L’activació microglial és un fenomen fisiològic que permet resoldre alteracions a l’homeostasi. Quan l’estímul desencadenant de l’activació microglial és proinflamatori, es desencadena una resposta inflamatòria en la que la micròglia produeix citocines i altres factors proinflamatoris que tenen potencial neurotòxic. Si aquesta activació es dóna de forma exacerbada o es cronifica, pot acabar tenint un efecte perniciós. De fet, diversos autors postulen que l’activació microglial pot agreujar el curs de patologies com l’Alzheimer o el Parkinson. És per això que en aquesta tesi ens vam plantejar la inhibició del fenotip proinflamatori de l’activació microglial com una diana terapèutica en les malalties neurodegeneratives. El primer objectiu va ser establir i caracteritzar un model in vitro de neuroinflamació, en el que estudiar el patró d’activació microglial a cultius tractats amb un estímul proinflamatori (LPS + interferó gamma). Així, vam determinar que la micròglia estimulada amb LPS/IFN-gamma s’activa amb un patró de resposta proinflamatori que es caracteritza per un increment en l’expressió dels enzims iNOS i COX-2 i en la producció de NO, TNF-alfa i IL-6. En una segona fase es va establir i caracteritzar un model de cocultiu de neurones i micròglia on estudiar la neurotoxicitat induïda per activació microglial en el que vam determinar que l’activació de la micròglia en resposta al LPS/IFN-gamma té un efecte neurotòxic principalment mediat per la producció de NO, mentre que el TNF-alfa la IL-6 i la COX-2 tenen un paper secundari. Una vegada establert el model experimental vam abordar la modulació de l’activació microglial inhibint els factors implicats en l’activació proinflamatòria, en concret els C/EBPs, ja que aquests factors regulen l’expressió de molts dels gens implicats en la resposta proinflamatòria microglial. La nostra hipòtesi era que la inhibició dels C/EBPs disminuiria aquesta resposta i tindria un efecte neuroprotector. La inhibició es va abordar des d’una aproximació farmacològica i una aproximació genètica. La inhibició farmacològica es va fer usant el flavonoide crisina que té efectes antiinflamatoris mediats per la inhibició dels C/EBPs en macròfags. Així, vam determinar que la crisina té un efecte antiinflamatori i neuroprotector i que aquest està mediat, si més no en part, per la inhibició de C/EBP-delta. Posteriorment, mitjançant la utilització de micròglia de ratolins deficients en C/EBP-beta o C/EBP-delta, vam determinar que l’absència de C/EBP-beta o C/EBP-delta inhibeix l’activació microglial i la neurotoxicitat associada. Els C/EBPs per tant són una possible diana terapèutica addicional per al tractament de patologies que cursen amb neuroinflamació. Per últim es va plantejar la inhibició de la sobreactivació microglial proinflamatòria potenciant els senyals inhibidors que mantenen a la micròglia en un estat quiescent, en concret la parella lligand-receptor CD200-CD200R. La nostra hipòtesi era que modulant l’activació de CD200R es podria inhibir la sobreactivació microglial i la neurotoxicitat associada. Així el tercer objectiu va ser estudiar, d’una banda quins estímuls poden modular l’expressió de CD200 a les neurones, i de l’altra quin és el paper de CD200 i CD200R en la modulació de l’activació microglial per part de les neurones. Per abordar aquest objectiu es va establir un model de mort neuronal apoptòtica i un model de mort neuronal necròtica per excitotoxicitat. En aquest model vam determinar que l’expressió de CD200 augmenta en neurones que estan morint, ja sigui per apoptosi com per necrosi, el que podria constituir un mecanisme de control de l’activació microglial en presència de mort neuronal (no es pot descartar que l’efecte observat sigui degut a una major estabilitat CD200 en front a altres proteïnes neuronals). Per últim ens vam plantejar estudiar l’efecte de la modulació de la senyalització CD200-CD200R sobre l’activació microglial i la neurotoxicitat associada, demostrant quel’expressió proteica de CD200 a neurones no es modula per estímuls antiinflamatoris com la IL-4 i la IL-10 ni proinflamatoris com el LPS i l’IFN-gamma. En resum, els resultats d’aquesta tesi mostren la utilitat dels models experimentals in vitro per estudiar la resposta inflamatòria de la micròglia i la neurotoxicitat resultant. Amb aquests models hem pogut establir la importància de la família de factors de transcripció C/EBPs en la regulació de la resposta inflamatòria microglial i suggerir la rellevància de CD200 en la comunicació entre la micròglia i les neurones que han entrat en un procés de mort cel•lular. / Microglial activation is a physiologic phenomenon that occurs in response to alterations of homeostasis. When microglia are activated by an pro-inflammatory stimulus there is an inflammatory response where cytokines and other pro-inflammatory factors with neurotoxic potential are released. A chronic or exacerbated response can have harmful effects; in fact many authors connect microglial pro-inflammatory overactivation with degenerative diseases such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Given that, the main goal of this thesis was develope strategies to inhibit pro-inflammatory microglial activation that could serve as therapeutic target in neurodegenerative diseases. To do so we set up and characterized an in-vitro model of neuroinflammation using LPS + interferon-gamma as a proinflammatory stimulus. Treated microglial cells undergo a proinflammatory response pattern characterized by the release of NO, TNF-alpha and IL-6 and the increase of iNOS and COX-2 expression. When microglial cells are co-cultured with cortical neurons, the pro-inflammatory response results in neurotoxicity, an effect mediated mainly by NO release, whereas TNF-alpha, la IL-6 and COX-2 may have a secondary role in the process. Using this model we tested whether we could modulate microglial activation by inhibiting C/EBPs, a family of transcription factors involved in the regulation of pro-inflammatory genes. We first used a pharmacologic approach treating microglial cells with an anti-inflammatory compound named crisin. We determinated that crisin has anti-inflammatory and neuroprotective effects and that these effects are mediated,at least in part, by C/EBP-delta inhibition. We then used a genetic approach to inhibit C/EBPs, by using microglial cells from KO mice. We showed that the lack of C/EBP-beta or C/EBP-delta inhibits microglial activation and the associated neurotoxicity. Therefore, we suggest that C/EBPs are a potential therapeutic target in the treatment of diseases where neuroinflammation is present. We also modulated microglial activation by potentiating the inhibitory signals that keep microglia in a resting state, such as the neuronal ligand CD200 and its microglial receptor CD200R. We showed that CD200 expression appears to increase in response to neuronal death but not in response to pro-inflammatory stimuli such as IL-4, IL-10 or anti-inflammatory stimuli such as LPS and IFN-gamma. In summary we demonstrated that in-vitro models can be used to study the pro-inflammatory and neurotoxic effect of the microglial response. Using this approach we determinated the relevance of C/EBPs in regulating microglial activation and our studies support an important role of CD200 in the crosstalk between microglia and neurons that undergoing cell death.

The aim of the thesis "Evaluation of the neurobehavioral effects of manganese exposure on rodents. Influence of stress", is to study and deepen about the manganese (Mn) potential prenatal, postnatal and adult toxic effects on the Central Nervous System (CNS), and about the possible impact of the stress situation on these toxic effects.Mn, as other trace elements, must be between certain limits of concentration in human and animal bodies, to work on well. An over exposition to Mn is associated to changes on CNS, with psychologic and neurologic symptoms, at the beginning the features are psychiatric alterations ("manganese madness"), that are very similar to the esquizofrenic ones. While at the first stages it can revert, at he last stages it persists, being irreversible.Development period is considered especially susceptible to a wide range of toxic expositions. Young animals not only absorve and retention Mn dramatically, but also they had showed a higher relative accumulation of Mn in CNS.Research in neurotoxicology on human beings give us advantages and disadvantages. In epidemiologic studies cause-effect or dose-effect relations can not be detected. Experimental control over the exposition is required to identify the relation between dose and Mn derived effects, in order to avoid this we chose research animals, rodents, to work on them. Mn neurotoxicity has been demonstrated when it is inhaled or injected, while possible toxic effects from Mn oral ingestion has been poorly studied, and data reported are not conclusive. There is also a lack of attention on Mn effects on development.After Mn intoxication symptoms observed in human beings are resembling to Parkinson symptoms, and this coincidence force the research to dopaminergic system, which has been extensively studied in relation to Mn effects. However, nowadays, the study of possible mechanisms of Mn neurotoxic action not only involves dopaminergic system, but also other transmitter systems. On the other hand, physic and psychologic stressors, provoke changes at CNS and more specifically, at dopaminergic system level.Given that, Mn and stressful situations affect, directly or indirectly, dopaminergic system function, Mn exposition at the same time that stress exposition could result as an interaction, increasing or modifying the effects of Mn on the CNS. The aim of this thesis is to assess the neurobehavioral effects of Mn prenatal, postnatal and in adults exposure on rodents and interactions of Mn and stress.Four studies has being done to reach the general goal of this thesis; and in with each one we could assess: Materno-toxic and feto-toxic effects of hydrocortisone (HC) and Mn prenatal exposure. Effects of Mn and stress prenatally exposed on postnatal development. Effects of chronic Mn oral exposure and stress exposure in adults. Neurobehavioral effects of two kinds of stress: restraint and noise.All these assessments gave us data about Mn toxicity: maternal, fetal, developmental and in adult animals. We also evaluated two types of stress models because of the rising interest in the assessment of stressful situations and more specifically in order to know the most suitable model of stress to use, in each case, in the future. / La tesi doctoral que porta per títol "Avaluació dels efectes neuroconductuals de l'exposició a manganès en animals d'experimentació. Influència de l'estrès", vol estudiar i aprofundir en els potencials efectes tòxics del manganès (Mn) sobre el sistema nerviós central (SNC), i la possible influència que les situacions d'estrès exercirien sobre aquesta toxicitat, a nivell prenatal, postnatal i en els éssers ja adults.El Mn, com altres elements essencials, ha de mantenir-se entre uns certs límits de concentració per un funcionament òptim de l'organisme. L'exposició excessiva a Mn està associada amb canvis al SNC, amb símptomes tant psicològics com neurològics, caracteritzats en el seu inici per una alteració psiquiàtrica ("bogeria mangànica") que recordaria força a l'esquizofrènia. Mentre que en fases inicials pot ser reversible, el manganisme més avançat persistiria, essent irreversible.El període del desenvolupament es considera especialment susceptible a un ampli rang d'exposicions tòxiques. Els animals molt joves no només absorbeixen i retenen Mn de manera excepcional sinó que també han mostrat una acumulació relativa més gran del Mn al SNC.Els estudis de neurotoxicitat del Mn conduïts en poblacions humanes comporten avantatges i desavantatges. En els estudis epidemiològics, les relacions causa-efecte o dosi-efecte no poden ser identificades. Es requereix el control experimental sobre l'exposició per poder identificar clarament relacions entre la dosi i l'efecte del Mn, d'aquí l'elecció de treballar amb animals d'experimentació, rosegadors.La neurotoxicitat del Mn ha estat demostrada quan aquest és inhalat o bé administrat per via parenteral. En canvi, els possibles efectes derivats del consum elevat de Mn per via oral han estat poc estudiats i no existeixen dades concloents al respecte. Així mateix, els efectes del Mn sobre el desenvolupament han rebut poca atenció.La simptomatologia observada en humans després de la intoxicació per Mn és semblant a la observada en la malaltia de Parkinson, la qual cosa ha fet que el sistema dopaminèrgic hagi estat àmpliament estudiat en relació als efectes del Mn. Tot i que en l'actualitat els possibles mecanismes de l'acció neurotòxica del Mn no es centren només en aquest sistema. Per altra banda, els estressors tant físics com psicològics, provoquen canvis a nivell de SNC, i concretament a nivell del sistema dopaminèrgic.Donat que el Mn i l'estrès afecten de forma directa o indirecta el funcionament del sistema dopaminèrgic, l'exposició concurrent a Mn i estrès es pot manifestar com una interacció, augmentant o modificant els seus efectes sobre el SNC. L'objectiu general d'aquest treball ha estat dirigit a avaluar els efectes neuroconductuals de l'exposició a Mn en rosegadors sobre la toxicitat materna, fetal, postnatal i en el subjecte adult, així com la influència que l'estrès pot exercir en aquesta exposició. En concret s'han fet 4 estudis per aconseguir l'objectiu general d'aquesta tesi; i en cadascun d'ells s'han estudiat:Els efectes materno i feto-tòxics de l'exposició prenatal a hidrocortisona (HC) i manganès (Mn), administrats s.c. (subcutani) Els efectes de l'exposició prenatal a Mn (administrat s.c.) i estrès en el desenvolupament postnatal. Els efectes de l'exposició crònica en adults a Mn i estrès, administrat via oral. Els efectes neuroconductuals de dos tipus d'estrès: estrès per immobilització i estrès per soroll.Mitjançant aquests estudis s'han obtinguts resultats que ens donen informació sobre la toxicitat: materna, fetal, durant el desenvolupament i en els animals adults. També hem avaluat diferents tipus o models d'estrès degut al gran interès que té l'avaluació de l'estrès i, en concret, la idoneïtat del model d'estrès a utilitzar en cada cas i en el futur.

Adolescence is a critical developmental period in which the brain emerges from an immature state to adulthood. This process of brain development is associated to greater cognitive capacity but also to altered emotional behaviour, such as anxiety and depressive symptoms; as well as increased sensation-seeking and risk taking behaviour. The proper development of brain and behaviour into adulthood can be negatively affected by external factors such as drug abuse and environmental conditions. This work consists firstly on, studying the impact of binge ethanol, 3, 4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA) and its combination in adolescent mice. Secondly, study the consequences of early-life stressful experiences (social isolation) into adulthood. Main results obtained from the first objective are that the combination of binge ethanol and MDMA induces emotional-like alterations. These alterations can be prevented by antidepressant treatment. In addition, MDMA induces memory impairments that may be associated to oxidative damage to specific proteins in the hippocampus. Neuroinflammation is also present after MDMA treatment, but not after binge ethanol treatment, in mice striatum. Metabolomic studies indicate that brain metabolism is altered after binge ethanol, MDMA or its combination. Even though these are only preliminary results, these alterations might be due to an imbalance in tryptophan metabolism. Regarding the second objective, our findings indicate that social isolation during adolescence induces an altered response to novel and stressful situations. These alterations are probably due to altered HPA axis activity. / L'adolescència és un període crític en el desenvolupament de l’individu en el qual el cervell va d’un estat immadur a l’edat adulta. Aquest procés va acompanyat d’una elevada capacitat cognitiva però també de freqüents alteracions de tipus emocional, com l’ansietat o els símptomes depressius, així com la cerca de sensacions de risc. Un bon desenvolupament del cervell i del comportament es pot veure negativament afectat per factors externs com són l’abús de drogues i les condicions ambientals desfavorables. Aquest projecte consisteix en primer lloc, a estudiar l'impacte de l’alcohol en excés, la 3, 4-Metilendioximetamfetamina (MDMA) i la seva combinació en ratolins adolescents. En segon lloc, estudiar les conseqüències en l’edat adulta d’experiències estressants durant l’adolescència. Els principals resultats obtinguts referents al primer objectiu són que la combinació d'alcohol en excés i MDMA provoca alteracions de tipus emocional. Aquestes alteracions poden ser previngudes pel tractament amb antidepressius. A més, la MDMA indueix un deteriorament de la memòria que pot estar associada amb el dany oxidatiu a proteïnes específiques de l'hipocamp. També s’ha observat una resposta neuroinflamatòria en el cos estriat dels ratolins després del tractament amb MDMA, però no després del tractament amb etanol en excés. Finalment, estudis de metabolòmica indiquen que el metabolisme cerebral es veu alterat després de l’alcohol en excés, la MDMA o la seva combinació. Tot i que només són resultats preliminars, aquestes alteracions poden ser conseqüència d'un desequilibri en el metabolisme del triptòfan. Referent al segon objectiu, els nostres resultats indiquen que l'aïllament social durant l’adolescència indueix una resposta alterada a situacions novelles i estressants. Aquestes respostes anormals són probablement conseqüència d’alteracions en l’activitat de l’eix HPA.

La 3,4-metilendioximetamfetamina (MDMA, èxtasi) i el cannabis són dues drogues les quals es consumeixen conjuntament de manera habitual. Malgrat que tots dos compostos presenten propietats reforçant i potencial addictiu, també tenen propietats farmacològiques oposades. La MDMA es una droga psicoestimulant, la qual causa hiperlocomoció, hipertèrmia, resposted de tipus asiogènic i neurotoxicitat. Per altra banda el Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), principal compost psicoactiu del cannabis, posseeix efectes relaxants, hipolocomotors, hipotèrmics i neuroprotectors. Els efectes de la MDMA i el THC al sistema nerviós central es troben mediats per dos mecanismes notablement diferents. La MDMA augmenta els nivells extracel·lulars de dopamina i serotonina, mentre que el THC produeix l'activació del receptor cannabinoide CB1. Cal destacar a més que les interaccions entre els sistemes monoaminèrgic i endocannabinoide s'observa de manera freqüent en l'organisme.En el present estudi hem explorat la implicació del sistema endocannabinoide i la MDMA en diversos aspectes. Per una banda el receptor cannabinoide CB1 juga un important paper en els efectes hiperlocomotors i hipertèrmics, i en les respostes de tipus ansiogènic produïdes per la MDMA. Curiosament, encara que el receptor CB1 no participa en els efectes recompensants primaris de la MDMA, és imprescindible per que tinguin lloc els seus efectes reforçants. Així mateix, l'alliberació de serotonina per part de la MDMA redueix de manera dosi-depenent la simptomatologia física causada pel síndrome d'abstinència a cannabinoides precipitada per un antagonista del receptor CB1. Finalment, el tractament amb THC era capaç de prevenir la hipertèrmia, activació glial, estrès oxidatiu i pèrdua de terminals causada per la MDMA. Com a conseqüència el THC exerceix un efecte neuroprotector contra la neurotoxicitat induïda per la MDMA. / 3,4-methylenedioximethamphetamine (MDMA, ecstasy) and cannabis are two drugs frequently consumed in combination. Despite both compounds have rewarding properties and abuse liability, they show opposite pharmacological properties. On the one hand, MDMA is a psychostimulant drug with hyperlocomotor, hyperthermic, anxiogenic-like and neurotoxic effects. On the other hand, Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), the main psychoactive compound of cannabis, has relaxant, hypolocomotor, hypothermic and neuroprotective properties. The effects of MDMA and THC in the central nervous system are mediated by two different mechanisms. MDMA enhances the extracellular levels of dopamine and serotonin, whereas THC activates the CB1 cannabinoid receptor. Likewise, interactions between the monoaminergic and the endogenous cannabinoid system have been frequently observed.In the current study, we explored the involvement of CB1 cannabinoid receptor on the hyperlocomotor, hyperthermic, anxiogenic-like, rewarding and reinforcing effects of MDMA. We also studied the effect of acute and chronic administration of MDMA on rimonabant-precipitated THC withdrawal syndrome. Furthermore, we explored the neuroprotective effects of THC on MDMA-induced neurotoxicity.As a result of this study we may conclude that endocannabinoid system and MDMA interact in a wide variety of aspects. CB1 receptor plays an important role on the hyperlocomotor, hyperthermic, and anxiogenic-like effects of MDMA. Interestingly, CB1 receptor is essential for the reinforcing but not the primary rewarding properties of MDMA. In addition, the release of serotonin by MDMA dose-dependently reduced the severity of THC withdrawal syndrome triggered by a CB1 antagonist. Finally, pretreatment with THC prevented the hyperthermia, glial activation, oxidative stress and terminal loss caused by MDMA. Consequently, THC exerts a neuroprotective effect against MDMA-induced neurotoxicity.