte às incisões, realizou-se síntese do músculo e dos planos superficiais. Foi convencionado estudar os efeitos do ultra-som pulsado após 3, 6 e 10 dias de estímulo. Antes do sacrifício dos animais foi-lhes administrado Colchicina, com a finalidade de bloquear a células em divisão. Mediante análise histopatológica comparativa dos músculos, constatou-se que enquanto nos animais não estimulados desenvolveu-se, aos 3 dias, áreas de necrose e inflamação, naqueles estimulados houve uma diminuição das mesmas. Além disso, nos animais estimulados, ocorre intensa neovascularização nas áreas de lesão. Observou-se também uma migração de células miogênicas (satélites) para restos de bainhas remanescentes de fibras musculares regeneradas. Constatou-se um aumento de mioblastos com núcleos em metáfase. Aos 10 dias, os animais estimulados exibiam inúmeros miotubos com formação de miofibrilas, caracterizando células musculares em franca maturação. Longe da área estimulada, o ultra-som foi capaz de induzir mitoses em células satélites. Notou-se que os efeitos do ultra-som pulsado aceleram a regeneração de fibras musculares mediante uma intensa neoformação vascular, acelerando a reparação da necrose e formação de mioblastos, os quais agregam-se em miotubos formando novas células. / It was used in the present research the low intensity pulsed ultrasound with aim of evaluating, experimentally, its physical effects on the regeneration of rats skeletal muscle. Ten male and female animals were used in this experiment. After election of the gluteus maximus muscle, perpendicular incisions were made (after anesthesia) in its fibers, reaching approximately two thirds of its thickness. After the incisions, a synthesis of the muscles and superficial plans was performed. It was established to study the effects of the pulsed ultrasound after 3, 6 and 10 day-stimuli. Before sacrificing the animals Colchinine was given aiming to block cells in division. By means of comparative histopathological analysis of the muscles, it was verified that in non-stimulated animals an area of necrosis developed in three days, while in those that were simulated there was a decrease of the same. Moreover, on the stimulated animals, there is intense neovascularization in the damaged area. A migration of myogenic cells (satellites) to rests of remaining sheaths from regenerated muscle fiber was also observed. It was verified an increase of myoblasts with nuclei in metaphase. In ten days, the stimulated animals showed countless myotubes with formations of myofibrils, characterizing mature muscle cells. Far from the stimulated area, the ultrasound was able of inducing mitosis to satellite cells. It was noticed that the effects of the pulsed ultrasound accelerate muscle fiber regeneration by means of an intense vascular neoformation, accelerating the restoration of the necrosis and the formation of myoblasts, which aggregates in myotubes forming new cells.

No músculo reside um conjunto de células miogênicas indiferenciadas denominadas células satélites (CS), que são essenciais na homeostasia e na regeneração muscular. No entanto, as fases de ativação, proliferação e diferenciação das CS podem ser influenciadas por vários fatores extracelulares, como, a adiponectina. Essa adipocina tem sido amplamente estudada em relação a seus efeitos anti-inflamatórios e antidiabéticos, e foi proposta como reguladora da miogênese in vitro, porém sua atuação na regeneração in vivo, ainda não é bem elucidada. O objetivo deste trabalho foi avaliar a regeneração muscular em camundongos deficientes de adiponectina. A lesão foi induzida pela injeção de 50 ul de cloreto de bário no músculo tibial anterior esquerdo de animais machos selvagens (WT) e deficientes em adiponectina (AdKO). Após 3, 7 e 14 dias os animais foram eutanasiados e as amostras coletadas para análises morfológicas, gênica e proteica. O grupo AdKO apresentou maior quantidade de núcleos centralizados comparado com o grupo WT após 7 dias da lesão. Foram encontrados redução da expressão gênica de Pax7, MyoD e Miogenina nos AdKO após 3 dias. Houve aumento dos níveis das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-4 após 3 e 7 dias, respectivamente, e aumento das citocinas pró-inflamatórias IL-1 &#946, IL-17, TNF- &#945 e IFN após 7 dias nos animais AdKO. Apesar de não haver diferença entre os genótipos na expressão gênica de F4/80, os animais AdKO apresentaram aumento de CD206. Os animais WT tiveram aumento de mRNA de adiponectina com 7 dias da lesão. Não foram encontradas diferenças significativas entre os genótipos quanto ao infiltrado inflamatório, a deposição de colágeno total, a área de secção transversal e a recuperação da massa muscular. Concluímos que a adiponectina é importante no processo de remodelamento tecidual durante a regeneração e que sua deficiência não compromete a maturação das fibras musculares, devido aumento da resposta anti-inflamatória, apesar de haver um possível comprometimento na resposta pró-inflamatória. / In the muscle resides a set of undifferentiated myogenic cells, called satellite cells (SC), which are essential in the maintenance of homeostasis and muscle regeneration. However, the control and activation of SC can be influenced by several extracellular myogenic factors, such as adiponectin. Adiponectin, an adipokine, mainly produced by subcutaneous adipose tissue, has been widely studied in relation to its anti-inflammatory and anti-diabetic effects, but its role as regulator of in vivo regeneration is not yet well elucidated. Here we evaluate muscle regeneration in adiponectin deficient mice. Barium chloride was administered to the left anterior tibial muscle of wild type (WT) and adiponectin deficient (AdKO) animals. The right anterior tibial muscle was not injured and was used as control. The animals were euthanized after 3, 7 and 14 days after injury. We measured the area of the fibers by laminin, in addition to qualitatively evaluating the response to injury by HE and picrosirius. The inflammatory response was verified by the concentration of several cytokines in the muscle, by ELISA, and by the gene expression of some inflammation pathways (RT-qPCR). The regeneration response was obtained by the analysis of regulatory genes of this process by RT-pPCR. The data were compared statistically and the significant differences considered presented p <0.05. The lesion was effective in causing tissue damage, and the activation of regulatory genes of the regeneration process besides inducing inflammation in WT. However, we observed that the animals with deletion for the adiponectin gene presented a myogenic response potentially similar to the control animals, however, the cellular response presents differences. We conclude that adiponectin deficiency does not compromise muscle regeneration, although there is a possible compromise of the pro-inflammatory response.

This study investigated the effect of bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) in a PEGylated fibrin gel (PEG) seeded into a decellularized extracellular matrix (ECM) on recovery of skeletal muscle following a volumetric muscle loss (VML) injury. Six to nine month old male Sprague-Dawley rats were used in this study. Approximately one-third of the skeletal muscle mass of the lateral gastrocnemius (LGAS) was removed from the LGAS, which was immediately replaced with an acellular ECM of the same dimensions. Seven days after injury, animals were injected with one of four solutions: saline (SAL), MSCs (MSC), PEGylated fibrin hydrogel (PEG), or MSCs in PEG (PEG+MSC). Maximal isometric tetanic tension (Po) of the LGAS was assessed fifty-six days after VML injury, followed by histological evaluation. VML injury resulted in a functional impairment of the LGAS capable of producing 76.1± 4.9% of the force generated in the non-injured contralateral LGAS. Tetanic tension of the PEG+MSC treated group was significantly higher compared to all other treatment groups (p < 0.05), although specific tension (N/cm2) in the PEG+MSC group (79.7±4.0%) was only significantly higher compared to SAL (58.2±3.0) and PEG (64.0±2.1%) treated groups (p < 0.05). However, LGAS mass was significantly higher in the PEG+MSC group compared to all other groups (p < 0.05). These findings suggest the combination of the PEG+MSC did not lead to a significant increase in muscle function compared to MSC treatment alone, and demonstrates the importance of MSCs in skeletal muscle regeneration in VML injury models. However, as evident by the significant increase in LGAS mass, PEG+MSC treatment may lead to histological differences not evaluated in this study. Gross morphology of the repaired gastrocnemius was indistinguishable from the contralateral control. / text

Ischemia/reperfusion (I/R) injury causes extensive damage to skeletal muscle, often resulting in prolonged functional deficits. This current study determines the efficacy of controlled release of SDF-1α and IGF-1 by conjugation to biodegradable, polyethylene glycol, (PEG)ylated fibrin gel matrix in skeletal muscle repair of an I/R injury. Male Sprague-Dawley rats underwent a 2-hour tourniquet induced I/R injury on their hind limbs. Twenty-four hours post injury the following treatments were administered: PEGylated fibrin gel (PEG-Fib), SDF-1 conjugated PEGylated fibrin gel (PEG-Fib/SDF-1), or dual protein IGF-1 and SDF-1 conjugated PEGylated fibrin gel (PEG-Fibrin/SDF-1/IGF-1. Following 14 days after injury, functional and histological evaluations were performed. There was no significant difference in maximum tetanic force production recovery between PEG-Fib and PEG-Fib/SDF-1 groups. However, PEG-Fib/SDF-1/IGF-1 group resulted in significant improvement of force production relative to the other treatment groups. The same results were found for specific tension. Histological analysis revealed a greater distribution of small myofibers in the PEG-Fib/SDF-1 group than the PEG-Fib group, while the PEG-Fib/SDF-1/IGF-1 group had the smallest distribution of small fibers and similar to controls (uninjured). There were also a greater number of centrally located nuclei in the PEG-Fib/SDF-1 group than the PEG-Fib group, while the PEG-Fib/SDF-1/IGF-1 group had similar values to controls. Although these results confirm the protective role of exogenous IGF-1, SDF-1 did not have an effect on skeletal muscle repair. / text

Orientador: Humberto Santo Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:08:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vomero_VivianeUrbini_D.pdf: 26340150 bytes, checksum: c1d13ac627e9a92ccb192b6270f0d38b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos. Dentre elas se destaca a B. jararacussu pela capacidade de inoculação de grande quantidade de veneno. O veneno desta espécie se caracteriza pela ação miotóxica, e esta ação causam importantes alterações locais, como a necrose das fibras musculares e conseqüentemente perda da massa muscular. No presente trabalho, estudamos os efeitos do deflazacort (glicocorticóide derivado da predinizona) e da L-Arginina (precursor do óxido nítrico) na regeneração das fibras musculares frente aos efeitos mionecróticos do veneno. Para tanto, utilizamos camundongos Swiss adultos jovens do sexo masculino. O músculo tibial anterior foi injetado com 80 µg do veneno bruto de B. jararacussu diluídos em 0,1 ml de solução fisiológica. Após as injeções dos venenos iniciaram-se a administração das drogas, com injeções intraperitoneais diárias de deflazacort na dosagem de 1,2 mg/kg por 5 e 20 dias. O segundo grupo recebeu a L-arginina junto à água de beber na concentração de 3,75 mg/ml desde o momento da injeção do veneno por 2 meses. O grupo controle foi composto por animais injetados com o veneno sem a realização de tratamento. A regeneração muscular foi avaliada no período de 2 meses e 5 dias através de cortes transversos do terço médio dos músculos, sendo corados com H&E e Tricrômico de Masson, para contagem da população total das fibras musculares e de células com núcleos centrais para análise da regeneração muscular. Quantificações da área muscular e da fibrose tecidual também foram realizadas. Identificou-se que com a L-Arginina ocorreu um aumento na regeneração muscular com a presença de maior número de fibras musculares regeneradas (2.230 ± 478) em relação ao animal injetado não tratado (1.005 ± 134). E no grupo tratado com Deflazacort observou-se um aumento da fibrose tecidual (1.077.051 ± 466.658,2; versus 777.107,3 ± 356.804,8 pixels quadrado) com número menor de fibras musculares (783,5 ± 134) em relação ao grupo não tratado. Desta forma, identificou-se o estímulo da regeneração muscular promovida pela L-arginina e o aumento da fibrose tecidual e diminuição da área muscular causado pela administração do antiinflamatório Deflazacort após o envenenamento pelo veneno bruto de B. jararacussu. / Abstract: The study evaluates the effect of deflazacort (DFZ), an anti-inflammatory oxalazine derivative of prednisone, on muscle regeneration following myonecrosis experimentally induced by B. jararacussu venom. Mice (n=15) right tibialis anterioris muscle was injected with 80 µg of venom. Two groups of animals (n=10) was treated during 5 and 20 days with a daily intraperitoneal injection of deflazacort, an anti-inflammatory oxalazine derivative of prednisone (1,2 mg/kg). The third group was injected with crude venom and did not receive any pharmacological treatment. The animals were killed 5 and 60 days after envenoming and muscle regeneration was evaluated by counting the number of muscle fibers and measuring the fibrosis area. We found that in deflazacort-treated group the area of fibrosis was higher (p< 0.05) than in injected muscles without treatment (1.077.051 ± 466.658,2; versus 777.107,3 ± 356.804,8 pixels square), and the number of muscle fiber was significant different too (755 ± 84; versus 1.221 ± 102). Although it does not reach the level of muscle fiber population of uninjured tibialis anterioris muscle (3.257 ± 478). We conclude that deflazacort treatment is detrimental to muscle fiber regeneration aggravating the loss of muscle mass after B. jararacussu envenoming. / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T14:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_Thalita_D.pdf: 12491560 bytes, checksum: ab548083ce9ee87e876b9cd018db9d32 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Venenos e toxinas de animais peçonhentos são importantes ferramentas farmacológicas para o estudo de fenômenos biológicos. Os venenos produzidos por insetos sociais da ordem Hymenoptera têm chamado a atenção de bioquímicos, imunologistas, farmacologistas e neurologistas, tanto do ponto de vista clínico como biotecnológico. Neste trabalho o mastoparano (MP) Polybia-MPII (INWLKLGKMVIDAL-NH2), do veneno da vespa Polybia paulista, serviu de ferramenta para avaliar se o peptídeo tem ação miotóxica e neurotóxica, bem como determinar a natureza dessa ação em biomembranas. A ação miotóxica foi avaliada pela análise morfológica ao microscópio de luz e eletrônico e morfometria durante as fases degenerativa (3 e 24 horas) e regenerativa (3, 7 e 21 dias) após a injeção intramuscular de 0,25 mg/ml do peptídeo. Com o objetivo de identificar os eventos celulares e moleculares que acompanham essas alterações nos diferentes períodos analisados, foi avaliada a expressão das citocinas pró-inflamatórias, o fator de necrose tumoral (TNF-a) e o interferon gama (IFN-g). Em geral, na avaliação da ação local de venenos e toxinas, tem sido dado ênfase à capacidade de induzir mionecrose e tem-se negligenciado a capacidade de induzir apoptose por parte dessas substâncias. No presente trabalho, através da técnica de TUNEL e da imunomarcação de caspases 3 e 9, foi analisado a capacidade do Polybia-MPII em promover morte celular programada por apoptose no músculo tibial anterior. A ação neurotóxica do Polybia-MPII foi avaliada por microscopia confocal e microscopia eletrônica de transmissão e consistiu em investigar a organização da inervação dos terminais em secções longitudinais através da marcação com alfa-bungarotoxina conjugada com tetrametilrodamina (TRITC-aBTX) ou com isotiocianato de fluoresceína (FITC-aBTX), e contra-imunomarcados com sinaptofisina (marcador específico para vesículas sinápticas) e neurofilamentos, e pela contagem de vesículas sinápticas nos terminais colinérgicos. Os resultados mostraram pela primeira vez que o mastoparano de P. paulista é um potente indutor de mionecrose e apoptose. A atividade miotóxica do peptídeo mostrou iniciar-se pela lise do sarcolema seguida por diferentes estados patológicos comprometendo a organização miofibrilar, seguida pela lise das miofibras e das miofibrilas, com preservação da lâmina basal. A indução de apoptose pelo peptídeo foi demonstrada morfologicamente pela técnica de TUNEL, presença de caspase 3 e 9 e pela severa alteração mitocondrial e alteração da cromatina dos núcleos observadas por microscopia eletrônica, as quais coincidiram com expressão aumentada de IFN-g e TNF-a, esta uma citocina que medeia a ativação de uma das via das caspases que leva à morte celular programada por apoptose. Com relação à atividade neurotóxica, os resultados mostraram que o Polybia-MPII possui ação pré-sináptica, devido à significativa diminuição no conteúdo de vesículas sinápticas nos terminais pré-sinápticos, corroborando com dados do nosso grupo que evidenciaram através de estudos eletrofisiológicos a mesma ação neurotóxica pré-sináptica causada pelo veneno bruto de P. paulista. Esses efeitos foram variáveis ao longo dos diferentes períodos analisados, mostrando que as alterações eram transitórias e que os fenômenos regenerativos permitiam o restabelecimento da morfologia original. Os estudos biofísicos feitos em membranas artificiais mostraram que o Polybia-MPII interage com a bicamada lipídica da membrana, provavelmente utilizando o triptofano como ancoragem através de um mecanismo conhecido como ¿carpet¿, desestabilizando o equilíbrio iônico e promovendo a ruptura da membrana. Os estudos biofísicos mostraram-se consistentes com as observações morfológicas ao microscópio de luz e eletrônico. Os dados permitem concluir que o mastoparano Polybia-MPII é um potente indutor de mionecrose em músculo esquelético e sua atividade neurotóxica periférica pode ser qualificada como moderada e pré-sináptica; além de induzir apoptose em fibra muscular, cujo significado precisa ser investigado. A reversibilidade dos efeitos causados pelo mastoparano está de acordo com os dados clínicos observados em acidentes com ferroadas de P. paulista em indivíduos não alérgicos, os quais se caracterizam na maioria por serem de pouca gravidade, curta duração e auto-limitantes / Abstract: Venoms and toxins of poisonous animals are important pharmacological tools to study biological phenomena. The venom of social insects as those produced by Hymenoptera get attention from biochemistries, immunologists, biologists, pharmacologists and neurologists, as in a clinic view as biotechnologically. In this study the mastoparan (MP) Polybia-MPII, (INWLKLGKMVIDAL-NH2) from Polybia paulista wasp venom, was used as a tool to analyze if the peptide has myotoxic and neurotoxic effects, as well to determine its action on biomembranes. The myotoxicity of the mastoparan was evaluated during the degenerative phase (3 and 24 hours) and regenerative phase (3, 7 and 21 days) after the intramuscular injection of 0.25 mg/ml of the peptide using light microscopy, transmission electron microscopy and morphometry. With the purpose of determining the cellular and molecular events accompanying the alterations caused by P. paulista wasp mastoparan in these time-points the expression of proinflammatory cytokines, such as the tumor necrosis factor alpha (TNF-a) and interferon gamma (IFN-g) were evaluated. In general, studies on the local effects of venom and toxins have focused on their myotoxic potential, whereas the potential to induce apoptosis has been neglected. In this work, the ability of Polybia-MPII in inducing cell death by apoptosis on the tibial anterior muscle was assessed by TUNEL technique and immunohistochemistry for caspase 3 and caspase 9. The neurotoxic action of Polybia-MPII was evaluated by examining the organization of terminals innervation in longitudinal sections labelled with tetramethylrhodamineconjugated- or isothiocyanate fluorescein-conjugated-alpha-bungarotoxin (TRITC or FITC a-BTX receptor, respectively) and counter labelled with a combination of antisynaptophysin (a specific marker to synaptic vesicles) and anti-neurofilament protein using confocal microscopy and transmission electron microscopy, and by counting the synaptic vesicle within the cholinergic terminals. The results showed for the first time that the Polybia-MPII is a potent inducer of myonecrosis and apoptosis. The myotoxic action of the peptide initiated with the lyses of the sarcolemma followed by the development of different pathologic stages affecting myofibrillar organization, and eventually myofibrils and myofibre lyses, but maintaining unaffected the basal lamina. The ability of the peptide to induce apoptosis was demonstrated by TUNEL technique, immunolabelling of caspase 3 and 9, severe mitochondrial damage and alteration of the structure of nuclei chromatin seen by electron microscopy. Such effects were positively correlated with increased IFN-g and TNF-a expression, being the last one a cytokine which mediates the caspase pathway leading to programmed cell death by apoptosis. Concerning Polybia-MPII neurotoxicity, the results showed a pre-synaptic action of the peptide which was inferred by a decrease in synaptic vesicles content of pre-synaptic terminals, in agreement with electrophysiological studies done by our group with the P. paulista crude venom. These alterations varied along the time intervals analyzed, evidencing that the alterations were transitory and the regenerative phenomena allow to morphological reestablishment. The biophysical studies performed on artificial membranes, showed that the peptide interacted with the lipid bilayer probably anchored by tryptophan and by a mechanism known as carpet. As a result, the ionic balance is impaired inducing membrane leakage. The biophysical data were consistent with the morphological observations by light and electron microscopy. Data allow concluding that Polybia-MPII mastoparan is a mighty inducer of myonecrosis whereas the peripheral neurotoxicity could be considered as moderate and pres-synaptic. Besides, the peptide has an apoptotic-inducing potential on skeletal muscle fibre, the meaning of which deserves further investigation. The reversibility of the mastoparan effects is in accordance with clinical data in non-allergic patients stung by P. paulista, whose outcome is considered of mild, short-lived and self-limiting in severity / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural