Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]

L'une des voies principales du métabolisme cellulaire est la voie des Pentoses Phosphates (PPP). Cette voie métabolique est composée de deux cascades enzymatiques, une voie oxydative et une voie non oxydative. La voie oxydative de la PPP produit un cofacteur, le NADPH, qui est responsable du processus de détoxification de la cellule par son activité réductrice et un précurseur de diverses biosynthèses comme la lipogenèse. Un dysfonctionnement des trois enzymes qui composent cette étape de la PPP peut engendrer la mort cellulaire. Grâce à une nouvelle technique, la Polarisation Dynamique Nucléaire suivie par Dissolution (D-DNP), qui permet d’obtenir un gain de sensibilité par un facteur > 10 000, la quantification des paramètres cinétique dans les conditions physiologiques in cell est possible.Dans ce travail de thèse, nous utilisons un nouveau modèle de quantification des paramètres cinétiques qui offre la possibilité d’étudier une cascade enzymatique composée de 3 enzymes par D-DNP. Grâce à ces expériences, la sélectivité de la première enzyme de la voie oxydative, la G6PD, pour l’un des deux anomères de glucose-6-phosphate, ainsi que le rôle antioxydant de la deuxième enzyme de la PPP, la 6PGL, ont été observés. Pour réaliser ces études, une méthode de synthèse et de purification des différents substrats de chaque enzyme a été développée. Le tout premier inhibiteur de la 6PGL a été testé. Des études préliminaires réalisées sur des Trypanosoma brucei, parasite responsable de la maladie du sommeil, indiquent que la pénétration du glucose dans les cellules est l'étape cinétiquement limitante pour sa conversion enzymatique. / The Pentose Phosphate Pathway (PPP) is one of the main pathways of cellular metabolism. This metabolic pathway is composed of two enzymatic cascades: one is an oxidative pathway, and the other is non-oxidative. The oxidative branch of PPP produces a cofactor, NADPH, which is responsible for the detoxification process of the cell due to its reducing activity, and is also a precursor of various biosynthesis such as lipogenesis. A dysfunction of one of the three enzymes that make up this step of PPP can lead to cell death. Thanks to a new method, Dissolution Dynamic Nuclear Polarization (D-DNP), which features a sensitivity gain by a factor 10,000 compared to standard liquid-state NMR, the quantification of kinetic parameters under physiological conditions, in cell, becomes possible.In this thesis, we add to the scientific library a new model of quantification of kinetic parameters, and the possibility of studying an enzymatic cascade composed of 3 enzymes by D-DNP measurements. Based on these experiments, the selectivity of the first enzyme in the oxidative pathway, G6PD, for one of the two glucose-6-phosphate anomers, was confirmed. The antioxidant role of the second PPP enzyme, 6PGL, was equally studied. To carry out these studies, a method of synthesis and purification of the different substrates of each enzyme has been developed. The very first inhibitor of 6PGL has also been tested. Preliminary experiments on Trypanosoma brucei, a parasite responsible for sleeping sickness, indicate that glucose penetration inside cells is the limiting kinetic step for its conversion.

Les protéines membranaires en hélices alpha forment le tiers des protéines codées par notre génome. D’autres protéines membranaires sont formées typiquement de feuillets bêta. Leur fonction varie de la formation de pores, la transmission de signaux à l’activité antibiotique. Elles sont aussi capables de transporter de larges cargos comme les protéines ou les acides nucléiques au travers de la membrane. Récemment, les peptides ont émergé comme un moyen prometteur pour le transport de médicaments vers leurs cibles.Les protéines membranaires peuvent être synthétisées chimiquement ou exprimées et marquées isotopiquement dans les bactéries, isolées, purifiées et reconstituées dans les bicouches lipidiques hydratées. Elles présentent une variété de configurations en interagissant avec ces bicouches lipidiques. Ceci dépend de la composition et de l’épaisseur de ces bicouches. L’orientation des bicouches lipidiques est maintenue mécaniquement en les disposant entre des plaques de verre. La RMN du solide des échantillons orientés est un des moyens possibles pour accéder à la topologie des peptides associés à des membranes phospholipidiques. Les échantillons sont difficiles à exprimer dans les bactéries en grande quantités et possède une solubilité réduite en dehors des membranes. En outre leur taille est trop importante pour la RMN du liquide et il est difficile de les cristalliser. Un des inconvénients majeur de la spectroscopie RMN est sa faible sensibilité. Cela résulte du faible moment magnétique nucléaire qui résulte en un décalage Zeeman faible et donc une polarisation réduite. Par ailleurs, l’intensité du signal RMN dépend de plusieurs facteurs comme la quantité d’échantillon la polarisation et le champ magnétique B0. Et le temps d’acquisition de certaines expériences peut être très long. Le but de ce projet est d’obtenir plus de signal des protéines membranaires. Dès lors, nous avons développé une cryosonde DNP (dynamic nuclear polarization) / RMN du solide. La DNP est une technique ingénieuse qui est utilisée pour le transfert de polarisation des noyaux hautement polarisés à des noyaux moins polarisés par irradiation microonde. Les microondes vont exister sélectivement les électrons qui transfèreront leur polarisation à l’ensemble des protons voisins, le signal proton peut ainsi être augmenté de 660 fois.Pour cela la cryosonde DNP RMN du solide qui opère à 100 K et 9,4 T a été utilisée. Une sonde est la pièce mécanique qui maintient l’échantillon dans le centre magnétique de l’aimant du spectromètre. C’est une antenne modulable qui irradie et détecte des champs radiofréquence. La pièce centrale de la sonde est une bobine solénoïdale ou une bobine en forme de selle enveloppant l’échantillon. La faisabilité de ces expériences DNP a été validée sur les échantillons orientés en rotation à l’angle magique. Ces expériences ont été menées sur des échantillons enroulés dans un rotor. Même si leur orientation par rapport au champ magnétique B0 est perdue, une valeur d’augmentation de 17 a été obtenue.[...] / Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]

La capacité à déterminer les structures moléculaires en trois dimensions à partir de monocristaux par des méthodes de diffraction a transformé la chimie des matériaux. Le problème de la détermination de structure est en grande partie non résolu, en particulier si le système étudié est situé à une surface et n'a pas de périodicité, comme dans la plupart des matériaux fonctionnels actuels. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) à l’état solide serait une méthode de choix pour caractériser les surfaces mais la limite de détection de la RMN est beaucoup trop faible pour permettre à la RMN de caractériser les surfaces. L’introduction récente d’une nouvelle approche utilisant la Polarisation Dynamique Nucléaire (DNP) pour améliorer la sensibilité de la RMN des surfaces (DNP SENS) permet à présent de réaliser des expériences qui étaient totalement impossible il y a quelques années encore. Plus particulièrement, grâce à la méthode DNP SENS, les présents travaux de thèse aboutissent à la première structure tridimensionnelle d’un complexe organométallique supporté sur silice, avec une précision de 0,7 Å. De nombreux aspects de l’expérience DNP SENS ont été exploré. Le transport de de l’hyperpolarisation par diffusion de spin est primordial et un modèle numérique dans les matériaux mésoporeux a été développé. De plus, une nouvelle matrice aqueuse se basant sur des gels polyacrylamides a été mise au point et utilisée pour la caractérisation par RMN de nanoparticules permettant ainsi d’étendre les domaines d’application de DNP SENS. Enfin les premières expériences RMN DNP combinant hauts champs magnétiques et haute fréquence de rotation d’échantillon sont présentées. / The ability to understand the properties of chemical systems relies on their detailed description at the molecular level. Over the last century, several methods based on X-ray diffraction have allowed a structure-based understanding of many materials. However, several key questions often remain unanswered. In particular when the system under investigation is located on a surface. Although an extensive range of surface-sensitive methods are available for surface science and give valuable information, they only lead to a partial understanding of surfaces at the molecular level. Moreover, these methods are not compatible with all kinds of materials and usually require the use of a model and pristine surface. Solid-State NMR would be a method of choice to characterize surfaces. However, the approach suffers from its intrinsically low sensitivity and this is strongly emphasize in the case of surfaces where the atoms of interest are diluted in the matrix. Dynamic Nuclear Polarization (DNP) applied to surfaces (SENS) recently emerged as a very promising method to characterize surface sites. It offers a dramatic enhancement of NMR sensitivity and DNP applied to materials has led to many examples in the last ten years. In the present thesis, I have shown that DNP SENS, in combination with EXAFS, allowed the detailed 3D structure determination of the silica-supported organometallic complex determined with a precision of 0.7 angstroms. In parallel, some experimental aspect of DNP SENS have been explored. A spin diffusion has been developed to understand diffusion of hyperpolarization in porous media. A new aqueous DNP matrix, coined DNP Jelly, has been developed to characterize nanoparticles and thus expanding experimental range of DNP SENS. Finally, the first experiment of DNP NMR at fast magic angle spinning (up to 40 kHz) and high field are reported.

Le travail de cette thèse a consisté à concevoir, réaliser et optimiser un montage expérimental de Polarisation Dynamique Nucléaire multi-échantillons pour des applications biomédicales en Imagerie Spectroscopique par Résonance Magnétique. Ce montage est constitué d'un aimant à fort champ magnétique (3,35T), dans lequel se place un système cryogénique à bain d'hélium (He4) liquide pompé pouvant atteindre des températures inférieures à 1,2K. Un ensemble d'inserts permet d'effectuer les différentes étapes du processus PDN dont l'irradiation des échantillons par un champ micro-onde (f=94GHz et P=50mW) et le suivi de leur polarisation par Résonance Magnétique Nucléaire. Ce système permet de polariser jusqu'à trois échantillons, de volume proche de 1mL, à des taux de polarisation de quelques pourcents. Il présente une forte autonomie supérieure à quatre heures, autorisant ainsi la polarisation de molécules à longues constantes de temps de polarisation. La possibilité de disposer quasi-simultanément, après dissolution, de plusieurs échantillons fortement polarisés ouvre la voie à de nouvelles applications dans le domaine de l'imagerie biomédicale / The aim of this thesis work was to design, build and optimize a large volume multisamples DNP (Dynamic Nuclear Polarization) polarizer dedicated to Magnetic Resonance Spectroscopic Imaging applications. The experimental system is made up of a high magnetic field magnet (3,35T) in which takes place a cryogenic system with a pumped bath of liquid helium (4He) allowing temperatures lower than 1,2K. A set of inserts is used for the different steps of DNP : irradiation of the sample by a microwave field (f=94GHz and P=50mW), polarization measurement by Nuclear Magnetic Resonance. . . With this system, up to three samples of 1mL volume can be polarized to a rate of few percents. The system has a long autonomy of four hours, so it can be used for polarizing molecules with a long time constant of polarization. Finally, the possibility to get quasisimultaneously, after dissolution, several samples with a high rate of polarization opens the way of new applications in biomedical imaging

La mesure de couplage dipolaire permet d’accéder à la structure tridimensionnelle d’un composé solide. Cependant, en présence d’une forte densité de spins couplés, le phénomène de troncature dipolaire rend difficile l’obtention de ces informations par RMN du solide. Ce problème peut être affranchi par l’étude de spins rares en abondance naturelle. En effet, avec une abondance naturelle de 1.1 %, la probabilité que trois 13C soient couplés, et avec elle la troncature dipolaire, devient négligeable. Une méthodologie basée sur la séquence de recouplage dipolaire POST-C7 permet d’accéder à des informations structurales d’échantillons en abondance naturelle sensibles à la fois à la conformation moléculaire et à l’empilement cristallin par mesure de couplages dipolaires 13C-13C. La sensibilité de détection des signaux RMN 13C est augmentée à l’aide la polarisation dynamique nucléaire ce qui permet de réduire considérablement les temps d’expériences. De plus, la séquence de recouplage R20_9_2 aidée de supercycles s’est montrée être plus robustes que POST-C7 face à de fortes anisotropies de déplacement chimique ou de forts couplages hétéronucléaires 1H-13C. La seconde problématique abordée concerne l’attribution de signaux 13C. En effet, il existe seulement quelques exemples de détermination de connectivités 13C -13C en abondance naturelle. Nous montrons ici que des spectres de corrélations dipolaires 13C-13C peuvent être obtenus en quelques jours à l’aide de la séquence de recouplage R20_9_2. Contrairement aux méthodologies basées sur le couplage J, notre séquence requiert un temps d’excitation DQ plus court ce qui la rend adaptée à l’étude de solides désordonnés. / Measurment of dipolar coupling provides 3D structural information of powder samples. However, in practice, the high density of spins in organic compounds prevents the measurements of long-range dipolar couplings in solid-state NMR by the so-called dipolar truncation effect. The study of rare spins on natural abundance allows to overcome this problem. In fact, with a natural abundance of 1.1 %, the probability for three 13C to be coupled is negligible. We developed a methodology based either on the dipolar recoupling NMR pulse sequence POST-C7 or on the dramatic increase in sensitivity provided by dynamic nuclear polarization. We demonstrated that its methodology provides a measure of 13C-13C dipolar couplings in natural abundance powder samples and that the so-obtained distance information is sensitive to both molecular conformation and crystal packing of powder samples. Moreover, we show that the recoupling pulse sequence R20_9_2 is more robust to strong chemical shift anisotropy and also to strong 1H-13C heteronuclear dipolar couplings than POST-C7. The second challenge involves 13C signal assignment for natural abundance. In fact, there are only a few examples of 13C-13C correlation spectra obtained for natural abundance samples. Here, we show that 13C-13C correlation spectra sequence based on the reintroduction of 13C−13C dipolar couplings can be obtained with standard MAS probe and within few days using R20_9_2 pulse sequence. Contrary to pulse sequences based on 13C-13C J coupling, our pulse sequence requires shorter DQ excitation time and hence, is more suitable for samples having short T2 relaxation times such as amorphous solids.