Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.

E. coli Patogênicas Aviárias (APEC) são uma das causas de doenças extra-intestinais em aves, as quais trazem grande prejuízo econômico para o setor avícola mundial. Os avanços nas pesquisas vêm aumentando o entendimento dos mecanismos de patogenicidade das APEC, demonstrando a grande importância da interação dos diversos fatores de virulência na determinação da sua patogenicidade. Redes Neurais Artificiais (RNAs) têm mostrado ser uma poderosa ferramenta para uma vasta gama de aplicações. Neste trabalho, o foco na aplicação da RNA é na predição (0 a 10) da patogenicidade de amostras APEC. Em 489 isolados APEC foram analisados a presença de 38 genes associados a virulência, o Índice de Patogenicidade (IP) in vivo e a motilidade das amostras. Duas RNAs foram construídas utilizando o software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) em duas fases distintas: treinamento e validação. Utilizou-se como camada de entrada, informações sobre a presença ou ausência dos 38 genes de virulência e a motilidade de cada uma das amostras, com uma camada de saída formada pelo IP in vivo previamente determinado. As RNAs construídas apresentaram uma classificação correta acima de 90%, sendo que a rede 1 apresentou uma classificação de 91,62 e a rede 2 de 99,03%. A rede 2 obteve uma especificidade superior a 99,64% em todas as categorias e uma sensibilidade superior a 92,86%. Isso demonstra que o método aqui proposto, revelou ser uma ótima ferramenta de suporte às decisões de médico veterinário, descartando no futuro a inoculação de animais. / Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) are one of the causes of extraintestinal diseases in birds, and cause considerable economic losses to the poultry industry worldwide. Advances in research have increased understanding of pathogenic mechanisms of APEC, and have demonstrated the importance of the interaction of several virulence factors in determining their pathogenicity. Artificial Neural Networks (ANN) have shown to be a powerful tool for a wide range of applications. In this paper, the focus on neural network applications in the prediction (index of 0-10) of the pathogenicity of isolates APEC. In 489 APEC isolates were analyzed: 38 virulenceassociated genes, the Pathogenicity Index (PI) in vivo and motility of the strains. Two ANNs were constructed using the software Neuroshell Classifier 2.1 (Ward Systems Group, Inc., Frederick, MD, USA) in two distinct phases: training and validation. We used as input layer, information about the presence or absence of the 38 virulenceassociated genes and the motility of each of the samples, with an output layer formed by a previously-determined PI in vivo. The ANNs showed a correct classification of the PI above of 90%, being that the network 1 had a rating of 91.62% and the network 2 of 99.03%. The network 2 obtained a specificity of over 99.64% and sensitivity greater than 92.86% in all categories. This demonstrates that the method proposed here has proven to be a great decision support tool for the veterinarian, thereby dispensing the inoculation of animals in the future.

Escherichia coli patogênicas extraintestinais (ExPEC) causam colibacilose aviária, infecções do trato urinário e meningite neonatal em humanos. A cepa ExPEC MT78 é virulenta in vitro e in vivo, e possui a habilidade de invadir células eucarióticas. Para melhor entender o fenótipo invasivo dessa cepa, foi criada uma biblioteca de mutantes aleatórios pela técnica de mutagênese marcada com assinatura, e os mutantes foram selecionados negativamente em ensaio de invasão a fibroblastos aviários. Mutantes atenuados apresentaram mutação em genes do operon da fímbria do tipo 1 e nos genes de metabolismo de açúcares treA e bglB. Foram feitos mutantes específicos para o gene que codifica a enzima trealase periplasmática (TreA) e para o operon de metabolismo de β-glicosídeos (bgl). O mutante MT78ΔtreA apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários, na expressão da fímbria do tipo 1 e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária. O mutante MT78Δbgl também apresentou, frente à cepa selvagem, diminuição na capacidade de adesão e invasão a fibroblastos aviários e na capacidade de colonizar a bexiga de camundongos em modelo de infecção urinária, mas não mostrou alteração na expressão da fímbria do tipo 1, medida por aglutinação de leveduras. Os resultados deste trabalho mostraram que a trealase periplasmática afeta a expressão da fímbria do tipo 1 e a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78, enquanto o operon do metabolismo de β-glicosídeos afeta a virulência in vivo da cepa ExPEC MT78 por um mecanismo ainda não-elucidado. / Extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) cause colibacillosis in birds, urinary tract infections and neonatal meningitis in humans. The ExPEC strain MT78 is virulent in vitro and in vivo, and is able to invade eukaryotic cells. In order to better understand the invasive phenotype of this strain, a library of random mutants was made using the signature-tagged mutagenesis approach. The mutants were negatively selected in invasion assays of avian fibroblasts. Attenuated mutants presented mutation in the type 1 fimbria operon and in the genes of sugar metabolism treA and bglB. Specific mutants were created for the periplasmic trehalase (TreA) gene and for the β-glycosides metabolism operon (bgl). The MT78ΔtreA mutant displayed, in comparison with the wild type strain, a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos, on type 1 fimbriae expression and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection. The MT78Δbgl mutant, compared to the wild type strain, also displayed a reduction on the capacity of adhesion and invasion to avian fibroblastos and on the capacity to colonize the bladder in a murine model of urinary tract infection, but did not show any difference on type 1 fimbriae expression as detected by yeast agglutination. Taken together, our results show that the periplasmic trehalase affects type 1 expression and in vivo virulence of the ExPEC strain MT78, and the operon for β-glycosides metabolism affects in vivo virulence by an as yet unidentified mechanism.

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-06Bitstream added on 2014-06-13T20:54:13Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_cb_me_jabo.pdf: 3799793 bytes, checksum: f1b3670130a5947eeee6d1e3151f9b69 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundecitrus / Dentro da comercialização de frutas, a citricultura é a mais importante. Representa para muitos países, dentre eles, os EUA e o Brasil, uma importante atividade econômica. Porém, esta atividade, vem sofrendo com inúmeras doenças e/ou pragas como a doença do Cancro Cítrico Asiático causada pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). Deste modo, com o objetivo do estudo do genoma funcional da X. citri, um banco de mutantes deste microorganismo foi obtido por meio de inserção aleatória do transposon Tn5, nas quais foram selecionados 53 mutantes que apresentaram, de forma superficial, alterações fenotípica em relação à X. citri selvagem. Para uma avaliação mais precisa, eles passaram por uma nova confirmação de suas alterações fenotípicas, onde foram inoculados em folhas de Citrus sinensis (Laranjeira pêra-Rio) e Citrus limonia (limoeiro cravo) e monitorados durante 16 dias, e aqueles que apresentaram as maiores alterações em relação à selvagem, tiveram confeccionadas para si curvas de crescimento in vivo. Conseguiu-se, desta forma, avaliar quantitativamente o processo patogênico, relacionar seus sintomas com dados numéricos e ainda descobrir detalhes até então não conhecidos. O mapeamento, dos respectivos loci mutados, foi realizado por seqüenciamento de DNA a partir do transposon, demonstrando que a metodologia empregada para a obtenção dos mutantes foi eficiente, conseguiu também revelar diversas proteína ainda hipotéticas, e outras, até então, não considerados como implicados no processo patogênico, como, uma Integrase, Fe-S oxidoredutase, Helicase IV, Receptor Dependente de Ton-B, entre outros / Concerning the commercialization of fruits, the citrus production is the most important. It represents for many countries, amongst them, U.S.A. and Brazil, an important economic activity. However, this activity has been suffering with many illnesses and/or plagues as the illness from the Asiatic citrus canker caused by the Xanthomonas citri subsp. citri bacterium (X. citri). In this way, from a bank of mutants of X. citri, gotten by means of random insertion of commercial one derived from transposon Tn5, had been selected 53 mutants that had presented, of superficial form, some type of phenotype alteration in relation to the wild X. citri. To a more necessary evaluation, each one of them passed for a new confirmation of its phenotype alterations, where they had been inoculated in leafs of Citrus sinensis ('Pera' sweet orange) and Citrus limonia ('Rangpur' lime) and monitored during 16 days, and those that had presented the biggest alterations in relation to the savage, had confectioned for itself in planta growth curves. We obtain, in such a way, to evaluate quantitatively the pathogenic process, to relate its symptoms with numerical data and still to discover not known details until then. The mapping of respective locus mutated was carried through by sequencing of DNA from transposon, demonstrating that the methodology used for the attainment of the mutants was efficient and still to disclose diverse genes still hypothetical, and others, until then, not considered as implied in the pathogenic process, as, Integrase, Fe-S oxidoredutase, Helicase IV, TonB-dependent receptor, among others

Submitted by Rafael Catão (rafadicastro@gmail.com) on 2016-07-06T18:58:37Z No. of bitstreams: 1 tese_v1_final.pdf: 18601124 bytes, checksum: 4b334ab5c27130fef2e66b1e2b7ed93a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-07T17:20:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 catao_rc_dr_prud.pdf: 18601124 bytes, checksum: 4b334ab5c27130fef2e66b1e2b7ed93a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-07T17:20:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 catao_rc_dr_prud.pdf: 18601124 bytes, checksum: 4b334ab5c27130fef2e66b1e2b7ed93a (MD5) Previous issue date: 2016-05-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Trinta anos após sua reemergência o dengue se encontra presente em aproximadamente todo o país. Devido às características sociais e ambientais, quase toda a extensão território nacional é propicio ao desenvolvimento da doença. Porém, existem alguns clusters de municípios que nunca notificaram casos autóctones ou que possuem taxas e casos muito abaixo da média. Esses municípios estão aglomerados em áreas com características (sociais e ambientais) semelhantes, evidenciando algum fato geográfico que impede ou limita a expansão/consolidação da doença naquela área. Propomos denominar essas áreas de barreiras geográficas de difusão, que dificultam ou impedem a transmissão do dengue nesses referidos clusters. As barreiras seriam componentes do Complexo Patogênico do Dengue, juntamente com as áreas nucleares e franjas, conformariam essa área de transmissão estável. Os complexos patogênicos foram definidos por Max Sorre (1933) e são constituídos pela extensão estável dos entes da cadeia epidemiológica de uma doença. Definimos como recorte empírico o estado de São Paulo. Como hipótese da pesquisa, aventamos que na análise da ampliação e consolidação do complexo patogênico do dengue no estado de São Paulo as barreiras geográficas de difusão do são formadas em relação aos determinantes socioespaciais em múltiplas escalas espaciais e temporais, modulando o processo de difusão da doença. O objetivo geral consiste em compreender o processo de ampliação e consolidação do complexo patogênico do dengue no estado de São Paulo e sua relação com a difusão espacial e as barreiras geográficas. Para tanto foi mapeada a difusão de vetores, da doença e mapeado o complexo no estado de São Paulo. / Thirty years after re-emerging dengue fever is already present in most parts of Brazil. Due to its environmental and social characteristics, almost the entire extension of national territory is propitious to the development of the disease. However, there are some municipalities’ clusters that have never notified autochthonous cases or that have rates and cases far below average. These municipalities’ clusters are in areas with similar environment and social characteristics, highlighting some geographic factor that prevents or limits the expansion/consolidation of the disease in that area. We propose nominate such areas as diffusion barriers, that difficult or blocks dengue transmission in these clusters. The barriers are components of the Dengue’s Pathogenic Complex, along with fringes and core areas, which conforms the stable transmission area. Defined by Max Sorre (1933), the Pathogenic Complex constitutes the stable spatial extension of a diseases transmission chain. We defined Sao Paulo state as the study area of the thesis. As hypothesis, we defined that in the analysis of the expansion and consolidation of the dengue fevers pathogenic complex in the Sao Paulo State the diffusion barriers are formed in relationship to the socio-spatial determinants in multiple temporal and spatial scales, modulating the diseases diffusion process. The aim of the thesis consists in comprehend the expansion and consolidation of dengue fevers pathogenic complex in Sao Paulo state and its relationship with spatial diffusion and geographical barriers. To achieve this aim we mapped and modelled the vector and the disease diffusion and propose a synthesis cartography of the pathogenic complex. / FAPESP 2014/17676-0 / FAPESP 2012/05913-1

Orientador: Edson Luiz Furtado / Banca: Marli Teixeira de Almeida Minhoni / Banca: Cesar Junior Bueno / Banca: Juliana Cristina Sodário Cruz / Banca: Kátia Regiane Brunelli / Resumo: Dentro do setor de horticultura, as plantas da família Brassicaceae são de grande expressão, tanto em volume, como em valor agregado na comercialização, por isso, destaca-se o cultivo intensivo de brassicas, como as variedades de Brassica oleraceae L. (Couve, repolho, Couve-flor, Brócolos, Couve de Bruxelas), Brassica napus L. e Brassica oleraceae L. var. pekinensis L. (Couve chinesa), sendo a base de sustentação econômica dos pequenos e médios produtores de hortaliças. Como outras culturas de plantio intensivo, as brassicas também enfrentam inúmeros problemas com doenças, dentre estes está a "hérnia das crucíferas", doença de enorme risco potencial ao produtor, visto seu difícil ou inexistente controle e por condenar a área, impedindo futuros cultivos de brassicas. O agente causal da "hérnia das crucíferas" (Plasmodiophora brassicae Woronin) é um endoparasita obrigatório, pertencente ao reino Protozoa, habitante do solo, sendo um dos fitopatógenos de solo menos estudados no mundo, mas sabe-se que este apresenta raças patogênicas, ou patotipos, sendo que algumas dessas já são conhecidas, principalmente os que ocorrem na Europa e no Japão sabem-se, também, que estas raças "quebram", com certa freqüência, a pouca resistência que os melhoristas conseguem incorporar nas variedades comerciais, fazendo com que quase não haja variedade resistente disponível no mercado, principalmente ao mercado brasileiro onde, possivelmente, haja raças ainda não relatadas. O objetivo deste estudo visou conhecer a variabilidade genética e patogênica de isolados de P. brassicae oriundos das principais regiões produtoras de Brassicas do estado de São Paulo, utilizando para isso: a) testes em variedade diferenciais, nacionais e importadas, com isolados monospóricos e não monospóricos para determinação das raças; b) estudo da agressividade dos isolados frente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Within the horticulture sector, the plants of the Brassicaceae family are widespread in both volume and value-added marketing, so we highlight the intensive cultivation of brassicas, such as varieties of Brassica oleracea L. (Kale, cabbage, cauliflower, broccoli, Brussels sprouts), Brassica napus L. and Brassica oleracea L. var. pekinensis L. (Chinese cabbage), and the basis of economic support for small and medium producers of vegetables. Like other intensive planting crops, the brassicas are also facing many problems with diseases, among these is the club root, disease of great potential risk to the producer, because its difficult or no control and order the area, preventing future crops brassicas. The agent causal of the club root (Plasmodiophora brassicae Woronin) is an obligatory endoparasites belonging to the kingdom Protozoa, inhabitant of soil, being one of the pathogens in soil less studied in the world, but it is known that this presents pathogenic races, or pathotypes, and some of these are already known, especially those taking place in Europe and Japan knows it, too, that these races "break" with some frequency, the little resistance that breeders can incorporate into commercial varieties, making that almost no resistant variety available in the market, especially the Brazilian market where perhaps there is not race related. This study aimed to investigate the genetic variability and pathogenic isolates of P. brassicae come from the main producing regions Brassicas state of Sao Paulo, using for this: a) testing range differential, domestic and imported, with no single spores and spore for the determination of races, b) study of the aggressiveness of the isolates in the face of cultivars available in the market, c) study of genetic variability within and between populations, using markers RAPD and Microsatellite d) genetic characterization through sequencing of genetic regions... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Iracema Helena Schoenlein-Crusius / Banca: José Ivanildo de Souza / Banca: André Rodrigues / Resumo: No Córrego do Sapateiro, no Parque Municipal do Ibirapuera, São Paulo, SP, foram coletadas amostras de água (50 mL) até 10 cm de profundidade, em local antes (local 1) e após (local 2) o tratamento da água por flotação, durante época chuvosa (janeiro, fevereiro e março) e época seca (junho, julho e agosto) em 2008. Concomitantemente, foram medidos a temperatura, oxigênio dissolvido, condutividade, e pH da água com equipamento U10 da Horiba. Os coliformes totais e fecais na água foram analisados com Aquatest®. De cada amostra de água, alíquotas de 1 mL foram espalhadas sobre meio de batata-dextrose-ágar, perfazendo 10 placas de Petri para cada local de coleta. Após a incubação durante 10 dias a 22ºC, as colônias foram quantificadas. As mais representativas foram purificadas e identificadas utilizando-se literatura pertinente. Para conduzir testes de patogenicidade foram selecionadas culturas representativas da micota submetendo-as a testes de crescimento a 37ºC, atividade proteásica e fosfolipásica. Os parâmetros abióticos da água não se apresentaram limitantes para a presença de geofungos e foram pouco influenciados pela flotação, exceto o oxigênio dissolvido, que no local 2 apresentou elevações significativas. Nos dois locais o número de coliformes totais e fecais foi predominantemente maior que 8 NMP/dL-1 durante o período de estudo. A quantificação de colônias de fungos variou de 0 a 148 UFC/mL-1. No total foram obtidos 30 táxons de fungos, distribuídos em 141 ocorrências. Vinte táxons foram registrados nos meses quentes e chuvosos e 21 nos demais. Vinte e quatro táxons em 76 ocorrências de fungos foram registrados para o local 1 e 20 táxons em 65 ocorrências no local 2. A micota foi composta por nove gêneros de fungos anamórficos, sendo eles Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Cylindrocladium... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In "Córrego do Sapateiro" in the "Parque Municipal do Ibirapuera", São Paulo city, São Paulo State, Brazil, water samples (50 mL) at 10cm depth were collected in sites before (site 1) and also after (site 2) flotation water treatment, during months in the rainy hot season (January, February and March) and in the dry, cold season (June, July and August) of 2008. Besides, the temperature, dissolved oxygen, conductivity and pH of the water were measured with an U10 Horiba equipment. Total and fecal coliforms were analyzed with Aquatest® kit. From each water sample, aliquots of 1mL were spreaded on potato-dextrose-agar media, totalizing 10 Petri dishes for each collection site. After incubation for 10 days at 22oC, the colonies were quantified. The most representative ones were purified to be identified using current literature. To perform the pathogenicity tests representative strains of the mycota were submitted to growth tests at 37oC, proteolythic and phospholypasic activities. Abiotic parameters of the water were not limitants for the presence of geofungi, and were little influenced by the flotation treatment, except for dissolved oxygen, that presented significant increases at site 2. At the two sites the number of total and fecal coliforms was predominantly higher than 8 NMP/dL-1 during the studied period. The quantity of fungal colonies varied from zero to 148 UFC/mL-1. A total of 30 fungal taxa was obtained, distributed in 141 occurrences. Twenty one taxa were registered in the rainy and hot months, and 21 in the remaining ones. Twenty four taxa, in 76 occurrences were registered for site 1 and 20 taxa in 65 occurrences for site 2. The mycota was composed by nine anamorphic genera, as Penicillium sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Cylindrocladium sp., Pestalotiopsis sp., Trichoderma sp., Cladosporium sp., Geotrichum sp. and Paecilomyces sp., besides two representants... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Capes / Uma superfície mal higienizada em um ambiente produtivo, somada à capacidade de adesão de um microrganismo, pode se tornar uma fonte potencial de contaminação e levar à formação de biofilmes. Estes, uma vez formados, são de difícil remoção e podem proliferar para a contaminação de alimentos. A preocupação com a segurança dos alimentos é um desafio, visto que problemas a ela relacionados podem comprometer a saúde do consumidor. O objetivo deste trabalho foi isolar microrganismos patogênicos potenciais produtores de biofilme microbiano presentes no processamento industrial de um frigorífico bovino. O desenvolvimento do trabalho se resume em três fases: entrevista com o coordenador de qualidade de um frigorífico da região dos Campos Gerais; diagnóstico de pontos críticos no controle de qualidade do processamento industrial desse frigorífico, por meio de um diagrama decisório e coleta de amostras durante o processo industrial através de swabs, utilizados no isolamento por microbiologia. Em seguida, foi identificado o perfil genético das amostras, por meio do isolamento de DNA, seguida de amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase com os primers universais rD1 e fD1. Os dados gerados na primeira fase indicam os programas de controle de qualidade aplicados na indústria frigorífica em estudo. A entrevistada, responsável pelo controle de qualidade da indústria, salientou o uso de Boas Práticas de Fabricação (BPF), Análise de Perigo e Pontos Críticos de Controle (APPCC), Procedimento Padrão de Higiene Operacional (PPHO), Monitoramento de Pragas (MIP) e Folha de Verificação (FV). A partir do diagrama decisório, foram identificados 25 pontos para a coleta de amostras para a identificação de microrganismos patogênicos. Dentre esses, dez pontos amostrais foram isolados por microbiologia convencional com meio de cultura EMB, indicando contaminação de conteúdo gastrointestinal por coliformes fecais. Em dez pontos, nem sempre distintos, houve crescimento em meio de cultura SS – Salmonella Shigella, indicando contaminação durante o abate a partir da manipulação da carne pelos funcionários, uma vez que esses podem ser portadores sadios de microrganismos patogênicos. Para identificação genotípica das amostras sequenciadas, os resultados chegaram a nível de gênero, sendo Escherichia, Proteus, Hafnia e Bacillus, todos pertencentes ao grupo de Enterobactérias, com exceção de Bacillus. Verificou-se através da identificação genotípica, relacionada com os locais de coleta das amostras no fluxograma, que há contaminação cruzada no ambiente produtivo do presente frigorífico, na maioria dos pontos, relacionadas com o manipulador. / An unhygienic surface in a productive environment, added to the adhesion capacity of a microorganism, can become a potential source of contamination and lead to the formation of biofilms. These, once formed, are difficult to remove and can proliferate for food contamination. Concern about food safety is a challenge, as related problems can compromise consumer health. The objective of this work is to select potential pathogenic microorganisms producing microbial biofilms present in the industrial processing of a beef cattle. The development of the work is summarized in three phases: interview with the quality coordinator of a refrigerator in the Campos Gerais region; diagnosis of critical points in the quality control of the industrial processing of this refrigerator, through a decision diagram and sample collection during the industrial process through swabs, used in the isolation by microbiology. Then, the genetic profile of the samples was identified through DNA isolation, followed by amplification by Polymerase Chain Reaction with the universal primers rD1 and fD1. The data generated in the first phase indicated the quality control programs in the refrigeration industry under study. The interviewee, responsible for the quality control of the industry, emphasized the use of Good Manufacturing Practices (GMP), Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP), Standard Operating Procedures (PPHO), Pest Monitoring (IPM) And Verification Sheet (FV). From the decision diagram, 25 points were identified for the collection of samples for the identification of pathogenic microorganisms. Among these, ten sample points were isolated by conventional microbiology with EMB culture, indicating contamination of gastrointestinal contents by fecal coliforms. At ten points, not always distinct, there was growth in the SS - Salmonella Shigella culture, indicating contamination during slaughter from the handling of the meat by the employees, since they may be healthy carriers of pathogenic microorganisms. For genotypic identification of the sequenced samples, the results reached the species level, being Escherichia, Proteus, Hafnia and Bacillus, all belonging to the group of Enterobacteria, except for Bacillus. It was verified through the genotypic identification, related to the sample collection sites in the flowchart, that there is cross contamination in the productive environment of the present refrigerator, in most of the points, related to the manipulator.

Capes / Uma superfície mal higienizada em um ambiente produtivo, somada à capacidade de adesão de um microrganismo, pode se tornar uma fonte potencial de contaminação e levar à formação de biofilmes. Estes, uma vez formados, são de difícil remoção e podem proliferar para a contaminação de alimentos. A preocupação com a segurança dos alimentos é um desafio, visto que problemas a ela relacionados podem comprometer a saúde do consumidor. O objetivo deste trabalho foi isolar microrganismos patogênicos potenciais produtores de biofilme microbiano presentes no processamento industrial de um frigorífico bovino. O desenvolvimento do trabalho se resume em três fases: entrevista com o coordenador de qualidade de um frigorífico da região dos Campos Gerais; diagnóstico de pontos críticos no controle de qualidade do processamento industrial desse frigorífico, por meio de um diagrama decisório e coleta de amostras durante o processo industrial através de swabs, utilizados no isolamento por microbiologia. Em seguida, foi identificado o perfil genético das amostras, por meio do isolamento de DNA, seguida de amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase com os primers universais rD1 e fD1. Os dados gerados na primeira fase indicam os programas de controle de qualidade aplicados na indústria frigorífica em estudo. A entrevistada, responsável pelo controle de qualidade da indústria, salientou o uso de Boas Práticas de Fabricação (BPF), Análise de Perigo e Pontos Críticos de Controle (APPCC), Procedimento Padrão de Higiene Operacional (PPHO), Monitoramento de Pragas (MIP) e Folha de Verificação (FV). A partir do diagrama decisório, foram identificados 25 pontos para a coleta de amostras para a identificação de microrganismos patogênicos. Dentre esses, dez pontos amostrais foram isolados por microbiologia convencional com meio de cultura EMB, indicando contaminação de conteúdo gastrointestinal por coliformes fecais. Em dez pontos, nem sempre distintos, houve crescimento em meio de cultura SS – Salmonella Shigella, indicando contaminação durante o abate a partir da manipulação da carne pelos funcionários, uma vez que esses podem ser portadores sadios de microrganismos patogênicos. Para identificação genotípica das amostras sequenciadas, os resultados chegaram a nível de gênero, sendo Escherichia, Proteus, Hafnia e Bacillus, todos pertencentes ao grupo de Enterobactérias, com exceção de Bacillus. Verificou-se através da identificação genotípica, relacionada com os locais de coleta das amostras no fluxograma, que há contaminação cruzada no ambiente produtivo do presente frigorífico, na maioria dos pontos, relacionadas com o manipulador. / An unhygienic surface in a productive environment, added to the adhesion capacity of a microorganism, can become a potential source of contamination and lead to the formation of biofilms. These, once formed, are difficult to remove and can proliferate for food contamination. Concern about food safety is a challenge, as related problems can compromise consumer health. The objective of this work is to select potential pathogenic microorganisms producing microbial biofilms present in the industrial processing of a beef cattle. The development of the work is summarized in three phases: interview with the quality coordinator of a refrigerator in the Campos Gerais region; diagnosis of critical points in the quality control of the industrial processing of this refrigerator, through a decision diagram and sample collection during the industrial process through swabs, used in the isolation by microbiology. Then, the genetic profile of the samples was identified through DNA isolation, followed by amplification by Polymerase Chain Reaction with the universal primers rD1 and fD1. The data generated in the first phase indicated the quality control programs in the refrigeration industry under study. The interviewee, responsible for the quality control of the industry, emphasized the use of Good Manufacturing Practices (GMP), Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP), Standard Operating Procedures (PPHO), Pest Monitoring (IPM) And Verification Sheet (FV). From the decision diagram, 25 points were identified for the collection of samples for the identification of pathogenic microorganisms. Among these, ten sample points were isolated by conventional microbiology with EMB culture, indicating contamination of gastrointestinal contents by fecal coliforms. At ten points, not always distinct, there was growth in the SS - Salmonella Shigella culture, indicating contamination during slaughter from the handling of the meat by the employees, since they may be healthy carriers of pathogenic microorganisms. For genotypic identification of the sequenced samples, the results reached the species level, being Escherichia, Proteus, Hafnia and Bacillus, all belonging to the group of Enterobacteria, except for Bacillus. It was verified through the genotypic identification, related to the sample collection sites in the flowchart, that there is cross contamination in the productive environment of the present refrigerator, in most of the points, related to the manipulator.