Les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) représentent un groupe hétérogène d’hémopathies malignes, caractérisées par une accumulation de progéniteurs myéloïdes indifférenciés. Cette accumulation proviendrait de l’existence de cellules souches leucémiques responsables de la résistance aux traitements et de la rechute de la maladie. Les Cellules Souches Leucémiques (CSL) se comportent comme les cellules souches embryonnaires, lesquelles expriment des marqueurs embryonnaires leur procurant des capacités de prolifération, d’autorenouvellement et d’absence de différenciation. Plusieurs études ont démontré le rôle des marqueurs embryonnaires (OCT4, NANOG, SOX2, SSEA1 et SSEA3) dans la cancérogénèse mais peu de données concernent les LAM. Dans le but d’identifier le rôle fonctionnel des marqueurs embryonnaires dans la LAM, une évaluation de leur expression dans les compartiments CD34+ de cellules souches hématopoïétiques et leucémiques a été réalisée. Leur sur-expression et leur implication dans les propriétés des cellules leucémiques (notamment OCT4), nous laisse penser que ces antigènes embryonnaires peuvent être utilisés comme marqueurs discriminants de la maladie résiduelle mais aussi comme cible thérapeutique potentielle. Cependant, les mécanismes de leucémogénèse par lesquels les antigènes embryonnaires seraient impliqués restent encore à être élucidés / Acute Myeloid Leukemias (AMLs) represent a heterogeneous group of malignant haemopathies, characterized by an accumulation of undifferentiated myeloid progenitors. This accumulation comes from the presence of Leukemic Stem Cells (LSCs) responsible for the resistance to treatment and relapse of the disease. LSCs behave as embryonic stem cells, which express embryonic markers giving them proliferation, self-renewal and lack of differentiation. Several studies have demonstrated the role of embryonic markers (OCT4, NANOG, SOX2, SSEA1 and SSEA3) in carcinogenesis, but there is few data in AML. In order to identify the functional role of the embryonic markers in AML, an evaluation of their expression in haematopoietic and leukemic stem cells CD34+ compartments was carried out. Their overexpression and involvement in the properties of leukemic cells (especially OCT4), suggest that these embryonic antigens can be used as discriminating markers of residual disease as well as a potential therapeutic target. However, the mechanisms of leukemogenesis by which embryonic antigens are involved remain to be elucidated

BMI1 est une protéine appartenant à la famille des polycombs impliquée dans la régulation épigénétique de la transcription. Il a été montré que cette protéine est essentielle à la régulation de la prolifération, de la sénescence et du métabolisme ainsi qu’à l’auto-Renouvellement des cellules souches hématopoïétiques et cancéreuses. Ce répresseur transcriptionnel au fort potentiel oncogénique est retrouvé surexprimé dans de nombreux types de cancer ; dans le cas de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) le niveau d’expression de BMI1 augmente avec l’aggravation de la pathologie. Cependant, les voies de signalisation impliquées dans sa surexpression et le rôle qu’il joue au sein de cette maladie demeurent méconnus. En réprimant l’expression de BMI1 par ARN interférence nous avons pu mettre en évidence que ce polycomb était essentiel à la prolifération cellulaire ainsi qu’au potentiel clonogénique des cellules de LMC. Nous avons également démontré pour la première fois que BMI1 soutenait la croissance tumorale à travers la répression d’un processus autophagique délétère pour la cellule cancéreuse. Une approche transcriptomique nous a permis d’identifier la cible transcriptionnelle impliquée dans ce processus, la Cycline G2. Nous avons, pour finir, trouvé une molécule, via une approche bioinformatique, capable de réinduire l’expression de la Cycline G2 dans les cellules de LMC, l’alexidine dihydrochloride. Cette molécule induit une forte autophagie dans les cellules cancéreuses ainsi que de l’apoptose. Elle s’est également montrée capable de resensibiliser à l’imatinib (un inhibiteur de BCR-ABL) une lignée pourtant résistante. / The polycomb protein Bmi1 is a major epigenetic regulator. It has been shown that this protein is essential for the regulation of cell proliferation, senescence and metabolism but also self-Renewal of hematopoïetic and cancer stem cells. This transcriptional repressor, with a strong oncogenic potential, is overexpressed in many types of cancer. In case of Chronic Myeloid Leukemia (CML) the expression level of BMI1 is associated with worsening prognosis. However, the signaling pathways involved in its overexpression and its role in this disease remains unclear. By using RNAi to repress BMI1 expression we highlighted that this polycomb was essential for proliferation and clonogenicity of CML cells. We also demonstrated, for the first time, that BMI1 supported tumor growth through repression of deleterious cancer cell autophagy. A transcriptomic approach allowed us to identify a transcriptional target involved in this process: the Cyclin G2. Through a bioinformatic approach, we finally found a molecule capable of expression re-Induction of Cyclin G2 in CML cells : alexidine dihydrochloride. This molecule induced a high level of autophagy as well as apopotosis in cancer cells. It had also been able to re-Sensitize to imatinib a resistant cell line. In conclusion, our results revealed a new role for the polycomb BMI1 in supporting the CML pathology. Moreover, our work allowed the identification of two new approaches for therapeutically targeting this oncogene functions.

Ces travaux de thèse ont porté sur le développement de formulations innovantes et nanoparticulaire, destinées à améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémie aigüe myéloïdes (LAM). Cette amélioration de la qualité de vie peut passer par le développement d’une formulation orale de décitabine.Trois stratégies de formulations différentes ont été développées : deux formulations de nanocapsules lipides (LNCs) avec encapsulation ou de décitabine, ou d’une prodrogue de décitabine (décitabine(C12)2) . La troisième stratégie a été le développement de particules de type liposomal, dans lesquelles la décitabine a été encapsulée. Après avoir été caractérisée sur des critères physicochimiques, chacune des stratégies basées sur les LNCs a été évaluée par des essais in vitro pour évaluer la perméabilité intestinale de la décitabine lorsqu’elle a été encapsulée. Une des stratégies a permis d’accroitre la perméabilité, in vitro, de la décitabine. L’activité sur la prolifération cellulaire a ensuite été évaluée sur des cellules humaines de LAM. Il a été démontré que l’encapsulation dans les LNCs améliore l’activité de la décitabine et de la décitabine (C12)2. Après l’ensemble de ces essais, en vue d’évaluer le potentiel avantages de ces formulations pour augmenter la demi-vie plasmatique de la décitabine, leurs stabilités dans du plasma humain a été évaluée. La décitabine (C12)2 libre et encapsulée permettent de limiter la dégradation rapide de la décitabine. Finalement, une étude de pharmacocinétique a été mise en place. L’encapsulation de la décitabine, en synthétisant au préalable une prodrogue permet d’augmenter les concentrations maximales atteintes. / The aim of this phD work was to develop nanoparticle formulations to improve patients’quality of life in case of acute myeloid leukemia (AML). These formulations could, for example, allow an oral administration of decitabine. Three different formulations were developed: two were based on lipid nanocapsules (LNCs) with an encapsulation of decitabine or a decitabine prodrug (decitabine(C12)2). The third strategy was aliposomal formulation with a decitabine encapsulation. After being characterized on physico-chemical parameters, in vitro intestinal permeability studies were performed on LNCs strategies. One strategy was able to enhance decitabine permeability. Cell proliferation studies performed on human AMLcell lines showed that encapsulations into LNCs improve decitabine and decitabine(C12)2 activities. In order to evaluate the potential of these formulations to enhance decitabine plasma half-life, their stabilities in human plasma were then assayed. Free decitabine(C12)2 or encapsulated into LNCs has been shown to limit the rapid decitabine degradation. Finally, pharmacokinetic studies were performed. Decitabine encapsulation into LNCs with a previous decitabine prodrug synthesis was able to increase maximal plasma concentrations.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une transformation maligne d'une cellule souche hématopoïétique, caractérisée par une anomalie génétique acquise : le chromosome Philadelphie (Ph), résultant de la translocation réciproque t(9 ;22)(q34 ;q11), et son équivalent moléculaire, l'oncogène BCR-ABL. La protéine BCR-ABL présente une activité tyrosine kinase constitutive qui agit sur les voies de survie et de prolifération. La progression de la maladie vers la phase accélérée puis blastique s'accompagne d'anomalies génétiques additionnelles marqueurs d'une instabilité génomique croissante. La responsabilité de BCR-ABL dans la genèse de cette instabilité génomique est fortement suspectée. Dérivé de 2-phénylamino-pyrimidines, l'Imatinib inhibe l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL ainsi que la prolifération de lignées cellulaires BCR-ABL positives et induit leur apoptose. Les échecs du traitement par l'Imatinib sont dus à des mécanismes de résistance qui ne sont pas tous entièrement caractérisés. Des nouveaux inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs) ou des associations avec l'Imatinib ont été développés afin de la surmonter. Cependant, une résistance croisée et multiple demeure difficile à traiter et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes de résistance afin d'éradiquer la maladie dans un avenir proche. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont montré que la présence de microremaniements génétiques (traduisant une instabilité) au sein de progéniteurs leucémiques CD34+ de patients traités par l'Imatinib corrélait avec la perte de réponse à l'Imatinib chez les patients diagnostiqués en phase chronique, suggérant que la résistance à l'Imatinib pourrait être corrélée aux altérations génétiques survenant précocement dans la physiopathologie de la maladie. 113 gènes affectés ont été détectés dont certains sont localisés dans des régions connues pour être hypervariables (CNV) suggérant un rôle de ces régions dans le développement de la LMC ou la résistance à l'Imatinib. Nous avons mis en évidence la présence d'une anomalie acquise récurrente dans telle région localisée en 8p23.1 qui groupe les gènes de la famille de la Défensine B. Ce microremaniement n'est pas lié à la résistance à l'Imatinib car il est retrouvé dans les populations cellulaires CD34+ Ph+ et Ph-, il peut donc être considéré comme un marqueur de l'instabilité d'une sous-population cellulaire clonale de CD34+ présentant une grande prédisposition à acquérir des altérations génétiques additionnelles, comme la fusion BCR-ABL. Nos études montrent que des altérations secondaires pourraient être le support d'une résistance à l'Imatinib. La résistance à l'Imatinib peut alors être liée à la dérégulation des voies de signalisation en amont ou en aval de BCR-ABL, affectant ainsi la prolifération, la survie, la différenciation et l'intégrité du génome. Il semble donc que le traitement par l'Imatinib seul ne soit pas suffisant pour éradiquer la maladie. Pour cette raison, de nouvelles molécules à associer avec l'Imatinib sont actuellement en cours d'évaluation. Parmi ces associations, les inhibiteurs de la voie Ras ont montré une certaine efficacité dans la restauration de l'activité proapoptotique de l'Imatinib. Il était donc intéressant de chercher une cible thérapeutique régulant négativement cette voie afin de surmonter cette résistance. GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) inhibe la voie Ras/Raf par une interaction directe. Il inhibe également la voie NFκB dont certains antagonistes sont capables de surmonter la résistance à l'Imatinib. Nos résultats montrent, pour la première fois, que l'expression de GILZ est diminuée dans des lignées humaines ou murines exprimant BCR-ABL sensibles ou résistantes aux ITKs ainsi que dans les cellules dormantes résiduelles isolées d'un modèle cellulaire murin développé au laboratoire. L'expression forcée de GILZ dans ces lignées résistantes restaure la sensibilité à l'Imatinib. Nos résultats montrent que le mécanisme passe par une inhibition de la voie mTORC2/Akt Ser473. Elle est due à une interaction directe de GILZ avec mTORC2 permettant l'activation de FoxO3a et l'induction de l'expression de la protéine proapoptotique Bim. Dans ce système, GILZ augmente l'expression de Bim tandis qu'Imatinib, par ses effets "Off-target", diminue celle de Mcl-1 inversant ainsi le rapport des membres antiapoptotiques/proapoptotiques de la famille Bcl-2 et entrainant l'apoptose. Le traitement séquentiel par les glucocorticoïdes puis l'Imatinib induit l'apoptose de cellules souches de patients résistants par le même mécanisme, suggérant que la modulation de l'expression de GILZ pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour cibler les cellules leucémiques résistantes ou résiduelles. La régulation de la voie mTORC2/Akt Ser473 semble être d'une importance cruciale dans la survie des cellules BCR-ABL+, ainsi que dans la résistance aux ITKs. Parmi les gènes méthylés dans notre étude, on retrouve un gène impliqué dans la régulation de cette voie et qui code pour la phosphatase PHLPP (PH domain and Leucine rich repeat Protein Phosphatase) dont l'activité est de déphosphoryler la sérine 473 d'Akt favorisant son inactivation. Nos résultats montrent que la réexpression du variant 1 de cette phosphatase (PHLPP1) dans notre modèle murin de résistance restaure la sensibilité à l'Imatinib et que la répression de celui-ci n'est pas exclusivement due à l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL, mais aussi à des modifications épigénétiques. Nos études ont permis d'identifier des gènes impliqués dans la résistance des LMC aux ITKs et de proposer de nouveaux traitements pour surmonter cette résistance en inhibant la voie Akt Ser473

La leucémie myéloïde aigue (LMA), cancer du sang causé par une prolifération excessive des précurseurs myéloïdes à un stade précoce de maturation, est associée à une survie variant entre 20 et 30% à cinq ans en dépit des traitements de chimiothérapie les plus intensifs. L’antigène CD33 est exprimé chez les cellules malignes dans 90% des LMA ce qui en fait une cible de choix pour le développement d’immunoconjugué (IC). Trois IC composés d’un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la maytansine, une toxine s’attaquant aux fuseaux mitotiques, ont été créés. Nous avons étudié l’effet de ces IC sur des cellules primaires et des lignées cellulaires LMA et étudier les mécanismes pouvant expliquer différents niveaux de sensibilité. Les études effectuées ont permis de déterminer que le niveau d’expression du CD33 n’explique pas la variation de sensibilité face aux IC. Il a été démontré que les IC anti-CD33 sont internalisés rapidement par la cellule et que le conjugué est retrouvé au niveau de l’endosome en premier lieu. Il a été confirmé que le lysosome est essentiel à l’effet anti-mitotique induit par le conjugué. Aussi, il est proposé que la protéine SOCS3 pourrait jouer un rôle dans la résistance aux IC anti-CD33 en dirigeant le complexe IC-CD33-SOCS3 vers le protéasome et ainsi empêcher la libération du composé toxique par le lysosome. Nous avons aussi conclu que les variations d’agent de liaison et l’augmentation du nombre de molécules toxiques entre les 3 IC n’ont pas été suffisantes pour augmenter leur efficacité à éliminer les cellules LMA. L’évaluation de ces IC ainsi que l’identification des mécanismes de résistance permettra de cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier de ce type de traitement et potentiellement d’identifier de nouvelles voies pour améliorer l’efficacité des traitements. / Acute myeloid leukemia (AML), a cancer where hematopoietic precursors are arrested in an early stage of development, is associated with a poor survival rate of 20 to 30% over five years, despite intensive chemotherapy treatments. In approximately 90% of AML cases the malignant cells express CD33 antigen, which makes it a target of choice for development of immunotoxin based therapy. Three immunoconjugates (IC) composed of anti-CD33 monoclonal antibody coupled with maytansine derivative, which prevent tubulin polymerization and thus formation of mitotic spindle, were designed. These three IC were tested for their activity against several AML cell lines and primary AML patient cells and we investigate mechanisms responsible for variation in sensitivity to IC treatment. In this report, we show that differences in number of CD33 molecules on AML cell surface does not explain the observed differences in IC sensitivity. We demonstrate that binding of huMy9-6 antibody to CD33 induces rapid internalization and that it is first process through endosome. We confirm that lysosomal processing is essential for the antimitotic effect induced by IC treatment. Also, we provide evidence that SOCS3 protein may play a role in resistance of AML cells to anti-CD33 therapy by directing IC-CD33-SOCS3 complex to the proteasome and therefore affecting lysosomal decoupling of IC-CD33 and intracellular release of maytansine derivatives. Finally, the linkers and maytansine derivative modifications were not sufficient to increase sufficiently the efficacy of conjugates to eliminate higher numbers of AML cells. The identification of mechanisms responsible for increased resistance of AML cell lines and primary AMLs may allow us to identify IC responsive AML cells and also identify strategies to improve the efficacy of IC treatment.

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) dérivent de progéniteurs hématopoïétiques dans lesquels se sont accumulés des événements génétiques conduisant à leur transformation. En établissant la hiérarchie clonale de multiples lésions récurrentes, nous démontrons que les événements impliquant les régulateurs de l'épigénétique sont les premiers événements dans le clone. A l'inverse, les mutations régulant la prolifération se produisent tardivement. Les événements précoces sont quasi constamment détectables en rémission complète. Les clones qui persistent servent de réservoir pour les rechutes, avec une variation qui augmente avec la durée de la rémission. Après xénogreffe, les échantillons de patients porteurs de lésions épigénétiques sont capables de repopulation hématopoïétique, ce qui est la signature fonctionnelle des événements pré-leucémiques. Cette hiérarchie est observée chez la majorité des patients. Cependant dans 1/3 des cas, il n'est pas retrouvé d'événement épigénétique, et on observe notamment des prédispositions germinales aux LAM, ou des mutations acquises de TP53. Chez 3 patients avec des LAM de novo, les mutations de TP53 sont associées à des mutations de DNMT3A dans un même clone. Cela suggère que les mutations de DNMT3A et de TP53 sont complémentaires pour obtenir une dominance clonale pré leucémique. En conclusion, dans la majorité des LAM, des hiérarchie clonales récurrentes, initiées par des lésions pré-leucémiques variées vont promouvoir l'expansion ou la variation clonale, jusqu'à l'émergence de la maladie. Ces données sont essentielles pour le développement de nouvelles stratégies personnalisées de suivi de la maladie résiduelle. / Acute myeloid leukaemia (AML) emerge from haematopoietic stem/progenitor cells that acquiregenomic or chromosomal aberrations, some being considered as pre-leukemic lesions. Here, byestablishing the chronological hierarchy of multiple driver lesions in AML, we show that most eventsaffecting epigenetic regulators - DNMT3A, TET2, ASXL1 mutations, as well as MLL and chromosome20q rearrangements - are the first lesions in the clone. In contrast to late mutations involving signallingpathways such as FLT3 or RAS, these early lesions are frequently detectable in complete remissionsample. By studying late relapses, we show that persistent clones behave as long-term relapsereservoirs, and variegate increasingly with delay to relapse. Cells from patients with early epigeneticdefects can repopulate bone marrow of xenotransplanted NOD/SCID/IL-2Rgc-null (NSG) mice withleukemic or non leukemic engraftment, a functional signature of pre-leukemic events. This genetichierarchy is observed in most patients but in one third of them lesions in epigenetic regulators are notthe first events. Some of these patients have genetic predisposition, or somatic mutations in TP53. Inthree de novo AMLs, but not in three secondary or therapy-related AMLs, these TP53 mutations wereaccompanied by DNMT3A mutations in a unique clone. This suggests that DNMT3A mutations maycomplement TP53 mutations to generate a dominant pre-leukemic clone. We conclude that in mostAMLs recurrent genetic hierarchies, initiated by distinct pre-leukemic lesions, promote progressiveclonal expansion or variegation, leading to the development of a full blown disease. These data areessential for the development of new personalised strategies for MRD evaluation.

La Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) est une maladie clonale caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie codant pour Bcr-Abl, une tyrosine kinase constitutivement active responsable de la leucémogenèse. Bien que très efficaces, les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) restent cependant inactifs sur les cellules souches leucémiques. Ce travail de thèse montre que la signalisation calcique, connue pour réguler de nombreux processus dans les cellules saines et cancéreuses, est importante dans la signalisation cellulaire au décours de la LMC. Le rôle des entrées calciques dépendantes des stocks (SOCEs) médiées par STIM1 (STromal Interaction Molecule 1) et les canaux Orai1 et TRPC1 ainsi que des entrées calciques induites par la thrombine a été étudié dans la leucémogenèse. Nous avons observé une diminution de ces entrées dans les cellules exprimant Bcr-Abl pouvant être expliquée par le changement de stœchiométrie Orai1/STIM1. Ceci entraîne la diminution de l'activation de NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) ainsi que des conséquences sur la prolifération et la migration cellulaire mais pas sur l'apoptose. De plus, les SOCEs sont restaurées dans les cellules cancéreuses après traitement à l'Imatinib, le principal ITK. Nous proposons alors que l'expression de Bcr-Abl joue un rôle sur l'homéostasie calcique en entraînant une dérégulation générale des fonctions cellulaires dans les cellules leucémiques notamment via la voie PKC (Protein Kinase C). Ainsi, ces résultats montrent une dérégulation des entrées calciques dans les cellules exprimant Bcr-Abl, suggérant que la signalisation calcique puisse être une cible thérapeutique en parallèle avec les ITKs. / Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal disease characterized by the presence of the Philadelphia chromosome encoding for Bcr-Abl, a constitutively active tyrosine kinase responsible for leukemogenesis. Although Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have revolutionized the therapy of Ph+ leukemia, the complete eradication of CML is limited by the emergence of resistance in hematopoietic stem cells. This thesis proposes that calcium (Ca2+) signaling pathways, known to govern a large number of functions in normal and cancer cells, may be important in CML cell signaling. Therefore, we studied the role of Store Operated-Calcium entry (SOCE) (i.e. STromal Interaction Molecule 1 (STIM1), Orai1 and TRPC1 channels) and thrombin induced Ca2+ entry in leukemogenesis. We found a decrease in both calcium entries in Bcr-Abl-expressing cells compared to normal cells. The reduced SOCE seems related to a change in stoichiometry of Orai1/STIM1. This leads to a reduction of the Nuclear Factor of Activated T-cells (NFAT) translocation and functional consequences on cell proliferation and migration but not on apoptosis. Moreover, we showed that SOCE is restored in malignant cells after treatment with Imatinib, the main TKI. We proposed that Bcr-Abl expression could impact on Ca2+ homeostasis enhancing a general disorganization of cell functions in leukemia cells notably via Protein Kinase C (PKC) pathway. Altogether this work shows a deregulation of Ca2+ entry in Bcr-Abl-expressing cells, suggesting that the Ca2+ signaling pathway could be a therapeutic target in parallel with TKIs.

La technologie iPSC (induced pluripotent stem cells) permet l’obtention d’une source cellulaire illimitée pour la modélisation et la thérapie de maladies génétiques, la médecine régénérative, l’étude pharmacologique et récemment la modélisation et l’étude du cancer. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est la pathologie modèle du concept de « cellule souche cancéreuse » : des cellules souches LMC (CS-LMC) s’avèrent résistantes aux inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK), traitement conventionnel de ce syndrome myéloprolifératif. Elles sont responsables de la persistance d’une maladie résiduelle et de rechutes lors de l’interruption du traitement. Malheureusement, leur isolement est difficile. Nous proposons dans ce travail de modéliser les CS-LMC par les iPSC LMC. Nous montrons pour la première fois dans les iPSC LMC que BCR-ABL1 réprime l’expression des facteurs clés de la pluripotence (OCT4,NANOG, le cluster miR302-367) via les kinases ERK1/2. Les ITK, en bloquant l’activité deBCR-ABL1, entraîne une hausse des niveaux d’expression de ces marqueurs. L’effet « prosouche» des ITK, découvert dans les iPSC LMC, est également observé lors du traitement de CS-LMC primaires. L’agent thérapeutique pourrait ainsi, en maintenant ou renforçant le compartiment LMC immature, participer paradoxalement à la persistance de la maladie résiduelle. Étonnamment, les ITK augmentent également l’expression des marqueurs« souches » dans les iPSC et CS hématopoïétiques normales. Ce résultat suggère un effet« pro-souche » généralisé à plusieurs types cellulaires. / IPSC (induced pluripotent stem cells) offer renewable source of biologically relevant human cells for genetic diseases modelling and therapy, regenerative medicine, pharmacological study and, recently, cancer research. The proof of « cancer stem cell concept » was established in chronic myeloid leukemia (CML) : CML stem cells (CML-SC) are resistant to treatment (tyrosine kinase inhibitors (TKI)). They are involved in residual disease persistence and relapse when treatment is discontinued in the majority of patients. We modelled CML-SC with CML iPSC. We showed, for the first time, that BCR-ABL1 acts as a repressor of key stemness markers (OCT4, NANOG, miR302-367 cluster) via ERK1/2 in human CML iPSC. By blocking BCR–ABL1 activity, TKI increase pluripotency gene expression. Interestingly, a similar pro-stemness effect was observed during CML-SC treatment. By inducing a more primitive stemness phenotype, TKI could promote residual disease and relapse. Interestingly, an increase of stemness gene expression was also observed during TKI treatment of healthy cells (iPSC and hematopoietic stem cells). These data suggest a global TKI pro-stemness effect in other stem cell types.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) avec dysplasie, identifiées par la classification OMS 2008 sous le nom de LAM-MRC (« AML with myelodysplasia-related changes »), sont actuellement définies par la présence de critères cliniques, cytologiques et cytogénétiques. Elles forment un groupe hétérogène tant sur le plan biologique que pronostique. Nous avons fait l'hypothèse que la caractérisation moléculaire des LAM-MRC pourrait permettre d'identifier des marqueurs spécifiques associés à ces pathologies et d'en distinguer différents sous-groupes. Nous avons mis en évidence que les LAM-MRC de risque cytogénétique intermédiaire présentent un profil mutationnel spécifique caractérisé par un taux élevé de mutation d'ASXL1 et une faible proportion de mutations de DNMT3A, NPM1 et FLT3. Les LAM-MRC de risque cytogénétique défavorable, essentiellement complexes et/ou monosomales, sont quant à elle associées aux mutations de TP53. Alors que les critères actuels des LAM-MRC ne permettent pas d'en stratifier le pronostic, nous avons montré que les mutations d'ASXL1 ou de TP53 sont des facteurs pronostics péjoratifs majeurs. Ainsi, une reclassification basée sur la présence de ces altérations moléculaires exclusives entre elles permettrait d'affiner le diagnostic et la stratification pronostique de ces maladies. Enfin, dans une stratégie de médecine personnalisée combinant le séquençage à haut débit à des tests de sensibilité thérapeutique in vitro, l'identification de tels marqueurs moléculaires permettraient de prédire la réponse aux traitements, de guider les choix thérapeutiques et d'orienter le développement de nouvelles drogues. / Acute myeloid leukemia (AML) with myelodysplasia-related changes (AML-MRC) as reported in the WHO 2008 classification are defined by the presence of clinical, morphological and cytogenetic criteria. AML-MRCs are heterogeneous diseases with prognostic heterogeneity. We hypothesized that molecular characterization of AML-MRC could identify specific molecular markers and disease subgroups. We showed that AML-MRCs with intermediate cytogenetic risk harbor a specific mutational profile characterized by a high frequency of ASXL1 mutations and a low incidence of DNMT3A, NPM1 and FLT3 mutations. Unfavorable cytogenetic risk AML-MRCs, especially due to complex and/or monosomal karyotypes, are associated with TP53 mutations. While WHO criteria do not stratify the prognosis of AML-MRC patients, we showed that the mutations of ASXL1 or TP53 are major poor prognostic factors. The criteria defining AML-MRC do not identify distinct clinical and biological subgroups and do not predict outcome of patients with AML-MRC. In contrast, ASXL1 and TP53-mutated AML identify two distinct biological subgroups of AML-MRC with very poor outcome. This molecular characterization could be useful to redefine AML-MRC in a future classification aiming at merging biological characterization and specific prognostic value. Finally, we showed that a personalized treatment approach combining next generation sequencing and in vitro drug screening could be useful to predict therapeutic response and to guide both treatment choices and new targeted drug developments.

La sous-famille BTN3A comprend 3 isoformes : BTN3A1, A2 et A3. Le domaine intracellulaire B30.2 de BTN3A1 est impliqué dans la reconnaissance du Phosphoantigène (Pag) et l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2(LTVγ9Vδ2). BTN3A2, dépourvue de B30.2, pourrait être un récepteur-leurre. L’anticorps monoclonal (Acm) 20.1 reconnaît les trois isoformes de BTN3A et sensibilise les tumeurs à la lyse par les LTVγ9Vδ2, mimant l’action des Biphosphonates (N-BP). Nous avons étudié l’expression, la régulation et le ciblage de BTN3A en contexte d’hémopathie maligne et de tumeur solide. Nous avons montré que BTN3A2 est l’isoforme majoritairement exprimée par les blastes de Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) primaire. Cependant, l’Acm 20.1 sensibilise les blastes de LAM primaire à la lyse par les LT Vγ9Vδ2, même ceux résistants aux N-BP. Cet effet est confirmé dans des souris NOD-SCID-γcKO xénogreffées avec la lignée U937 ou des blastes primaires. Nous avons ensuite montré l’expression de BTN3A sur des lignées et des tumeurs pancréatiques primaires et observé qu’elle est associée au pronostic chez les patients atteints de cancer du pancréas. L’expression de BTN3A2, isoforme majoritairement exprimée augmente en contexte de stress cellulaire hypoxique et métabolique. La faible expression de BTN3A1 comparativement à BTN3A2 et le clivage des BTN3A pourraient favoriser l’échappement tumoral à la reconnaissance par les LT Vγ9Vδ2. Cependant, les LT Vγ9Vδ2 ont des fonctions cytolytiques préservées en hypoxie. Le ciblage de BTN3A par l’Acm 20.1 sur les tumeurs étudiées, en restaurant la lyse par les LT Vγ9Vδ2, offrirait des perspectives thérapeutiques notamment pour les tumeurs chimiorésistantes. / BTN3A subfamily comprises three isoforms: BTN3A1, A2 and A3. The B30.2 intracellular domain of BTN3A1is involved in Phosphoantigen recognition and Vγ9Vδ2 T cells activation. BTN3A2, devoid of B30.2 domain, could be « a decoy receptor ». The agonist anti-BTN3A monoclonal Antibody (mAb) 20.1 recognizes the three BTN3A isoforms and sensitizes tumors to Vγ9Vδ2 T cell lysis. This mAb mimics the effect of Aminobisphosphonates (N-BP). We studied BTN3A expression, regulation and targeting in tumors of hematological and solid origin. We showed that primary Acute Myeloïd Leukemia (AML) blasts express BTN3A with a main expression of BTN3A2. However, the 20.1 mAb sensitizes primary AML blasts to Vγ9Vδ2 T cell lysis even N-BP-poorly sensitive blasts. This was confirmed in NOD-SCID-γc KO mice xenografted with U937 human cell line or primary blasts. Next, we have demonstrated BTN3A expression in pancreatic cell lines and primary tumors. We observed that BTN3A is associated to prognosis in patients with pancreatic cancer. BTN3A2 is the most highly expressed isoform and its level of expression increases upon hypoxic and metabolic cellular stress. The weak expression of BTN3A1 compared to BTN3A2 isoform together with BTN3A molecules shedding could constitute an immune escape mechanism of tumor cells from Vγ9Vδ2 T cells recognition. Though, Vγ9Vδ2 T cells have preserved cytotoxic functions under hypoxic condition. BTN3A targeting with anti-BTN3A 20.1 mAb on the tumors we studied would open new therapeutic perspectives notably in chemoresistant tumors, thanks to the restoration of Vγ9Vδ2 T cell lysis.