Os vetores retrovirais representam uma das melhores opções para transferência e terapia gênica, pois fornecem expressão do transgene em longo prazo. Entretanto, a inserção do provírus pode causar mutagênese insercional, induzindo proto-oncogenes. Eventos deste tipo têm sido descritos em protocolos clínicos para o tratamento de SCID-X1, doença granulomatosa crônica e talessemia beta, quando vetores retrovirais (oncorretrovirus) foram utilizados. Atualmente, existem poucos métodos simples e rápidos para revelar e quantificar a expansão clonal. Assim, descrevemos a construção uma biblioteca de vetores contendo uma marcação aleatória, denominada código de barras. O sequenciamento do código de barras permitirá revelar, caracterizar e até quantificar a expansão clonal de uma população de células transduzidas. Esta metodologia ajudará a testar novos arranjos de promotores e genes terapêuticos, para o desenvolvimento de vetores mais seguros contribuindo para a redução da probabilidade de um evento de proliferação clonal desencadeado pela mutagênese insercional. / Retroviral vectors represent one of the best options for gene transfer and therapy, where long-term transgene expression is required. However, insertion of the provirus can cause insertional mutagenesis, which may have adverse consequences, such as induction of proto-oncogenes. Such events have been described in clinical trials for the treatment of SCID-X1, chronic granulomatous disease and beta thalessemia with some retroviral vectors. Currently, there are few simple and quick methods that can reveal and quantify clonal expansion. Thus, we describe the construction of a vector library containing random markers, called \"barcodes\". The sequencing of the barcode could reveal, characterize and quantify the clonal expansion of a transduced cells population. This methodology will be valuable to test new arrangements of promoters and therapeutic genes, allowing the development of safer vectors, helping to reduce the probability of clonal proliferation events triggered by insertional mutagenesis.

A mutagênese química utilizando o agente mutagênico N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) seguida da observação do fenótipo deu origem a um mutante Anêmico. O tipo de herança é autossômica dominante, com morte intra útero dos mutantes homozigotos. O mapeamento genético foi feito utilizando-se marcadores microssatélites, sendo selecionados marcadores polimórficos entre as linhagens BALB/c e C57BL/6 envolvidas no mapeamento. Estabeleceu-se um painel de microssatélites distribuídos por todo o genoma do camundongo, que permitisse a localização do cromossomo portador da mutação. O gene mutante foi localizado no cromossomo 7 entre os marcadores D7Mit301 e D7Mit131 delimitando um intervalo entre 46,5cM e 51cM de 4,5cM. Através das análises fenotípicas do mutante Anêmico e estudo dos genes candidatos neste intervalo, foi selecionado o gene Hbb responsável pela síntese das globinas b-major e b-minor , sendo o gene que mais se identifica com as características do mutante, localizado a 50cM. A deficiência deste gene leva a uma das mais severas anemias humana, a b-Talassemia major. / Chemical mutagenesis, using the mutagenic agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), and followed by observation of the phenotype, originated in an Anaemic mutant. The inheritance-type is dominant auto-somic, with intra-uterus death of the homozygotic mutants. Genetic mapping was undertaken by means of micro-satellite markers, polymorphic markers being selected from among the BALB/c and C57BL/6 lineages involved in the mapping itself. A panel was established of the micro-satellites distributed throughout the whole mouse genome, thereby permitting localization of the mutation bearing chromosome. The mutant gene was located in chromosome 7 between markers D7Mit301 and D7Mit131, these delimiting an interval between 46,5cM and 51cM of 4,5cM. Selection of the Hbb gene responsible for synthesis of the b-major and b-minor globins came about through phenotypic analysis of the Anaemic mutant and a study of candidate genes within this interval, the selected gene being that which was most identified with the mutants characteristics and located at 50cM. A deficiency in this gene leads to one of the most severe forms of human anaemia, b-Talhassemia major.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:54:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdrianaPoncianoFernandes-dissertacao-completa-PDF.pdf: 757559 bytes, checksum: e6a59737e6f245fe2c768705d6b780ac (MD5) Previous issue date: 2008-10-13 / This study analyzed the effects of the hydroalcoholic extract of Pyrostegia venusta, popularly known as cipó-de-são-joão , on various types of Gram negative and Gram positive bacteria, and on yeasts. It also evaluated the effects of the extract on the growth and cell differentiation in Herpetomonas samuelpessoai in vitro , and the in vivo mutagenic effect by the micronucleus test. The antimicrobial activity of the extract was evaluated by two methods: agar diffusion test, and tube dilution test. The growth and cell differentiation of H. samuelpessoai occurred in chemically defined medium after incubation at 28°C, for 48 hours. Growth was calculated by cell count in a Neubauer chamber, and differentiation was measured by observing cells stained by the panoptic method to calculate the percentages of the pro-, para- and opistomastigote forms. To determine the LD 50, groups of female albino Swiss mice received a single oral dose of different extract concentrations (300 mg/kg and 2000 mg/kg). For mutagenic evaluation, Swiss albino mice, aged approximately12 weeks, were used. Each trial was carried out in five groups of animals, each group consisting of 3 males and 3 females: negative control (0.9% NaCl); positive control (50 mg/kg of ENU) treatments 1, 2 and 3 (1000, 1500 and 2000 mg/kg of extract, respectively). The micronucleus test in mouse bone marrow erythrocytes was done 24 and 28 hours after treatment. The polychromatic erythrocytes (PCEs) were observed through an optical microscope and counted with the help of a digital cell counter. The results showed that the hydroalcoholic extract of Pyrostegia venusta leaves at the concentrations of 72.6 mg/mL and 145.2 mg/mL had no antimicrobial activity on the 19 strains of bacteria and yeasts tested. With regard to LD50, the extract did not show median lethal dose at the concentrations of 300 mg/kg and 2000 mg/kg. The micronucleus test showed statistically significant differences in the number/percentage index of micronucleated PCEs between the positive control group (ENU 50mg/kg) and negative control (0.9% NaCl), and positive control and extract treatments. But these differences were not observed either between the negative controls and the extract-treated group, or between the sexes and times of treatment (24 hr-48hr), thus suggesting that the hydroalcoholic extract of P. venusta leaves does not exhibit either clastogenic or aneugenic potentials. / Este estudo teve por objetivos analisar os efeitos do extrato hidroalcoólico de Pyrostegia venusta, conhecida popularmente como cipó-de-são-joão, sobre diversos tipos de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e também sobre leveduras, além de analisar seu efeito no crescimento e diferenciação celular em Herpetomonas samuelpessoai in vitro e mutagênico in vivo , através do Teste do Micronúcleo. A atividade antimicrobiana do extrato foi verificada por dois métodos: teste de difusão em ágar e teste de diluição em tubo. Os experimentos de crescimento e diferenciação celular de H. samuelpessoai foram realizados em meio quimicamente definido, após incubação a 28 °C, por 48 horas, sendo o crescimento estimado pela contagem das células em câmara de Neubauer e a diferenciação pela observação das células coradas pelo método Panótico em microscopia óptica, objetivando estimar os percentuais de formas pró, para e opistomastigota. Para a determinação da DL 50 foram utilizados grupos de camundongos Swiss albinos fêmeas que receberam, por via oral, dose única de diferentes concentrações do extrato (300 e 2000 mg/Kg). Para a avaliação mutagênica foram utilizados camundongos Swiss albinos, com idade aproximada de 12 semanas. Cada ensaio foi realizado empregando-se cinco grupos de animais, cada grupo constituído por 3 machos e 3 fêmeas, sendo assim tratados: controle negativo (NaCl 0,9%); controle positivo (50 mg/kg ENU); tratamento 1, 2 e 3 (1000, 1500 e 2000mg/Kg do extrato, respectivamente). O teste do micronúcleo em eritrócitos da medula óssea de camundongos foi realizado 24 e 48 horas após o tratamento, e os eritrócitos policromáticos (PCEs) foram observados em microscopia óptica e contados com o auxílio de um contador de células digital. Os resultados evidenciaram que o extrato hidroalcoólico da folha de Pyrostegia venusta, nas concentrações testadas (72,6 mg/mL e 145,2 mg/mL), não possui atividade antimicrobiana para as dezenove cepas testadas de bactérias e fungos. No que se refere à DL50, o extrato não apresentou dose letal média nas concentrações testadas de 300mg/kg e 2000mg/kg. Ao teste de micronúcleo, os resultados revelaram diferenças estatísticas significativas do número/índice percentual de PCEs micronucleados entre o grupo de animais do controle positivo (ENU 50mg/Kg) e controle negativo (NaCl 0,9%), bem como controle positivo e tratamentos com o extrato. Entretanto, essas diferenças não foram observadas entre o grupo de animais do controle negativo e o grupo de animais tratados com o extrato e, ainda, entre os sexos e os tempos de tratamento (24-48h), sugerindo que o extrato hidroalcoólico de folhas de P. venusta não apresenta potencial clastogênico e/ou aneugênico.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:54:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdrianaPoncianoFernandes-dissertacao.pdf: 757676 bytes, checksum: 9e7b2d453d791c3e8b207f675e650f36 (MD5) Previous issue date: 2008-10-13 / This study analyzed the effects of the hydroalcoholic extract of Pyrostegia venusta, popularly known as cipó-de-são-joão , on various types of Gram negative and Gram positive bacteria, and on yeasts. It also evaluated the effects of the extract on the growth and cell differentiation in Herpetomonas samuelpessoai in vitro , and the in vivo mutagenic effect by the micronucleus test. The antimicrobial activity of the extract was evaluated by two methods: agar diffusion test, and tube dilution test. The growth and cell differentiation of H. samuelpessoai occurred in chemically defined medium after incubation at 28°C, for 48 hours. Growth was calculated by cell count in a Neubauer chamber, and differentiation was measured by observing cells stained by the panoptic method to calculate the percentages of the pro-, para- and opistomastigote forms. To determine the LD 50, groups of female albino Swiss mice received a single oral dose of different extract concentrations (300 mg/kg and 2000 mg/kg). For mutagenic evaluation, Swiss albino mice, aged approximately12 weeks, were used. Each trial was carried out in five groups of animals, each group consisting of 3 males and 3 females: negative control (0.9% NaCl); positive control (50 mg/kg of ENU) treatments 1, 2 and 3 (1000, 1500 and 2000 mg/kg of extract, respectively). The micronucleus test in mouse bone marrow erythrocytes was done 24 and 28 hours after treatment. The polychromatic erythrocytes (PCEs) were observed through an optical microscope and counted with the help of a digital cell counter. The results showed that the hydroalcoholic extract of Pyrostegia venusta leaves at the concentrations of 72.6 mg/mL and 145.2 mg/mL had no antimicrobial activity on the 19 strains of bacteria and yeasts tested. With regard to LD50, the extract did not show median lethal dose at the concentrations of 300 mg/kg and 2000 mg/kg. The micronucleus test showed statistically significant differences in the number/percentage index of micronucleated PCEs between the positive control group (ENU 50mg/kg) and negative control (0.9% NaCl), and positive control and extract treatments. But these differences were not observed either between the negative controls and the extract-treated group, or between the sexes and times of treatment (24 hr-48hr), thus suggesting that the hydroalcoholic extract of P. venusta leaves does not exhibit either clastogenic or aneugenic potentials. / Este estudo teve por objetivos analisar os efeitos do extrato hidroalcoólico de Pyrostegia venusta, conhecida popularmente como cipó-de-são-joão, sobre diversos tipos de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e também sobre leveduras, além de analisar seu efeito no crescimento e diferenciação celular em Herpetomonas samuelpessoai in vitro e mutagênico in vivo , através do Teste do Micronúcleo. A atividade antimicrobiana do extrato foi verificada por dois métodos: teste de difusão em ágar e teste de diluição em tubo. Os experimentos de crescimento e diferenciação celular de H. samuelpessoai foram realizados em meio quimicamente definido, após incubação a 28 °C, por 48 horas, sendo o crescimento estimado pela contagem das células em câmara de Neubauer e a diferenciação pela observação das células coradas pelo método Panótico em microscopia óptica, objetivando estimar os percentuais de formas pró, para e opistomastigota. Para a determinação da DL 50 foram utilizados grupos de camundongos Swiss albinos fêmeas que receberam, por via oral, dose única de diferentes concentrações do extrato (300 e 2000 mg/Kg). Para a avaliação mutagênica foram utilizados camundongos Swiss albinos, com idade aproximada de 12 semanas. Cada ensaio foi realizado empregando-se cinco grupos de animais, cada grupo constituído por 3 machos e 3 fêmeas, sendo assim tratados: controle negativo (NaCl 0,9%); controle positivo (50 mg/kg ENU); tratamento 1, 2 e 3 (1000, 1500 e 2000mg/Kg do extrato, respectivamente). O teste do micronúcleo em eritrócitos da medula óssea de camundongos foi realizado 24 e 48 horas após o tratamento, e os eritrócitos policromáticos (PCEs) foram observados em microscopia óptica e contados com o auxílio de um contador de células digital. Os resultados evidenciaram que o extrato hidroalcoólico da folha de Pyrostegia venusta, nas concentrações testadas (72,6 mg/mL e 145,2 mg/mL), não possui atividade antimicrobiana para as dezenove cepas testadas de bactérias e fungos. No que se refere à DL50, o extrato não apresentou dose letal média nas concentrações testadas de 300mg/kg e 2000mg/kg. Ao teste de micronúcleo, os resultados revelaram diferenças estatísticas significativas do número/índice percentual de PCEs micronucleados entre o grupo de animais do controle positivo (ENU 50mg/Kg) e controle negativo (NaCl 0,9%), bem como controle positivo e tratamentos com o extrato. 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Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T11:59:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GenotoxicidadeMercurialContribuicao.pdf: 831216 bytes, checksum: 3df12be6cc5c27a34dcbe4f212f47c61 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-18T13:02:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GenotoxicidadeMercurialContribuicao.pdf: 831216 bytes, checksum: 3df12be6cc5c27a34dcbe4f212f47c61 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T13:02:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GenotoxicidadeMercurialContribuicao.pdf: 831216 bytes, checksum: 3df12be6cc5c27a34dcbe4f212f47c61 (MD5) Previous issue date: 2008-06-05 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O mercúrio é uma importante fonte de poluição ambiental em diversas partes do mundo e especialmente na Amazônia. Atualmente, existem evidências de que a exposição crônica a concentrações relativamente baixas de mercúrio poderia estar iniciando processos genotóxicos (dano ao DNA) em humanos. Porém, foram realizados até agora poucos estudos epidemiológicos com populações amazônicas expostas que não incluíram uma comparação com uma população controle. O objetivo do presente estudo foi identificar a técnica mais adequada para analisar gentoxicidade mercurial em populações amazônicas e estabelecer os valores normais de genotoxicidade em uma população ribeirinha amazônica. Para a realização dos testes in vitro foram aplicadas e comparadas duas técnicas tradicionais de detecção de genotoxicidade (micronúcleos e aberrações cromossômicas). Culturas primárias de linfócitos sangüíneos de voluntários de Belém foram expostas a concentrações relativamente baixas de metilmercúrio (1-500μg/l ou 0,004-2 μM). O índice mitótico (proporção de células em metáfase) originado com a técnica de detecção de aberrações cromossômicas revelou-se como o parâmetro mais sensível à genotoxicidade mercurial. Após a identificação da técnica e o parâmetro mais sensível à genotoxicidade mercurial, essa técnica foi aplicada para estudar uma população ribeirinha amazônica que funcionasse como controle para os estudos de genotoxicidade mercurial que estão sendo feitos. Foi selecionada a população de Panacauera, e a média do índice mitótico encontrado nos indivíduos dessa população foi de 0.077 ± 0.045. Os valores de índice mitótico detectados apresentaram uma variabilidade que não esteve relacionada com a idade ou o sexo. Quando esses valores foram comparados com os valores de Brasília Legal (comunidade exposta ao metilmercúrio) registrados na literatura, foi verificado que para alguns grupos o índice mitótico de Brasília Legal foi inferior ao de Panacauera, o que indicaria uma inibição da progressão do ciclo celular e/ou uma perda da capacidade proliferativa causada pela intoxicação mercurial. Estes resultados apóiam a idéia de que o índice mitótico poderia servir como parâmetro essencial para o diagnóstico precoce do dano causado pela exposição mercurial e contribuem para o escasso conhecimento epidemiológico sobre as conseqüências que está tendo a exposição crônica de mercúrio nas populações da Amazônia. / Mercury is an important environmental pollutant for the world and, specially, for the Amazon. Presently, there are some evidences about chronic exposure to relatively low concentrations of mercury initiating genotoxic processes (DNA damage) in humans. However, to date, few epidemiological studies were carried out with Amazonian populations exposed to mercury, but no study included a population as a control to compare. The aim of this study was to identify the technique more adequate for analyzing mercury genotoxicity in Amazonian populations and to establish control values of genotoxicity in an Amazonian riverside population. To carry out in vitro tests, two traditional methods to detect genotoxicity (micronuclei and chromosomal aberrations) were applied and compared. Primary cultures of blood lymphocytes of volunteers from Belém, were exposed to relatively low concentrations of methylmercury (1-500μg/l or 0,004-2 μM). Mitotic index (proportion of cells in metaphase) originated with the method of detection of chromosomal aberrations was the parameter more sensitive to mercury genotoxicity. After identification of the method and the parameter more sensitive to mercury genotoxicity, this method was applied to study an Amazonian riverside population as a control for studies about mercury genotoxicity. Panacauera was selected as control population and mitotic index for this population was 0.077 ± 0.045. Detected values of mitotic index showed variability, not related to age or sex. When these values were compared to the values of Brasilia Legal (community exposed to methylmercury) registered in literature, mitotic index of Brasilia Legal for some groups was below mitotic index of Panacauera, pointing to an inhibition of the cell-cycle progression and/or loss of proliferative capacity due to mercury intoxication. These results support the idea that mitotic index may serve as an essential parameter for the early diagnosis of the damage provoked by mercury exposure, and they contribute to the epidemiological knowledge about the consequences of the chronic exposure with mercury in Amazonian populations.

O objetivo deste estudo foi aumentar o banco de dados em relação a resíduos (cake) e efluentes (licor) industriais e o seu nível de clastogenicidade. Este estudo contribuiu para mostrar: a) que o bioensaio com Tradescantia pallida foi sensível para a avaliação da clastogenicidade em mistura complexa de resíduos catalíticos industriais, nunca testados anteriormente. b) a tendência de uma dose resposta para ambos os resíduos catalíticos c)a pasta (cake) apresenta maior clastogenicidade que o licor nas concentrações estudadas. Provavelmente isto se deve a menor concentração de Ti e Al no licor do que no cake. / The aim of this study was to increase data concerning liquid effluent (liquor) and solid waste (cake) and their level of clastogenicity using TradMCN. This study contributed to show a) bioassay Trad-MCN with Tradescantia pallida was sensitive to evaluate the clastogenicity in a complex waste mixture, never tested before b) a tendency of a dose response for both catalytic wastes. c) higher clastogenicity of cake comparing to liquor effluent in concentrations evaluated. Probably this is due to the much lower Ti and Al concentrations in the liquor than in the cake

Submitted by JULIE ANNE ESPÍNDOLA AMORIM (julie__anne@hotmail.com) on 2018-06-05T18:33:56Z No. of bitstreams: 1 Tese_23-03-18-final_corrigida_05-06-2018_Juliecorrigidapdf.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-05T18:59:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 amorim_jae_dr_jabo.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-05T18:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amorim_jae_dr_jabo.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico tipo A, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XccA), é uma das doenças de citros mais importantes, afetando todas as cultivares comerciais, para a qual não existem ainda estratégias de controle eficientes. Os genes ntrB e ntrC codificam, respectivamente, a histidina quinase (HK) e o regulador de respostas (RR), pertencentes a um sistema de dois componentes (TCSs), que atuam no sistema regulador de nitrogênio (NTR). Porém, o possível papel desses genes na virulência da XccA e de outros fitopatógenos ainda não foi elucidado. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos dos genes ntrB e ntrC no desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo (Citrus limonia Osbeck), bem como a possível relação desses genes com a regulação da expressão de genes do sistema de secreção tipo 3 (SST3), considerado um dos principais fatores de virulência da XccA. Os mutantes ΔntrB e ΔntrC foram obtidos pela técnica de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia da polimerase de extensão por sobreposição. A mutação dos genes causou redução na sintomatologia do cancro cítrico e diminuição da população bacteriana no espaço intercelular do tecido foliar da planta. A análise das curvas de crescimento in vitro revelou que a ausência do gene ntrB não alterou a viabilidade da bactéria, enquanto a mutação do gene ntrC afetou o “fitness” bacteriano em meio de cultura NB. Análises in vitro indicaram que o mutante ΔntrC formou duas vezes mais biofilme e produziu cinco vezes mais goma xantana do que a XccA 306 in vitro. A expressão dos genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW e hrpD6) do SST3 avaliados foi significativamente maior (p < 0,05) no mutante ΔntrC do que na XccA 306 e no ΔntrB, indicando que ntrC possa atuar na regulação do SST3. Porém, o nível de expressão desses genes no mutante ΔntrB não apresentou diferença significativa (p > 0,05) em relação à XccA 306. A modelagem molecular revelou semelhança estrutural entre as regiões receptoras de NtrC e HrpG, sugerindo que a fosforilação de HrpG por NtrB possa ocorrer in vivo. Em síntese, os resultados obtidos neste estudo indicam que a mutação dos genes ntrB e ntrC afeta o desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo e que o gene ntrC pode atuar na regulação dos mecanismos de formação de biofilme, produção de goma xantana e expressão de genes do SST3 e/ou que a ausência desse gene ocasione um desequilíbrio celular na XccA 306, resultando na alteração desses mecanismos, enquanto NtrB pode apresentar papel na regulação de genes do SST3 por meio da fosforilação de HrpG. / The citrus canker type A, provoked by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XccA), is one of themost important citrus diseases, affecting all the commercial cultivars, for which there are no effective control strategies. The ntrB and ntrC genes encode a histidine kinase (HK) and the response regulator (RR), respectively, belong to a two-component system (TCSs), related to the nitrogen regulatory system (NTR). However, the possible role of ntrB and ntrC genes in the virulence of XccA and other phytopathogens has not yet been elucidated. Therefore, the aim of this study was to investigate the impact of the ntrB and ntrC genes on the development of citrus canker in rangpur lime (Citrus limonia Osbeck), as well as the possible relation of ntrB and ntrC genes with the regulation of the type 3 secretion system (T3SS) gene expression, which is considered one of the main virulence factors of XccA. The ΔntrB and ΔntrC were obtained by site-directed mutagenesis through overlap extension polymerase chain reaction. The mutation of the ntrB and ntrC genes caused a reduction of the citrus canker symptoms, and decrease of the bacterial population in the intracellular space of the foliar tissue of the plant. In vitro growth curves analysis revealed that the ΔntrB did not affect the viability of the bacterium, whereas the ΔntrC affected the bacterial fitness in NB culture medium. In vitro analysis indicated that the ΔntrC formed 2x more biofilm, and produced 5x xanthan gum compared to the XccA 306. The T3SS related genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW and hrpD6) expression was significantly higher (p <0.05) in the ΔntrC than in the XccA 306 and the ΔntrB, indicating that ntrC can modulate the regulation of T3SS. However, the level of expression of these genes in the ΔntrB did not differ (p> 0.05) in relation to the XccA 306. Molecular modeling revealed structural similarity between NtrC and HrpG receptors motifs, suggesting that phosphorylation of HrpG by NtrB may occur in vivo. Overall, the results obtained in this study strongly suggest that the mutation of the ntrB and ntrC genes affect the development of rangpur lime citrus canker and that ntrC gene may play an important role in the regulation of the mechanisms of biofilm formation, xanthan gum production and T3SS gene expression and/or that the absence of this gene causes a cellular imbalance in XccA 306 resulting in the alteration of these mechanism, whereas the NtrB may have a role with the regulation of T3SS genes by phosphorylation of HrpG. / 3385/2013

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-20Bitstream added on 2014-06-13T20:23:16Z : No. of bitstreams: 1 maschio_lr_dr_sjrp.pdf: 1208225 bytes, checksum: 581a26de1a4603e41d2d07020f15f18d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Devido às crescentes expansões demográficas e industriais observadas nas últimas décadas, o meio ambiente tem recebido uma carga significativamente crescente de efluentes domésticos, industriais e agrícolas, causando impactos severos nos ecossistemas e um potencial comprometimento à saúde humana. Dentre os efluentes domésticos, podemos citar uma gama de poluentes, tais como químicos de diversas categorias, além de contaminações por agentes biológicos diversos. Já os efluentes industriais contêm poluentes orgânicos e/ou inorgânicos, dependendo da atividade industrial. Baseando-se nestes dados, este trabalho teve como objetivo investigar, por meio de ensaios biológicos com dois organismos-teste, a possível presença de contaminantes com potencial citotóxico, genotóxico e mutagênico, que são despejados ao longo do rio Preto, inclusive na Represa Municipal de São José do Rio Preto. O material biológico utilizado neste estudo constituiu-se de sementes de Allium cepa (cebola) e peixes da espécie Oreochromis niloticus (Tilápia). Coletas de águas foram realizadas, sazonalmente, nos meses de agosto de 2006 e 2007 (estação seca) e março de 2007 e 2008 (estação chuvosa), em seis pontos distintos: Ponto 1 (P1), 8 km antes do represamento; Ponto 2 (P2), 1 km antes do represamento; Ponto 3 (P3), local de despejo do esgoto; Ponto 4 (P4), margem oposta do despejo do esgoto; Ponto 5 (P5), saída do represamento; Ponto 6 (P6), 1 km após o represamento. Análises químicas foram realizadas para todas as coletas realizadas. Para a realização do estudo, 100 sementes de Allium cepa foram submetidas à germinação, em placa de Petri, em amostras de águas coletadas nos seis diferentes pontos do rio Preto, em água ultra pura (controle negativo) e em uma substância reconhecidamente aneugênica (Trifluralina - controle positivo), sempre à temperatura ambiente... / Due to increasing population and industrial expansion observed in recent decades, the environment has received a significant increased burden of domestic industrial and agricultural sewerage, which can cause severe impacts on ecosystems, and a potential damage to human health as well. A wide range of harmful pollutants can be found in domestic effluent, such as chemicals from various categories, in addition to contamination by various biological agents. On the other hand, industrial effluents contain organic and / or inorganic pollutants, depending on industrial activity. Based on these data, this study aimed to investigate, by means of biological tests with two test-organism, the possible presence of contaminants with cytotoxic, genotoxic and mutagenic potential, which are dumped along the Preto river, an important river that flows in the region of Sao Jose do Rio Preto/SP. The biological material used in this study consisted of seeds of Allium cepa (onion) and one specie of fish (Tilapia: Oreochromis niloticus). Water samples were taken seasonally in August 2006 and 2007 (dry season) and March 2007, and 2008 (rainy season), in six distinct sites: Site 1 (S1), 8 km before the damming, Site 2 (S2), 1 km before the damming, Site 3 (S3), place of sewerage discharge; Site 4 (S4), opposite margin of sewage discharge, Site 5 (S5), end of the damming; Site 6 (S6) 1 km after damming. Chemical analyses were performed for all collected samples. For the study, 100 seeds of A. cepa were submitted to germination in Petri dishes with samples water from six different sites of the Preto river, Ultra pure water (negative control), and with an aneugenic substance (Trifluralin - positive control). For most of collection points and periods studied, root meristems cells of A. cepa, exposed to water samples collected along the Preto river, showed no significant differences... (Complete abstract click electronic access below)

O objetivo deste estudo foi aumentar o banco de dados em relação a resíduos (cake) e efluentes (licor) industriais e o seu nível de clastogenicidade. Este estudo contribuiu para mostrar: a) que o bioensaio com Tradescantia pallida foi sensível para a avaliação da clastogenicidade em mistura complexa de resíduos catalíticos industriais, nunca testados anteriormente. b) a tendência de uma dose resposta para ambos os resíduos catalíticos c)a pasta (cake) apresenta maior clastogenicidade que o licor nas concentrações estudadas. Provavelmente isto se deve a menor concentração de Ti e Al no licor do que no cake. / The aim of this study was to increase data concerning liquid effluent (liquor) and solid waste (cake) and their level of clastogenicity using TradMCN. This study contributed to show a) bioassay Trad-MCN with Tradescantia pallida was sensitive to evaluate the clastogenicity in a complex waste mixture, never tested before b) a tendency of a dose response for both catalytic wastes. c) higher clastogenicity of cake comparing to liquor effluent in concentrations evaluated. Probably this is due to the much lower Ti and Al concentrations in the liquor than in the cake

Mapeamento dos subsítios de &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas &#945;-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da &#945;-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da &#945;-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da &#945;-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As &#945;-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da &#945;-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The &#945;-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri &#945;-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the &#945;-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic &#945;-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced &#945;-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of &#945;-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.