Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente chez le jeune enfant. En dépit de plusieurs avancements thérapeutiques, seulement 60% survivront à long terme. Cette résistance aux traitements est possiblement due, en partie, à la présence des cellules souches cancéreuses (CSC). PARP-1 joue un rôle important dans la chimiorésistance de certaines tumeurs et son inhibition a montré une potentialisation des agents anticancéreux conventionnels. De plus, Bcl-2 est surexprimé dans le NB et son expression accrue contribuerait à la résistance à la chimiothérapie. Le but de notre travail était de déterminer les effets in vitro d’un PARP inhibiteur, AG-014699 (AG), et d’un inhibiteur de Bcl-2, Obatoclax (Obx), in vitro et in vivo, en monothérapie ou en combinaison avec de la Doxorubicine (Doxo) ou du Cisplatin (Cis), deux agents anticancéreux classiquement utilisés dans le traitement du NB. Afin de déterminer l’expression de PARP-1 dans les tumeurs de NB, nous avons analysé une cohorte de 132 tumeurs. Nous avons utilisé le test MTT afin d’évaluer la sensibilité de 6 lignées cellulaires de NB et des CSC à un traitement avec AG seul ou en combinaison avec de la Doxo ou du Cis. Nous avons déterminé l’étendue de la mort cellulaire par Annexin-V et caractérisé les dommages à l’ADN à l’aide d’un marquage γH2aX. De plus, les modulations des voies de signalisation intracellulaire ont été analysées par Western Blot. La sensibilité des cellules à l’Obx a été analysée par MTT sur 6 lignées cellulaires de NB et sa combinaison avec le Cis a également été déterminée dans 2 lignées cellulaires. Le marquage Annexin-V et des combinaisons avec ZVAD-FMK ont aussi été utilisés pour caractériser les effets d’Obx sur l’apoptose. Des expériences in vivo ont également été faites. Nos résultats démontrent que l’expression de PARP-1 est associée aux tumeurs moins agressives. AG n’a peu ou pas effet sur la croissance tumorale et ne potentialise pas significativement les effets de la Doxo ou de Cis. AG combiné à la Doxo semble sensibiliser les CSC dans une lignée cellulaire. L’Annexin-V et le marquage γH2aX ne révèlent pas d’effets synergiques de cette combinaison et les dommages à l’ADN et la mort cellulaire observés sont attribués à la Doxo. Cependant, on observe une augmentation d’apoptose et de bris d’ADN dans une lignée cellulaire (SK-N-FI) lorsqu’AG est utilisé en monothérapie. On observe une surexpression de pAKT et pERK suite à la combinaison Doxo et AG. Les cellules de NB sont sensibles à l’Obx à des concentrations à l’échelle nanomolaire. De plus, Obx active la mort cellulaire par apoptose. Aussi, Obx a un effet synergique avec le Cis in vitro. In vivo, l’Obx diminue significativement la taille tumorale. Nous concluons que l’Obx présente une avenue thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB alors que l’utilisation d’AG ne semble pas être aussi encourageante. / Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumour of childhood. In spite of many therapeutic improvements, only 60% survive long term. Presence of cancer stem cell (CSCs) is thought to mediate such resistance. PARP-1 plays an important role in the chemoresistance of certain tumours and its inhibition is shown to potentiate cells to routinely used anticancer agents. Moreover, Bcl-2 is over-expressed in NB and that its increased expression would contribute to chemotherapy resistance. Our goal was to determine the efficacy in vitro of a PARP inhibitor, AG-014699 (AG), and a Bcl-2 inhibitor, Obatoclax (Obx), in vitro and in vivo, in monotherapy or in combination to Doxorubicine (Doxo) and Cisplatine (Cis), classical chemotherapeutic agents used in NB treatment. In order to determine PARP-1 expression in NB tumours, 132 tumours were analyzed. We used an MTT test to evaluate 6 NB cell line and CSC sensitivity to AG alone or in combination to Doxo and Cis. We investigated the extent of cell death by Annexin-V and determined the degree of DNA damage by γH2aX staining. Also, signalling pathway modulations were analyzed by Western Blots. Obx sensitivity was determined by MTT test on 6 NB cell lines and its combination to Cis was also examined in 2 NB cell lines. Annexin-V and combinations to ZVAD-FMK also evaluated its effect on apoptosis. In vivo experiments were also done. Our results show that PARP-1 is associated to less aggressive tumors. AG has little to no effect on tumour growth when used alone and does not potentiate the effects of Doxo and Cis although more experiments will be needed. AG combined to Doxo seems to sensitize CSC in one cell line. Annexin-V and γH2aX staining reveal no effects of AG combination and Doxo mostly confers all cell damage and death. However, we do observe an increase in DNA damage and apoptosis in one cell line (SK-N-FI) when AG is used in monotherapy. pAKT and pERK are upregulated by Doxo and AG combination. NB cells are sensitized to Obx at nanomolar concentrations. Also, Obx activates apoptotic cell death. Moreover, Obx synergizes with Cis in vitro. In vivo, Obx significantly decreases tumor size. We conclude that Obx seems like a promising therapeutic approach in NB treatment whilst AG does not look so encouraging.

L'apport des anticorps immunomodulateurs ciblant PD-1, PD-L1 et CTLA-4 ont récemment révolutionné la prise en charge thérapeutique du cancer. Cependant, seule une minorité de patients développent des réponses objectives à ces traitements. Par conséquent, de nouvelles innovation thérapeutiques sont nécessaires afin d'augmenter l'immunogénicité des tumeurs et de surmonter la résistance à la thérapie contre les anticorps immunomodulateurs. Les propriétés oncolytiques de certains virus peuvent être exploitées afin de permettre un amorçage de l'immunité anti-tumorale. Différents virus oncolytiques (OVS) sont actuellement en développement clinique intense en combinaison avec des thérapies par anticorps immunomodulateurs. Nous avons trouvé qu'un vaccin viral pédiatrique disponible dans le commerce a des propriétés oncolytiques. Ce virus pédiatrique peut tuer directement les cellules cancéreuses, avec des caractéristiques de mort cellulaire immunogène. De plus, ce virus a des propriétés pro-inflammatoires et peut activer la voie NF-kB indépendamment des voies de danger cellulaire (TLR et IRF). Ces propriétés biologiques in vitro se traduisent in vivo en une activité anti-tumorale. L'Injection intra-tumorale du vaccin a des effets anti-tumoraux directs mais également à médiation immunitaire. De façon intéressante, dans des modèles de souris immunocompétentes porteuses de tumeurs murines, l'injection intra-tumorale de vaccin a un effet synergique avec des anti CTLA-4 permettant la guérison de 100% des souris. Les vaccins sont des produits pédiatriques et adultes de grade clinique. Par conséquent, des stratégies de vaccination in situ par injection intra-tumorale pourraient être rapidement mises en clinique / Immune checkpoint targeted therapies against PD-1, PD-L1 and CTLA-4 are currently revolutionizing cancer care. However, only a minority of patients develop objective responses with these treatments. Therefore, new therapeutic interventions are needed to increase the immunogenicity of tumors in order to overcome resistance to immune checkpoint blockade therapy. Oncolytic properties of common viruses can be exploited for the priming of anti-tumor immunity and such oncolytic viruses (OVs) are currently in intense clinical development in combination with immune checkpoint targeted therapies. We have found that commercially available virus vaccines do have oncolytic properties. These pediatric vaccine virus can directly kill cancer cells with features of immunogenic cell death. Moreover, it has pro-inflammatory properties and can activate the NF-Kb pathway in a toll-like receptor and IRF3 independent manner. These in vitro biological properties translate in vivo into anti-tumor activity. Intra-tumoral vaccine therapy has anti-tumor effects which are partly immune mediated. Interestingly, in immunocompetent murine pediatric tumor models, intra-tumoral injection overcome resistance and synergize with immune checkpoint targeted therapy. Vaccines are pediatric and adult clinical grade products. Therefore, in situ intra-tumoral immunization strategies could be implemented quickly in the clinic

Le neuroblastome est cancer du jeune enfant se développant au sein du système nerveux périphérique sympathique. Cette tumeur est caractérisée par sa grande hétérogénéité clinique : allant de formes régressant spontanément aux tumeurs de haut-risque, réfractaires aux traitements les plus agressifs. La survie à long terme des patients présentant un neuroblastome de haut-risque reste par ailleurs inférieure à 50%, ce qui souligne la nécessité de trouver de nouveaux traitements afin d’améliorer leur prise en charge thérapeutique.Récemment, en définissant le paysage épigénétique des cellules de neuroblastome, nous avons observé la présence de super-enhancers (SE). La caractérisation du paysage des SE dans les lignées de neuroblastome nous a permis de révéler l’hétérogénéité cellulaire du neuroblastome, composée de deux identités distinctes : noradrénergique et mésenchymateuse. Chacune des identités cellulaires est caractérisée par un circuit de régulation transcriptionnelle (CRC) : les facteurs PHOX2B, HAND2 et GATA3 définissent l’identité noradrénergique alors que les facteurs de la famille AP-1 gouvernent l’identité mésenchymateuse. Nous avons par ailleurs montré la différence de sensibilité aux chimiothérapies classiquement utilisées en clinique entre ces deux types cellulaires, avec une résistance accrue des cellules mésenchymateuses.Mon travail de thèse porte sur la caractérisation du rôle des facteurs de transcription PHOX2B et GATA3 dans l’établissement et le maintien de l’identité noradrénergique des cellules de neuroblastome. J’ai réalisé leur knock-out par CRISPR-Cas9 dans la lignée noradrénergique SH-SY5Y. L’inactivation de PHOX2B ne modifie ni le programme transcriptionnel ni le phénotype des cellules, arborant une identité noradrénergique. En revanche, les cellules inactivées pour GATA3 possèdent un phénotype cellulaire mésenchymateux ainsi que des capacités de migration, d’invasion et de résistance aux chimiothérapies. Le knock-out de PHOX2B et GATA3 entraine une diminution de la prolifération cellulaire, traduisant le phénomène d’addiction transcriptionnelle des cellules cancéreuses. La caractérisation du paysage épigénétique des cellules inactivées pour GATA3 démontre leur reprogrammation de l’identité noradrénergique vers l’identité mésenchymateuse avec l’effondrement des SE noradrénergiques ainsi que l’acquisition de SE mésenchymateux. GATA3 est donc indispensable pour le maintien de l’identité noradrénergique in vitro.Les résultats générés lors de ma thèse montrent que les facteurs de transcription impliqués dans un même CRC possèdent des rôles distincts dans l’identité cellulaire. La caractérisation de la dynamique de reprogrammation ainsi que des facteurs impliqués dans ce processus nous permettrons de mieux comprendre les phénomènes de plasticité cellulaire à l’origine de la progression tumorale et de la rechute thérapeutique des patients. / Neuroblastoma is a pediatric tumor of the peripheral sympathetic nervous system characterized by its diversity of clinical presentations from spontaneous regression to highly aggressive tumors. Currently, the overall survival of high-risk neuroblastoma patients remains under 50% which highlight the need to find new therapeutic approaches to improve patient outcome.Recently, we defined the epigenetic landscape of neuroblastoma cell lines and observed the presence of super-enhancers (SE). The characterization of the SE landscape let us to define the heterogeneity of neuroblastoma cell identity with the presence of noradrenergic and mesenchymal cells. Both cell identities are governed by a core regulatory circuitry (CRC), composed by PHOX2B-HAND2-GATA3 in the noradrenergic cells and by AP-1 transcription factors in the mesenchymal cells. We also demonstrate the different behaviors of the cells regarding chemotherapy treatments with a higher resistance of the mesenchymal cells.My thesis aimed at deciphering the role of PHOX2B and GATA3 transcription factors in the establishment and the maintenance of the noradrenergic identity of neuroblastoma cells. To do this, PHOX2B and GATA3 were knock-out by CRISPR-Cas9 in the noradrenergic SH-SY5Y cell line. PHOX2B knock-out has no major impact neither on the transcriptomic profile nor the phenotype of the cells. PHOX2B knock-out cells still maintain their noradrenergic identity. In contrast, GATA3 knock-out cells harbor a mesenchymal phenotype showing higher ability to migrate, invade and being pore resistant to chemotherapy than control SH-SY5Y cells. Both PHOX2B and GATA3 knock-out decrease the SH-SY5Y cell proliferation in vitro and in vivo, which highlight the transcriptional dependency of the noradrenergic cells for their identity-related transcription factors. The characterization of the epigenetic landscape of GATA3 knock-out cells revealed their reprograming from the noradrenergic to the mesenchymal identity with the loss of noradrenergic SE and the acquisition of mesenchymal SE. These results demonstrate that GATA3 is essential for the maintenance of the noradrenergic identity in vitro.Altogether, these results show that transcription factors involved in a CRC can have distinct role in the cell identity. The characterization of the reprogramming dynamics as well as the factors involved in this process will allow us to better understand the cellular plasticity involved in the tumor progression and patient relapse.

Adulte ou pédiatrique, les tumeurs solides ont besoin d’oxygène et de nutriments pour se développer et métastaser. Leur apport est assuré par la néo-vascularisation tumorale issue d’un processus multifactoriel appelé l’angiogénèse. Son équilibre est maintenu par une balance entre facteurs pro- et anti-angiogéniques. Elle fait partie des principales cibles pour traiter les cancers et l’inhibition de la voie VEGF en est un facteur clé. Cependant, la réponse aux agents anti-angiogéniques a montré, malgré des résultats encourageants, un effet transitoire associé à l’apparition d’une résistance adaptative de la tumeur.Nous avons étudié l’inhibition de l’angiogénèse et les mécanismes potentiels d’échappement dans les tumeurs pédiatriques solides, et principalement dans le neuroblastome. Le neuroblastome est une tumeur originaire de la crête neurale et atteint généralement l’enfant jeune. Nous avons exploré l’effet anti-tumoral de l’inhibition sélective des récepteurs 1, 2, 3 du VEGF à l’aide de l’inhibiteur à tyrosine kinase axitinib dans divers modèles précliniques de neuroblastome. L’axitinib a montré une activité anti-tumorale modérée associée à une inhibition de la vascularisation. Néanmoins, après un traitement prolongé in vitro, les cellules tumorales IGR-N91-Luc deviennent résistantes à l’axitinib. Elles prolifèrent normalement mais secrètent de «l’ hepatocyte growth factor» (HGF) et activent la voie MAPK. In vivo, le traitement prolongé par axitinib entraîne le développement d’un phénotype plus agressif de la tumeur avec l’augmentation du nombre d’animaux présentant des métastases, associée à une activation de la voie SRC. Ceci nous a conduit à explorer l’effet d’une inhibition ciblant principalement VEGFR2 et MET (récepteur à l’HGF) avec le cabozantinib. Ainsi nous avons contrôlé le développement tumoral en inhibant la néo-vascularisation et l’activation de SRC, et induit la mort cellulaire dans le modèle orthotopique IGR-N91-Luc et inhibé le développement métastatique dans le modèle systémique IMR-32-Luc. Par ailleurs, nous avons étendu notre exploration à d’autres facteurs jouant un rôle dans l’angiogénèse comme FGFR ou PDGFR car ils représentent, comme MET, de puissants oncogènes. Pour cibler simultanément VEGFR et PDGFR, nous avons utilisé l’inhibiteur multi-kinase regorafenib. In vivo, à des doses bien tolérées qui permettent un traitement prolongé, le regorafenib a montré une activité anti-tumorale significative. Cet effet a été associé principalement à une forte inhibition de la vascularisation mais également à l’induction de la mort cellulaire. En élargissant notre étude à d’autres modèles de tumeurs pédiatriques, nous avons observé que son activité est indépendante du type histologique. Compte tenu du caractère oncogénique de PDGFR, nous avons évalué cet inhibiteur dans des modèles présentant une amplification du gène PDGFRA, qui entraine une surexpression et une activation forte du récepteur. Combiné avec des thérapies standards capables d’induire des dommages à l’ADN telles que l’irradiation ou l’irinotecan, l’effet du regorafenib a été potentialisé, notamment dans les modèles amplifiés pour le gène PDGFRA se traduisant par des régressions tumorales. Ces évaluations précliniques soutiennent le développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour les enfants atteints de tumeurs solides. / Solid tumors either adult or pediatric need oxygen and nutrients to grow and metastasize. Their input is provided by tumor neovascularization after a multifactorial process called angiogenesis. Balance is maintained by equilibrium between pro and anti-angiogenic factors. It is one of the main targets for treating cancers and the inhibition of the VEGF pathway is a key factor. However, despite encouraging results, the response to anti-angiogenic agents showed a transient effect associated with the development of an adaptive tumor resistance. We studied the inhibition of angiogenesis and potential escape mechanisms in solid pediatric tumors, mainly in neuroblastoma. Neuroblastoma is a solid tumor derived from the neural crest and it usually affects childhood. We investigated the anti-tumor effect of selective inhibition of VEGF receptors 1, 2, 3 using the tyrosine kinase inhibitor axitinib in various preclinical neuroblastoma l models. Axitinib showed a moderate anti-tumor activity associated with the inhibition of vascularization. However, after prolonged treatment in vitro, tumor cells IGR-N91-Luc become resistant to axitinib. They proliferate normally but secrete the "hepatocyte growth factor" (HGF) and activate the MAPK pathway. In vivo, prolonged treatment by axitinib results in the development of a more aggressive tumor phenotype with an increase in the number of animals exhibiting metastases associated with an activation of SRC signaling. This led us to explore the effect of inhibiting concomitant VEGFR2 and MET (HGF receptor), main cabozantinib targets. So we stabilized tumor growth by inhibiting the neovascularization and activation of SRC, induced cell death in the orthotopic model IGR-N91-Luc and inhibited metastatic development in the IMR-32-Luc systemic model. In addition, we extended our exploration of other factors that play a role in angiogenesis like FGFR or PDGFR because they represent, like MET, powerful oncogenes. To simultaneously target VEGFR and PDGFR, we used the multi-kinase inhibitor regorafenib. In vivo, at well-tolerated doses that allow prolonged treatment, regorafenib showed significant anti-tumor activity. This effect was mainly associated with a strong inhibition of vascularization, but also (with) induction of cell death. By expanding our study to other models of pediatric tumors, we observed that its activity was independent of histologic type. Given the oncogenic character of PDGFR, we evaluated the inhibitor in models which present a PDGFRA gene amplification, which results in a strong activation of the receptor. Combined with standard therapies that can induce DNA damages such as irinotecan or radiation, the effect of regorafenib was potentiated, mainly in PDGFRA gene amplified models, where tumor regressions were obtained. These preclinical evaluations support the development of a new therapeutic strategy for children with solid tumors.

Le facteur de transcription p73 est impliqué dans des pathologies du système neuronal (maladie d’Alzheimer, neuroblastome…) en régulant le cycle cellulaire, l’apoptose et la différenciation neuronale.Identifier les modifications post-traductionnelles de p73 permettrait de mieux comprendre les fonctions biologiques des isoformes p73 et leurs régulations. Notre analyse bio-informatique prédit entre autres, trois sites sur p73 potentiellement phosphorylés par la calcium-calmoduline dépendante kinase 2 (CamKII), qui est aussi impliquée dans le cycle cellulaire, l’apoptose et la différenciation neuronale. Après avoir confirmé la phosphorylation de p73 par cette kinase in vitro, nous avons démontré que la CamKII favorise l’activité transcriptionelle de p73 et modifie le niveau de protéique des isoformes de p73. L’étude de la caractérisation des sites impliqués dans cette régulation suggère que les effets de la CamKII sur p73 résultent davantage de la coopération de l’ensemble des sites que d’un seul site précis. Par ailleurs, cette étude moléculaire s’inscrit dans un contexte physiologique précis où l’apoptose neuronale induit par le déséquilibre de l’homéostasie calcique s’expliquerait en partie par la signalisation p73-CamKII. / The transcription factor p73 is implicated in neurodegenerativ diseases (Alzheimer disease, neuroblastoma…) by regulating cell cycle, neuronal apoptosis and differenciation.Identifying the post-translationnal modifications on p73 would allow to better understand the p73 biological functions and regulations. Bioinformatic analyses predict amongst others, three potential phosphorylation sites on p73 for the calcium-calmodulin dependant kinase 2 (CamKII), which is also implicated in cell cycle, neuronal apoptosis and differenciation. After showing the p73 phosphorylation by CamKII in vitro, we demonstrated that CamKII favors the p73 transcriptional activity and modulates the proteic expression of the p73 isoforms. The study to identify the sites implicated in these CamKII effects highlights cooperation between the sites instead of the prevalence of a specific site.. Besides this molecular approach, we also investigate the implication of this regulation in a physiologic context. Our results reveal that the neuronal death triggered by a calcic homeostasis alteration could be mediated by the p73-CamKII signalization.

Le FGF1 est un facteur de croissancenon sécrété, localisé dans le cytosol et le noyau.Il induit la prolifération, la différenciation et lasurvie cellulaires. Il est également impliqué dansla progression tumorale et peut conférer unechimiorésistance aux tumeurs qui lesurexpriment.Notre équipe s’intéresse depuis plusieursannées aux activités intracrines du FGF1 en tantque régulateur de la différenciation et de lasurvie cellulaires. L’équipe a ainsi montré que leFGF1 intracellulaire a une activité antiapoptotiquedans plusieurs modèles cellulaires :cellules REtsAF (fibroblastes de rat), PC12(phéochromocytome de rat), SH-SY5Y(neuroblastome humain) suite à l’induction del’apoptose dépendante de p53 via un stressgénotoxique. Dans les cellules PC12, un modèled’étude de la différenciation neuronale, le FGF1possède également une activité neurotrophique.À l’aide de différentes formes mutantes duFGF1, nous avons cherché à mieux caractériserles mécanismes régulant son activité antiapoptotiquedans les cellules PC12 et SH-SY5Y,ainsi que son activité neurotrophique dans lescellules PC12. Nous avons pu montrer que ledomaine C-terminal du FGF1 ainsi que sesmodifications post-traductionnelles sontimportants pour la régulation de ses activitésintracellulaires ; et que la phosphorylation duFGF1 inhibe son activité anti-apoptotique dansles cellules PC12 et SH-SY5Y mais ne régule passon activité de différenciation dans les cellulesPC12.Nos résultats montrent donc pour lapremière fois le rôle de la phosphorylation dansla régulation des activités du FGF1 et ce dansdeux modèles cellulaires de rat et humain. / .FGF1 is a non-secreted cytosolic andnuclear growth factor, inducing cell proliferation,differentiation and survival. FGF1 is also involvedin tumor progression and can inducechemoresistance in FGF1 overexpressing tumors.Our team has focused for several years onthe FGF1 intracrine neurotrophic and survivalactivities. The team has shown that intracellularFGF1 is an anti-apoptotic factor in several celllines : REtsAF (rat fibroblasts), PC12 (derivedfrom a rat pheochromocytoma) and SH-SY5Ycells (derived from a human neuroblastoma)following the induction of p53-dependentapoptosis via a genotoxic stress. In PC12 cells, amodel of neuronal differentiation, FGF1 is also aneurotrophic factor.We aimed to better characterize themechanisms regulating the anti-apoptoticactivity of FGF1 by expressing various mutantforms of FGF1 in PC12 and SH-SY5Y cell lines. Wehave shown that FGF1 C-terminal domain and itspost-translational modifications are importantfor the regulation of its intracellular activities ;and that FGF1 phosphorylation inhibits its antiapoptoticactivities in both PC12 and SH-SY5Ycell lines, but does not affect its differentiationactivity in PC12 cells.Thus, our results showed for the first time thecrucial role of FGF1 phosphorylation in theregulation of its intracrine anti-apoptotic activityin both rat and human cellular models.

Le neuroblastome à haut risque est caractérisé par un faible taux de survie (~30%) et des récidives fréquentes, malgré les traitements multimodaux existants. Généralement, les études d’évaluation des médicaments utilisent la culture cellulaire en 2D, mais elle ne reflète pas la biologie tumorale du neuroblastome in situ, incluant les caractéristiques associées à l’hypoxie et la densité cellulaire. En comparaison aux patients, la culture cellulaire conventionnelle semble altérer le phénotype cellulaire du neuroblastome, le transcriptome et l’épigénome qui affecteront, à leur tour, les résultats des études pharmacologiques. Ainsi, un nouveau modèle de culture cellulaire en 3D a été développé avec plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome afin d’atteindre une culture de sphéroïdes à long terme (un mois) avec un taux de viabilité convenable. L’hypothèse de recherche est que les changements épigénétiques et transcriptionnels seront induits par l’adaptation en 3D et vont s’amplifier dans le temps lors de la culture en 3D. Ces changements ont été mesurés en 3D dans le temps pour identifier le moment où l’épigénome des sphéroïdes ressemble le plus à celui des patient à haut risque. Le changement de l’expression des régulateurs épigénétiques survient 24 jours après la mise en sphéroïde, ce qui se traduit par une différence dans la sensibilité aux médicaments épigénétiques par rapport à la culture 2D. En conclusion, notre étude nous a permis de dériver des nouveaux modèles de neuroblastome qui sont plus représentatifs des patients d’un point de vue épigénétique et pharmacologique. / High-risk neuroblastoma is characterized by a low survival rate (~30%) and frequent recurrences, despite all the multimodal treatments available to date. Typically, drug evaluation studies use 2D cell culture which does not reflect well the tumor biology of neuroblastoma in situ, including features associated with hypoxia and cell density. Thus, compared to patients data, the conventional 2D cell culture seems to alter the neuroblastoma cell phenotype, transcriptome and epigenome which in turn will affect the results of pharmacological studies. A new 3D cell culture model was developed with several neuroblastoma cell lines to achieve long term spheroid culture (up to one month) with a suitable viability rate. We hypothesized that transcriptional and epigenetic changes will be induced by 3D adaptation and will amplify over time in the cells cultured in 3D. All these changes were measured by Western Blot in 2D, in short term 3D and in long term 3D to identify the timepoint when the epigenome of the spheroids most closely resembles that of the patient. We found that the occurrence of changes in epigenetic regulator expression occurs after 24 days of spheroid culture, resulting in a difference in a drug sensitivity compared to 2D culture. In summary, we developed new neuroblastoma models that are more representative of patient’s epigenome and pharmacological sensitivity.

Malgré plusieurs chimiothérapies suivies d’une transplantation et d’une immunothérapie, 40% des patients avec un neuroblastome (NB) à haut risque subissent une progression de la maladie ou une rechute. L’échec de ces traitements est attribué à la présence de cellules initiatrices de tumeur (TIC) qui expriment le marqueur CD133 et qui sont souvent résistantes aux agents chimiothérapeutiques. Les cellules Natural Killer (NK), qui possèdent un effet anti-tumoral, peuvent être utilisées dans le cadre du développement de nouvelles approches immuno-thérapeutiques. Nous posons l’hypothèse que les cellules NK activées éliminent efficacement les TIC et contribuent à la réduction des risques de rechute. De plus, il est possible d’augmenter l’effet anti-tumoral des cellules NK contre le NB. L’activité cytotoxique des cellules NK est augmentée par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) activées. A la suite de la stimulation de leurs récepteurs Toll-like les pDC produisent de grandes quantités d'interféron-alpha (IFN-α). Nous avons étudié les propriétés lytiques des cellules NK contre des lignées cellulaires de NB à la suite de leur activation par l’IFN-α ou des pDC activées. Nos résultats révèlent une augmentation de l’activité cytolytique des cellules NK contre ces lignées en réponse à une stimulation par les pDC activées. De plus, les cellules de NB CD133+ ou celles résistantes à l’immunothérapie dirigée contre le GD2 sont sensibles à la lyse médiée par les cellules NK stimulées par les pDC. Nous avons examiné les mécanismes cellulaires impliqués dans la lyse des cellules de NB. Nous montrons que cette cytotoxicité est médiée en partie par TRAIL induisant l'apoptose et en partie par la libération des granules cytotoxiques. Ainsi, ces résultats permettent de proposer une nouvelle approche immuno-thérapeutique complémentaire au traitement par l’anticorps anti-GD2 pour les patients atteints de NB à haut risque. / Despite aggressive treatment by chemotherapy followed by transplantation and treatment with anti-tumor cell disialoganglioside (GD2) monoclonal antibody, IL-2, GM-CSF and retinoic acid, 40% of patients with high-risk neuroblastoma (NB) still undergo disease progression or relapse. Furthermore, tumor-initiating cells (TIC) expressing the CD133 marker are present in NB tumors and are more resistant to chemotherapy. To evaluate a new immunotherapeutic approach, we took advantage of the anti-tumor effect of Natural Killer (NK) cells. We hypothesized that activated NK cells would be a potent therapeutic strategy to eliminate TIC and reduce relapse of NB. We aimed to establish the best strategy to increase the NK cell mediated cytotoxicity against NB. NK cell cytotoxic activity is increased by cytokines, chemokines and activated plasmacytoid dendritic cells (pDC) which produce high amounts of interferon-alpha (IFN-α) upon Toll-like receptor stimulation. We investigated NK-cell lytic properties against NB cell lines following activation by IFN-α or activated pDC. Our results reveal an increased cytolytic activity of NK cells against NB cell lines after stimulation by activated pDC, CD133+ (TIC) as well as anti-GD2 resistant NB cells are sensitive to NK cell mediated cytotoxicity following stimulation by activated pDC. We also examined the cellular mechanisms involved in NK cell-mediated lysis of NB cell lines. The increased cytotoxicity is partially mediated by TRAIL induced apoptosis and as well as by the release of cytolytic granules. In conclusion, we propose a new immunotherapeutic approach that can be used in combination with the anti-GD2 therapy for the treatment of high-risk NB patients.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur extra-crânienne la plus fréquente du jeune enfant. Malgré une thérapie multimodale très agressive, 40% des patients atteints de NB à haut risque rechutent. Le traitement de ces patients consiste à éliminer la tumeur par chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, à reconstituer la moelle osseuse par une greffe de cellules souches autologues et enfin à éliminer la maladie résiduelle (MRD) par une immunothérapie visant l’antigène GD2 exprimé par les neuroblastes. Notre étude préclinique a examiné l’efficacité de deux stratégies de traitements qui visent à potentialiser les thérapies actuelles et réduire leur toxicité. La première consiste à réduire la masse tumorale par la radiothérapie ciblée combinée à des radiosensibilisants. La deuxième approche est basée sur l’activation des cellules natural killer (NK) pour potentialiser l’effet de l’immunothérapie anti-GD2 et éliminer la MRD. L’autophagie est un processus catabolique qui élimine les protéines et organelles endommagées par différents stress incluant les irradiations. Par conséquent, inhiber l’autophagie pourrait sensibiliser les neuroblastes aux irradiations. Or, nous avons montré qu’étant très radiosensibles, les neuroblastes ne sont pas davantage éliminés par les irradiations quand ils sont traités avec un inhibiteur de l’autophagie. De plus, l’absence d’un inhibiteur efficace de l’autophagie à usage thérapeutique ne permet pas actuellement d’adopter cette approche. Notre étude a également permis de révéler une nouvelle approche de stimulation des cellules NK par les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) activées par un ligand du récepteur Toll-like, capable d’éradiquer la MRD et prévenir les rechutes de NB. Nos résultats ont permis, d’une part, d’élucider les mécanismes impliqués dans la lyse des cellules NK activées par les pDC contre les neuroblastes et, d’une autre part, de démontrer que l’axe pDC-NK chez le patient est fonctionnel, augmente l’efficacité de l’anti-GD2 et élimine efficacement les neuroblastes. Ainsi, l’immunothérapie par les cellules NK est une stratégie très prometteuse pour traiter le NB. Cette étude préclinique servira de base à l’élaboration d’un essai clinique pour traiter les enfants atteints de NB au CHU Sainte Justine. / Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumor in childhood. Despite aggressive multimodal therapy, 40% of patients with high-risk NB relapse. The current therapy comprises an induction treatment with chemotherapy and surgery, a consolidation treatment including radiotherapy and high-dose chemotherapy followed by bone marrow rescue with autologous hematopoietic stem cell transplantation and finally anti-GD2 immunotherapy targeting the disialoganglioside (GD2) antigen expressed by neuroblasts to treat minimal residual disease (MRD). Our preclinical study proposes two treatment strategies to potentiate current therapies and reduced toxicities. The first aim to reduce tumor mass by targeted radiotherapy combined with radiosensitizers. The second approach is based on the activation of natural killer (NK) cells to potentiate the effect of anti-GD2 therapy and eliminate MRD. Autophagy is a catabolic process that recycle damaged proteins and organelles, induced under various conditions of cellular stress including irradiation. Therefore, inhibiting autophagy could sensitize neuroblasts to irradiation. However, our study showed that neuroblasts were highly sensitive to irradiation and autophagy inhibitor failed to increase neuroblasts sensitization to irradiation. In addition, the absence of a potent autophagy inhibitor for therapeutic use does not allow this approach to be adopted. Our preclinical study demonstrated a novel approach based on NK cell stimulation with Toll-like activated plasmacytoid dendritic cells (pDC) that enhances the efficacy of anti-GD2 immunotherapy and prevent NB relapse. We elucidated the mechanisms involved in pDC-activated NK cells killing of neuroblasts. We further demonstrated that neuroblasts were efficiently killed by patient’s NK cells after stimulation by activated pDC. This is further increased by the addition of anti-GD2 antibody. Altogether, our study demonstrates that NK cell-based immunotherapy has a real potential to enhance anti-GD2 immunotherapy effect and prevent NB relapse. This preclinical study will serve as a basis for the development of a clinical trial to treat children with NB at CHU Sainte Justine.

Le neuroblastome pédiatrique à haut risque est incurable malgré l’intensification des traitements. Chez le patient, les cellules de neuroblastome échappent à l’activité anticancéreuse des cellules immunitaires Natural Killer (NK). Or, lorsque cultivées in vitro en monocouche (2D), les cellules de neuroblastomes redeviennent sensibles à l’activité cytotoxique des cellules NK ce qui ne reflètent pas leur résistance dans les tumeurs in situ. Nous faisons l'hypothèse que lorsque cultivées en 3D sous forme de sphéroïdes, les cellules de neuroblastome pourraient retrouver certaines caractéristiques qui les rendraient plus représentatives des tumeurs in situ au niveau immunologique. Ainsi, un tel modèle préclinique pourrait mieux refléter la résistance aux cellules NK et servir de modèle de criblage pour la découverte de médicaments potentialisant la cytotoxicité des cellules NK. Pour répondre à cette question, nous avons développé un système de culture cellulaire 3D utilisant plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome. À ce système, une co-culture en 3D avec une lignée de cellules Natural Killer (NK92) a été mise en place. Nous avons mis en évidence que les sphéroïdes de neuroblastome présentent des changements d’expression de certains gènes qui sont retrouvées chez les patients ainsi qu’une plus grande résistance à l’activité cytotoxique des cellules NK92 en comparaison avec les lignées en monocouche. Les co cultures de sphéroïdes ont été exposées à des inhibiteurs de protéines impliquées à différents niveaux de l’épigénome afin de découvrir des médicaments qui sensibiliseraient les cellules de neuroblastome à l’activité cytotoxique des NK92. Une différence dans la sensibilité aux médicaments entre les sphéroïdes et les cellules en 2D ainsi qu’en monoculture ou en co-culture a été observée et certains composés ont été identifiés en vue de potentialiser l’activité des cellules NK92. Ainsi, nos études ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la résistance des cellules du neuroblastome à l’activité cytotoxique des cellules NK dans un modèle plus représentatif de la tumeur in situ. / High-risk pediatric neuroblastoma remains incurable despite intensified treatments. In patients, neuroblastoma cells evade the anti-cancer activity of Natural Killer (NK) immune cells. However, when cultured in vitro in a monolayer (2D), neuroblastoma cells become sensitive to the cytotoxic activity of NK cells, which does not reflect their resistance in tumors in situ. We hypothesize that when cultured in 3D in the form of spheroids, neuroblastoma cells could regain certain characteristics that would make them representative of tumors in situ at the immunological level. Thus, such a preclinical model could better reflect NK cell resistance and serve as a screening model for drug discovery to discover a treatment that can potentiate NK cell cytotoxicity. To answer this question, we developed a 3D cell culture system using several neuroblastoma cell lines. To this system, a 3D coculture model with a Natural Killer (NK92) cell line was set up. We have shown that neuroblastoma spheroids develop changes in the expression of certain genes that are found in patients as well as greater resistance to NK92 cells compared to monolayer cell lines. Spheroid cocultures were exposed to inhibitors of proteins involved at different levels of the epigenome to discover drugs that would sensitize neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK92. A difference in drug sensitivity between spheroids and cells in 2D as well as in monoculture or coculture was observed and some compounds were identified to potentiate the activity of NK92 cells. Thus, our studies have provided a better understanding of the mechanisms involved in the resistance of neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK cells in a more representative model of the tumor in situ.