Ulm, Univ., Diss., 2008.

Regulated cell death (RCD) is indispensable for homeostasis and plays a crucial role in the pathophysiology of numerous diseases. Adrenocortical carcinomas (ACCs) represent a rare and highly malignant type of cancer. Currently, the most common therapeutic options include the complete surgical removal of the adrenal gland and/or the administration of mitotane, a derivative of the pesticide DDT. Yet patient survival remains poor and the mechanism of action of mitotane remains elusive. In this thesis it is demonstrated that the human ACC cell line NCI-H295R is sensitive to mitotane-induced cell death. In the first part, the involvement of three different RCD pathways, namely apoptosis, necroptosis and ferroptosis, in mitotane induced necrosis was investigated. To this end, different inhibitors were used, which were not able to block mitotane-induced cell death. When the medium was supplemented with insulin, transferrin, sodium selenite and linoleic acid (ITS+1) no cell death of the ACC cells was observed. This phenomenon was attributed to the presence of linoleic acid, since ITS supplementation lacking this component was not able to reverse mitotane-induced necrosis. Identification of new drug targets for alternative options of ACC treatment led to the investigation of key molecules involved in the pathways of necroptosis and ferroptosis. The receptor-interacting protein kinase 1 and 3 (RIPK1 and 3) and the mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) were considered as interesting targets given their crucial role in the execution of necroptosis. A western blot analysis of those molecules revealed the presence only of RIPK1, suggesting that the necroptosis machinery is not present in the NCI-H295R cells. Of interest, evaluation of the expression levels of glutathione peroxidase four (GPX4), one of the main inhibitory molecules of ferroptosis, showed a much higher expression in the ACC cells compared to the standard cell line used for studying ferroptosis, the human fibrosarcoma HT1080 cells. A hypothesis that the NCI-H295R cells are susceptible to ferroptosis induction was formed based on this finding. Compounds representative of all the four classes of ferroptosis inducers (FINs) were tested. Direct inhibition of GPX4 using the small compound RSL3, a type II FIN, led to high necrotic populations. Co-treatment with the ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 (Fer-1) completely reversed RSL3-induced ferroptosis. Type IV FIN FINO2, that causes indirect loss of the enzymatic activity of GPX4, lead also to high necrotic populations, while Fer-1 prevented FINO2-induced ferroptosis. Data from public databases concerning gene methylation or mutation status of ACC tissues and normal human adrenal tissues was used to investigate potential key players of ferroptosis that might be either mutated or silenced in ACCs. Of note, glutathione peroxidases 3 and 5 (GPX3 and 5) were highly methylated, while the enzyme cystathionine gamma-lyase (CSE) involved in the transsulfuration pathway via the break down of cystathionine into cysteine and α-ketobutyrate and ammonia was found to be highly mutated. Collectively, these data point towards a high sensitivity of ACCs to ferroptosis induction. This could provide a new chapter for the therapeutic approaches of ACCs. Additionally, these findings provide a better understanding of the biology of this type of cancer that highly mutates or silences ferroptosis-related genes. The second part of this thesis focuses on the involvement of RCD in spontaneous cell death in isolated murine tubules. Existing literature points towards an involvement of necroptosis and ferroptosis pathways in the kidney in models of acute kidney injury (AKI). Acute tubular necrosis (ATN) represents a hallmark of AKI. While the work in the Linkermann lab has shown that isolated tubules perfused with type I FIN erastin undergo cell death in a “wave-of-death” manner, no deeper insights into the propagation of tubular necrotic injury exist. A protocol for isolation of murine kidney tubules was established, providing an ex-vivo model for investigation of tubular death. The absence of potentially confounding blood cells as well as immune cells was ensured by extensive washing steps as well as the use of collagenase. Visual observation and staining of isolated tubules with the nucleic acid stain SYTOX green revealed a spontaneous cell death in a “wave-of-death” manner. This wave was running in parallel with a calcium concentration change, indicating its involvement in the spontaneous necrosis. To investigate the potential involvement of mitochondria in this process, electron microscopy images were obtained from parts of the tubules with different levels of damage which revealed highly damaged and ballooned mitochondria. These data provided with a phenotypic characterisation of the spontaneous tubular necrosis. Aiming to approach this type of death genetically, necroptosis and pyroptosis deficient mice (MLKL/GSDMDDKO) were used. Comparison of the LDH release, used as a measure of necrosis, from isolated kidney tubules of the MLKL/GSDMDDKO mice and wild type (WT) mice showed no difference. This indicated that neither necroptosis nor pyroptosis are involved in the tubular necrosis. Therefore, the next step was to investigate the effects of Fer-1 at the levels of LDH of isolated tubules from WT mice. A significantly lower LDH release was observed in tubules treated with Fer-1 compared to the ones treated with vehicle. However, this reduction in the LDH release was not complete, suggesting that ferroptosis is only partially responsible for the spontaneous death of isolated tubules. The difference of male and female mice towards AKI sensitivity has been noted in the literature in that female mice are less susceptible compared to the male mice. Therefore, the next step was to investigate whether this protection of females can be observed at the level of isolated tubules. Indeed, the LDH release from tubules isolated from female mice was significantly less compared to the LDH release of tubules isolated from male mice. Based on the data obtained from isolated tubules from WT male mice treated with Fer-1, a similar experiment was performed with tubules isolated from WT female mice. No difference in the LDH release was observed between the Fer-1-treated tubules and the vehicle-treated ones, indicating that another cell death pathway might be involved. The most obvious difference between male and female organisms is the sex hormones. Whether testosterone or β-estradiol are responsible for the higher susceptibility or protection against cell death has been a debate over the last years. To test this hypothesis, three different cell lines were utilised. A pre-treatment of 16 h with either testosterone or β-estradiol was performed. Treatment with either type I FIN erastin or type II FIN RSL3 followed, and cells were analysed via flow cytometry. Data revealed protective effects of β-estradiol against ferroptosis induction. Next, the effects of β-estradiol in a simultaneous treatment with RSL3 were investigated. Interestingly the protective effects of the hormone were still observed. Among the metabolites of β-estradiol, 2-hydroxyestradiol (2-OHE2) has been reported to exert antioxidant effects. Therefore, 2-OHE2 was used in a simultaneous treatment with RSL3, and the obtained data showed that it was a much more potent inhibitor of necrotic cell death than β-estradiol even at lower concentrations. Collectively these data indicate that the lower susceptibility of female organisms towards cell death might be explained by the presence of β-estradiol and its more potent antioxidant metabolites. Such findings could change the way the two sexes are approached scientifically, while providing new insights on different therapeutic strategies between male and female organisms.

Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) wird in der Herzchirurgie zur Korrektur komplexer angeborener Herzfehler angewendet. In den letzten Jahren zeigte sich eine Abnahme der Morbidität und Mortalität nach kardiochirurgischen Eingriffen. Es entstanden aber gleichzeitig Bedenken über eine Beeinträchtigung der neurologischen Funktion und psychomotorischen Entwicklung der operierten Kinder. Wir untersuchten das morphologische Schädigungsmuster im Gehirn nach extrakorporaler Zirkulation mit Kreislaufstillstand in tiefer Hypothermie (KSTH) in einem neonatalen Tiermodell. Zusätzlich evaluierten wir morphologisch den Einfluss einer neuroprotektiven Vorbehandlung mit systemischer und intrathekaler Applikation von Methylprednisolon (MP). Material und Methoden: 24 neugeborenen Ferkeln mit einem Alter unter 1 Woche (Gewicht: 2,1 ± 0,5 kg KG) wurden mittels eines cardiopulmonalen Bypass(CPB) bei 15 °C rektaler Körpertemperatur einem totalen Kreislaufstillstand (KSTH) von 120 Minuten ausgesetzt. Nach Reperfusion wurden die Tiere vom CPB entwöhnt und für 6 Std. überwacht. Eine Gruppe ohne Intervention mit 12 Tieren diente als Kontrollgruppe, bei 7 Tieren wurde eine systemische und bei 5 Tieren eine intrathekale Methylprednisolongabe (Urbason) präoperativ durchgeführt. Das Gehirn wurde nach Fixierung regional histologisch und immunhistochemisch untersucht. Die nekrotischen und apoptotischen Neurone wurden quantitativ in Hippocampus, Kortex, Stammganglien und Kleinhirn erfasst. Molekulargenetische Untersuchungen erfolgten im frontalen Kortex und es wurde die Genexpression mittels "Real-time PCR" für das Hitze-Schock-Protein 70 kD (HSP 70) und die apoptotischen Gene Bak, FAS und Bcl-xL erfasst. Ergebnisse: Das Schädigungsmuster nach KSTH von 120 Minuten bestand aus Nekrose der Neuronen mit einem Fokus in Hippocampus, Kleinhirn und Kortex. Zusätzlich kam es im Gyrus dentatus zum Auftreten apoptotischer Neuronenveränderungen, wobei durch die MP-Vorbehandlung die Anzahl apoptotischer Neurone zunahm. Unter der systemischen Steroidbehandlung kam es zu einer signifikanten Hyperglykämie. Molekulargenetisch zeigten sich bei systemischer Steroidvorbehandlung eine Induktion pro-apoptotischer Gene. Nach intrathekaler Steroidgabe war das Verhältniss zugunsten der anti-apoptotischen Gene signifikant verändert. Die Expression des HSP-70 war nur in der intrathekalen Gruppe signifikant erhöht und scheint im Zusammenhang mit einer geringeren neuronalen Zellschädigung zu stehen. Schlussfolgerung: Eine systemische Vorbehandlung mit MP zeigte keinen neuroprotektiven Effekt, im Gegenteil kam es zu einer Zunahme nekrotischer und apoptotischer neuronaler Zellveränderungen. Bei intrathekaler Applikation des MP und Umgehung der Blut-Hirn-Schranke kam es zu einer signifikanten Reduktion der nekrotischen Zellveränderungen im Sinne einer neuroprotektiven Wirkung. Die routinemäßige Applikation von Steroiden in der Kinderherzchirurgie sollte aufgrund dieser Ergebnisse kritisch überdacht werden. / We evaluated the mode of neuronal cell injury and the possible neuroprotective effect of pretreatment with high dose steroids in a neonatal piglet model with CPB and 120 minutes deep hypothermic circulatory arrest (DHCA). Methods: 24 neonatal piglets (age < 10 days and 2,1 ± 0,5 kg BW) were included in this study. Three groups were formed, one group without any additional pharmacological treatment (n=12) served as control group, two groups with a high dose methylprednisolone (MP) pretreatment, where 30 mg / kg/ BW MP (Urbason) was administered either systemically preoperatively (n=7), or intrathecally 4-6 hours preoperatively (n=5). All animals were anaesthetized, intubated and mechanically ventilated. After median sternotomy the animals were connected to CPB by cannulation of the aorta and right atrium. Full flow CPB (200 ml/kg/min) was initiated to achieve homogeneous systemic cooling. Circulatory arrest for 120 min. was induced when rectal temperature of 15°C was achieved. After rewarmed reperfusion and establishment of stable cardiac ejection the animals were weaned from CPB and monitored for 6-8 hours. Thereafter the animals were sacrificed and the brain was immediately removed, cut in standardized sections and fixated and frozen for further histological and immunohistochemical studies. Neuronal cells were counted in cerebral cortex, basal ganglia, hippocampal region and cerebellum in respect to apoptotic and hypoxic-necrotic neuronal cell changes in each animal. Real-time PCR was performed from frozen brain sections for analysis of expression of heat-shock-protein 70kD (HSP 70), FAS, Bak and Bcl-xl. Results: The main preliminary findings of this neonatal ischemic brain model were the quantitative evaluation of cell injury including perivascular astroglial cells and necrotic and apoptotic neuronal cell changes. The systemic application of high dose methylprednisolone lead only to a slight reduction of edema, but it produced a significant hyperglycemia and aggravation of neuronal necrosis. Intrathecal MP was effective in reducing neuronal necrosis without appearance of hyperglycemia. Application of steroids lead to an induction of neuronal apoptosis in the hippocampus. Increased pro-apoptotic gene expression were detected with steroid pretreatment. Increased expression of HSP 70 may reflect reduction in neuronal cell death. Conclusion: Systemic pretreatment with methylprednisolone seems not to be effective for neuroprotective goal during cardiac surgery with DHCA. In contrast intrathecal steroid treatment could reduce neuronal cell death significant. The pronounced apoptotic neuronal cell changes, which were seen after steroid pretreatment, raises concern with regard to the routine use of methylprednisolone during pediatric cardiac surgery.

Die Haut ist das größte Organ des Menschen und bildet die Barriere gegenüber Einwirkungen aus der Umwelt. Die Störung der Hautbarriere durch exogene und endogene Reize führt zu einer Entzündungsreaktion in der Haut. In der Folge können Hauterkrankungen wie die irritative oder Atopische Dermatitis entstehen. Der Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) ist ein pleiotrop wirksames Zytokin, das eine zentrale Rolle bei entzündlichen Prozessen spielt. Ziel der vorgelegten Promotionsarbeit war zu untersuchen, ob und wie TNF-α zu Entzündungsgeschehen, ausgelöst durch exogene und endogene Faktoren, beiträgt. Die Bedeutung von TNF-α wurde in TNF-ko Mäusen in verschiedenen Hautmodellen untersucht. Für das Irritationsmodell wurden chemische und physikalische Reize verwendet. TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) wurde durch die verschiedenen Stimuli signifikant induziert. Diese Induktion war unabhängig von der endogenen TNF-α Produktion, gezeigt durch den Einsatz von TNF- ko Mäusen . Da endogenes TNF-α für die Hautirritation keine notwendige Bedingung darstellte, wurde die Bedeutung von TNF-α bei der atopischen Dermatitis (AD) untersucht. TNF-α defiziente Mäuse zeigen verstärkt Ekzeme im Vergleich zu Wildtyp Mäusen. Die Behandlung von TNF-ko Mäusen mit einem TSLP Antikörper führte zu einer Verminderung des Ekzems. Mastzellen wurden vermehrt in läsionaler Haut gefunden und korrelierten mit dem Schweregrad des atopischen Ekzems sowie der TSLP-Expression. / The skin is the largest organ of an individuum and builds the barrier for a host against the environment. Skin barrier disruption by exogenous or endogenous stimuli can lead to skin inflammation. As a consequence, irritant or atopic eczema, frequent skin diseases, may evolve. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is a pleiotropic cytokine which plays a central role in inflammatory processes. The main aim of this thesis was to clarify whether and how endogenous TNF-α is contributing to skin inflammation driven by exogenous and endogenous triggers. The role of endogenous TNF-α was studied using TNF knockout (-/-) mice. In an irritation model, chemical and physical stimuli were applied on to mouse skin. Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) was significantly induced by the used irritants. This TSLP induction was independent from endogenous TNF-α proven by using TNF-/- mice. Next the role of TNF-α in atopic dermatitis (AD) promoting an allergic skin inflammation was investigated. TNF-/- mice developed more severe AD compared to the wildtype mice and TSLP was significantly increased and correlated with the severity of the eczema. To prove the pathophysiological role of TSLP for AD progression, TNF-/- mice were pretreated with an TSLP antibody. Indeed, these mice developed less AD symptoms compared to the control mice. Mast cells (MCs) were also significantly increased in lesional skin in the AD model and moreover, correlated with AD severity, but also with TSLP expression.

Der Transkriptionsfaktor hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) trägt zur Expression von adaptiven Genen unter hypoxischen Bedingungen bei. Zusätzlich wurde vermutet, dass HIF-1 eine Rolle in der Regulation des späten neuronalen Zelltodes spielt. Suspensionszellen und adhärenten PC12-Zellen mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) behandelt, wurden als ein experimentelles Modell für die Untersuchung der Beziehung zwischen Hypoxie induziertem Zelltod und Aktivität von HIF-1 herangezogen. Zelltod wurde durchflusszytometrisch mit einer Doppelfärbung (Annexin V und Propidium-Jodid) der Zellen und durch eine Analyse der allgemeinen Zelltodparameter wie LDH und die mitochondriale Dehydrogenase bestimmt. Parallel wurden Zellen mit einem Kontrollvektor und einem hypoxiesensitiven Vektor mit drei Hypoxie-bindenden-Elementen (HBE) transfiziert und die durch HIF-1 aktivierte Luciferase gemessen. Hypoxieexposition der NGF-behandelten PC12-Zellen resultierte in einer höheren Zelltodrate verglichen mit den unbehandelten Kontrollzellen. PC12 Zellen, zwei Tage mit NGF behandelt, zeigten eine bis zu 10-fach verminderte HIF-1-Aktivität. Diese Verminderung könnte zu dem erhöhten hypoxie-induzierten Zelltod durch verminderte Expression von HIF-1alpha-regulierten Genen, welche für die Anpassung an Hypoxie verantwortlich sind, beitragen. Die Verminderung der HIF-1 Aktivität und der Anstieg der Hypoxiesensitivität könnte darauf hinweisen, dass NGF als eine Art hierarchisch organisiertes Signalmolekül fungiert. / The transcription factor hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) strongly contributes to the expression of adaptive genes under hypoxic conditions. In addition, HIF-1 has been implicated in the regulation of delayed neuronal cell death. Suspension-grown and adherent PC12 cells treated with NGF were used as an experimental model for studying the relationship between hypoxia-induced cell death and activation of HIF-1. Cell damage was assessed by flow cytometry of double-stained (annexin V and propidiumiodide) cells, and by analysis of the overall death parameters LDH and mitochondrial dehydrogenase. In parallel, cells were transfected with a control and a three-hypoxia-responsive-elements (HRE)-containing vector and HIF-1-driven luciferase activity was determined. Exposure of NGF-treated PC12 cells to hypoxia resulted in a higher cell death rate when compared to untreated controls. PC12 cells exposed for 2 days to NGF exhibited a decrease of HIF-1 activity up to a factor of ten. This decrease may contribute to the enhanced hypoxia-induced cell death via reduced expression of HIF-1alpha-regulated genes resposible for adaptation to hypoxia, like those for glucose transport proteins and enzymes of the glycolytic chain. The decrease in HIF-1 activity and the increase in hypoxia sensitivity may suggest that NGF act as an hierachically organized signaling molecule.

In this work, the influence of the second messenger cAMP on the functional plasticity of M-DC8+ dendritic cells (DC) was examined. The marker M-DC8 defines a population of native DC first described in blood. After their isolation, M-DC8+ DC acquire a mature CD83+ phenotype during a short culture ex vivo. After a challenge with LPS and IFN-g, M-DC8+ DC secrete large amounts of the proinflammatory cytokines IL-12(p70) and TNF-a surpassing by far other DC populations and monocytes. Due to their preferential induction of TH1-dominated T cell responses, M-DC8+ DC might play a role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Different cAMP-elevating agents suppressed the proinflammatory cytokine production and enhanced the secretion of anti-inflammatory IL-10. Activity of phosphodiesterase (PDE) 4, the most important cAMP-hydrolysing enzyme in immune cells, was detected and RT-PCR revealed the expression of PDE4 subtypes 4A, 4B and 4D in M-DC8+ DC, whereas 4C was not detectable. The PDE4-specific inhibitors AWD12-281 and Roflumilast were then used to elevate cAMP concentrations. These substances have been proven to be efficient in anti-inflammatory therapies. In the presence of PDE4 inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12 and TNF-a was decreased by 90 % and 60 %, respectively, whereas the IL-10-release was doubled. These effects were only observed, if the PDE4 inhibitors where present from the beginning of the culture. The inhibition of the IL-12 secretion was reverted using an a-IL-10-receptor antibody. PDE4 inhibitor-treated M-DC8+ DC showed a reduced capacity to polarize TH1-cells, which was demonstrated analysing culture supernatants by ELISA and by single-cell analysis detecting intracellular IFN-g und IL-4. These results suggest that PDE4 inhibitors may not only be useful in the therapy of TH2-mediated diseases but also in TH1-dominated indications such as multiple sclerosis and Crohn´s disease. Despite the shift of the cytokine profile, the in vitro maturation of M-DC8+ DC was not affected by PDE4 inhibitors. The expression of CD83, CD80, CD86, MHC-molecules as well as CD54 and CD58, was assessed by FACS analysis. Correspondingly, in the presence of AWD12-281, M-DC8+ DC efficiently stimulated the proliferation of allogeneic CD4+CD45RA+ T-cells. In the second part of this study, the effects of an inhibition of cAMP-synthesis in M-DC8+ DC were analyzed. Two adenylyl cyclase (AC) inhibitors, 2,5-Dideoxyadenosine and SQ22536, clearly hampered the in vitro maturation of M-DC8+ DC. The expression of the DC maturation marker CD83 could be reconstituted using the stable cAMP-analogon 8-Br-cAMP. Measuring the intracellular cAMP concentration in M-DC8+ DC, initially low cAMP-levels were observed, but within 30 min the concentration raised and returned to original levels within 2 hrs. Blocking the cAMP synthesis by AC inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12, TNF-a and IL-10 was strongly reduced. Furthermore, it was demonstrated that M-DC8+ DC can only release IL-12 after a transient elevation of cAMP, i.e. they acquire a &amp;quot;license&amp;quot;. Such a regulation of the IL-12 production has not been described before. Protein kinase A is an important effector molecule of cAMP. Inhibiting its activity resulted in a reduced expression of the DC maturation marker CD83 and a lower cytokine production underlining the importance of cAMP-signalling for the activation of M-DC8+ DC. In conclusion, this study provides evidence for a new concept of the immune-regulatory function of cAMP. Here, cAMP is essentially involved in the initial activation and maturation of DC and enables them to secrete large amounts of IL-12 and TNF-a upon stimulation with a TLR ligand. Conversely, a long-term elevation of cAMP-concentrations inhibits the proinflammatory effector functions of M-DC8+ DC and can induce anti-inflammatory responses by enhancing the secretion of IL-10. / In dieser Arbeit wurde der Einfluss des second messengers cAMP auf die funktionelle Plastizität von M-DC8+ dendritischen Zellen (DC) untersucht. Der Oberflächenmarker M-DC8 definiert eine zunächst im Blut beschriebene Population nativer DC. Nach ihrer Isolation erlangen M-DC8+ DC während einer kurzen Kultur einen maturen CD83+ Phänotyp. Nach Stimulation mit LPS und IFN-g produzieren native M-DC8+ DC deutlich höhere Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12(p70) und TNF-a als andere DC-Populationen oder Monozyten. Dies resultiert in einer Programmierung TH1-dominierter T-Zellantworten. M-DC8+ DC könnten daher an der Pathogenese entzündlicher Krankheiten beteiligt sein. Unterschiedliche cAMP-erhöhende Substanzen supprimierten die proinflammatorische Zytokinproduktion und verstärkten gleichzeitig die Sekretion des anti-inflammatorischen IL-10. In M-DC8+ DC konnte die Aktivität von Phosphodiesterase (PDE) 4, dem wichtigsten cAMP-hydrolysierenden Enzym in Immunzellen, nachgewiesen werden. Durch RT-PCR wurde die Expression der PDE4-Subtypen 4A, 4B und 4D gezeigt, nicht aber 4C. Zur Erhöhung der cAMP-Konzentration wurden dann die PDE4-spezifischen Inhibitoren AWD12-281 und Roflumilast eingesetzt, deren klinische Effizienz bei anti-inflammatorischen Therapien belegt ist. Auch diese Substanzen verringerten die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12 und TNF-a durch M-DC8+ DC um 90 % bzw. 60 %, während die IL-10-Freisetzung etwa verdoppelt wurde. Diese starken Effekte konnten nur erzielt werden, wenn die PDE4-Inhibitoren von Beginn der Kultur an eingesetzt wurden. Die Hemmung der IL-12-Sekretion wurde in Gegenwart eines a-IL-10-Rezeptor-Antikörpers aufgehoben. Unter dem Einfluss von PDE4-Inhibitoren war die TH1-Programmierung durch M-DC8+ DC deutlich reduziert, was sowohl durch die Analyse der Zellüberstände mittels ELISA als auch auf Einzelzell-Ebene durch intrazelluläre Detektion von IFN-g und IL-4 nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PDE4-Inhibitoren nicht nur für TH2-vermittelte Erkrankungen sondern auch für TH1-dominierte Indikationen wie Multiple Sklerose oder Morbus Crohn von Nutzen sein könnten. Trotz der starken Modulation des Zytokinprofils blieb die in vitro-Ausreifung M-DC8+ DC unbeeinflusst von PDE4-Inhibitoren. Untersucht wurde die Expression von CD83, CD80, CD86, MHC-Molekülen, CD54 und CD58 mittels FACS-Analyse. Entsprechend induzierten M-DC8+ DC auch in Anwesenheit von AWD12-281 die Proliferation allogener CD4+CD45RA+ T-Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Blockade der cAMP-Synthese auf M-DC8+ DC auswirkt. Zwei Adenylatcyclase-Inhibitoren, 2,5-Dideoxyadenosine und SQ22536, hemmten die in vitro-Maturation von M-DC8+ DC deutlich. Die CD83-Expression wurde mit 8-Br-cAMP rekonstituiert. Messungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in unbehandelten M-DC8+ DC zeigten initial niedrige cAMP-Spiegel, die innerhalb von 30 min anstiegen und nach 2 h wieder auf das Ausgangsniveau abfielen. Die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12, TNF-a und IL-10 wurde durch AC-Inhibitoren deutlich vermindert. M-DC8+ DC erhalten nur nach einer transienten cAMP-Erhöhung die &amp;quot;Lizenz&amp;quot; IL-12 freizusetzen. Eine derartige Regulation der IL-12-Sekretion ist bisher nicht beschrieben. Eine Hemmung des cAMP-Effektormoleküls Proteinkinase A resultierte in der reduzierten Expression des DC-Maturationsmarkers CD83 und einer verringerten Zytokinproduktion. Dies unterstreicht die Bedeutung von cAMP für die Aktivierung M-DC8+ DC. Zusammenfassend gibt diese Arbeit am Beispiel nativer humaner DC Anhalt für ein neues Konzept der immunregulatorischen Funktion von cAMP. Hierbei ist cAMP wesentlich an der Ausreifung von M-DC8+ DC beteiligt, woraufhin diese große Mengen IL-12 und TNF-a sekretieren können. Dagegen wirkt eine langfristige cAMP-Erhöhung durch die Induktion von IL-10 anti-inflammatorisch.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet umfangreiche histologische Untersuchungen an verschiedenen Tumoren bezüglich ihrer Infiltration durch Makrophagen-Subpopulationen, Granulozyten und Lymphozyten. Hierfür wurden 18 Gewebe-Mikroarrays mit jeweils 200 - 300 Tumorstanzen aus insgesamt 27 Organen des Gastrointestinaltraktes, des Urogenitaltraktes, des Respirationssystems und des endokrinen Systems angefertigt. Da alle Proben mit derselben Technik (Gewebe-Mikroarrays, Immunhiostochemie) ausgewertet wurden, bestand nun erstmalig die Möglichkeit eines direkten Vergleiches zwischen den verschiedenen Tumoren unterschiedlicher Organe. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden fünf verschiedene Antikörper (anti-KP1, anti-PG-M1, anti-MRP8, anti-MRP14, anti-MRP8/14) eingesetzt. Die Antikörper gegen die Epitope PG-M1 und KP1 gelten als Pan-Makrophagen-Marker. Die Antikörper anti-MRP8, anti-MRP14 und anti-MRP8/14 gelten als Marker für entzündlich aktivierte Makrophagen. Diese Makrophagen wurden in einen aktiven inflammatorischen Typ (MRP14+, MRP8/14+), der proinflammatorische Zytokine wie TNF-a und Sauerstoffradikale bildet, und in einen chronisch inflammatorischen Typ (MRP8+) eingeteilt. Die Formation des MRP8/14-Heterodimers korreliert mit der zellulären Aktivierung wie z. B. mit der Aktivierung der NADPH-Oxidase. Es wurde beschrieben, dass diese Makrophagen auf Grund ihrer Eigenschaften eventuell die Tumorzellproliferation inhibieren und zytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen ausüben können. Für die verschiedenen Tumorgewebe wurden höhere Makrophagendichten im Vergleich zum Normalgewebe und eine vergleichsweise geringe Dichte an MRP+ Makrophagen sowie signifikante Korrelationen zwischen den verschiedenen Makrophagen-Subpopulationen festgestellt. Die Dichte der Lymphozyten korrelierte negativ mit steigendem Tumorzellanteil und mit fortgeschrittenem Tumorstadium. Die Abnahme der Lymphozyten (Gastrointestinal- und Respirationstrakt) im Tumorgewebe im Vergleich zum tumorfreien Gewebe sowie die geringe Anzahl der potenziell tumoriziden MRP8/14+ Makrophagen lässt vermuten, dass die Immunantwort gegen den Tumor unterdrückt wird. Die positive Assoziation zwischen Makrophagen und Lymphozyten weist jedoch darauf hin, dass Makrophagen nicht am Rückgang der Lymphozyten beteiligt sind . Eine Korrelation der Makrophagen mit klinisch relevanten Parametern (pT-Stadium, UICC-Stadium, Lymphknotenmetastasen) zeigten ein voneinander abweichendes Infiltrationsmuster der CD68+ und MRP+ Makrophagen, was auf unterschiedliche Funktionen hinweist. Ferner liegen zahlreichen funktionelle Untersuchungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen vor, welche darauf hinweisen, dass Makrophagen durch Hypoxie angezogen werden und im hypoxischen Tumorgewebe schließlich an der Neubildung von Blut- und Lymphgefäßen beteiligt sind. Um einen möglichen Zusammenhang zu zeigen, wurde mit den Antikörpern anti-CD31 und anti-CD34 die Gefäßdichte in Tumoren untersucht. Es zeigten sich zahlreiche positive Korrelationen zwischen Gefäßen und Makrophagen, jedoch konnte in den tumorfreien Geweben kein Zusammenhang zwischen beiden Größen gefunden werden. Das Vorkommen größerer Makrophagendichten in Tumoren mit wenig Nekrose als in Tumoren ohne Nekrose, die positive Korrelation zwischen der Anzahl der Gefäße und der Zahl der Makrophagen in Tumoren und die Unabhängigkeit von Makrophagen und Gefäßen im tumorfreien Gewebe legt die Vermutung nahe, dass TAM die Angiogenese begünstigen. Trotz vieler ähnlicher Charakteristika zwischen den Tumoren unterschiedlichen Ursprungsgewebes wurden auch Unterschiede festgestellt, die besonders die Anzahl der Makrophagen-Subpopulationen betreffen. Weitere Studien zur Aufklärung der Funktion unterschiedlicher Makrophagen-Subpopulationen (z. B. Immunsuppression, Neoangiogenese) sind notwendig, um deren Relevanz für das Tumorwachstum und die Tumorprogression aufzuklären.

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Die vorliegende Arbeit beinhaltet umfangreiche histologische Untersuchungen an verschiedenen Tumoren bezüglich ihrer Infiltration durch Makrophagen-Subpopulationen, Granulozyten und Lymphozyten. Hierfür wurden 18 Gewebe-Mikroarrays mit jeweils 200 - 300 Tumorstanzen aus insgesamt 27 Organen des Gastrointestinaltraktes, des Urogenitaltraktes, des Respirationssystems und des endokrinen Systems angefertigt. Da alle Proben mit derselben Technik (Gewebe-Mikroarrays, Immunhiostochemie) ausgewertet wurden, bestand nun erstmalig die Möglichkeit eines direkten Vergleiches zwischen den verschiedenen Tumoren unterschiedlicher Organe. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden fünf verschiedene Antikörper (anti-KP1, anti-PG-M1, anti-MRP8, anti-MRP14, anti-MRP8/14) eingesetzt. Die Antikörper gegen die Epitope PG-M1 und KP1 gelten als Pan-Makrophagen-Marker. Die Antikörper anti-MRP8, anti-MRP14 und anti-MRP8/14 gelten als Marker für entzündlich aktivierte Makrophagen. Diese Makrophagen wurden in einen aktiven inflammatorischen Typ (MRP14+, MRP8/14+), der proinflammatorische Zytokine wie TNF-a und Sauerstoffradikale bildet, und in einen chronisch inflammatorischen Typ (MRP8+) eingeteilt. Die Formation des MRP8/14-Heterodimers korreliert mit der zellulären Aktivierung wie z. B. mit der Aktivierung der NADPH-Oxidase. Es wurde beschrieben, dass diese Makrophagen auf Grund ihrer Eigenschaften eventuell die Tumorzellproliferation inhibieren und zytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen ausüben können. Für die verschiedenen Tumorgewebe wurden höhere Makrophagendichten im Vergleich zum Normalgewebe und eine vergleichsweise geringe Dichte an MRP+ Makrophagen sowie signifikante Korrelationen zwischen den verschiedenen Makrophagen-Subpopulationen festgestellt. Die Dichte der Lymphozyten korrelierte negativ mit steigendem Tumorzellanteil und mit fortgeschrittenem Tumorstadium. Die Abnahme der Lymphozyten (Gastrointestinal- und Respirationstrakt) im Tumorgewebe im Vergleich zum tumorfreien Gewebe sowie die geringe Anzahl der potenziell tumoriziden MRP8/14+ Makrophagen lässt vermuten, dass die Immunantwort gegen den Tumor unterdrückt wird. Die positive Assoziation zwischen Makrophagen und Lymphozyten weist jedoch darauf hin, dass Makrophagen nicht am Rückgang der Lymphozyten beteiligt sind . Eine Korrelation der Makrophagen mit klinisch relevanten Parametern (pT-Stadium, UICC-Stadium, Lymphknotenmetastasen) zeigten ein voneinander abweichendes Infiltrationsmuster der CD68+ und MRP+ Makrophagen, was auf unterschiedliche Funktionen hinweist. Ferner liegen zahlreichen funktionelle Untersuchungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen vor, welche darauf hinweisen, dass Makrophagen durch Hypoxie angezogen werden und im hypoxischen Tumorgewebe schließlich an der Neubildung von Blut- und Lymphgefäßen beteiligt sind. Um einen möglichen Zusammenhang zu zeigen, wurde mit den Antikörpern anti-CD31 und anti-CD34 die Gefäßdichte in Tumoren untersucht. Es zeigten sich zahlreiche positive Korrelationen zwischen Gefäßen und Makrophagen, jedoch konnte in den tumorfreien Geweben kein Zusammenhang zwischen beiden Größen gefunden werden. Das Vorkommen größerer Makrophagendichten in Tumoren mit wenig Nekrose als in Tumoren ohne Nekrose, die positive Korrelation zwischen der Anzahl der Gefäße und der Zahl der Makrophagen in Tumoren und die Unabhängigkeit von Makrophagen und Gefäßen im tumorfreien Gewebe legt die Vermutung nahe, dass TAM die Angiogenese begünstigen. Trotz vieler ähnlicher Charakteristika zwischen den Tumoren unterschiedlichen Ursprungsgewebes wurden auch Unterschiede festgestellt, die besonders die Anzahl der Makrophagen-Subpopulationen betreffen. Weitere Studien zur Aufklärung der Funktion unterschiedlicher Makrophagen-Subpopulationen (z. B. Immunsuppression, Neoangiogenese) sind notwendig, um deren Relevanz für das Tumorwachstum und die Tumorprogression aufzuklären.

Die Wirkung von zwei endogen neuroprotektiven Substanzen, Melatonin und 17 beta-Estradiol wurde an drei Caspase-abhängigen, apoptotischen, aber Exzitotoxin-unabhängigen Schadensmodellen an neuronalen Primärkulturen untersucht und mit der bei vorwiegend nekrotischen Schadensmodellen verglichen. Es zeigten sich eine Abhängigkeit des neuroprotektiven Potentials von der Art des Zelluntergangs sowie unterschiedliche Mechanismen der Neuroprotektion. Melatonin wirkte in allen drei apoptischen Modellen nicht neuroprotektiv, sondern verstärkte die Schädigung der Neurone noch, während partiell gegen die OGD-induzierte Nekrose (OGD, engl. Oxygen glucose deprivation, kombinierter Sauerstoff- und Glukoseentzug) kortikaler Neurone Schutz erzielt wurde. Der Einsatz des endogenen neuroprotektiven Faktors Melatonin als Therapeutikum ist möglicherweise nur bei neurodegenerativen Erkrankungen mit exzitotoxischer Schädigung durch Glutamat oder oxidativem Stress wie bei Epilepsie oder dem Schlaganfall durch Ischämie sinnvoll. Die fehlende bzw. potenzierenden Wirkung von Melatonin bei neuronaler Apoptose in vitro, stellt jedoch einen therapeutischen Erfolg bei der Behandlung der mit apoptotischer Schädigung einhergehenden Alzheimer'schen Erkrankung in Frage. Bei klinischer Anwendung ist auch der von uns erhobene Befund zu beachten, dass in vitro native neuronale Zellen durch Melatonin geschädigt werden. 17 beta-Estradiol wirkte sowohl bei nekrotischer als auch bei apoptotischer Zellschädigung. Dabei zeigten sich wesentliche Unterschiede in den Mechanismen der Neuroprotektion und in der Ansprechbarkeit verschiedener Regionen des Gehirns. Schutz vor Apoptose konnte nur durch eine Langzeitvorbehandlung (20 h) in septalen und hippokampalen Kulturen, nicht jedoch in kortikalen Kulturen beobachtet werden. Dieser Effekt liess sich durch Rezeptorantagonisten, Proteinsynthesehemmung sowie durch Hemmung der Phosphoinositol-3-Kinase blockieren. Eine Kurzzeitbehandlung war gegen Apoptose nicht wirksam, zeigte gegen OGD und Glutamattoxizität jedoch neuroprotektives Potential. Dieser Effekt liess sich nicht antagonisieren, so dass hier ein direkter antioxidativer Mechanismus wahrscheinlich erscheint. Die antiapoptotische Wirkung in septalen und hippokampalen Kulturen korrelierte mit einer höheren Dichte des Estrogenrezeptors-alpha und einer erhöhten Expression antiapoptotischer Proteine in diesen Regionen. Da bei der Alzheimer'schen Erkrankung der Kortex betroffen ist, könnte der fehlende Effekt von 17 beta-Estradiol in kortikalen Neuronen sowohl auf die neuronale Apoptose als auch auf die Proteinexpression von Bcl-2 und Bcl-xL möglicherweise auf experimenteller Basis erklären, warum eine langfristige Estrogentherapie bei Frauen mit milder bis moderater Alzeimer'scher Erkrankung den Progress der Erkrankung nicht aufhalten konnte (Mulnard et al. 2000). / The neuroprotective effect of melatonin and 17 beta-estradiol has been evaluated in several in vitro models of neuronal apoptosis and necrosis. Melatonin was not neuroprotective in three models of apoptosis but showed a pro-apoptotic effect in primary cortical neurons. Melatonin revealed to damage naïve neurons, too. Partial protection was observed against necrotic neurodegeneration after oxygen-glucose deprivation (OGD). The use of melatonin as a therapeutic agent might be of interest in neurodegenerative diseases with excitotoxic damage like epilepsia or ischemia, but is questioned in case of apoptotic neurodegeneration. 17 beta-estradiol was neuroprotectiv in both necrotic and apoptotic neurodegeneration. Differences in the mechanism of neuroprotetion and in the efficacy in different regions of the brain were observed. A neuroprotective effect was visible only in hippocampal and septal cultures if 17 beta-estradiol was applied 20 h prior (long term pre-treatment) but not in cortical neurons. This effect correlates with an increased density of estrogen receptor-alpha and an increased expression of anti-apoptotic proteins like Bcl-2 and Bcl-xL in these regions. These effect could be blocked with receptor antagonists, protein synthesis inhibitors and an inhibitor of the phosphatidylinositol 3-kinase. A short term pre-treatment revealed a receptor independent neuroprotective potential against OGD and glutamate toxicity. The failure of 17 beta-estradiol to protect cortical neurons against apoptosis could be an experimental basis to understand, why a long lasting treatment with estrogens of women with mild to moderate Alzheimer´s disease failed to inhibit the progress of the illness (Mulnard et al., 2000)