Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:21:59Z : No. of bitstreams: 1 cordeiro_mf_dr_jabo.pdf: 737504 bytes, checksum: 28b79a078c889bdd457fb2f63a6e13b7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O uso repetido da laparoscopia para aspiração folicular (LAF) associado ou não à estimulação hormonal foi avaliado. Para tanto foram utilizadas 40 fêmeas caprinas sem-raça-definida, divididas aleatoriamente em 4 grupos com 10 animais cada, sendo: Grupo 1 - adultas estimuladas com 80 mg de FSHp e 300 UI de eCG; Grupo 2 - adultas não estimuladas (controle); Grupo 3 - prépúberes estimuladas com metade das doses preconizadas para o G1 e Grupo 4 - pré-púberes não estimuladas. Cada fêmea foi submetida a seis sessões de colheita com intervalo de uma semana entre as intervenções. A estimulação hormonal foi feita em dose única, 36 horas antes do ato operatório. A técnica consistiu do uso de duas punções para a introdução do endoscópio e da pinça de manipulação atraumática. Após a visualização dos ovários, os folículos visíveis na sua superfície foram puncionados com auxílio de agulha de aspiração acoplada a um sistema de vácuo. Os oócitos encontrados foram classificados de acordo com a qualidade, submetidos à maturação in vitro por 27 horas, e posteriormente fixados e corados para avaliação do estádio de maturação. A técnica utilizada, embora tenha apresentado redução da qualidade dos oócitos, não interferiu na taxa de maturação ao longo das seis intervenções. A resposta ovariana diminuiu com o uso repetido da estimulação com FSH exógeno. Não houve comprometimento da condição corporal e da fertilidade dos animais. A avaliação das funções hepática e renal e da analgesia, indica que o protocolo anestésico utilizado é seguro e eficiente para este tipo de procedimento cirúrgico. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a técnica de laparoscopia para aspiração folicular é adequada para a obtenção de oócitos de fêmeas caprinas pré-púberes e adultas. / The repeated use of the laparoscopy to follicular aspiration (LFA) associated or not the hormonal stimulation was evaluated. Forty crossbred goat females were used, divided randomly in 4 groups with 10 animals each, being: Group 1 - adult stimulated with 80 mg of FSHp and 300 UI of eCG; Group 2 - adult not stimulated (control); Group 3 - pre-pubertal stimulated with half of the dose praised for the G1 and Group 4 - prepubertal not stimulated. Each female was submitted the six sessions of harvest with interval of one week between the interventions. The hormonal stimulation was made in only dose, 36 hours before the surgery. The technique consisted of the use of two punctions for the introduction of the endoscopy and the clamp atraumatic manipulation. After the visualization of the ovaries, the visible follicles in its surface were punched with aid of needle of aspiration connected to a vacuum system. The recovery oocytes were classified in accordance with the quality, submitted to in vitro maturation for 27 hours, and later fixed and stained for evaluation of maturation state. The used technique does not interfered in the maturation rate although oocytes quality has reduced. However the ovulatory response diminished with the repeated use of exogenous FSH stimulation. Damage was not observed in corporal condition nor fertility. The evaluation of the hepatic function, renal and pain analysis, showed that the anaesthetic protocol used is safe and efficient for this type of surgery. In conclusion, the technique of laparoscopy to follicular aspiration is adjusted for the attainment of oocytes in goat females adult and prepubertal.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Angiotensin II (AngII), progesterone (P4) and prostaglandins (PGs) are essential for ovulation of a fertile oocyte. This study sought to understand how these factors are linked together during the ovulatory process. To this end, first we characterized the pattern of expression of genes of interest to the renin-angiotensin system in follicular cells and AngII concentration in the fluid during the periovulatory period. Cows were ovariectomized at various times after GnRH injection to obtain pre (at the time of GnRH treatment) and periovulatory follicles (3, 6, 12, and 24 h after GnRH treatment). Theca and granulosa cells were separated and processed to real time RT-PCR Herein we demonstrated that the gonadotropin surge stimulates the follicular secretion of AngII and theca cells expression of mRNA for AGTR2 receptors. Next, we assessed whether AngII can modulate the secretion of steroids and PGs by follicular cells using in vitro culture of theca and granulosa cells of bovine ovaries from abattoir. In this study we found that AngII in synergism with LH stimulates the synthesis of PGE2 and PGF2α and P4 by granulosa cells. The role of AngII and PGs as mediators of nuclear maturation of oocytes in ruminants induced by gonadotropins had already been demonstrated. However, a similar action performed by P4 is still controversial in cattle. In this work, using in vitro and in vivo models, we evidenced that P4 not only participates in this process, but it is also an intermediate factor between AngII and PGs in the cascade of events. With the present work is possible to conclude that AngII, P4 and PGs are "linked" mediators of the preovulatory gonadotropin surge. These data allowed us to propose a unified model for both, ovulation and the resumption of nuclear maturation of oocytes. In this model the preovulatory gonadotropin surge up regulates the production of AngII and follicular expression of AGTR2 receptors, stimulating the secretion of P4 and the release of PGE2 and PGF2α, culminating with the ovulation of a fertile gamete. / A angiotensina II (AngII), progesterona (P4) e prostaglandinas (PGs) são fatores essenciais para que ocorra a ovulação de um oócito fértil. Este trabalho buscou entender se esses fatores interagem durante o processo de ovulação e maturação oocitária. Para tanto, primeiramente caracterizamos a expressão de genes de interesse para o sistema renina angiotensina em células foliculares e a concentração de AngII no fluido folicular durante o período periovulatório. Para tanto, folículos pré-ovulatórios de vacas foram coletados em diversos momentos após a administração intramuscular de GnRH. Após a coleta, o líquido folicular e as células da teca e granulosa foram separadas para realização da técnica de RT-PCR em tempo real. Neste estudo, foi observado que o pico de gonadotrofinas estimula a secreção folicular de AngII e a expressão de RNAm para receptores do tipo AGTR2 nas células da teca. Em seguida, avaliamos se a AngII é capaz de modular a secreção de esteróides e PGs pelas células foliculares. Células foliculares bovinas obtidas a partir de ovários de abatedouro foram cultivadas in vitro na presença de LH, AngII e/ou saralasina. Com este experimento, foi verificado que a AngII em sinergismo com LH estimula a síntese de P4, PGE2 e PGF2α pelas células da granulosa. O papel da AngII e PGs como mediadoras da maturação nuclear de oócitos em ruminantes induzida por gonadotrofinas já havia sido demonstrado. No entanto, uma ação similar realizada pela P4 ainda possuía caráter questionável em bovinos. No presente trabalho, utilizando modelos in vitro e in vivo, foi evidenciado que a P4 não só participa desse processo, mas também é um fator intermediário entre AngII e PGs na cascata de eventos. Ao final deste trabalho foi possível concluir que AngII, P4 e PGs são mediadores conectados da ação do pico pré-ovulatório de gonadotrofinas. Esses dados nos permitem propor um modelo unificado de eventos tanto para a ocorrência da ovulação quanto para a retomada da maturação nuclear do oócito. Neste modelo, o pico pré-ovulatório de gonadotrofinas aumenta a secreção folicular de AngII e a expressão de receptores AGTR2, os quais estimulam a secreção de P4 e por consequência de PGE2 e PGF2α, culminando com a ovulação de um gameta fértil.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 410014 bytes, checksum: 670794b294aeae950000e5e2848a5f4f (MD5) Previous issue date: 2004-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the vitrification of immature bovine oocytes, using differents equilibrium times and differents concentrations of ethylene glicol (EG) during equilibrium period, with a vitrification solution containing EG associated with two disaccharides. It was evaluated the influence of each treatment on the oocytes maturation rates, after thawing. The experiment was conducted in the LRA-DVT-UFV. It was tested three equilibrium solutions (ES), containing 3, 20 or 40% of EG, three equilibrium times (ET), 0,5, 5 and 15 minutes, and two vitrification solutions (VS), containing 40% of EG + 1,0 mol L-1 of trehalose or 40% of EG + 1,0 mol L-1 of sucrose. The three ES, the three ET and the two VS were combined among each other, completing 18 treatments. The controlled treatment had fresh oocytes non vitrified maturated in vitro. It was used 2.103 immature oocytes, distributed in 19 treatments. The selected oocytes were kept in the ES (basemedium with 3, 20 or 40% of EG) for a determined ET (0,5, 5 or 15 minutes). After the end of the ET, the oocytes were transfered to the VS (base-medium with 40% of EG + 1,0 mol L-1 of trehalose or 40% of EG + 1,0 mol L-1 of sucrose), for one minute. During this time, the oocytes were loaded in 0,25 mL straw and dipped directly in liquid nitrogen. The oocytes were thawed by exposing the straw for five seconds to air, followed by immersion in water bath at 37 °C for 30 to 45 seconds, and were gradually rehydrated in trehalose solutions (for treatments 1 to 9) or sucrose solutions (for treatments 10 to 18). After rehydratation, the recovery rate and morfology of the oocytes were evaluated. The oocytes were cultured for 22 to 24 hours. The recovery rate was not affected by ES, ET and VS, but the morfology of the oocytes was. The ES containing 40% of EG showed the highest rate of normal oocytes (NORM) (76,94%). The ET of 15 minutes showed the highest rate of NORM (80,58%) and lowest rate of oocytes with citoplasmic retraction (CITRET) (16,02%). Vitrifications solutions containing trehalose also showed the highest rate of NORM (76,80%) and the lowest rate of CITRET (19,93%). The combinations ET for 15 minutes and ES containing 3, 20 ou 40% of EG showed the lowest rates of CITRET (17,40; 20,78 and 9,88%, respectively). The combination (treatment 14) VS with sucrose, ET for five minutes, ES with 20% of EG showed the highest rate of MII (metaphase II) (44,55%). The lowest rate of MII in the treatments that used sucrose, were found in the combinations ES with 40% of EG and ET for 15 and five minutes (0,95 and 0,00%, respectively). The highest rate of MII in the treatments that used trehalose was 5,32%. The highest rates of CC (cromatin condensation) were found in the treatments that used trehalose. It was observed that the rate of MII of treatment 14 was significally different from the controlled treatment (44,55% and 74,95%, respectively). The results point out that morfologic evaluation of immature oocytes after thawing and rehydratation, based on citoplasmic retraction, do not reflect the potencial of the oocytes fo in vitro maturation. The use of trehalose in the VS influenced negatively the oocyte maturation. The use of sucrose in the VS influenced positively the oocyte maturation. Elevated concentrations of EG (40%) associated with a long ET (five and 15 minutes) did not favor the oocyte development. The protocol using 20% of EG in the ES, with ET of five minutes and the VS containing 40% of EG + 1,0 mol L-1 of sucrose, showed good rates of in vitro maturation, for immature bovine oocyte. / O objetivo do presente trabalho foi avaliar a vitrificação de ovócitos imaturos de bovinos, utilizando diferentes tempos e concentrações de etilenoglicol (EG) no equilíbrio, com a solução de vitrificação contendo o EG associado com dois dissacarídeos. Avaliou-se a influência de cada tratamento sobre a taxa de maturação dos ovócitos, após o descongelamento. O experimento foi realizado no LRA-DVT-UFV. Foram testados três soluções de equilíbrio (SE), contendo 3, 20 ou 40% de EG, três tempos de equilíbrio (TE), 0,5, 5 e 15 minutos, e duas soluções de vitrificação (SV), contendo 40% de EG + 1,0 mol L-1 de trealose ou 40% de EG + 1,0 mol L-1 de sacarose. As três SE, os três TE e as duas SV foram combinadas entre si, perfazendo um total de 18 tratamentos. O tratamento controle continha ovócitos frescos não congelados, maturados in vitro. Foram utilizados 2.103 ovócitos imaturos, distribuídos em 19 tratamentos. Os ovócitos selecionados foram mantidos imersos na SE (meiobase com 3, 20 ou 40% de EG) por um determinado TE (0,5, 5 ou 15 minutos). Após o término do TE os ovócitos foram tranferidos para a SV (meio-base com 40% de EG e 1,0 mol L-1 de trealose ou 40% de EG e 1,0 mol L-1 de sacarose), por um minuto. Durante este tempo, os ovócitos foram envasados em palheta de 0,25 mL e colocados diretamente no nitrogênio líquido. Os ovócitos foram descongelados por meio da exposição das palhetas por cinco segundos ao ar, seguida da imersão em Banho Maria a 37 °C por 30 a 45 segundos, e reidratados gradativamente em soluções de trealose (para os tratamentos 1 a 9) ou sacarose (para os tratamentos 10 a 18). Após a reidratação, foi avaliado a taxa de recuperação e a morfologia dos ovócitos.Os ovócitos foram cultivados durante 22 a 24 horas. Observou-se que a SE, TE e a SV não influenciaram a taxa de recuperação, mas influenciaram a morfologia dos ovócitos. A SE que continha 40% EG proporcionou maior taxa de ovócitos normais (OVNORM) (76,94%). O TE de 15 minutos proporcionou maior taxa de OVNORM (80,58%) e menor taxa de ovócitos com retração citoplasmática (OVRET) (16,02%). As soluções de vitrficação contendo a trealose também proporcionaram maior OVNORM (76,80%) e menor OVRET (19,93%). As combinações TE por 15 minutos e SE com 3, 20 ou 40% de EG proporcionaram as menores OVRET (17,40; 20,78 e 9,88%, respectivamente). A combinação (tratamento 14) SV com sacarose, TE por cinco minutos, SE com 20% de EG proporcionou a maior taxa de MII (metáfase II) (44,55%). As piores taxas de MII para os ovócitos dos tratamentos que envolveram a sacarose, foram encontradas nas combinações de SE com 40% de EG e TE por 15 e 5 minutos (0,95 e 0,00%, respectivamente). A maior taxa de MII para os ovócitos dos tratamentos que envolveram a trealose foi de 5,32%. As maiores taxas de CC (condensação da cromatina) foram observadas nos tratamentos que envolveram a trealose. Observou-se que a taxa de MII do tratamento 14 foi significativamente diferente do tratamento controle (44,55% e 74,95%, respectivamente). Conclui-se que a avaliação morfológica de ovócitos imaturos após o descongelamento e reidratação, com base na retração citoplasmática, não reflete o verdadeiro potencial de maturação in vitro dos ovócitos. O uso da trealose na SV influenciou negativamente a maturação ovocitária. O uso da sacarose na SV influenciou positivamente a maturação ovocitária. Concentrações elevadas de EG (40%) associado a um longo TE (cinco e 15 minutos) não favoreceram o desenvolvimento ovocitário. O protocolo utilizando 20% de EG na SE, com TE de cinco minutos e com a SV contendo 40% de EG + 1,0 mol L-1 de sacarose, proporcionou índices razoáveis de maturação in vitro, para ovócitos imaturos de bovinos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:54:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 272543 bytes, checksum: 2dcf69c50e38fd64e6faa78f1f0d9c46 (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / The in vitro embryo production (IVP) efficiency has been limited by oocyte developmental competence and in vitro culture conditions. The use of Brilliant Cresyl Blue (BCB) dye has been described as an alternative method for selection of better quality oocytes. The aim of this work was to evaluate the selection of immature oocytes by BCB dye and the expression of transcripts involved in the transition from genome-maternal. In the first step, a total of 998 immature oocytes was distributed into: G1- Control: oocytes sent directly to in vitro maturation, not exposed to the dye; G2- Control incubation (mPBS): oocytes exposed to mPBS solution without BCB for 1h; G3- BCB+: oocytes exposed to mPBS added of BCB and positively stained; G4- BCB-: oocytes exposed to mPBS with BCB and colorless. Oocytes of each treatment were matured, fertilized and presumptive zygotes were cultured in vitro for eight days. The rates of cleavage were obtained at 48h after the beginning of the culture and the rates of blastocysts at eight days post fertilization. The cleavage rates between G1 and G3 were similar, but higher than G2 and G4, the ones which similar. The oocytes in G3 showed blastocyst rate similar to the G1 and G2, but higher than G4. In another step, total RNA was extracted from three pools of 12 immature oocytes obtained from each group and used to generate cDNA. The relative abundance of MATER and Zar-1 transcripts was analyzed by Real Time PCR. No difference was found on relative expression for MATER and Zar-1 among groups. In conclusion, the conventional morphologic selection associated to the selection by BCB dye can be used as method of selection of immature oocyte, distinguishing two oocytes populations with different development competence, however this double selection did not select more competent oocytes when used only the conventional morphologic assessment. Moreover, the dye is not able to select oocytes with different patterns of expression transcripts MATER and Zar-1. / A eficiência da produção in vitro de embriões (PIV) tem sido limitada pelas condições de cultivo in vitro e baixa competência dos oócitos utilizados na maturação in vitro. A utilização do corante Azul Cresil Brilhante (ACB) associado à seleção morfológica convencional, tem sido descrita como uma alternativa para seleção de oócitos de melhor qualidade. Objetivou-se neste trabalho avaliar o uso do ACB como método de seleção de oócitos imaturos bovinos, utilizando como parâmetros de avaliação o desenvolvimento embrionário e a expressão de genes envolvidos na transição do genoma materno-zigótica. Na primeira etapa, um total de 998 oócitos foram distribuídos em 4 grupos: G1-Controle: oócitos submetidos à maturação sem exposição ao corante ; G2- Controle de incubação (mPBS): oócitos mantidos em mPBS por 1h a temperatura de 38,5º C em ar atmosférico; G3-ACB+: oócitos mantidos em mPBS adicionado de ACB, nas mesmas condições de G2, que apresentaram ao final da incubação citoplasma corado; G4- ACB-: oócitos mantidos em mPBS adicionado de ACB nas mesma condições de G2, que ao final da incubação apresentaram citoplasma incolor. Os oócitos de cada tratamento foram maturados, fertilizados e os possíveis zigotos cultivados in vitro por oito dias. As taxas de clivagem foram obtidas 48h após inicio do cultivo e as taxas de blastocistos oito dias após fecundação. As taxas de clivagem de G1 e G3 foram semelhantes, no entanto foram maiores que G2 e G4, as quais semelhantes. Os oócitos G3 apresentaram taxas de blastocisto semelhantes ao G1 e G2, mas foram maiores do que o G4. Na segunda etapa, o RNA total foi extraído de três pools de 12 oócitos imaturos obtidos dos mesmos tratamentos acima descritos e usados para gerar cDNA. A abundância relativa dos transcritos MATER e Zar-1 foi analisada por Real Time-PCR. Não foi encontrada diferença na expressão relativa dos transcritos MATER e Zar-1 entre os tratamentos. Em conclusão, à seleção morfológica convencional associada à seleção pelo corante ACB pode ser usada como método de seleção de oócitos imaturos, distinguindo duas populações de oócitos com diferente competência de desenvolvimento, no entanto esta dupla seleção não selecionou oócitos mais competentes quando utilizado unicamente o critério morfológico convencional de seleção. Além disso, o corante não foi capaz de selecionar oócitos com diferente padrão na expressão dos transcritos MATER e Zar-1.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-30Bitstream added on 2014-06-13T19:59:07Z : No. of bitstreams: 1 silva_rb_me_jabo.pdf: 1298125 bytes, checksum: 1ad82f6104f2a03b81c31c4de310d4d7 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Foram investigados os efeitos da irradiação com diodos lasers operando em 780 nm (infravermelho) e 660 nm (visível) na maturação, fertilização e cultivo in vitro de embriões bovinos. Verificou-se que a irradiação de oócitos com ambos os lasers, durante 30, 60, 120 e 180 segundos (L30, L60, L120, L180) não afetou (p>0,05) as taxas de maturação nuclear (Infravermelho: L30 - 88,92% vs. C30 – 81,84%; L60 – 83,56% vs. C60 – 87,40%; L120 – 76,06% vs. C120 – 85,30%; L180 – 77,42% vs. C180 - 80,16%; e Visível: L30 – 65,81% vs. C30 – 71,59%; L60 – 62,75% vs. C60 – 69,62%; L120 – 70,38% vs. C120 – 64,04%; L180 – 56,72% vs. C180 – 67,41%), e de maturação citoplasmática, avaliada por meio da distribuição dos grânulos corticais (Infravermelho: L30 – 86,18% vs. C30 – 61,04%; L60 – 66,03% vs. C60 – 56,16%; L120 – 53,75% vs. C120 – 79,81%; L180 – 57,70% vs. C180 – 82,04% e Visível: L30 – 81,08% vs. C30 – 74,42%; L60 – 68,11% vs. C60 – 61,63%; L120 – 75,95% vs. C120 – 48,33%; L180 – 77,77% vs. C180 – 59,52%). As porcentagens de produção embrionária ao sétimo dia de cultivo in vitro não foram alteradas (p>0,05) após a irradiação de oócitos com laser infravermelho (L30 – 29,20% vs. C30 – 42,60%; L60 – 32,0% vs. C60 – 31,0%; L120 – 38,0% vs. C120 – 35,0%; L180 – 37,0% vs. C180 – 32,0%), mas foram reduzidas após a irradiação com laser visível durante 180 seg. (L180 – 36,0% vs. C180 – 56,0 %). A irradiação em espermatozóides com ambos os lasers não afetou (p>0,05) as taxas de clivagem ao terceiro dia de cultivo in vitro (Infravermelho: L30 – 90,0% vs. C30 – 95,83%; L60 – 85,56% vs. C60 – 98,33%; L120 – 90,83% vs. C120 – 90,83%; L180 – 89,72% vs. C180 – 97,50%; e Visível: L30 – 82,96% vs. C30 – 85,61%; L60 – 82,10% vs. C60 – 82,53%; L120 – 80,48% vs. C120 – 82,44%;... / The diodo lasers irradiation effects, operating in 780nm (infrared light) and 660 nm (visible light), were evaluated on in vitro maturation, fertilization and culture rates of bovine embryos. Both infrared and visible laser irradiation on oocytes, during 30, 60, 120 and 180 seconds (30, 60, 120, 180) did not change (p>0,05) the rates of nuclear maturation (Infrared: L30 – 88.92% vs. C30 – 81.84%; L60 – 83.56% vs. C60 – 87.40%; L120 – 76.06% vs. C120 – 85.30%; L180 – 77.42% vs. C180 – 80.16%; and Visible: L30 – 65.81% vs. C30 – 71.59%; L60 – 62.75% vs. C60 – 69.62%; L120 – 70.38% vs. C120 – 64.04%; L180 – 56.72% vs. C180 – 67.41%), and the cytoplasmic cortical granule distribution (Infrared: L30 – 86.18% vs. C30 – 61.04%; L60 – 66.03% vs. C60 – 56.16%; L120 – 53.75% vs. C120 – 79.81%; L180 – 57.70% vs. C180 – 82.04% and Visible: L30 – 81.08% vs. C30 – 74.42%; L60 – 68.11% vs. C60 – 61.63%; L120 – 75.95% vs. C120 – 48.33%; L180 – 77.77% vs. C180 – 59.52%). The in vitro embryo production rates measured on seventh day of culture were not changed (p.0,05) after the infrared laser irradiation (L30 – 29.20% vs. C30 – 42.60%; L60 – 32.0% vs. C60 – 31.0%; L120 – 38.0% vs. C120 – 35.0%; L180 – 37.0% vs. C180 – 32.0%), but they were reduced (p<0,05) after the visible laser irradiation during 180 seconds (L180 – 36.0% vs. C180 – 56.0 %). When spermatozoa were irradiated, both lasers did not change the rates of cleavage (p>0,05) on third day of in vitro culture (Infrared: L30 – 90.0% vs. C30 – 95.83%; L60 – 85.56% vs. C60 – 98.33%; L120 – 90.83% vs. C120 – 90.83%; L180 – 89.72% vs. C180 – 97.50%; and Visible: L30 – 82.96% vs. C30 – 85.61%; L60 – 82.10% vs. C60 – 82.53%; L120 – 80.48% vs. C120 – 82.44%; L180 – 83.53% vs. C180 – 87.15%), the embryo production percentages on seventh day ...(Complete abstract, click electronic access below)

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: Vários são os componentes que tem a capacidade de interferir no metabolismo e desenvolvimento do oócito no interior do folículos, dentre esses fatores estão As EVs. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da maturação oocitária in vitro pelas EVs extraídos de vacas submetidas ao estresse térmico (ET) ou não. Para tanto 12 vacas da raça holandesa foram submetidas ao ET e 12 vacas foram mantidas em condições de termo-neutralidade, em seguida tiveram seus folículos aspirados em dois momentos do ciclo estral (pré-ovulação e desvio). Após a separação das EVs do fluido folicular, e visualizados pela microscopia eletrônica. Então As EVs foram colocados em meio de maturação para avaliação da ação destas vesículas durante a maturação oocitária. Após 22 horas de maturação, os oócitos e as células do cummulus foram recuperados para posterior análise de progressão da maturação e também para expressão de genes de interesse. Não foi observada diferença estatística entre os grupos na análise de progressão meiótica nem na integridade do DNA. Indicando que As EVs não interferiram na morfologia oocitária. A expressão gênica no entanto demonstrou que genes relacionados a expansão do cummulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), metabolismo energético (BMP15,CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 e 4) e apoptose (BCL2 e STAT3), apresentaram expressão diminuída no grupo termo-neutro. Os dados do nosso estudo indicam que o ambiente termo-neutro levou a uma sinalização intrafolicular das EVs com a fin... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There are several components that have the ability to interfere with the metabolism and development of the oocyte in side of follicles, among these factors are the EVs. Thus the aim of this study was to evaluate the modulation of oocyte maturation in vitro by EVs extracted from cows under heat stress or not. For that, 12 Holstein cows were subjected to heat stress and 12 cows were kept in a thermo-neutral conditions, then had their follicles aspirated in two stages of the estrous cycle (pre-ovulation and deviation). After separation of the EVs from follicular fluid, and visualized by electron microscopy. The EVs were placed in maturation medium for evaluation of the action of these vesicles during oocyte maturation. After 22 hours of maturation, oocytes and cummulus cells were recovered for further analysis of meiotic progression and for expression of genes of interest. There was no statistical difference between the groups in meiotic progression analysis or the DNA integrity. Indicating that the EVs not interfere in oocyte morphology. Gene expression however demonstrated that genes related to the expansion of the cumulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), energy metabolism (BMP15, CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 and 4) and apoptosis (BCL2 and STAT3) showed decreased expression the thermo-neutral group. The data from our study indicate that the thermo-neutral environment led to a intrafollicular signaling EVs in order to indicate a favorable situation for the oocyte. / Mestre

O objetivo deste estudo foi analisar as concentrações do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1) e insulina (INS) no fluido folicular durante foliculogênese em éguas, e localizar o receptor tipo 1 de IGF (IGF1R) nas paredes foliculares. Durante a estação reprodutiva, 40 éguas mestiças enviadas para abate em matadouro, com idades variando entre 6 e 16 anos foram utilizadas. As éguas foram abatidas de forma humanitária. Os tratos reprodutivos internos foram recuperados dentro de 10 min após o abate, ovários de éguas cíclicas foram separados do resto do aparelho. As éguas foram classificadas em quatro grupos: G1 – Folículo ≤ 13,5 mm e CL identificável; G2 – Folículo de 13,6 - 22,5 mm e CL identificável; G3 – Folículo de 22,6 - 31,5 mm e CL identificável; G4 – Folículo ≥ 31,6 mm e CL difícil de identificar. O fluido folicular (FF) foi aspirado e armazenado a -80 ° C até a sua utilização. Após a punção do FF, um fragmento da porção ventral da parede folicular foi removido para realizar a imunohistoquímica para localização de receptores IGF1R. O IGF1 livre foi determinado por ensaio imunoradiométrico. A INS foi determinada por um radioimunoensaio de fase líquida. A concentração de IGF1 livre e INS no FF aumentou com o crescimento folicular (P < 0,05). O escore imunohistoquímico de IGF1R nas células da granulosa e da teca interna da parede folicular equina em diferentes grupos aumentou (P < 0,05) com aumento folicular. Concluímos que as concentrações de IGF1 livre e INS no FF e de IGF1R em paredes foliculares de éguas aumentam com o crescimento folicular durante a foliculogênese, dando evidência do papel importante do IGF1 e INS no desenvolvimento folicular, e uma interação entre ambos hormônios na fisiologia reprodutiva ovariana. Sendo a égua um modelo de pesquisa para estudos comparativos na dinâmica folicular para consideração em mulheres, a conclusão deste estudo pode ser aplicada, também, a humanos. / The aim of this study was to analyze free type 1 insulin-like growth factor (IGF1) and insulin (INS) concentrations in follicular fluid during folliculogenesis in mares, and to localize type 1 IGF receptor (IGF1R) on follicular walls. During the breeding season, 40 mixed-breed mares sent to slaughter at an abattoir, with ages ranging between 6 to 16 years were used. Mares were humanely slaughtered. Internal reproductive tracts were recovered within 10 min after slaughter; ovaries of cyclic mares were separated from the rest of the tract. Mares were categorized into four groups: G1 – Follicle ≤ 13.5 mm and CL identifiable; G2 – Follicle of 13.6 to 22.5 mm and CL identifiable; G3 – Follicle of 22.6 to 31.5 mm and CL identifiable; G4 – Follicle ≥ 31.6 mm and CL difficult to identify. The follicular fluid (FF) was aspirated and stored at -80°C until use. After puncture of the FF, a fragment of the ventral portion of the follicular wall was removed to perform immunohistochemistry to localize IGF1R receptors. Free IGF1 was determined by immunoradiometric assay. INS was determined by a liquid phase radioimmunoassay. The concentration of free IGF1 and INS in FF increased with follicle growth (P < 0.05). Immunohistochemical score of IGF1R on granulosa and internal theca cells from equine follicular wall on different groups increase (P < 0.05) with follicular raise. We conclude that free IGF1 and INS concentrations in FF and IGF1R in follicular walls of mares increase with follicular growth during folliculogenesis, giving evidence of important role of IGF1 and INS in follicular development, and an interaction between both hormones in ovarian reproductive physiology. As the mare is a model research for comparative studies in follicular dynamics for consideration in women, the conclusion of this study can be applied to humans also.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-03T12:32:37Z No. of bitstreams: 1 Ricardo de Macedo Chaves.pdf: 847836 bytes, checksum: d3823ad319704f7a05a04fb624401ca9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-03T12:32:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ricardo de Macedo Chaves.pdf: 847836 bytes, checksum: d3823ad319704f7a05a04fb624401ca9 (MD5) Previous issue date: 2010-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study was divided in three stages and aimed to determine the cellular changes induced by heat stress on nuclear maturation in vitro and induction of cell death by apoptosis in goat oocytes and embryos. The ovaries of goats in the dry season and rainy season were collected in a slaughterhouse and transported to the Laboratory of Biotechnical Reproduction of UFRPE. The first stage, the cumulus oophorus complexes in goat of 12 repetitions were collected by the technique of "slicing" of the follicles from 2 to 6 mm in diameter and selected based on morphology. Divided into Group-1 (recovered) and Group-2 (in vitro matured), 25 oocytes per drop were placed in basic medium maturity (MBM). After collection of oocytes, it was determined the quality of oocytes, the enzyme activity of group II caspases with reagent PhiPhiLux-G1D2 and DNA fragmentation (TUNEL). Group-2, after maturation, were determined the stage of nuclear maturation, enzymes caspases and DNA fragmentation. In the stages of nuclear maturation stages of germinal vesicle, disruption of the germinal vesicle, metaphase I and II showed no significant difference (P > 0.05). There was no significant difference (P > 0.05) in the activity ofenzymes and caspases in DNA fragmentation of oocytes recovered and matured in vitro. The second stage, the cumulus oophorus complexes in goat were submitted to maturation, fertilization and in vitro. The percentage of cleaved oocytes was determined on day 3 (D-3) and the oocytes that developed to the stages of 8-16 cells (D-4), morulae (D-5) and blastocyst (D-8) after fertilization. The quality of blastocysts was assessed with the pigment DAPI and the determination of blastomeric positive for apoptosis by TUNEL assay. Significant difference (P < 0.05) stages of fertilization, cultivation in D-3 and morulae. No significant difference (P > 0.05) phases of maturation, growing on D-4, blastocyst and the TUNEL test. Based on these results, we concluded that the dry and rainy seasons will notinfluence the nuclear maturation in vitro apoptosis of oocytes and embryos and in vitro production of embryos in goats. / Este estudo foi dividido em duas etapas e teve como objetivo determinar as alterações celulares induzidas pelo estresse térmico na maturação nuclear in vitro e na indução da morte celular por apoptose em oócitos e embriões caprinos. Os ovários de cabras nas estações seca e chuvosa, foram coletados em abatedouro e transportados ao Laboratório de Biotécnicas da Reprodução da UFRPE. Na primeira etapa, os complexos cumulus oophorus caprinos de 12 repetições foram colhidos pela técnica de “slicing” dos folículos entre 2 a 6 mm de diâmetro e selecionados com base na morfologia. Divididos em Grupo-1 (recuperado) e Grupo-2 (maturados in vitro), 25 oócitos foram colocados por gota em meio básico de maturação (MBM). Após a coleta dos oócitos, foi determinado a qualidade dos oócitos, atividade das enzimas Caspases do grupo II com reagente PhiPhiLux-G1D2 e fragmentação de DNA (TUNEL). O Grupo-2, após maturação, foi determinado o estádio de maturação nuclear, enzimas Caspases e fragmentação de DNA. Nos estádios de maturação nuclear as fases de Vesícula Germinativa, Rompimento da Vesícula Germinativa, MetáfaseI e II não apresentaram diferença significativa (P > 0,05). Não foi encontrada diferença significativa (P > 0,05) na atividade das enzimas Caspases e na fragmentação do DNA dos oócitos recuperados e maturados in vitro. Na segunda etapa, os complexos cumulus oophorus caprinos foram submetidos à maturação, fertilização e cultivo in vitro. A porcentagem de oócitos clivados foi determinada no dia 3 (D-3) e os oócitos que se desenvolveram aos estádios de 8-16 células (D-4), mórula (D-5) e blastocisto (D-8) após a fertilização. A qualidade dos blastocistos foi avaliada com o corante DAPI e a determinação de blastômeros positivos para apoptose através do ensaio de TUNEL. Foi encontrada diferença significativa (P < 0,05) nas fases de fertilização, cultivo no D-3 e mórula. Não apresentaram diferença significativa (P > 0,05) às fases de maturação, cultivono D-4, blastocisto e no teste de TUNEL. Com base nos dados obtidos, podemos concluir que as estações seca e chuvosa não exercem influência na maturação nuclear in vitro, na apoptose de oócitos e embriões e na produção in vitro de embriões da espécie caprina..

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-03-23T20:39:38Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Denize Silva Brazil - 2017.pdf: 5061634 bytes, checksum: 34802ff0a8ca3775ced77fb220378cf1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-24T11:03:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Denize Silva Brazil - 2017.pdf: 5061634 bytes, checksum: 34802ff0a8ca3775ced77fb220378cf1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T11:03:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Denize Silva Brazil - 2017.pdf: 5061634 bytes, checksum: 34802ff0a8ca3775ced77fb220378cf1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Leptospirosis is an important zoonosis and it causes economic losses due to abortion, mastitis, infertility, and drop in milk production in affected herds. The disease may be disseminated through urine, water, contaminated soils, venereal and transplacental routes, and there is a risk of transmission by in vitro embryo manipulation. Thus, with the advancement of reproductive biotechnology, the concern with the sanity of animals or herds in the face of any disease also transmitted by semen or embryos has increased. As an alternative for the inactivation of infectious agents, the technique of photodynamic inactivation (PDI) has became prominent as it does not cause natural microbial resistance. The method consists in the combination of a photosensitizer (PS), light, and molecular oxygen, resulting in the formation of reactive oxygen species (ROS) that at high levels induce cell death. In this study, in order to inactivate in vitro Leptospira interrogans, six PSs were tested at a concentration of 10 μM and at the irradiation times of 30 and or 60 min. The TMPP and ZnTMPP porphyrins were efficient, the first one in the 30 min irradiation, the second one in both irradiation times. Methylene Blue (MB) demonstrated satisfactory inactivation when irradiated for 60 min. Hematoporphyrin and phthalocyanines did not demonstrate efficiency in the inactivation of leptospires in the experimental parameters used. When evaluating the action of ZnTMPP and MB on oocyte viability, both demonstrated to be innocuous to cumulus-oocyte (CCOs) complexes matured in the 30 min, which makes them potential candidates for the disinfection of biological materials or by-products of animal origin in place of antibiotics, known to cause bacterial resistance. / A leptospirose é uma importante zoonose e traz consideráveis perdas econômicas em decorrência de abortamentos, mastites, infertilidade e queda da produção de leite em rebanhos acometidos. A doença pode ser disseminada pela urina, água, solos contaminados, via venérea, transplacentária e há risco de transmissão pela manipulação de embriões in vitro. Dessa forma, com o avanço das biotécnicas reprodutivas, a preocupação com a sanidade de animais ou rebanhos frente a qualquer enfermidade também transmitida por sêmen ou embriões tem aumentado. Como alternativa para a inativação de agentes infecciosos, a técnica de inativação fotodinâmica (PDI) vem ganhando destaque por não causar resistência microbiana natural. O método consiste na combinação de um fotossensibilizador (PS), luz e oxigênio molecular, resultando na formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) que em altos níveis induzem a morte celular. Neste trabalho, com o objetivo de inativar a Leptospira interrogans in vitro, seis PSs foram testados na concentração de 10 μM e em tempos de irradiações de 30 e ou 60 min. As Porfirinas TMPP e ZnTMPP mostraram-se eficientes, a primeira na irradiação de 30 min, a segunda em ambos os tempos de irradiação testados. O Azul de Metileno (MB) demonstrou uma inativação satisfatória quando irradiado por 60 min. Hematoporfirina e Ftalocianinas testadas não demostraram eficiência na inativação das leptospiras nos parâmetros experimentais analisados. Ao avaliar a ação da ZnTMPP e do MB sobre a viabilidade dos oócitos, ambos demonstraram ser inócuos aos complexos cumulusovócitos (CCO’s) maturados no tempo de 30 min, o que os torna potenciais candidatos à utilização para a desinfecção de materiais biológicos ou subprodutos de origem animal em substituição aos antibióticos, conhecidamente causadores de resistência bacteriana.

A transição materno-embrionária é um fenômeno complexo caracterizado pela iniciação da transcrição no embrião e a substituição do mRNA materno pelo mRNA embrionário. O mRNA e as proteínas estocadas no oócito são utilizados nas primeiras clivagens e, posteriormente, o embrião deve iniciar a transcrição dos genes necessários ao seu desenvolvimento, que ocorre no estádio de oito células em embriões bovinos. Nesta etapa, podem ser observados embriões competentes a continuar o desenvolvimento, enquanto embriões incompetentes sofrem bloqueio. Pelo fato do bloqueio ocorrer na fase de ativação do genoma embrionário, formulou-se a hipótese de que o bloqueio estaria associado a genes transcritos neste momento, contrariamente à hipótese mais aceita de bloqueio passivo. O objetivo deste trabalho foi de identificar, categorizar e avaliar transcritos diferencialmente expressos entre embriões bovinos de desenvolvimento rápido e lento, além de elucidar possíveis vias de sinalização de morte ou sobrevivência celular. Para isso, foi feita uma hibridação em membrana de macro arranjo contendo genes humanos relacionados a ciclo celular, hibridada com aRNA marcado radioativamente oriundo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com sua velocidade de desenvolvimento, seguido por RT-PCR e análise de vias de sinalização para validação da hibridação. A média de similaridade entre estes genes humanos e bovinos de 89,3%. Pelas membranas de macro arranjos foram identificados 120 genes com modulação diferencial entre embriões lentos e rápidos, sendo 100 genes com regulação superior nos embriões lentos. Entre os genes com modulação positiva nos embriões rápidos, 40% foram primariamente identificados como ligantes a proteínas e 25% têm atividade catalítica, com resultados similares no grupo de genes com modulação positiva nos embriões lentos. Por um lado, as diferenças de transcrição entre embriões de desenvolvimento rápido e lento não foram confirmadas pelo RTPCR. Mas os genes diferencialmente modulados estão associados e constitutivamente presentes em algumas vias de sinalização para morte celular. Os resultados sugerem que a ativação do genoma embrionário é necessária para a sinalização de vias de sobrevivência ou morte celular programada. Assim, o bloqueio do desenvolvimento não é um processo passivo, mas sim um processo ativo de transcrição de genes, ativando tanto a cascata de sobrevivência quanto a cascata de morte em embriões com baixo potencial de desenvolvimento. / Maternal-zygotic transition is a complex phenomenon characterized by the initiation of transcription in the embryo and the transition of maternal mRNA with embryonic mRNA. It is believed that the mRNAs and proteins synthethized by the oocyte during its growth and final maturation allow the zygote to develop during the early stages of embryo development up to the 8 cell-stage, the moment when the bovine embryo acquires transcriptional competence. Competent embryos are able to develop until blastocyst, while incompetent embryos block. Since the blockage occurs during embryo genome activation, we developed the hypothesis that gene transcription in incompetent embryos is associated with the blockage, instead of passive blockage. The aim of this work was to identify, categorize and analyze gene expression differences between fast cleavage and slow cleavage embryos, and discover possible signaling pathways to cell death or cell survival. We used a macroarray membrane spotted with human genes related to cell cycle and hybridizated with a radioactive labeled aRNA from fast or slow in vitro produced embryos. Real-time PCR and signaling pathways analysis were designed for further validation of the array. The mean similarity between human and bovine genes was 89,3%. According to the array membranes, it was possible to identify 120 genes differentially expressed between slow and fast cleavage embryos. Hence, the majority of the genes were more expressed in slow embryos (100 genes versus 20 genes in fast group). Among genes more expressed at fast embryos, 40% were identified as protein binding and 25% have catalytic activity, with similar results in slow embryos. In one hand, differences between fast and slow embryos transcripts were not confirmed by real-time PCR analysis. But on the other hand, the differentially expressed genes are somehow related to and constitutively present in some recognized death pathways. Together, these results presented herein suggest that embryonic genome activation is necessary for survival or cell death signaling. Moreover, developmental block is not a passive pathway, but rather a very active transcriptional pathway, leading to activation of cell survival genes prior to genes related to death in slow-developing embryos.