La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est la cause la plus fréquente de déficience visuelle centrale irréversible chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés, avec des impacts sociétaux et financiers majeurs. La DMLA est une maladie à multiples facettes provoquée par des interactions entre les facteurs de risque et les antécédents génétiques et l'inflammation joue un rôle important. Les effets pro-inflammatoires provoquent une perturbation de l'environnement sousrétinien physiologiquement immunosuppresseur. L'accumulation de phagocytes mononucléaires (PM) dans l'espace sous-rétinien qui s'ensuit est au coeur de l'étiologie des formes atrophiques et humides de la DMLA. Après l’usage de tabac, l'obésité est l'un des facteurs de risque modifiables les plus importants. Nous avons démontré que les régimes riches en graisses exacerbent la néovascularisation choroïdienne (NVC) en modifiant le microbiote intestinal. La dysbiose intestinale entraîne une perméabilité intestinale accrue, une inflammation chronique de bas grade, une augmentation des PM sur le site de l'angiogenèse pathologique dans l'oeil et exacerbe finalement la NVC. La modification du microbiote peut réduire l'inflammation et atténuer la NVC et peut ainsi fournir des traitements peu intrusifs et rentables pour prévenir ou retarder la DMLA exsudative. Une autre option thérapeutique qui pourrait réduire la NVC par modulation inflammatoire consiste à piéger localement les ligands de NRP1 avec un piège dérivé de NRP1. Les ligands de NRP1 sont élevés dans le vitré des patients atteints de DMLA. Nous avons constaté que les PM exprimant NRP1 favorisaient la NVC en atténuant la production de facteurs inflammatoires et en favorisant l'activation alternative, donnant aux PM un caractère pro-angiogénique. Les PM moins inflammatoires et plus de type M2 qui sont enrichis avec l'âge et exacerbent la NVC peuvent être modulés et devenir moins nuisibles en empêchant l'activation de NRP1. Cette thèse explore deux angles dans lesquels la régulation de l'inflammation peut influencer la formation de NVC et jette les bases du développement futur de nouveaux traitements préventifs primaires et secondaires efficaces dans le contexte de la DMLA. / Age related macular degeneration (AMD) is the most common cause of irreversible central vision impairment in people over 50 in industrialized countries, with major societal and financial impacts. AMD is a multifaceted disease provoked by interactions among environmental risk factors and genetic backgrounds in which inflammation plays an important role. Proinflammatory effects cause a disruption of the physiologically immunosuppressive subretinal environment. The ensuing accumulation of mononuclear phagocytes in the subretinal space is central to the etiology of both atrophic and wet forms of AMD. After smoking, obesity is one of the most important modifiable risk factors. We demonstrate that high-fat diets exacerbate choroidal neovascularisation (CNV) by altering gut microbiota. Gut dysbiosis leads to heightened intestinal permeability and chronic low-grade inflammation, increases recruitment of microglia and macrophages to the site of pathological angiogenesis in the eye and ultimately exacerbates CNV. Modifying microbiota can reduce systemic and local choroidal inflammation and attenuate pathological neovascularization and may thus provide minimally intrusive and cost-effective paradigms to prevent or delay exudative AMD. Another therapeutic option that could reduce CNV through inflammatory modulation is locally trapping ligands of NRP1 with a NRP1-derived trap. Ligands for NRP1 are elevated in the vitreous of patients with AMD at times of active CNV. We found that NRP1-expressing MPs promote CNV by mitigating production of inflammatory factors and promoting alternative activation, giving the MPs a pro-angiogenic character. The less inflammatory and more M2-like MPs that are enriched with age and exacerbate CNV can be rendered less detrimental by hindering NRP1 activation. This thesis explores two angles wherein regulation of inflammation can influence the formation of CNV and lays the groundwork for future development of novel effective primary and secondary preventive treatments for AMD.

No / The orally active microtubule-disrupting agent (S)-1-ethyl-3-(2-methoxy-4-(5-methyl-4-((1-(pyridin-3-yl)butyl)amino)pyrimidin-2- yl)phenyl)urea (CYT997), reported previously by us (Bioorg Med Chem Lett 19:4639-4642, 2009; Mol Cancer Ther 8:3036-3045, 2009), is potently cytotoxic to a variety of cancer cell lines in vitro and shows antitumor activity in vivo. In addition to its cytotoxic activity, CYT997 possesses antivascular effects on tumor vasculature. To further characterize the vascular disrupting activity of CYT997 in terms of dose and temporal effects, we studied the activity of the compound on endothelial cells in vitro and on tumor blood flow in vivo by using a variety of techniques. In vitro, CYT997 is shown to potently inhibit the proliferation of vascular endothelial growth factor-stimulated human umbilical vein endothelial cells (IC(50) 3.7 +/- 1.8 nM) and cause significant morphological changes at 100 nM, including membrane blebbing. Using the method of corrosion casting visualized with scanning electron microscopy, a single dose of CYT997 (7.5 mg/kg i.p.) in a metastatic cancer model was shown to cause destruction of tumor microvasculature in metastatic lesions. Furthermore, repeat dosing of CYT997 at 10 mg/kg and above (intraperitoneally, b.i.d.) was shown to effectively inhibit development of liver metastases. The time and dose dependence of the antivascular effects were studied in a DLD-1 colon adenocarcinoma xenograft model using the fluorescent dye Hoechst 33342. CYT997 demonstrated rapid and dose-dependent vascular shutdown, which persists for more than 24 h after a single oral dose. Together, the data demonstrate that CYT997 possesses potent antivascular activity and support continuing development of this promising compound.

L’obésité est en croissance rapide à l’échelle mondiale et représente un facteur de risque important pour plusieurs pathologies, dont la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Dans l’obésité, le tissu adipeux blanc (WAT) subi un remodelage pathologique caractérisé par le recrutement de macrophages pro-inflammatoires facilitant l’établissement de l’inflammation stérile systémique. Contrairement au WAT, les tissus adipeux brun (BAT) et beige (BgAT) participent à la thermogénèse, un processus qui libère de la chaleur en métabolisant les lipides. En raison de leurs potentiels effets physiologiques bénéfiques, le recrutement d’adipocytes et l’activation de ces types spécifiques de tissu adipeux (AT) ont fait l’objet de multiples recherches et débats. Malgré les avancées considérables dans le domaine, les mécanismes impliqués dans l’activation du BAT et du BgAT ainsi que les mécanismes impliqués dans le développement de l’obésité et leur contribution à des maladies comme la DMLA, restent mal définis. Dans un premier temps, nous avons développé le protocole RELi pour permettre une extraction et une quantification fiable des protéines du AT murin saturé en lipides. Notre protocole élimine les lipides contaminants en excès, réduit la variabilité du chargement de protéines pour le western blot et l’usage de gènes de ménage standards (Article #1). Ensuite, nous avons étudié l’inflammation au niveau du BAT dans un modèle d’obésité induite par l’alimentation. La délétion de la Neuropiline 1 (NRP1) chez les macrophages résidents du tissu adipeux (ATMs) a provoqué une diminution des densités de la vasculature et de l’innervation. De plus ces souris sont devenues plus sensibles à l’exposition au froid suggérant un rôle des ATMs-Nrp1+ dans la régulation de l’homéostasie du BAT et de la température corporelle (Article #2). Finalement, nous avons exploré l’axe BgAT-DMLA; plus spécifiquement son impact potentiel sur la néovascularization choroïdienne (CNV) en utilisant des approches in vivo et in vitro. Nous avons démontré que la délétion génétique de PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16 (PRDM16), un gène impliqué dans la thermogénèse, conduit à une réduction de la CNV, et que la réintroduction d’AT-PRDM16+ exacerbe la formation de CNV pathologique. Le traitement d’explants de choroïde avec du milieu conditionné par des adipocytes-PRDM16+ augmente la croissance des vaisseaux sanguins. Ensemble, les données suggèrent un rôle sécrétoire potentiel pour le BgAT-PRDM16+ capable d’influencer la formation distale de CNV qui pourrait être pertinente pour la DMLA (Article #3). Les travaux présentés dans cette thèse établissent les bases d’un protocole permettant l’obtention de résultats reproductibles dans l’étude du AT, soulignent l’importance des ATMs- Nrp1+ dans la régulation de l’homéostasie du BAT et explorent pour la première fois l’implication du BgAT-PRDM16+ chez la DMLA neovasculaire. Ce travail établit les bases de la compréhension des mécanismes moléculaires reliant la régulation du AT thermogénique et les pathologies caractérisées par un excès de gras. Ce travail souligne également l’importance d’évaluer l’activation du BgAT chez les patients atteints de la DMLA. / Obesity is rapidly growing worldwide and represents a significant risk factor to several pathologies, including age-related macular degeneration (AMD). In obesity, the white adipose tissue (WAT) undergoes a strong remodeling characterized by the recruitment of pro- inflammatory macrophages, facilitating low-grade chronic inflammation. Unlike WAT, brown (BAT) and beige (BgAT) adipose tissues participate in thermogenesis, a process that releases heat by metabolizing lipids. Due to the likely beneficial physiological effects of BAT and BgAT, the recruitment of adipocytes and activation of these specific types of adipose tissue (AT) has been the subject of much research and debate. Despite considerable advances in the field, the mechanisms involved in BAT- and BgAT-activation as well as mechanisms involved in the development of obesity and their contribution to diseases such as AMD, remain ill-defined. First, we developed the RELi protocol to allow a reliable extraction and quantification of proteins from murine AT saturated with lipids. Our protocol eliminates excess contaminating lipids, reduces the variability of protein loading in Western blot and stabilizes expression of housekeeping genes (Article #1). Next, we investigated the inflammatory component of BAT in a diet-induced obesity model. The deletion of NRP1 in resident adipose tissue macrophages (ATMs) led to the expansion of the BAT and affected the densities of the vasculature and the innervation. Moreover, these mice became more sensitive to cold exposure, suggesting a role of ATMs-Nrp1+ in the regulation of BAT homeostasis and body temperature (Article #2). Lastly, we explored the axis of BgAT and AMD; more specifically, its potential impact on choroidal neovascularization (CNV) using in vivo and in vitro approaches. We demonstrated that the genetic deletion in BgAT of PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16 (PRDM16), a gene involved in thermogenesis, leads to a reduction of CNV, and that the reintroduction of BgAT-PRDM16+ via AT transplantation exacerbates the formation of pathological CNV. Treatment of choroid explants with PRDM16+-adipocyte-conditioned medium augmented blood vessel growth. Altogether, the data suggest a potential secretory role for BgAT-PRDM16+ to influence distal CNV formation that could be relevant to AMD (Article #3). The work presented in this thesis establishes the basis of a protocol allowing reproducible results in the study of AT, underlines the importance of ATMs-Nrp1+ in the regulation of BAT homeostasis and explores, for the first time, the involvement of BgAT-PRDM16+ in neovascular AMD. This work sets the basis for the understanding of the molecular mechanisms linking the regulation of thermogenic AT and pathologies characterized by an excess of fat. This work also highlights the importance of assessing the activation of BgAT in patients with AMD.

No description available.

Η οπτική συνεκτική τομογραφία με τη χρήση συχνοτήτων ( FD-OCT) είναι μια ενδαγγειακή απεικονιστική μέθοδος που χρησιμοποιεί εγγύς στο υπέρυθρο φως, για να παράγει υψηλής ανάλυσης εικόνες του τοιχώματος του αυλού του αγγείου. Όπως και στην τεχνολογία υπερήχων, εκπέμπεται φωτεινή ενέργεια η οποία ανακλάται και εξασθενεί, σύμφωνα με την υφή του προσπιπτομένου ιστού. Το OCT μπορεί να απεικονίσει, με ανάλυση από 10 έως 20 μm, μικροδομές του αγγειακού τοιχώματος με εξαίσια λεπτομέρεια. Μέχρι σήμερα, η δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου είχε περιοριστεί σε μικρές αρτηρίες διαμέτρου έως 4mm και δεν είχε εφαρμοστεί in vivo στα αγγεία των κάτω άκρων, κάτωθεν του επιπέδου των βουβώνων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναφερθεί για παγκοσμίως πρώτη φορά η ασφάλεια και η σκοπιμότητα της απεικόνισης με Οπτική Συνεκτική Τομογραφία του αρτηριακού άξονα των κάτω άκρων , κάτωθεν του επιπέδου της βουβώνας ( μηροϊγνυακός άξονας και κνημιαία αγγεία), καθώς και οι σχετιζόμενες με το FD-OCT επιπλοκές. Επιπρόσθετα, να διερευνηθούν για πρώτη φορά, με τη χρήση FD-OCT, τα χαρακτηριστικά του αγγειακού τοιχώματος του ανωτέρω άξονα (τόσο πριν όσο και μετά από αγγειοπλαστική ή/και τοποθέτηση stent), η μορφολογία της αθηρωματικής πλάκας, η μορφολογία και η ποσοτικοποίηση της υπερπλασίας του νέου εσωτερικού χιτώνα (neointima) εντός του stent, η επαναστένωση εντός του stent (ISR) και η κακή εναπόθεση (malapposition) των stent struts σε μια σειρά από ασθενείς που πάσχουν από περιφερική αρτηριοπάθεια (PAD). Μελετήθηκαν, με ποσοτική ανάλυση του αυλού τους (Quantitative vascular analysis), αρτηρίες με διάμετρο έως 7 χιλιοστά. Μικτά χαρακτηριστικά από περιοχές πλούσιες σε λιπίδια, εναποθέσεις ασβεστίου και ασβεστοποιημένες πλάκες, νεκρωτικές περιοχές και ίνωση εντοπίστηκαν σε όλες τις απεικονιζόμενες αθηροσκληρωτικές βλάβες. Ωστόσο, με βάση το επικρατέστερο από τα παραπάνω απεικονιστικά χαρακτηριστικά, οι βλάβες στο πλαίσιο της έρευνας ταξινομήθηκαν ως αμιγώς ινωτικές, ως ινοασβεστοποιημένες, ως πλούσιες σε λιπίδια και τέλος ως νεκρωτικές/ασβεστοποιημένες. Συσσώρευση των μακροφάγων εντός της αθηρωματικής πλάκας σημειώθηκε σε μικρό ποσοστό των de novo αθηρωματικών αλλοιώσεων. Ποικίλοι βαθμοί υπερπλασίας του νέου έσω χιτώνα απεικονίσθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις ISR αλλοιώσεων, με καθαρά ινωτικά χαρακτηριστικά και σημαντική νεοαγγείωση σε κάποιες από αυτές. Η νεοαγγείωση συνέπεσε με το επίπεδο της μέγιστης στένωσης του αγγειακού αυλού. Σημαντικού βαθμού διαχωρισμός με μεγάλο περιορισμό του αγγειακού αυλού, τέτοιος ώστε να απαιτηθεί να τοποθετηθεί ενδοαυλικό stent, ανιχνεύθηκε σε αρκετές περιπτώσεις της de novo αθηρωμάτωσης. Η ψηφιακή αφαιρετική αγγειογραφία παρέλειψε να προσδιορίσει μεγάλο ποσοστό των σοβαρών διαχωρισμών μετά από αγγειοπλαστική. Η νεοαθηροσκλήρυνση εντός του νέου έσω χιτώνα των κνημιαίων φαρμακευτικών stents (DES), είναι ένα συχνό εύρημα τόσο στους συμπτωματικούς όσο και στους ασυμπτωματικούς ασθενείς. Μπορούμε να υποθέσουμε ότι, κατά αναλογία με τα εμφυτευμένα DES στα στεφανιαία αγγεία, η ελαττωματική ενδοθηλιοποίηση που προκαλείται από την εκλυόμενη φαρμακευτική ουσία, μαζί με την νεοαγγείωση που αναπτύσσεται μεταξύ των stent struts, μπορούν να υποδαυλίσουν την νεοαθηροσκλήρυνση εντός του νέου έσω χιτώνα των κνημιαίων DES, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε επαναστένωση εντός του stent (ISR) και απώλεια του εμβαδού του αυλού των περιφερικών αρτηριών. Οι παρατηρήσεις της μελέτης αυτής θέτουν σε αμφισβήτηση το παραδοσιακό τρόπο κατανόησης της περιφερειακής επαναστένωσης εντός του stent ως μιας απλής υπερπολλαπλασιαστικής απάντησης στο βαρότραυμα. Η απεικόνιση με FD-OCT είναι ένα βέλτιστο πειραματικό εργαλείο για την αξιολόγηση της εξέλιξης της αθηροσκληρωματικής νόσου και την επαναστένωση του αγγείου. Μπορεί να παρέχει υψηλής ευκρίνειας ενδοαγγειακή απεικόνιση κατά τη διάρκεια αγγειοπλαστικών επεμβάσεων στα κάτω άκρα και θα μπορούσε να αποδειχθεί κλινικά χρήσιμο για τον προσδιορισμό της εντός του stent πρόπτωσης ιστού και του strut malapposition. Παρ 'όλα αυτά, δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για τη συνήθη κλινική πρακτική μέχρι να προκύψουν στοιχεία από περαιτέρω κλινικές δοκιμές για τον καθορισμό των ειδικών ενδείξεων της απεικόνισης με FD-OCT στις περιφερικές αρτηρίες. / Optical coherence tomography (OCT) is a catheter-based imaging method that employs near-infrared light to produce high-resolution intravascular images. OCT can readily visualize vessel microstructure at a 10- to 20-μm resolution with exquisite detail. To date, however, applicability of the method has been limited to small diameter arteries (≤4 mm). To the best of the author’s knowledge, this study is the first worldwide that demonstrates the safety and clinical feasibility of frequency domain Optical Coherence Tomography (FD-OCT) imaging of infrainguinal vessels in vivo during infrainguinal angioplasty procedures. It is also the first study that reports the use of intravascular FD-OCT to detect and characterize in-stent neointimal tissue following infrapopliteal drug eluting stent (DES) placement in patients suffering from critical limb ischemia. Quantitative lumen analysis of arteries with diameter up to 7 mm was performed. High-resolution OCT images provided exquisite two-dimensional axial and longitudinal views of the infrainguinal arteries and allowed thorough investigation of a variety of angioplasty sequela, including and not limited to intimal tears and dissection flaps, white and red thrombus, stent mesh malapposition, and intrastent plaque prolapse. Of interest, OCT identified cases of suboptimal postangioplasty outcome that single-plane subtraction angiography did not recognize and accounted. Mixed features of lipid pool areas, calcium deposits and calcified plaques, necrotic areas, and fibrosis were identified in all of the imaged atherosclerotic lesions. However, based on the predominant baseline imaging findings, lesions under investigation were classified as purely fibrotic, fibrocalcific, mostly lipid-laden and necrotic/calcified. Intraplaque accumulation of macrophages was noted in some of de novo atheromatic lesions. Varying degrees of neointimal hyperplasia were demonstrated in all cases of in stent restenosis (ISR) lesions with purely fibrotic features and considerable neovascularization in some of them. The latter finding coincided with the level of maximum vessel stenosis in all cases. Neoatherosclerosis following infrapopliteal DES placement is a frequent finding in both symptomatic and asymptomatic patients. Our preliminary observations allow us to speculate that analogous to coronary implanted DES, defective endothelialization induced by the eluted drug, along with neovascularization developing between the stent struts, may incite neointimal neoatherosclerosis, which may result in ISR and lumen loss of the peripheral arteries. It also seems that infrapopliteal neoatherosclerosis may be a significant contributing factor for ISR rather than a minor and sporadic process, highlighting the clinical significance of the phenomenon. Our observations put in dispute the traditional way of understanding peripheral in-stent restenosis as a simple hyperproliferative response to barotraumas and may explain the paramount importance of aggressive risk factor modification strategies. Neointimal neoatherosclerosis as identified by FD-OCT may have a role in the development of below-the-knee restenosis and thus warrants further investigation by larger controlled studies. Moreover, it may prove clinically useful for the determination of intrastent tissue prolapse and strut malapposition. FD-OCT should not be utilized as a tool for routine clinical practice until evidence from further clinical trials emerge to determine the specific indications for OCT imaging of the peripheral arteries.