Lipidmembranen ermöglichen die räumliche Anordnung von Biomolekülen. Einerseits repräsentieren Lipidvesikel Kompartimente zur Aufrechterhaltung chemischer Milieus und dienen der Verkapselung verschiedenster Substanzen. Anderseits stellen inhomogene Membranen Matrizen für eine laterale Organisation von Membrankomponenten dar. In der vorliegenden Arbeit wurden lipophile Nukleinsäuren zum Aufbau kompartimentalisierter Strukturen auf der Basis von Lipidmembranen benutzt, erstens, für die geordnete, dreidimensionale Assemblierung von Vesikeln, zweitens, für eine spezifische Funktionalisierung inhomogener Lipidmembranen. Definierte Schichten stabiler Lipidvesikel wurden auf „layer-by-layer“ beschichteten Silikapartikeln angeordnet. Mit Hilfe einer optischen Pinzette wurde der gerichtete Transport der mit Vesikeln beschichteten Partikel demonstriert. Moleküle konnten in den Vesikeln verkapselt und bei Bedarf vor Ort freigesetzt werden. Zudem wurde die kontrollierte Fusion der immobilisierten Veskel gezeigt, die eine Durchmischung von verschiedenen Membrankomponenten zur Folge hatte. Lipophile Nukleinsäuren wurden in die Membranen von lipiddomänenbildenden Vesikeln inkorporiert. Cholesterolbasierte DNS verteilte sich hierbei homogen über die gesamte Membran. Palmitoylierte Peptid-Nukleinsäure konzentrierte sich hingegen in der flüssig-geordneten Phase von flüssig-flüssig phasenseparierten Membranen, welche sogenannten Lipid Rafts in Zellmembranen ähnelt. Mittels der palmitoylierten Peptid-Nukleinsäure und tocopherolmodifizierter DNS wurden lateral inhomogene Membranen domänenspezifisch funktionalisiert. Beide Konstrukte konnten temperaturabhängig vermischt und separiert werden. / Lipid membranes are versatile tools for the spatial organization of biomolecules. On one hand, lipid vesicles represent enclosed compartments to maintain chemical environments and allow the efficient entrapment of substances. On the other hand, lateral inhomogeneous membranes provide the two dimensional sorting of membrane-bound compounds. In this work, lipophilic nucleic acids were used to build multicompartment systems based on lipid membranes by the controlled assembly of vesicles and the domain specific functionalization of inhomogeneous membranes. Three dimensional architectures of vesicles were formed by the sequential assembly of vesicles on layer-by-layer coated particles. Upon binding of the vesicles to the particles the vesicles remained stable – they did not fuse neither became leaky. Molecules could be entrapped inside the vesicles and released on demand. It was shown that the vesicles assembled on a particle can be transported to a defined destiny using an optical tweezer. Thus, the targeted delivery and the release of encapsulated molecules on site was achieved. It was also shown that vesicles immobilized on the particles can be fused by remote control, resulting in a mixing of membrane associated compounds. Different lipophilic nucleic acids were arranged in two dimensional patterns by incorporation into domain-forming vesicles. Cholesterol-modified DNA revealed an equal distribution to both domains in liquid-liquid phase-separated membranes, whereas palmitoylated peptide nucleic acid partitioned into the liquid-ordered domain, which resembles lipid rafts of cellular membranes. Using the palmitoylated peptide nucleic acid and tocopherol-modified DNA both domains of liquid-liquid phase-separated vesicles were functionalized with different DNA recognitions sites. Both constructs could be mixed and separated by temperature control.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein modulares Nukleinsäure-basiertes System zur Immobilisierung von verschiedenen bioaktiven Molekülen untersucht. Zur Verankerung nutzt das System komplementäre Nukleinsäurestränge. Einer der beiden Stränge wird durch anodische Polarisation partiell in die anodische Oxidschicht eingebaut, an den komplementären Strang wird das biologische Molekül konjugiert. Der Vorteil des hier weiter entwickelten Immobilisierungssystems bildet dessen Vielseitigkeit. Es kann auf alle titanbasierenden Implantate übertragen werden und dadurch, dass ein universelles Verankerungssystem verfügbar ist, können verschiedene bioaktive Moleküle aufgebracht werden. Für die Übertragung des Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems auf reale Implantatoberflächenzustände konnten optimale Prozessbedingungen festgelegt werden. Weiterhin konnten verschiedene Ankerstrangsequenzen hinsichtlich ihres Einflusses auf Adsorption und Hybridisierungseffizienz beurteilt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode entwickelt werden, die es ermöglicht, das Immobilisierungssystem mit 25 kGy Standarddosis Gammastrahlung zu sterilisieren. Hierbei wurden verschiedene Strategien (Trocknung, Schutzgas, Opferstränge) untersucht und hinsichtlich ihrer Ankerstrangschutzfähigkeit bewertet. In Zell- und Tierversuchen konnte die biologische Aktivität der über das Immobilisierungssystem aufgebrachten Wachstumsfaktoren VEGF und BMP-2 gezeigt werden. Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein wichtiger Beitrag zur Weiterentwicklung eines Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems im Hinblick auf eine klinische Anwendung geleistet werden.

Ein Schlüsselfeld der gegenwärtigen Biomaterialforschung ist die Modifizierung von Oberflächen mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix (EZM) oder Molekülen, die bestimmte Funktionen nachahmen. Trotz einer Reihe positiver Ergebnisse in vitro und in vivo ist es mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Immobilisierungsmethoden nicht möglich, unterschiedliche Komponenten in einem Prozessschritt zu immobilisieren, definierte Freisetzungscharakteristika für gleiche und/oder unterschiedliche Moleküle zu realisieren und die Beschichtung der Oberflächen nach Sterilisation der Implantate vorzunehmen, um empfindliche bioaktive Substanzen, wie Proteine, vor Schädigung zu bewahren. An diesem Punkt setzt die vorliegende Arbeit mit dem Ziel an, ein nukleinsäurebasiertes Immobilisierungssystem für Titanwerkstoffe zu entwickeln. Es wird zunächst am Beispiel eines Peptids mit der Aminosäuresequenz Arginin–Glyzin–Asparaginsäure (RGD) nachgewiesen, dass an der Grenzfläche Passivschicht/Elektrolyt von Titanwerkstoffen vorliegende Moleküle in durch anodische Polarisation verdickte Oxidschichten partiell eingebaut werden können und dabei ihre Funktionalität erhalten bleibt. Diese Immobilisierungsmethode wird zum Immobilisierungssystem erweitert, indem Nukleinsäureeinzelstränge mit der beschriebenen Methode als Ankerstränge (AS) in anodisch formierte Oxidschichten fixiert und in einem zweiten Prozessschritt mit komplementären Gegensträngen (GS) hybridisiert werden. In der Arbeit wird gezeigt, dass das Peptid in einem weiten Parameterbereich der elektrochemischen Bedingungen immobilisiert werden kann. Demgegenüber führen im Falle des nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystems die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die Photoaktivität der Oxidschicht sowie mehrfache Trocknungen und Wiederbenetzungen zu einer Schädigung gebundener AS bis hin zu einem vollständigen Verlust der Hybridisierbarkeit. Durch Zugabe von Ethanol in hoher Konzentration während des Immobilisierungsschritts, Arbeit unter Lichtausschluss sowie Vermeidung mehrerer Trocknungen und Wiederbenetzungen können die Nebenwirkungen soweit eingeschränkt werden, dass alle immobilisierten AS hybridisierbar sind. Nach dessen Etablierung im Rahmen dieser Arbeit ist es in nachfolgenden Projekten möglich, das nukleinsäurebasierte Immboilisierungssystem zu einem modularen, nukleinsäurebasierten Immobilisierungssystem zu erweitern, um die eingangs beschriebenen Grenzen etablierter Methoden zu umgehen. Dazu müssen im zweiten Prozessschritt Konjugate aus GS und bioaktiven Molekülen, wie z. B. Peptide oder Wachstumsfaktoren, eingesetzt werden. Weiterhin können durch die Nutzung verschiedener Längen und Basensequenzen die Hybridstabilität und damit die Freisetzungskinetik beeinflusst werden. / Surface functionalization with bioactive molecules is a main field in current biomaterial research. However, in vitro and in vivo results are heterogeneous. This may be at least partially attributed to the limits of the applied immobilization methods. With established immobilization methods possibilities are limited to immobilize different molecules in one step, to implement defined release kinetics for similar and/or different substances, or to carry out the immobilization after sterilization of the implant to save sensitive molecules from damage. Therefore in this thesis a nucleic acid based immobilization system for bioactive molecules is developed for titanium based materials. Using a peptide with the amino acid sequence arginine–glycine–aspartic acid (RGD) it is demonstrated at first, that small molecules, being present at the interface electrolyte/passive layer, can be immobilized by their partial incorporation in anodically formed oxide layers. The immobilization can be carried out in a wide range of electrochemical parameters and the peptide preserves its biological function under all conditions. This immobilization method is enhanced by utilizing single-stranded nucleic acids as anchor strands (AS), which can be hybridized by complementary strands (CS) in a second step. Contrary to the peptide, bound AS are damaged by the formation of reactive oxygen species during anodic polarization of the substrate, the photoyctivity of the titanium oxide layer and multiple drying and wetting cycles. These side effects must be constrained by adding ethanol in a high concentration to the electrolyte during the immobilization procedure, excluding light during preparation and avoiding multiple drying and wetting cycles. Applying these conutermeasures, a 100% hybridization of immobilized AS can be achieved. After establishing the nucleic acid based immobilization system it can be developed further to a modular, nucleic acid based immobilization system to overcome limitations of established immobilization methods. At first, conjugates of CS and bioactive molecules, such as peptides or growth factors, should be used in the hybridization step for a true functionalization of the surface. Furthermore, hybrid stability and thus release kinetics can be adjusted by using CS of different length and base sequences.

Meine Untersuchungen zeigen, dass es sich bei der zellfreien DNA (cfDNA, engl. cell-free DNA) des Spenderorgans (GcfDNA, engl. graft-derived cell-free DNA) um einen klinisch vielversprechenden Biomarker zur direkten Ermittlung der Organschädigung im Sinne einer „flüssigen Biopsie“ handelt. Alles was dafür notwendig ist, ist eine Blutprobe des Empfängerpatienten. Im Gegensatz zu konventionellen Markern wird die Organschädigung unmittelbar, direkt und hochspezifisch angezeigt. Durch neue Entwicklungen in der Labordiagnostik lässt sich dieser Marker im routinemäßigen Einsatz mittels digital droplet PCR (ddPCR) bestimmen. Die Analyseergebnisse können bei verhältnismäßig niedrigen Kosten innerhalb eines Arbeitstages erstellt werden. Unmittelbar nach Transplantation ist bei allen Patienten eine sehr hohe Konzentration der GcfDNA messbar. Innerhalb von wenigen Tagen fallen die Werte schnell ab und erreichen die Größenordnung stabiler Transplantatempfänger, die in der Lebertransplantation unter 10% liegen. Dabei besteht keine signifikante Korrelation der initialen GcfDNA-Freisetzung mit der Ischämieschädigung des Spenderorgans, ermittelt durch die Dauer der kalten Ischämiezeit (WIZ). Bei unzureichender Immunsuppression ist eine erhöhte GcfDNA-Freisetzung zu beobachten. Mithilfe der GcfDNA als Marker der Organintegrität lässt sich auch der gemeinsame Effekt verschiedener Immunsuppressiva ermitteln. Die GcfDNA verhält sich dabei umgekehrt proportional zur immunsuppressiven Therapie. Patienten mit akuten Abstoßungen haben im Mittel GcfDNA-Werte oberhalb von 50%. Die GcfDNA-Werte sind bereits mehrere Tage vor einer klinisch manifestierten akuten Abstoßung erhöht. Auch eine virusassoziierte Transplantatschädigung durch Hepatitis C manifestiert sich in vergleichsweise höheren GcfDNA-Werten. Cholestasen gehen hingegen nicht mit erhöhten GcfDNA-Werten einher. Die immunsuppressive Therapie könnte sich durch den routinemäßigen Einsatz der GcfDNA sicherer, einfacher, zuverlässiger und individueller gestalten lassen. Unter-Immunsuppressionen und daraus resultierende Abstoßungen würden sich bereits in der subklinischen Phase erkennen lassen und die Therapie von der bloßen Reaktion auf klinische Ereignisse hin zur Prävention verschieben. Um das Ziel einer personalisierten Medizin zu erreichen, könnte die Immunsuppression für jeden Patienten auf das absolut notwendige und damit gegenüber der bisherigen Praxis optimale Maß festgelegt werden. Geringere Nebenwirkungen und eine Reduktion der Kosten für das Gesundheitswesen wären die Konsequenz. Dieser Marker könnte dazu beitragen, das finale Ziel, nämlich eine Verbesserung des Langzeiterfolges nach Organtransplantationen, zu erreichen. Multizentrische Studien zur Validierung dieses Markers vor dem routinemäßigen Einsatz laufen bereits.

Micro-pollutants such as 17β-estradiol (E2) have been detected in different water resources and their negative effects on the environment and organisms have been demonstrated. It is essential to confirm the presence of micro-pollutants in different environments by biosensors and to remove these compounds. In this thesis, E2-binding target structures were used to investigate the underlying binding properties. E2-binding protein, DNA-, and PNA-aptamere (peptide nucleic acid) structures were used as targets to determine physicochemical interactions. The protein dataset consist of 35 publicly accessible three-dimensional structures of E2-protein complexes, from which six representative binding sites could be selected. There is no three-dimensional structure information for an E2-specific DNA aptamer, thus it was modeled using a coarse-grained modeling method. Using sequence information additional DNA aptamers were modeled. The E2 ligand was positioned close to the potential binding area of the aptamer structures, the underlying complexes were investigated by a molecular dynamics simulation, and the interactions were examined by an interaction profiler tool for each time step. A PNA generator was developed that can convert DNA and RNA in silico to more robust, but chemically equivalent PNA. This generator was used to transform the E2-specific DNA aptamer into PNA for binding studies with E2. All formed complexes were investigated with respect to the following non-covalent interaction types: hydrogen bonds, water-mediated hydrogen bonds, π-stacking, and hydrophobic interactions. Ten functional groups could be derived which formed the conserved interactions to E2. The study contributes to the understanding of the behavior of ligands that bind through different target structures in an aqueous solution and to the identification of binding specific interaction partners. The results of this thesis can be used to design novel synthetic receptor and filter systems.

Die Detektion von Nukleinsäuren ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Erkennung von viralen und bakteriellen Spezies in biologischen Proben. Oligonukleotid-vermittelte Reaktionen (OVR), die die Zielsequenz als Katalysator der chemischen Reaktion zwischen reaktiven Sonden verwenden, bieten gegenüber den enzymatischen Methoden viele Vorteile, wie z.B. Simplizität und Kosteneffizienz. Normalerweise besitzt das Produkt der OVR deutliche fluoreszierende Eigenschaften, die durch Fluoreszenzspektroskopie gemessen werden können. Die Haupteinschränkung solcher Systeme ist die nur moderate Helligkeit von organischen Farbstoffen, die meistens zur Markierung von reaktiven Sonden genutzt werden. Um dieses Problem zu lösen, sind Fluorophore mit höherer Helligkeit erforderlich. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Detektion von RNA durch Templat-vermittelten Transfer des Fluorophors auf den Quantum Dot (QD). Das System besteht aus zwei reaktiven Peptide Nucleic Acid (PNA)-basierten Antisense-Sonden. Die Label Akzeptor PNA (LAPNA) Sonde ist auf dem QD immobilisiert und enthält eine Cysteineinheit am N-terminus. Die Label Donor PNA (LDPNA) Sonde trägt eine Cy5-Einheit, die als Thioester gebunden ist. Durch die benachbarte Hybridisierung der Sonden am RNA-Templat nimmt die effektive Molarität der reaktiven Gruppen zu, und führt somit durch das Prinzip von Native Chemical Ligation zum Transfer des Cy5 auf den QD. Dies resultiert in Förster−Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen dem QD und den Cy5-Molekülen, der durch die Löschung der Emission des QDs sowie die Verstärkung der Fluoreszenz des Cy5 beobachtet werden kann. Die Verwendung von sehr hellen QDs als FRET-Donor ermöglicht die Umsetzung von Sonden bei geringen Konzentrationen und ermöglicht die Erkennung von RNA mit Nachweisgrenzen im Bereich von weniger pikomolar. / Detection of nucleic acids is one of the most reliable methods for the identification of bacterial and viral species in biological samples. Oligonucleotide-templated reactions (OTRs) that exploit an RNA or DNA target to catalyze a chemical reaction hold great promise for the development of enzyme-free and low-cost detection schemes. Commonly, these strategies rely on organic dyes and are designed so that the product of OTR exhibits distinct fluorogenic properties. The main constraint of such schemes is the moderate brightness of organic fluorophores, which limits the read-out when the probes are used at low concentrations. To tackle this obstacle, significantly brighter fluorophores are needed. This work describes the development of an RNA detection scheme that relies on target-templated fluorophore transfer onto a semiconductor quantum dot (QD). The approach uses two reactive peptide nucleic acid (PNA) antisense probes. Label acceptor peptide nucleic acid (LAPNA) probe is immobilized on a QD and bears a cysteine at the N-terminus; label donor peptide nucleic acid (LDPNA) probe is equipped with a Cy5 dye, attached as a thioester. The adjacent annealing of these recognition elements following binding to target RNA triggers the transfer of Cy5 onto a QD in a native chemical ligation manner. This leads to a detectable fluorescence signal brought about by FRET from QD to the Cy5. The use of unprecedentedly bright QDs that can act as FRET donors for several Cy5 functionalities allows application of probes at very low concentrations (pM range) and achieves enhanced sensitivity of target-templated RNA detection. The method enabled RNA detection in the low pM range using a conventional microtiter plate reader.

In den letzten Jahren gab es rasche Weiterentwicklungen auf dem Gebiet der Nukleinsäure-Erkennung. Von microRNA-Quantifizierung zur Untersuchung von Zelltods, --Teilung und -Regulation bis zur Bewertung genetischer Variabilität in Hinblick auf Krankheitsentstehung und -Behandlung: Die Analyse von Nukleinsäuren wird in der zukünftigen Medizin eine zentrale Rolle zukommen. Vor allem die Erkennung von SNPs als Hauptquelle der genetischen Vielfalt, aber aus Analysesicht auch eine der herausforderndsten Mutationen, stellt in dieser Hinsicht einen wesentlichen Aspekt dar. Methoden zur SNP-Erkennung müssen nicht nur sensibel, selektiv und stabil, sondern auch vielfältig sein und eine der wachsenden Analyseanzahl gerecht werdende hohe Verarbeitungsmenge bieten. Im Rahmendieser Arbeit wurde ein chemisches Prüfverfahren zur Erkennung von Nukleinsäuren und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) entwickelt. Das Reaktionssystem zur Nukleinsäuren- Erkennung beruht hierbeiauf der Interaktion zweier modifizierter Peptid-Nukleinsäure (PNS) Oligonukleotiden. Das Erste beinhaltet einen C-terminalen Thioester (Donor-Sonde), die zweite einen N-terminalen Cysteinyl-Rest (Akzeptor-Sonde). Zusätzlich ist die Donor-Sonde durch einenmakrocyclischen Metall Chelatkomplex aus 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure(DOTA) mit einem gebundenen lanthanoid-tag funktionalisiert. In die Akzeptor-Sonde wurde, zurReinigung mit magnetischen Streptavidin Partikeln, Biotin integriert. Der Ziel-DNA-Strang bringt beideSonden in räumliche Nähe zueinander und ermöglicht so eine chemische Reaktion. Das so gewonneneLigationsprodukt beinhaltet den Lanthanoid-Tag und Biotin, über welches das Produkt gereinigt wird,bevor die Detektion mittels ICP-MS erfolgt. Die Lanthanoid Konzentration dient als Indikator desLigationsprodukts welches wiederum den Reporter des Ziel-DNS-Strangs darstellt. Die, mithilfe diesesSystems erreichte, methodische Nachweisgrenze lag bei 29 pM mit einem RSD von 6,8% bei 50 pM(n=5). Zur Erkennung von SNPs wurde das Experiment mit einer Kombination zweier-Sets PNS Sonden mit unterschiedlichen Lanthanoid Tags durchgeführt. Das erste Set zielte auf die SNP beinhaltende Sequenz (Reportersystem) ab, während das zweite an eine benachbarte Sequenz (Kontrollsystem) binden sollte. Zur Erkennung der SNP wurden die Signale bei der Lanthanoide wurden ins Verhältnis gesetzt. Mithilfe dieses Verfahrens konnte durch Messung von sechs Lanthaniden bei einer Konzentration von 5 nM erfolgreich simultan zwischen den Allelen dreier SNPs unterschieden werden. / The field of nucleic acid detection has evolved swiftly in recent years. From quantification of micro RNA for the study of cell death, proliferation, and regulation, to the assessment of the influence of genetic variability towards disease development and treatment, the analysis of nucleic acids will play a central role in future medicine. In that regard, the detection of SNPs, as the primary source of genetic variability and the most challenging mutation from the analytical point of view, will be at the forefront of the discussion. Methods for the detection of SNPs not only require sensitivity, selectivity and robustness, but they should also allow multiplexing and offer high throughput in order to face the growing analysis demand In this work an assay for the detection of nucleic acids and single nucleotide polymorphisms (SNPs) was developed. The reaction system for the detection of nucleic acids is based on the interaction between two modified peptide nucleic acid (PNA) oligonucleotides. The first incorporated a C-terminal thioester (donor probe), and the second one a N-terminal cysteinyl residue (acceptor probe). In addition, the donor probe is functionalized with a metal-tag, which consist of a macrocyclic metal chelate complex of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) with a chelated lanthanoide. A biotin tag for purification by streptavidin magnetic particles was incorporated in the acceptor probe. The target DNA strand brings together the reporter probes allowing the chemical reaction. The resulting ligation product contains the metal-tag and the biotin, which is used to purify the product before measurement in the ICP-MS system. The lanthanoid concentration is used as an indicator of the ligation product, which at the same time serves as reporter of the target template. The methodological limit of detection achieved with this system was 29 pM with RSD of 6.8% at 50 pM (n=5). Detection of SNPs was performed using a combination of two sets of PNA probes labeled with different lanthanoid metal tags. The first probe set targeted the sequence where the SNP was present (reporter probe system), while the second set of probes was designed to bind to a neighboring sequence (control probe system). The signals of both lanthanides were used to establish a ratio that allowed the detection of the SNP. This assay was successfully used to simultaneously differentiate between alleles of 3 SNPs by measuring six lanthanoids at 5 nM concentration.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein modulares Nukleinsäure-basiertes System zur Immobilisierung von verschiedenen bioaktiven Molekülen untersucht. Zur Verankerung nutzt das System komplementäre Nukleinsäurestränge. Einer der beiden Stränge wird durch anodische Polarisation partiell in die anodische Oxidschicht eingebaut, an den komplementären Strang wird das biologische Molekül konjugiert. Der Vorteil des hier weiter entwickelten Immobilisierungssystems bildet dessen Vielseitigkeit. Es kann auf alle titanbasierenden Implantate übertragen werden und dadurch, dass ein universelles Verankerungssystem verfügbar ist, können verschiedene bioaktive Moleküle aufgebracht werden. Für die Übertragung des Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems auf reale Implantatoberflächenzustände konnten optimale Prozessbedingungen festgelegt werden. Weiterhin konnten verschiedene Ankerstrangsequenzen hinsichtlich ihres Einflusses auf Adsorption und Hybridisierungseffizienz beurteilt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Methode entwickelt werden, die es ermöglicht, das Immobilisierungssystem mit 25 kGy Standarddosis Gammastrahlung zu sterilisieren. Hierbei wurden verschiedene Strategien (Trocknung, Schutzgas, Opferstränge) untersucht und hinsichtlich ihrer Ankerstrangschutzfähigkeit bewertet. In Zell- und Tierversuchen konnte die biologische Aktivität der über das Immobilisierungssystem aufgebrachten Wachstumsfaktoren VEGF und BMP-2 gezeigt werden. Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein wichtiger Beitrag zur Weiterentwicklung eines Nukleinsäure-basierten Immobilisierungssystems im Hinblick auf eine klinische Anwendung geleistet werden.

Fluoreszenzmarkierungstechniken für lebende Zellen ermöglichen es Biologen, einen Blick in eine komplexe biologische Umgebung zu werfen und Informationen über ein bestimmtes Ziel in einer nahezu natürlichen Umgebung zu erhalten. Dank der konzertierten Bemühungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft gibt es eine Fülle von kommerziell erhältlichen, genetisch kodierbaren Markern und Reportern für die Fluoreszenzmikroskopie. Allerdings gibt es nur wenige Lebendzellmethoden, die eine direkte Konjugation von Nukleinsäuren mit Proteinen erlauben, obwohl es robuste DNA-Technologien gibt, die mit Oligo-Antikörper-Konjugaten auf Zelloberflächen durchgeführt werden. Ein weiterer, oft einschränkender Aspekt der Markierung ist die Fähigkeit, Ziele selektiv zu multiplexen. In dieser Studie wurde eine Methode der Tag-Probe-Markierung entwickelt, die eine selektive, gleichzeitige Markierung von zwei verschiedenen Zielen mit zwei Peptid-Nukleinsäure-Strängen (PNA) ermöglicht. Diese Methode verwendet ein Paar von Coiled-Coil-Peptiden, um die Konjugation einer PNA-Gruppe an ein Zielprotein zu steuern, das ein Peptid-Tag exprimiert. Die Verwendung orthogonaler Coiled-Coils ermöglicht Multiplexing. Die Markierung von synthetischen Tag-Peptiden, die mittels Flüssigchromatographie analysiert wurden, hat gezeigt, dass der orthogonale duale Transfer von PNA selektiv, quantitativ und schnell ist. Die PNA-Konjugation von exemplarischen Membranrezeptoren, gefolgt von der Hybridisierung mit komplementären Fluorophor-DNAs, ermöglichte eine unkomplizierte Visualisierung von dualen Rezeptoren in lebenden Zellen. Durch den Einsatz einfacher molekularer Hilfsmittel, die die Grundlage der DNA-Nanotechnologie bilden, konnte durch die Rekrutierung mehrerer DNAs eine zunehmend hellere Markierung erreicht werden und die löschbare Oberflächenmarkierung ermöglichte eine quantitative Untersuchung der Rezeptorinternalisierung. / Live-cell fluorescent labelling techniques allow biologists to glimpse into a complex biological environment and derive information about a specific target in a near-native environment. Thanks to a concerted effort from the scientific community, a plethora of commercially available, genetically encodable tags and reporters for fluorescence microscopy exist. However, few live-cell methods allow direct conjugation of nucleic acids with proteins despite the robust DNA technologies carried out on cell surfaces using oligo-antibody conjugates. Another aspect of labelling which is often limiting is the ability to selectively multiplex targets. In this study, a method of tag–probe labelling was developed that accomplishes selective, simultaneous labelling of two distinct targets with two peptide nucleic acid (PNA) strands. The technique uses a pair of coiled-coil peptides to guide conjugation of a PNA group to a target protein expressing a peptide tag and using orthogonal coiled-coil enables multiplexing. Initially, the labelling of synthetic tag-peptides analysed by liquid chromatography revealed the orthogonal dual transfer of PNA to be selective, quantitative, and rapid. PNA conjugation of exemplar membrane receptors followed by hybridization with complementary fluorophore-DNAs achieved straightforward live-cell dual receptor visualization. Finally, using simple molecular tools that form the basis of DNA nanotechnology, recruitment of multiple DNAs facilitated progressively brighter labelling, and erasable surface labelling allowed quantitative study of receptor internalisation.

Die Entwicklung von enzymfreien, isothermen Nachweisverfahren für Nukleinsäuren, die mit der PCR konkurrieren können, ist seit langem ein Ziel. Eine potenzielle Strategie besteht darin, Nukleinsäure-templierte Reaktionen zu verwenden, bei denen das Templat (Analyt) als Katalysator fungiert und das Signal verstärkt. Die derzeitig verwendeten Strategien, wie Ligations- oder Transferreaktionen, sind jedoch in ihrer Empfindlichkeit aufgrund des Effekts der Produktinhibierung begrenzt. Um dies zu überwinden, müssen die Reaktanten nicht nur sequenzspezifisch an die DNA oder RNA binden, sondern die Produkte müssen sich auch von der DNA oder RNA wieder lösen können. Diese Arbeit stellt ein neues Paradigma für Nukleinsäure templierte Reaktionen vor: Das Loss-of-Affinity Prinzip. In diesem Prinzip werden Produkte generiert, die eine geringere Affinität zum Templat aufweisen als die Reaktanten. Dadurch wird die Produktinhibierung verhindert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Loss-of-Affinity Prinzip mit triplexbildenden, spaltbaren bis-PNA Sonden untersucht. Diese erfuhren eine C-O-Bindungsspaltung, ausgelöst durch die katalytische Photoreduktion eines Rutheniumkomplexes. Nach mehreren Optimierungsrunden zeigte eine 10-mer bis-PNA Sonde eine beeindruckende katalytische Effizienz. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Loss-of-Affinity Prinzip zur Überwindung der Produktinhibierung genutzt werden kann. Die verwendeten bis-PNAs zeigten jedoch eine stark unspezifische Bindung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die bis-PNA Sonden gegen PNA- und GPNA-Spermin Sonden ausgetauscht, um das Problem der unspezifischen Bindung zu überwinden. Die PNA- und GPNA Spermin Sonden zeigten die wahrscheinlich effizientesten, bisher bekannten Nukleinsäure templierten Reaktionen, welchee die meisten natürlichen Enzyme übertrafen. Darüber hinaus zeigten sie eine ausgezeichnete Sequenzspezifität. / Developing enzyme-free isothermal detection methods of nucleic acids that can challenge PCR has been a long-standing goal. One potential strategy revolves around nucleic acid-templated reactions, in which the template (analyte) can act as a catalyst and amplify the signal. However, current strategies such as ligation reactions or functional group interconversions are plagued by product inhibition, which limits the sensitivity. To overcome this, the reactants must not only bind to DNA or RNA in a sequence-specific manner, but the products must also be able to detach from the DNA or RNA. This work introduces a new paradigm to nucleic acid-templated reactions, the loss-of-affinity principle, which yields products that have a lower template affinity than the reactants. This prevents product inhibition. In the first part of this work, the loss-of-affinity principle was explored with triplex-forming immolative bis-PNA probes that underwent a C-O bond cleavage upon catalytic photoreduction using a ruthenium complex. After several rounds of optimization, a 10-mer bis-PNA demonstrated an impressive catalytic efficiency. These results demonstrate that the loss-of-affinity principle can be used to overcome product inhibition. However, the bis-PNAs demonstrated highly non-specific binding. In the second part of this work, the bis-PNAs were replaced with PNA- and GPNA-spermine probes to address the issue of non-specific binding. The PNA- and GPNA-spermine probes exhibited probably the most efficient nucleic acid-templated reactions to date, outperforming most natural enzymes. In addition, they demonstrated excellent sequence specificity.