Orientador: Ary Fernandes Júnior / Resumo: As doenças infecciosas, incluindo aquelas transmitidas por alimentos, causadas por micro-organismos ainda representam uma grande preocupação, especialmente devido ao surgimento de bactérias resistentes aos antimicrobianos atualmente em uso. Várias substâncias provenientes de plantas exibem atividades inibitórias sobre micro-organismos, sendo uma estratégia empregada para buscas de novos fármacos que interfiram nos mecanismos de resistência. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito inibitório de cinco compostos voláteis majoritários encontrados em óleos essenciais de algumas plantas (eugenol, cinamaldeído, terpineol, geraniol e citronelol) sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (padrões ATCC e isolados clínicos) para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pela metodologia da microdiluição (Resazurin Microtiter Assays-REMA). Além disto, foram testadas combinações entre os compostos e drogas antimicrobianas de uso convencional para verificação de sinergismo e a influência de concentrações subinibitórias dos compostos na produção de enterotoxinas estafilococócicas dos tipo A, B, C e D. A fim de ilustrar o efeito dessas substâncias nas células bacterianas de E. coli e MRSA e na formação do septo divisional em X. citri, foram feitas imagens por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia de fluorescência, respectivamente. O composto que apresentou melhor atividade antimicrobiana sobre as linhagens bacterianas testadas foi o cinamaldeído com ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Les cellules T auxiliaires TH17 sont caractérisées par l’expression de la cytokine IL-17A, ainsi que le facteur de transcription RORɣt. Elles sont connues pour jouer un rôle clé dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Ces cellules existent sous deux formes : les cellules régulatrices, immunomodulatrices, et les cellules pathogènes qui sont critiques pour l'inflammation. Il est donc important de comprendre le mécanisme qui sous-tend la différenciation des cellules TCD4+ naïves en ces deux types cellulaires. J'ai trouvé que le facteur de transcription Ikaros est un répresseur indirect de la transcription des gènes pathogéniques (Il3, Csf2, Ifng, Stat4…) dans les cellules TCD4+ naïves murines, cultivées pour induire une polarisation vers le phénotype TH17 régulateur. De plus, en absence d’Ikaros et en conditions de culture régulatrice, l’ajout d’IL-6 seul augmente l’expression de GM-CSF, facteur clé dans l’induction des maladies auto-immunes, suggérant un rôle d’Ikaros dans la régulation de cette voie. En conclusion, nos résultats suggèrent que Ikaros est nécessaire pour polariser correctement les cellules TCD4+ naïves dans le programme TH17. / TH17 cells are characterized by the expression of the cytokine IL-17A, as well as the transcription factor RORɣt. They are known to play key role in the pathogenesis of the multiple sclerosis. These cells exist in two forms: the regulating cells, immunomodulatory, and the pathogenic cells which are critical for the inflammation. Thus it is important to understand the mechanism which underlies the differentiation of naïve CD4+ T cells in these two cellular types. I found that the transcription factor Ikaros is an indirect repressor of the transcription of pathogenic genes (Il3, Csf2, Ifng, Stat4…) in naïve CD4+ T cells, cultured to induce a polarization toward regulatory TH17 cells. Moreover, in absence of Ikaros and in regulatory condition of culture, adding IL-6 alone increases the expression of GM-CSF, key factor to induce auto-immune diseases, suggesting a role of Ikaros in this pathway. In conclusion, our results suggest that Ikaros is necessary to polarize correctly naïve CD4+ T cells in TH17 cells.

Escherichia coli patogênicas extraintestinais (ExPEC) causam colibacilose aviária, infecções do trato urinário e meningite neonatal em humanos. A cepa ExPEC MT78 é virulenta in vitro e in vivo, e possui a habilidade de invadir células eucarióticas. Para melhor entender o fenótipo invasivo dessa cepa, foi criada uma biblioteca de mutantes aleatórios pela técnica de mutagênese marcada com assinatura, e os mutantes foram selecionados negativamente em ensaio de invasão a fibroblastos aviários. Mutantes atenuados apresentaram mutação em genes do operon da fímbria do tipo 1 e nos genes de metabolismo de açúcares treA e bglB. Foram feitos mutantes específicos para o gene que codifica a enzima trealase periplasmática (TreA) e para o operon de metabolismo de β-glicosídeos (bgl). O mutante MT78ΔtreA apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários, na expressão da fímbria do tipo 1 e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária. O mutante MT78Δbgl também apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária, mas não mostrou alteração na expressão da fímbria do tipo 1, medida por aglutinação de leveduras. Os resultados deste trabalho mostraram que a trealase periplasmática afeta a expressão da fímbria do tipo 1 e a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78, enquanto o operon do metabolismo de β-glicosídeos afeta a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78 por um mecanismo ainda não-elucidado. / Extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) cause colibacillosis in birds, urinary tract infections and neonatal meningitis in humans. The ExPEC strain MT78 is virulent in vitro and in vivo, and is able to invade eukaryotic cells. In order to better understand the invasive phenotype of this strain, a library of random mutants was made using the signature-tagged mutagenesis approach. The mutants were negatively selected in invasion assays of avian fibroblasts. Attenuated mutants presented mutation in the type 1 fimbria operon and in the genes of sugar metabolism treA and bglB. Specific mutants were created for the periplasmic trehalase (TreA) gene and for the β-glycosides metabolism operon (bgl). The MT78ΔtreA mutant displayed, in comparison with the wild type strain, a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos, on type 1 fimbriae expression and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection. The MT78Δbgl mutant, compared to the wild type strain, also displayed a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection, but did not show any difference on type 1 fimbriae expression as detected by yeast agglutination. Taken together, our results show that the periplasmic trehalase affects type 1 expression and in vivo virulence of the ExPEC strain MT78, and the operon for β-glycosides metabolism affects in vivo virulence by an as yet unidentified mechanism.

Entre as 12 espécies do gênero Yersinia, Yersinia enterocolitica é a mais prevalente como causa de doença em humanos e animais. Sua patogenicidade é relacionada, entre outras características, a seis biotipos: o 1B e os biotipos 2 a 5 comprovadamente patogênicos e o biotipo 1A, considerado como não-patogênico. Entretanto, dados da literatura relatam linhagens do biotipo 1A como sendo os agentes causais de infecções em humanos e animais. O objetivo deste trabalho foi investigar o potencial patogênico e verificar a similaridade genômica de linhagens de Y. enterocolitica biotipo 1A, isoladas de material clínico e não-clínico. Foram estudadas 52 linhagens de Yersinia enterocolitica biotipo 1A isoladas de humanos (11), animais (11), alimentos (15) e ambiente (15), quanto a susceptibilidade a antimicrobianos, comportamento frente a testes fenotípicos relacionados à virulência, resistência a reativos intermediários do oxigênio, invasão a células HEp-2 e Caco-2, presença de genes de virulência por PCR e similaridade genômica por Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR) e Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Tanto as linhagens clínicas como as não-clínicas apresentaram resistência à ampicilina e à cefalotina. Não foi observada diferença entre linhagens de origem clínica e não-clínica frente aos testes de fermentação da salicina, hidrólise da esculina, atividade da pirazinamidase, reativos intermediários do oxigênio e invasão a células HEp-2. Entretanto, linhagens de origem não-clínica foram mais invasivas a células Caco-2 do que as de origem clínica. Oito dos 11 genes de virulência pesquisados foram encontrados. Os genes ystB, hreP e fepD foram mais freqüentemente detectados em linhagens de origem clínica. Ao contrário, os genes myfA, fepA, fes e tccC apresentaram-se mais freqüentes nas linhagens de origem não-clínica. Entretanto, a diferença na freqüência de tais genes não foi estatisticamente significativa entre linhagens clínicas e não-clínicas. O gene inv foi detectado em todas as linhagens estudadas, entretanto, os genes ail, ystA e virF não foram detectados em nenhuma das 52 linhagens. O dendrograma de similaridade genômica consenso das técnicas de ERIC-PCR e PFGE, permitiu a visualização de dois grupos (A e B). Foi observada uma alta similaridade genômica (>63%) entre quase todas as linhagens isoladas de humanos e animais, bem como uma alta similaridade genômica para a maioria das linhagens de origem clínica e não-clínica (>58%). O índice de discriminação de ERIC-PCR foi 0,98, e o de PFGE foi 0,99. Entre as linhagens do biotipo 1A estudadas, não foi observada diferença entre o potencial patogênico de linhagens de origem clínica e não-clínica frente aos testes fenotípicos realizados e prevalência de genes de virulência pesquisados. A exceção foi o teste de invasão a células Caco-2, onde as linhagens não-clínicas foram mais invasivas. As técnicas de ERIC-PCR e PFGE discriminaram similarmente as linhagens estudadas. A alta similaridade genômica entre as linhagens de origem clínica e não-clínica evidencia os animais como sendo importantes reservatórios de Y. enterocolitica biotipo 1A e sugere que isolados de ambiente e alimentos tem sido fonte de contaminação de humanos e animais. / Among the 12 species of the genus Yersinia, Yersinia enterocolitica is the most prevalent cause of illness in humans and animals. Among other characteristics, its patogenicity is related to six biotypes: 1B and 2 to 5 considered pathogenic and the 1A biotype considered non-pathogenic. Despite being defined as non-pathogenic, literature has been shown that biotype 1A strains may be the etiological agents of infections in humans and animals. The aim of this work was to investigate the pathogenic potential and to verify the genomic similarity of Y. enterocolitica biotype 1A isolated from clinical and non-clinical sources. Fifty-two strains of Y. enterocolitica biotype 1A isolated from humans (11), animals (11), food (15), and environment (15) were analyzed regarding their susceptibility to antimicrobials, behavior against phenotypic tests related to virulence, resistance to oxygen intermediate reactives, invasion to HEp-2 and Caco-2 cells, presence of virulence genes by PCR, and genomic similarity by Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR) and Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Both clinical and non-clinical strains showed resistance to ampicillin and cephalothin. It was not observed any difference in the pathogenic potential between clinical and non-clinical strains face of the following tests: salicine fermentation, esculin hydrolysis, pirazinamidase activity, oxygen intermediate reactives and HEp-2 cell invasion assay. On the other hand, the non-clinical strains were more invasive to Caco-2 cells than the clinical ones. Eight of 11 studied virulence genes were found. Genes ystB, hreP and fepD were more often detected in clinical strains. In contrast, myfA, fepA, fes and tccC were presented more frequently in non-clinical strains. However, the frequency difference of those genes was not statistically significant between clinical and non-clinical strains. The inv gene was detected in all the strains studied; but no ail, ystA, and virF genes were found in any of the 52 strains. ERIC-PCR and PFGE dendogram allowed the visualization of two groups named A and B. It was observed a high genomic similarity among almost all human and animal isolated strains (>63%), as well as a high genomic similarity between the clinical and non-clinical strains (>58%). The discriminatory index for ERIC-PCR was 0.98 and for PFGE was 0.99. Among biotype 1A strains no difference was observed between the pathogenic potential of clinical and non-clinical strains face to the phenotype tests employed, and regarding the prevalence of the studied virulence genes. The exception was the Caco-2 cells invasion assay where non-clinical strains were more invasive., ERIC-PCR and PFGE discriminated the studied strains similarly. The high genomic similarity between the clinical and non-clinical strains gives evidence that animals constitute important reservoirs of Y.enterocolitica biotype 1A and suggests that environmental and food isolates have been the source of human and animal infections.

No presente estudo, um conjunto de três experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a ocorrência de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes em três lacticínios (A, B e C) localizados na região sudeste do Brasil de dezembro 2013 a abril de 2015 (Experimento 1), a eficiência do tratamento com ácido peracético (APA) e jato de plasma a frio (PF) para inativar os isolados em diferentes tempos (Experimento 2) e a capacidade dos isolados produzir biofilmes na superfície de poliestireno e de aço inoxidável, juntamente com inativação e remoção de células aderidas pelo APA (Experimento 3). No Experimento 1, foram analisadas amostras de leite e queijo, superfícies com e sem contato com alimentos. L. monocytogenes foi isolada em apenas uma amostra (0,3%, N = 349) de ralo no laticínio B, enquanto seis (1,7%, n = 349) S. aureus foram isolados de luvas de manipuladores em laticínio A, salmoura no laticínio B e superfície do queijo, utensílio, bota e mão esquerda de trabalhador no lacticínio C. Apesar das incidências desses dois agentes patogênicos de origem alimentar nos lacticínios avaliados foram baixo, sua presença também indica a necessidade de controle estratégias para impedir a sua persistência e contaminação cruzada. No Experimento 2, tratamento com APA (0,5%) e jato de PF foram aplicados diretamente sobre suspensões de isolados de S. aureus e L. monocytogenes. A inativação bacteriana (aproximadamente de 7 ciclos log) foi alcançada em 120 seg. com o tratamento com APA para todos os isolados, enquanto que o tratamento com plasma a frio reduziu aproximadamente 2 ciclos log nas superficies. Outros estudos usando tratamentos de plasma a frio mais longos são necessários para a total descrição da cinética desta tecnologia para a inativação de importantes patógenos de origem alimentar. No Experimento 3, o tratamento com APA (0,5%) em diferentes tempos (0-controle, 15, 30, 60 e 120 seg.) foi avaliada para a remoção de células aderidas de quatro isolados de S. aureus e um isolado de L. monocytogenes em microplacas de poliestireno, assim como para a inativação de biofilmes dos isolados em aço inoxidável. O tratamento com APA removeu (p<0,05) células aderidas de todos os isoladoas estudados S. aureus da superfície, sem diferenças (p> 0,05) no indice de formação de biofilmes nos tempos de tratamento. No entanto, nenhum efeito (p> 0,05) foi observado em células aderidas de L. monocytogenes. A microscopia de epifluorescência mostrou que todas as bactérias testadas foram parcialmente e completamente inativadas após 15 seg e 30 seg. respectivamente. Os resultados indicam um potencial para a utilização de APA contra biofilmes formados por S. aureus e L. monocytogenes, e da necessidade de novos estudos com a PF para determinar os parâmetros ideais para a inativação dos patógenos de origem alimentar. / In the present study, a set of three experiments were conducted aiming to evaluate the occurrence of Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in three dairy plants (A, B and C) from Southeast region of Brazil from December 2013 to April 2015 (Experiment 1), the efficiency of peracetic acid (PAA) and cold plasma (CP) jet treatment to inactivate the isolates at different times (Experiment 2) and the ability of the isolates to produce biofilms on polystyrene and stainless steel surface, along with inactivation and removal of biofilms by PAA (Experiment 3). In Experiment1, samples of milk and cheese, food contact surfaces and non-food contact were analyzed. L. monocytogenes was isolated in only one sample (0.3%, N=349) of drain sponge swab in dairy plant B, while 6 (1.7%, N=349) S. aureus strains were isolated from handlers\' glove in dairy plant A, brine in dairy plant B and cheese surface, cheese utensil, worker\'s boot and worker\'s left hand in dairy plant C. Although the incidences of those two food-borne pathogens in the dairy plants evaluated were low, their presence also indicates the need for control strategies to prevent their persistence and cross-contamination. In Experiment 2, PAA (0.5%) and CP jet treatment were applied directly on suspensions of S. aureus and L. monocytogenes strains. Reduction of bacterial load (nearly 7 log cycles) was achieved with 15 sec. of PAA treatment of all strains, whereas CP treatment reduced approximately 2 log cycles after 2 min. Hence, plasma treatment has a potential for reducing the bacterial load on surfaces, although further studies using longer CP treatment times are necessary to fully describe the kinetics of this technology for inactivation of important food pathogens. In Experiment 3, PAA (0.5%) treatment at different times (0-control, 15, 30, 60 and 120 sec.) was evaluated for removing of adherent cells of 4 strains of S. aureus and one strain of L. monocytogenes on polystyrene plates, as well as for inactivation of biofilms of those strains on stainless steel. PAA treatment removed (p<0.05) all the S. aureus cells from the surface, with no difference (p>0.05) in the reduction of the biofilm-forming index at the treatment times. However, no effect (p>0.05) was observed on L. monocytogenes adhered cells. Epifluorescence microscopy showed that all bacterial strains tested were partially and completely inactivated after 15 sec. and 30 sec., respectively. Results indicate a potential use of PAA against biofilms formed by S. aureus and L. monocytogenes, and the need of further studies with CP to determinate the ideal parameters for inactivation of food-borne pathogens.

Amostras de biofilme de biomassa suspensa de tanque de aeração de lodo ativado, de córrego contaminado com esgoto e de vários pontos de planta de tratamento de água foram analisadas com relação à presença de bactérias indicadoras e patogênicas. Nos testes presuntivos foram detectados todos os microrganismos-alvo (Coliformes, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. e Legionella spp.), porém nos testes confirmatórios por PCR e teste bioquímico somente as espécies E. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, e L. pneumophila foram confirmadas para algumas cepas selecionadas dos testes presuntivos. S. flexneri foi somente confirmada por teste bioquímico e S. aureus somente por PCR. Nenhuma amostra de C. jejuni foi confirmada por nenhum dos testes. Estes resultados demonstram que os meios seletivos para testes presumptivos não se mostraram confiáveis uma vez que muitas amostras presuntivas não foram confirmadas por PCR ou teste bioquímico específico. Estes resultados demonstram o potencial de biofilmes como reservatório de patógenos. / Biofilm samples from activated sludge reactors, surfaces from water treatment plants and water samples from a creek contaminated with raw sewage were analyzed for the presence of microbial indicator bacteria and pathogens. All target organisms (Coliforms, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. and Legionella spp.) were detected by using presumptive testing media. Only a small proportion of positive colonies from presumptive tests were confirmed as pathogenic strains of E. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, and L. pneumophila in confirmatory testing by selective PCR and biochemical tests. S. flexneri was only confirmed in biochemical tests, S. aureus only by PCR and no colony of C. jejuni was confirmed positive by either PCR or biochemical testing. Presumptive media are therefore not safe means for assessing pathogen load in biofilm samples. These results demonstrate the importance of microbial biofilms as reservoirs for microbial pathogens.

A exposição humana a microrganismos patogênicos e suas toxinas em alimentos constitui um grave problema de saúde pública. O uso indiscriminado de antimicrobianos convencionais promove o aumento da resistência dos microrganismos às principais moléculas existentes no mercado. Além disso, as limitações do uso de substâncias químicas em matérias primas alimentares têm estimulado pesquisas para o desenvolvimento de metodologias eco-amigáveis para evitar a multiplicação de fungos e/ou eliminar suas toxinas. O Staphylococcus aureus é uma das principais bactérias patogênicas que apresenta taxas elevadas de resistência aos antimicrobianos, e por este motivo tem sido objeto de estudo de pesquisas que tentam identificar novos compostos bioativos para o combate de infecções. O Aspergillus parasiticus é um dos principais fungos produtores de aflatoxinas, substâncias carcinogênicas que contaminam diversos tipos de cereais antes e após o processamento. Estudos recentes demonstraram que extratos de plantas possuem atividade antimicrobiana e antifúngica, além de potencial para degradação de micotoxinas. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivos avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos brutos e liofilizados de folhas de maracujá, araçá, alecrim e orégano sobre células planctônicas de S. aureus e A. parasiticus, bem como verificar a capacidade dos referidos extratos em degradar in vitro a aflatoxina B1 (AFB1), ocratoxina A (OTA) e zearalenona (ZEA). Os efeitos antibacterianos e antifúngicos dos extratos foram avaliados através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida / fungicida mínima (CBM/CFM). Os ensaios de degradação da micotoxinas foram realizados em diferentes tempos de incubação (12-48 h) a 37º C, utilizando-se cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinação das concentrações das micotoxinas. O maracujá não demonstrou atividade antimicrobiana tanto para S. aureus quanto para A. parasiticus. Dos quatro extratos estudados, o araçá demonstrou o maior efeito antibacteriano, cujos valores de CIM para extratos bruto e liofilizado foram 0.39 mg/mL e 0.45 mg/mL, respectivamente. Os menores valores de CIM para A. parasiticus foram obtidos com o orégano liofilizado (8.33 mg/mL) e o araçá bruto (3.215 mg/mL). Contudo, não foi possível identificar valores de CFM para o fungo analisado. Não houve efeito de degradação de OTA e ZEA por nenhum dos extratos avaliados. Todos os extratos reduziram a concentração de AFB1 após 48 h de incubação. A maior porcentagem (60.3%) de redução de AFB1 foi obtida com o extrato de alecrim após 48 h de incubação. A atividade antimicrobiana demonstrada pelos extratos das plantas avaliadas indica um potencial para sua aplicação no combate a bactérias patogênicas e fungos toxigênicos. Este é o primeiro estudo realizado com extratos dessas quatro espécies de plantas que evidenciou a capacidade de redução in vitro de AFB1. / Human exposure to pathogenic microorganisms and their toxins in food is a serious public health problem. The indiscriminate use of conventional antimicrobials increases the resistance of microorganisms to the main molecules available in the market. In addition, limitations on the use of chemical substances in food raw materials have stimulated researches for the development of eco-friendly methodologies to avoid the multiplication of fungi and/or eliminate their toxins. Staphylococcus aureus is one of the major pathogenic bacteria with high rates of antimicrobial resistance, and for this reason it has been the subject of research studies aiming to identify new bioactive compounds to combat infections. Aspergillus parasiticus is one of the main aflatoxin-producing fungi, which are carcinogenic substances that contaminate many types of cereals before and after processing. Recent studies have demonstrated that plant extracts have antimicrobial and antifungal activity, as well as potential for degradation of mycotoxins. In this context, the objective of the present study was to evaluate the in vitro antimicrobial effects of crude and lyophilized extracts of leaves from sweet passion fruit, araçá, rosemary and oregano on planktonic cells of S. aureus and A. parasiticus. The in vitro degradation of aflatoxin B1 (AFB1), ochratoxin A (OTA) and zearalenone (ZEN) by the crude extracts was also investigated. The antimicrobial and antifungal effects were evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal / fungicidal concentration (MBC / MFC). Mycotoxin detoxification assays were conducted at different incubation times (12-48h) at 37 °C. The concentrations of mycotoxins were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Sweet passion fruit had no antimicrobial activity on S. aureus or A. parasiticus. Out of the four extracts evaluated, araçá showed the highest antimicrobial effect with MIC of 0.39 mg/mL and 0.45 mg/mL for crude and lyophilized extracts, respectively. The lowest MIC values for A. parasiticus were obtained with lyophilized oregano (8.33 mg/mL) and crude araçá (3.215 mg/mL). However, no MFC values were obtained for the analyzed fungi. Although OTA e ZEN were not degraded by any extract evaluated, all extracts reduced the concentration of AFB1 after 48 h of incubation. The highest percentage of AFB1 reduction (60.3%) was obtained with rosemary extract after 48h of incubation. The antimicrobial activity demonstrated by extracts of the evaluated plants indicates a potential for application against pathogenic bacteria and toxigenic fungi. This is the first study carried out with extracts of these four plants species that demonstrated the in vitro ability for AFB1 reduction.

The innate immune system is the first line of defence against pathogen invasion. The range of diseases that are caused by deficiencies in or deregulation of the innate immune system illustrates the importance of maintaining an effective balance between clearance of infectious agents and minimisation of inflammatory mediated tissue damage. This thesis explores the role of two proteins in the regulation of the innate immune system. Primarily, this work investigates the effect of human β-defensin 3 (hBD3) on the response to self-DNA and pathogenic DNA. HBD3 is an antimicrobial peptide (AMP), which has been shown to have a role in regulating the immune response; increased copy number of the region containing the gene for hBD3, DEFB103, is linked to an increased risk of psoriasis. Additionally, a similar cationic AMP, LL37, has been shown to exacerbate the pathogenesis of psoriasis by forming an immunogenic complex with self-DNA. This lead to the hypothesis that hBD3 may also affect the innate immune response to DNA. Therefore this project investigates what effect hBD3 has on the response of the innate immune system to self and pathogenic DNA. Flt-3 dendritic cells were used to show that whilst hBD3 increased cellular uptake of self-DNA, it did not convert self-DNA into an immune stimulus. However, hBD3 significantly exacerbated the response to bacterial DNA in a TLR9-dependent manner, also by increasing cellular uptake into FLDCs. The finding that hBD3 increased cellular uptake of both self- and pathogenic DNA suggests that at sites of infection or increased cell death, where DNA would be found in the extracellular environment, hBD3 may increase uptake into immune cells and could induce an increased immune response. Since increased hBD3 expression is induced by inflammatory stimuli, this process would cause a positive feedback loop of inflammation during bacterial infections. In conclusion, hBD3’s role in regulating the innate immune response to DNA is at the ligand-receptor level rather than affecting signalling pathways. Furthermore, hBD3 promotes the innate immune response to bacterial DNA by increasing the efficiency of cellular uptake possibly by inducing DNA aggregation. These results implicate a possible role for hBD3 in the earliest stages of psoriatic plaque development, which is often initiated or exacerbated by an infection, and this could be investigated further. Secondly, I investigated the innate immune function of an E3 ubiquitin ligase (E3L) not previously associated with human disease. Mutations in E3L have been identified in three microcephalic primordial dwarfism families; these patients also presented with recurrent respiratory illnesses. E3L has been implicated in the regulation of the innate immune system via interactions with signalling pathways downstream of the receptor, though its role is not clear. We hypothesised that E3L had a dual role both in regulating growth and cell division and in regulating the immune system. Primary patient fibroblasts did not demonstrate an altered cytokine response to bacterial or viral ligands, implying that E3L may have a specific function in immune cells. To investigate this further, and to provide a system to study E3L in vivo, two transgenic mouse lines were designed and engineered, firstly a conditional ‘knock-out’ designed to replicate some of the alternative isoforms of E3L seen in RT-PCRs, and secondly a ‘knock-in’ line to recapitulate the human mutation in exon 7 of E3L, R185X. These mouse lines should offer an insight into the developmental role for E3L, and contribute to establishing a potential role for E3L in the innate immune system. This thesis exemplifies the complexity of the innate immune system and the regulatory pathways that interact to maintain a delicate homeostasis preventing pathogenic inflammation. Understanding these regulatory mechanisms may shed light on the pathogenicity of diseases and identification of potential targets for therapeutics.

Orientadores: José Roberto Guimarães, Regina Maura Bueno Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Civil, Arquitetura e Urbanismo / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:23:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fagnani_RegianeAparecidaGuadagnini_D.pdf: 2932805 bytes, checksum: ed51cdda9a4191dd5c1b275767a76ecd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste estudo foi avaliada a eficiência do processo de tratamento por lodos ativados e, a eficiência de um processo oxidativo avançado (POA), a peroxidação assistida por radiação ultravioleta (H2O2/UV) na desinfecção do efluente da estação de esgoto (ETE) Samambaia da cidade de Campinas/SP. A avaliação da eficiência da ETE e dos processos foi feita com base na remoção de coliformes totais (CT), Escherichia coli (EC), Clostridium perfringens (CP), cistos de Giardia spp. oocistos de Cryptosporidium spp., ovos e larvas de helmintos e, na redução dos valores de turbidez, cor (aparente e verdadeira) e carbono orgânico dissolvido (COD). Para tanto, 13 amostras de afluente e 18 amostras de efluente foram coletadas. O efluente foi desinfetado utilizando-se doses UV de 125 a 20.700 mW s cm-2 e concentração de peróxido de hidrogênio de 30 a 93 mg L-1. Os processos de fotólise e peroxidação foram também avaliados de forma isolada. Todas as amostras de afluente e efluente apresentaram as bactérias avaliadas, cistos de Giardia spp. e, larvas e/ou ovos de helmintos. Na avaliação das características temporais do afluente da ETE, verificou-se que alguns dos parâmetros avaliados, tiveram considerável aumento ou redução com relação ao observado em outros períodos. No período de maior incidência de chuvas (primavera, no ano de 2012) observou-se o menor valor para COD (43% menor do que os obtidos para as outras épocas do ano) e, maior valor para a turbidez (aumento de 57%). Na primavera e no inverno detectou-se também oocistos de Cryptosporidium spp., com maior concentração no inverno. Ovos de helmintos tiveram sua quantificação mínima detectada no outono. A peroxidação aplicada isoladamente não promoveu a inativação de nenhum dos organismos avaliados e, nem reduziu os valores das variáveis físicas e químicas. O POA promoveu a redução de mais de 80% do valor de cor aparente e verdadeira (p < 0,05). Os processos foto-assistidos (radiação UV e H2O2/UV) alcançaram a maior inativação de CT e EC com a dose de radiação de 177 mW s cm-2, sendo de 5 log para a fotólise e, o limite <1 NMP/100mL para o POA e, promoveram a inativação de 2 log de CP, independente da dose de radiação UV aplicada. Quanto aos cistos de Giardia spp., os processos avaliados não promoveram a sua redução. Porém o processo de UV e POA gerou alterações nos cistos (p < 0,05) sendo que o POA alcançou alterações (de fluorescência e/ou forma) em 100% dos cistos observados quando utilizada a dose de radiação UV de 1.775 mW s cm-2. Nenhum dos processos reduziu ou danificou ovos de helmintos, independentemente da condição experimental avaliada / Abstract: This study evaluates the effectiveness of activated sludge and the performance of advanced oxidation process (AOP), the peroxidation assisted by ultraviolet radiation (H2O2/UV), used for effluent disinfection at Samambaia Wastewater Treatment Plant (Samambaia WWTP) in Campinas/SP. The evaluation of the WWTP and of the disinfection processes¿ efficiency was based on the inactivation and/or the number of organisms (total coliforms (TC), Escherichia coli (EC), Clostridium perfringens (CP), Giardia spp. cysts, Cryptosporidium spp. oocysts, helminth eggs and larvae) and turbidity, color (apparent and true) and dissolved organic carbon (DOC) reduced. For this evaluation, 13 samples of affluent and 18 of effluent were collected. The effluent was disinfected using UV doses 125 to 20,700 mW s cm-2 and hydrogen peroxide concentration of 30 to 93 mg L-1. The photolysis and peroxidation processes were separately evaluated. Each affluent and effluent sample revealed the bacteria, Giardia spp. cysts and helminth eggs and/or larvae. In the evaluation of affluent seasonality it has been found that some parameters considerably increased or reduced when different periods were compared. In the period with higher incidence of rain (spring of 2012), it was observed that the DCO value was lower (43% lower when compared to other periods) and, turbidity value was higher (an increase of 57%). In the spring and winter Cryptosporidium spp. oocysts were detected with higher concentration in the winter. Helminth eggs had lower quantification during the autumn. The isolated peroxidation process did not promote the inactivation and/or reduction of any evaluated organism, nor reduced the value of any physical or chemical parameter. The AOP promoted the reduction of 80% or higher of apparent and true color (p < 0.05). The photo-assisted processes (UV radiation and AOP) achieved greater inactivation of TC and EC bacteria with UV dose of 177 mW s cm-2, being 5 log of UV radiation and, <1 MPN/100mL of AOP and, promoted the CP inactivation of 2 log, independent on the UV dose applied. The evaluated processes did not promote the Giardia spp. cysts reduction. However UV and AOP processes caused cysts alteration (p < 0.05), as AOP reached 100% cysts alteration when a 1,775 mW s cm-2 UV dose was applied. Helminth eggs were not reduced or damaged for any studied process, independent on the evaluated experimental condition / Doutorado / Saneamento e Ambiente / Doutora em Engenharia Civil

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.