Les complexes des pores nucléaires (NPCs) sont des assemblages protéiques ancrés dans l’enveloppe nucléaire (EN) qui permettent et régulent les échanges entre le cytoplasme et le noyau. Au-delà de leur fonction de transport, plusieurs sous unité des NPCs (les nucléoporines, Nups) jouent un rôle important dans d’autres processus cellulaire tels que la division cellulaire et la différenciation. Le complexe-Y, composé de 9 Nups distincte, dont Nup133, représente une sous unité structurale des NPCs. Cependant, une fraction de ce complexe est localisée aux kinétochores (KTs) durant la mitose, où il est requis pour la ségrégation des chromosomes. Cette localisation aux KTs dépend du complexe Ndc80 mais également de Cenp-F. Par ailleurs, l’interaction Nup133/Cenp-F s'effectue aussi au niveau de l'EN en prophase, ce qui permet le recrutement de la dynéine, étape requise pour l’ancrage des centrosomes à l’EN dans les cellules HeLa et pour la migration du noyau vers le centrosome dans les progéniteurs neuronaux de cerveau de rat. Des études développementales chez la souris ont précédemment identifié le mutant merm qui meurt en milieu de gestation (E10.5). Bien que la mutation merm entraine l’absence de Nup133, la prolifération des cellules souches embryonnaires (mESCs) dérivées de blastocystes merm (Nup133-/-) n’est pas altérée. Cependant l’absence de Nup133 altère la différenciation des mESCs, notamment en neurones post-mitotique. Ce projet de thèse visait à comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels Nup133 contribue à la division et la différenciation cellulaire. Afin de caractériser le phénotype des mESCs Nup133-/-, nous avons utilisé deux protocoles de différenciation in vitro, vers une voie neuroectodermale ou mésoendodermale. Cette étude a montré que le nombre de cellules est fortement diminué chez le mutant Nup133-/- comparé aux cellules contrôles lors de la différenciation des mESCs. Cependant les mESCs Nup133-/- qui survivent montrent, comme les mESCs contrôles, une diminution de l’expression des marqueurs de pluripotence et une augmentation des marqueurs de différentiation. L’analyse par cytométrie de flux n’a pas révélé d'altération majeure dans la progression du cycle cellulaire mais à mis en évidence une augmentation de la mort cellulaire lors de la différenciation des mESCs Nup133-/-. Afin de déterminer les domaines de Nup133 requis pour la différenciation des mESCs, nous avons développé une stratégie de sauvetage en établissant des lignées mESCS Nup133-/- qui expriment de manière stable GFP-Nup133, différentes délétions de Nup133 qui n’altèrent pas sa localisation au NPCs (GFP-Nup133DN, DMid, et DC) ou la GFP seule comme contrôle. Des études fonctionnelles ont indiqué que le domaine N-ter (NTD) de Nup133 est requis pour la différenciation des mESCs.Le seul partenaire identifié de Nup133-NTD étant Cenp-F, j’ai décidé de déterminer si l’interaction Nup133/Cenp-F jouait un rôle dans la différenciation des mESCs. En collaboration avec l’équipe de R. Guerois, nous avons simulé in silico l’interaction de Nup133-NTD avec un peptide de Cenp-F que nous avions identifié dans des cribles en double hybride. Cette modélisaton nous a permis de concevoir des mutants affectant la surface d’interaction Nup133/Cenp-F. Nous avons montré que ces mutations empêchent la localisation de Cenp-F à l’EN sans altérer sa présence aux KTs. J’ai également utilisé la stratégie de sauvetage décrite plus haut, pour étudier un mutant de Nup133 qui empêche son interaction avec Cenp-F. Cette étude a montré que l’interaction Nup133/Cenp-F n'est pas requise pour la différenciation in vitro des mESCs. L’étude de Cenp-F a été complétée par la caractérisation d’une mutation de Cenp_F qui affecte sa localisation aux KTs. Nous avons montré que cette mutation altère l’interaction entre Cenp-F et Bub1 mais sans affecter celle avec Nup133. Cette étude a ainsi permis d'identifier Bub1 comme un partenaire direct de Cenp-F requis pour son ancrage aux KTs. / Nuclear pores complexes (NPCs) are macromolecular assemblies anchored in the nuclear envelope (NE) providing the gates that allow and regulate all exchanges between the nucleus and the cytoplasm. Beyond their function in transport, several NPC subunits, the nucleoporins (Nups), have been demonstrated to also play important roles in other cellular processes including cell division and differentiation.The Y-complex, composed of 9 distinct Nups, including Nup133, represents a major structural subunit stably bound to both the cytoplasmic and nuclear faces of the NPCs. Beyond its structural role at nuclear pores, the Y-complex localizes at kinetochores in mitosis, where it is required for chromosome segregation. This kinetochores localization relies on the Ndc80 complex, but also on Nup133/Cenp-F interaction. The Nup133/Cenp-F interaction also contributes to the recruitment of dynein to the NE, a process that is required for the correct centrosomes tethering at the NE in prophase HeLa and for the migration of the nucleus towards the centrosomes prior to mitotic entry in rat brain progenitor cells.Developmental studies previously identified the mouse merm mutant that dies in midgestation (E10.5). In collaboration with the team of E. Lacy, the team of V. Doye showed that the merm mutation leads to the absence of Nup133. Importantly this study further revealed that self-renewal is not impaired in embryonic stem cells (mESCs) derived from merm (Nup133-/-) blastocyst. However, the lack of Nup133 impairs mESC differentiation into postmitotic neurons. How Nup133 contributes to ESCs differentiation remains however unknown.This PhD project aimed at understanding the cellular mechanisms explaining Nup133 contribution to cell division and differentiation.To characterize Nup133-/- mESCs differentiation phenotype, we used two distinct in vitro differentiation protocols, towards either neuroectodermal or mesoendodermal fate. This study revealed that cell number was strongly decreased in Nup133-/- relative to WT in mESC differentiation. However, the few Nup133-/- mESCs that survived displayed, as WT mESCs, a decreased expression of pluripotency markers and acquired differentiated state based on marker expression. FACS analyses did not reveal any major alteration of cell cycle progression but showed increased cell death upon differentiation.To determine which domain of Nup133 is critical for mESC differentiation, we developed a “rescue strategy” using Nup133 alleles deleted for structurally defined domains. Therefore, we established Nup133-/- mESC lines stably expressing GFP-Nup133, GFP-Nup13-ΔN, different ΔC-ter domain (that did not impair the binding of Nup133 to the NPC) or GFP alone as control. Functional studies indicated that while full length and C-ter deleted Nup133 rescue Nup133-/- ESCs defect in differentiation, Nup133-ΔN does not.The only identified partner of Nup133-NTD is Cenp-F. In view of the role of Nup133-NTD in mESC differentiation, I decided to determine if Nup133/Cenp-F interaction contributes to mESC differentiation. In collaboration with R. Guerois' team we simulated in silico the interaction of Nup133-NTD with a short peptide of Cenp-F that we previously identified using yeast-2-hybrid (Y2H) screens. We could thereby design mutants affecting Nup133/Cenp-F contact and show that they prevent Cenp-F localization to the nuclear envelope without altering its kinetochore localization. I then used the “rescue strategy” described above to study a Nup133 mutant specifically impairing its interaction with Cenp-F. This analysis revealed that Nup133/Cenp-F interaction is dispensable for in vitro mESC differentiation. This study on Cenp-F was completed by the characterization of a mutation within an adjacent leucine zipper affecting Cenp-F targeting to kinetochores. We evidenced that this mutation impairs Cenp-F interaction with Bub1 but not with Nup133, identifying Bub1 as a direct kinetochore tether of Cenp-F.

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Chez les eucaryotes, les pores nucléaires (NPCs), ancrés dans l’enveloppe nucléaire (EN), régulent les échanges nucléocytoplasmiques. Ces complexes, très conservés, sont composés d’une trentaine de protéines appelées nucléoporines (Nups) présentes en multiples copies au sein de chaque NPC. Chez la levure S. cerevisiae, seules quatre Nups, dont la protéine Pom33, possèdent des domaines transmembranaires. Une étude réalisée en amont de ce projet a permis de caractériser Pom33 et de montrer que le mutant pom33∆ est viable et ne présente pas de défaut apparent de transport nucléocytoplasmique mais se caractérise par un défaut de distribution des NPCs. Pom33 joue également un rôle dans l’assemblage des pores nucléaires au sein de l’EN (biogenèse de novo des NPCs). POM33 appartient à une famille de gènes très conservés. Il possède un paralogue chez S. cerevisiae, PER33, qui code pour une protéine localisée majoritairement au réticulum endoplasmique et minoritairement aux NPCs et qui n’est pas impliquée dans la biogenèse des NPCs. Chez les mammifères, il n’existe qu’un homologue de Pom33/Per33, TMEM33. Dans le cadre de ce doctorat, nous nous sommes demandés quels étaient les déterminants contribuant à l’adressage spécifique de Pom33 au niveau des NPCs et à sa fonction dans la biogenèse de ces structures. La purification de Pom33-ProtA, suivie de spectrométrie de masse, nous a permis d’identifier un nouveau partenaire de Pom33, le facteur d’import Kap123. Des approches in vitro ont montré une interaction directe entre Kap123 et le domaine C-terminal (CTD) de Pom33, qui est perturbée en présence de RanGTP. Par ailleurs, des prédictions in silico ont révélé la présence dans ce domaine CTD de deux hélices amphipathiques, conservées chez l’humain. Des analyses par dichroïsme circulaire et flottaisons ont confirmé la capacité du CTD à s’organiser en hélice en présence de membranes lipidiques et à interagir préférentiellement avec les membranes très courbées. L’expression d’une version mutée de Pom33-CTD, incapable de se lier aux membranes et couplée à la GFP, a révélé la capacité de ce domaine à agir comme un NLS, importé spécifiquement dans le noyau par Kap123. Alors que la délétion du domaine CTD affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs, la mutation des résidus basiques impliqués dans l’interaction avec Kap123 ou des résidus permettant sa liaison aux membranes lipidiques ne récapitule pas ce phénotype. En revanche, la perte combinée de ces deux déterminants affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs ainsi qu'une interaction génétique avec le mutant nup133∆, impliqué dans la biogenèse de novo des NPCs. Les résultats obtenus lors de cette étude indiquent donc que l’adressage de Pom33 est un mécanisme actif et multifactoriel, qui met en jeu au moins deux déterminants dans son domaine CTD. Ces données indiquent également un rôle de ce domaine dans la biogenèse de novo des NPCs, qui pourrait néanmoins n’être qu’un effet indirect de son rôle dans l’adressage de Pom33 aux NPCs. Au cours de cette étude, nous avons également mis en évidence d’autres partenaires potentiels de Pom33, en particulier Myo2, une localisation de Pom33 au niveau du bourgeon lors de la division et une interaction génétique entre POM33 et KAP123. Ces observations préliminaires ouvrent de nouvelles pistes de réflexion quant au rôle de Pom33 lors de la division cellulaire. / In eukaryotic cells, nucleocytoplasmic exchanges take place through the nuclear pores complexes (NPCs). These conserved macromolecular assemblies are embedded in the nuclear envelope (NE) and composed of ~30 distinct proteins called nucleoporins (Nups), each presents in multiple copies. In the budding yeast Sacharomyces cerevisiae, there are only four transmembrane Nups, including Pom33. A previous study leds to the characterization of Pom33 and revealed that pom33∆ mutant cells, although viable and without apparent alteration in nucleocytoplasmic transport, display NPCs distribution defect. Pom33 also contributes to the biogenesis of NPCs into the intact NE (de novo biogenesis). Pom33 is highly conserved among species and has a paralogue in S. cerevisiae, Per33, which can associate with NPCs but is mainly localized at the endoplasmic reticulum (ER) and NE. Unlike Pom33, Per33 is not involved in NPCs distribution and biogenesis. In mammalian cells, there is a unique homologue of Pom33/Per33, named TMEM33. In the context of this thesis, we aimed to identify the determinants involved in the specific targeting of Pom33 to NPCs and in its function in pore biogenesis. To characterize these determinants, we first performed affinity-purification experiments followed by mass spectrometry analyses. This identified a novel Pom33 partner, the nuclear import factor Kap123. In vitro experiments revealed a direct interaction between Pom33 C-terminal domain (CTD) and Kap123 that involves positively-charged residues within Pom33-CTD and is altered in the presence of Ran-GTP. Moreover, in silico analyses predicted the presence of two evolutionarily-conserved amphipathic ~-helices within Pom33-CTD. Circular dichroism studies and liposome co-floatation assays confirmed that this CTD domain is able to fold into ~-helices in the presence of liposomes and revealed its preferential binding to highly curved lipid membranes. When expressed in yeast, under conditions abolishing Pom33-CTD membrane association, Pom33-CTD behaves as a Kap123-dependent nuclear localization domain. While deletion of Pom33 C-terminal domain (Pom33-∆CTD-GFP) impairs Pom33 NPC targeting and stability and leads to a NPC distribution phenotype, mutants affecting either Kap123 binding or the amphipathic properties of the ~-helices do not display any detectable defect. However, combined impairment of lipid and Kap123 binding affects Pom33 targeting to NPCs and leads to an altered NPC distribution and a genetic interaction with the deletion of NUP133, a gene coding for a nucleoporin involved in NPCs biogenesis. Together, these results indicate that Pom33 targeting to NPCs is an active and multifactorial process that requires at least two determinants within its CTD. They also suggest a role of Pom33-CTD in the de novo NPCs biogenesis process, which could however only be an indirect consequence of its requirement for Pom33 targeting to NPCs. Our mass spectrometry analysis also identified other partners of Pom33, in particular Myo2, a molecular motor required for the cell cycle-regulated transport of various organelles and proteins and for correct alignment of the spindle during mitosis. Our studies also revealed a specific localization of Pom33 at the bud tip during mitosis and a genetic interaction between POM33 and KAP123. Taken together, these preliminary observations open new perspectives regarding additional functions of Pom33 during cell division.

Movement is a prerequisite for normal fetal development and growth. Intrauterine movement restrictions cause a broad spectrum of disorders in which the unifying feature is a reduction or lack of fetal movement, giving rise to the term fetal akinesia deformations sequence (FADS [OMIM 208150]). FADS corresponds to a clinically and genetically heterogeneous constellation of properties and is characterized by multiple joint contractures, facial abnormalities, and lung hypoplasia as a result of the decreased in utero movement of the fetuses. Affected babies are often prematurely and stillborn, and those born alive typically die within minutes or hours after birth. The genetic causes for this fatal disorder are ill-defined as a genetic diagnosis is rarely executed, but mutations in three genes, namely RAPSN, DOK7, and MUSK, as well as in the subunits of the muscular nicotinic acetylcholine receptor (AChR) have been described. These mutations are thought to affect neuromuscular junctions, although this has not been proven experimentally.The nucleoporin NUP88 is a constituent of the nuclear pore complex (NPC), the gate for all trafficking between the nucleus and the cytoplasm. NUP88 resides on both the cytoplasmic and the nuclear side of NPCs, and it is found in two distinct subcomplexes. It associates with NUP214 and NUP62 on the cytoplasmic face, while on the nuclear side NUP88 binds NUP98 and the intermediate filament protein lamin A. The NUP88-NUP214-NUP62 complex plays an essential role in the nuclear export of a subset of proteins and pre-ribosomes, which is mediated by the nuclear export receptor CRM1. NUP88 in particular somewhat participates in the nuclear export of NF-κB proteins in a CRM1-dependent manner. Moreover, NUP88 is frequently overexpressed in a variety of human cancers, and its role in cancer appears linked to the deregulation of the anaphase-promoting complex. Here, we report the first Mendelian disorders caused by mutations in NUP88 and with that the first lethal developmental human disease due to mutations in a nuclear pore component. We demonstrate that biallelic mutations in NUP88 are likely to cause fetal akinesia of the Pena-Shokeir subtype. We confirm in zebrafish that loss of NUP88 impairs movement and the mutations identified in the affected individuals resemble a loss-of-function phenotype. We show that loss of NUP88 affects expression and localization of rapsyn, the protein encoded by RAPSN, in human and mouse cell lines, and patient samples. Consistent with altered rapsyn, AChR clustering and neuromuscular junction formation in zebrafish are abnormal. We therefore propose that defective NUP88 function cause FADS by affecting neuromuscular junction formation.Keywords: Nuclear pore complex, NUP88, Fetal Akinesia Deformation Sequence, rapsyn, acetylcholine receptor clustering, synaptic transmission, fetal development, inherited developmental disorder. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The nuclear pore complex (NPC) is perhaps the largest protein complex in the eukaryotic cell, and controls the movement of molecules across the nuclear envelope. The NPC is composed of up to 30 proteins termed nucleoporins (Nups), each grouped in different sub-complexes. The transmembrane ring sub-complex is composed of Nups responsible for anchoring the NPC to the nuclear envelope. Bioinformatic analysis has traced all major sub-complexes of the NPC back to the last eukaryotic common ancestor, meaning that the nuclear pore structure and function is conserved amongst all eukaryotes. In this study Arabidopsis T-DNA knockout lines for these genes were investigated to characterise gene function. Differences in plant growth and development were observed for the ndc1 knockout line compared to wild-type but gp210 plants showed no phenotypic differences. The double knockout line gp210 ndc1 was generated through crosses to observe plant response to the knockout of two anchoring-Nup genes. No synergistic affect from this double knockout was observed, suggesting that more, as yet unidentified Nups function the transmembrane ring in plants. The sensitivity to nuclear export inhibitor leptomycin B (LMB) was tested also for knockout lines, although growth sensitivity to the drug was not observed. Nucleocytoplasmic transport of knockout lines was measured in cells transformed by particle bombardment. To express fluorescent protein constructs actively transported through the NPC, localisation of protein determined the nucleocytoplasmic transport of the cell. The ndc1single knockout and the double knockout gp210 ndc1 exhibited decreased nuclear export. Further experiments in determining NDC1 localisation and identification of other Nups in the transmembrane ring sub-complex would bring a more comprehensive understanding to the plant NPC.