Thesis (Ph. D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2003. / Vita. Bibliography: References located at the end of each chapter.

Com o objetivo de conhecer meios, explantes, tecidos envolvidos e controle genético da regeneração in vitro a partir de plântulas de Eucalyptus grandis, dez progênies de polinização aberta da população base, origem Atherton localizada em Anhembi, estado de São Paulo foram utilizadas. Sementes de sete progênies foram germinadas in vitro. Após vinte dias de cultivo, cotilédones, segmentos proximais e distais dos hipocótilos foram inoculados em nove meios de cultura usando o meio basal de JADS em combinação com dois reguladores de crescimento (ANA e BAP). Após 14 semanas de cultivo, foram feitas avaliações da regeneração e histologia. Células do córtex estavam envolvidos na regeneração dos hipocótilos e as células subepidérmicas originaram calos e estes deram origem a brotos nos cotilédones. Todos os brotos formados tiveram conexão com o sistema vascular do tecido original. Foi verificado que o melhor tratamento, onde 41% dos hipocótilos distais regeneraram, na combinação de ANA e BAP 0,5 mg L-1. Posteriormente, os segmentos distais dos hipocótilos das dez progênies foram inoculados naquele meio, houve diferenças significativas de regeneração entre as progênies (P<0,0001) com extremos de regeneração de 11% a 60% e com uma média de 37%. A herdabilidade quanto ao caráter foi alta (h 2 m =0,94), indicando que houve um forte controle genético na regeneração in vitro dentro da população. Houve também alta variabilidade dentro da amostra estudada assim como um forte efeito materno sobre a regeneração. / Aiming at better knowledge on tissue culture media, axplants, tissues involved and genetic control of in vitro regeneration of Eucalyptus grandis from seedlings, seeds from ten open pollinated progenies from the basic population, origin Atherton, located in Anhembi, São Paulo State (BR) were used. Initially, seeds from seven progenies were germinated in vitro. Twenty days after culture, cotyledons and, distal and proximal hypocotyls segments were inoculated in culture media using JADS basic medium with varius NAA + BAP combinations. After 14 weeks of culture, evaluations bud induction, regeneration, and histological analysis were done. Cortex cells were involved in hypocotyls direct regeneration and cotyledon epidermic cells gave rise to callus which in turn produced shoots. All shoots developed had connection to the original vascular system. It was verified that NAA + BAP at 0,5 mgL-1 concentration each was the best treatment, where 41% of the distal hypocotyls regenerated. Distal hypocotyl segments from of seedlings of ten progenies were inoculated showing significant differences regeneration among progenies. Regeneration varied from 11% to 60% with a mean of 37%; the heritability in relation to the character was ( 94 , 0 2 = m h ), indicating that there was a strong genetic control of the in vitro regeneration within the population. Also, there was a high variability within the samples studied as well as a strong maternal effect on the regeneration.

Submitted by Katiane Souza (katyane.souza@gmail.com) on 2016-06-05T16:39:15Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4186223 bytes, checksum: 3758454784531cdb854ab4f824e31065 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-05T16:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4186223 bytes, checksum: 3758454784531cdb854ab4f824e31065 (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brazil has 47 endemic species of strawberry guava (Psidium spp.), being an important center of genetic diversity of this genus. In the Caatinga biome, the occurrence of the species P. schenckianum Kiaersk, P. guineense Swartz. (most often) and Psidium grandifolium Mart. have been reported. These species have great potential for economic exploitation of the fruit, which is rich in vitamin C and can be consumed fresh or processed in the form of juices, sweets, jams, jellies and ice cream. It also presents outstanding antimicrobial activity, pharmacological and antioxidant as well as essential oils. In addition, strawberry guava are the main sources of resistance to nematode (Meloidogyne enterolobii), which is the main pathogen of guava (P. guajava). This resistance can be transferred to the Paluma guava (cv. GP). However, the strawberry guava is endangered in its natural environment and presents limitations in vegetative propagation by conventional methods, making impossible cloning the resistant plants. Micropropagation is a viable propagation technique of species susceptible to extinction and difficult vegetative propagation. Protocols allowing the cloning of this species for future studies should be improved. Thus, the aim of this research is to develop a protocol for micropropagation of Psidium spp., determining the culture medium, conditions of gas exchange, type of explant and concentration of growth regulators. Seedlings of three access of strawberry guava and cultivar guava paluma (cv.GP) were grown under the following conditions: JADS culture medium, MS and WPM to determine the culture medium; and medium JADS sealed with lids without membrane (SM), one membrane (1M) and two membranes (2M) with carbon dioxide exchange rates (TTCO2) 14; 21 and 25 μL L-1, respectively, to determine the best seedling growth in TTCO2 Psidium spp. After this, different explants of Brazilian guava trees were transferred to regeneration media with different concentrations of indolbutyric acid (IBA): 0, 2.46, 4.92 and 9.84 mM in rooting induction and benzyladenine (BA): 0.0, 2.2 and 4.44 mM; BA + naphthaleneacetic acid (NAA): 2.22 uM BA + 0.054 uM ANA; and 4.44 uM BA + 0.054 uM ANA in regeneration shoots of the following explants: nodal and apical segments in semi-solid culture, stem segments in liquid culture, organogenesis internodal segments, and leaf sections in semi-solid cultureof a P. guineense access and induction of organogenesis in liquid culture using root segments of a P. schenckianum access and three accessions of P. guineense. Seedlings of strawberry guava and cv. GP showed better growth in JADS culture medium. TTCO2 (25 μL L-1) resulted in the growth of seedlings with improved morphophysiological and anatomical characteristics and biosynthesis of compounds of reserve in leaves from both species (P. guineense and P. guajava). This condition is the most indicated for the development in in vitro propagation protocols of Psidium spp. It was not necessary the addition of IBA in the rooting of shoots. Shoots were obtained with and without addition of plant hormones in stem segments, apical segments, nodal and root segments in P. guineense accesses from direct organogenesis, maintaining the same ploidy of the seedlings of this species. In stem segments, the greater number of shoots was observed with 2.22 and 4.44 mM of BA. Shoots were elongated, rooted and acclimatized with 100% survival, showing that the in vitro regeneration protocol established is efficient. This is the first micropropagation protocol established to strawberry guava / O Brasil possui 47 espécies endêmicas de araçazeiros (Psidium spp.), constituindo-se num importante centro de diversidade genética do gênero. No bioma Caatinga, já foram reportadas a ocorrência das espécies Psidium schenckianum Kiaersk., P. guineense Swartz. e P. grandifolium Mart., com maior frequência das duas primeiras. Estas espécies apresentam grande potencial de uso de seus frutos, por serem ricos em vitamina C, podendo ser utilizado no consumo in natura ou industrializado, na forma de sucos, doces, compotas, geleias e sorvetes. Apresenta ainda, marcante atividade antimicrobiana, farmacológica e antioxidante além de possuir grande quantidade de óleos essenciais. Além disso, os araçazeiros são as principais fontes de resistência ao nematoide (Meloidogyne enterolobii), principal patógeno que acomete a goiabeira (P. guajava), a qual pode ser transferida para a goiabeira Paluma (cv. GP). Contudo, os araçazeiros encontram-se em risco de extinção em seus ambientes naturais e apresentam dificuldades na propagação vegetativa pelos métodos convencionais, impossibilitando a clonagem das plantas resistentes. A micropropagação é uma técnica viável para propagação de espécies passíveis de extinção e de difícil propagação vegetativa, devendo-se desenvolver protocolos que possibilitem a clonagem desta espécie para estudos futuros de melhoramento. Dessa forma, objetivou-se com a presente pesquisa desenvolver um protocolo para micropropagação de Psidium spp., determinando o meio de cultura, condições de trocas gasosas, tipo de explante e concentração de fitorreguladores. Plântulas de três acessos de araçazeiros e da cultivar de goiaba Paluma (cv. GP), foram crescidas nas seguintes condições: meios de cultura JADS, MS e WPM para determinação do meio de cultura, e em meio de cultura JADS, vedados com tampas sem membrana (SM), uma membrana (1M) e duas membranas (2M) com taxas de trocas de dióxido de carbono (TTCO2) de 14; 21 e 25 μL L-1, respectivamente, para determinar a melhor TTCO2 no crescimento de plântulas de Psidium spp. Após determinada estas condições, diferentes explantes de araçazeiros foram induzidos a regeneração in vitro, utilizando diferentes concentrações de ácido indolbutírico (AIB) (0; 2,46; 4,92 e 9,84 μM) na indução de rizogênese; benziladenina (BA) (0,0; 2,2 e 4,44 μM) e BA + ácido naftalenoacético (ANA) (2,22 μM BA + 0,054 μM ANA e 4,44 μM BA + 0,054 μM ANA) na regeneração de brotos dos seguintes explantes: segmentos nodais e apicais em meio de cultura semi-sólido, segmentos caulinares em meio de cultura líquido, organogênese de segmentos internodais, e secções foliares em meio de cultura semi-sólido, de um acesso de P. guineense e indução de organogênese em meio de cultura líquido, utilizando segmentos radiculares de um acesso de P. schenckianum e três acessos de P. guineense. As plântulas de araçazeiro e da cv. GP apresentaram melhor crescimento em meio de cultura JADS. Maiores TTCO2 (25 μL L-1), resultaram no crescimento das plântulas com melhores características morfofisiológicas e anatômicas, e na biossíntese de compostos de reservas nas folhas de ambas as espécies (P. guineense e P. guajava), sendo esta condição a mais indicada para o desenvolvimento de protocolos de propagação in vitro de Psidium spp. Não foi necessária adição de AIB no enraizamento das brotações. Foram obtidas brotações com e sem adição de fitorreguladores, em segmentos caulinares, segmentos apicais, nodais e, em segmentos radiculares nos acessos de P. guineense, a partir de organogênese direta, mantendo a mesma ploidia das plantas oriundas de sementes desta espécie. Em segmentos caulinares, maior número de brotações foi observado com 2,22 e 4,44 μM de BA. As brotações foram alongadas, enraizadas e aclimatizadas com 100% de sobrevivência, permitindo inferir que o protocolo de regeneração in vitro estabelecido é eficiente. Este é o primeiro protocolo de micropropagação estabelecido para araçá.

O estudo objetivou caracterizar o desenvolvimento morfológico e organológico de embriões suínos da raça Landrace (Sus scrofa domesticus) aos 20 (n=6) e 30 (n=7) dias pós inseminação artificial (p.i.), utilizando técnicas macroscópicas e microscópicas, além da análise morfométrica dos principais órgãos (coração, pulmão, fígado e mesonefro), inferindo sua importância na manutenção do concepto. Os embriões aos 20 p.i. apresentaram macroscopicamente pele translúcida; prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo; vesícula óptica sem pigmentação da retina; arcos branquiais; curvatura cervical; broto do membro torácico em forma de \"remo\"; fígado; coração; mesonefro; somitos e vascularização dermal. Nas análises histológicas, visualizaram-se as vesículas encefálicas; arcos branquiais; vesícula óptica sem pigmentação da retina; flexura encefálica; na região torácica e abdominal o coração e o fígado respectivamente; mesonefro (rim primitivo); intestino primitivo e somitos. Morfometricamente, os principais órgãos (coração, fígado e mesonefro) dos embriões aos 20 dias p.i., não diferiram significativamente (p<0,05), demonstrando desenvolvimento organológico apropriado a esta fase. As avaliações morfológicas e histológicas dos embriões aos 30 dias p.i. revelaram características semelhantes aos de 20 dias p.i., exceto pela presença do 4º ventrículo encefálico; curvatura cervical acentuada; fosseta nasal; vesículas ópticas com pigmentação da retina; membros torácicos e pélvicos com distinção dos dígitos; cauda; fígado volumoso e coluna vertebral, macroscopicamente; e pela presença das vesículas encefálicas secundárias; medula espinhal; medula oblonga; 3º ventrículo encefálico; coluna vertebral; pulmão; intestino primitivo e metanefro, microscopicamente. Entretanto, as análises estatísticas revelaram que as avaliações morfometricas do coração, pulmão, fígado e mesonefro diferiram entre si (p<0,05) em relação ao desenvolvimento dos principais órgãos. A comparação entre as médias das áreas totais do coração, fígado e mesonefro, pelo teste Mann-Whitney, indicaram que os embriões, aos 20 e 30 dias p.i., apresentaram diferença significativa (p<0,05). Este estudo sugeriu que a taxa de uniformidade e desenvolvimento dos embriões podem ser determinantes para a manutenção do concepto durante o período gestacional. Porém, mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos acerca do desenvolvimento embrionário no terço inicial da gestação a fim de minimizar as perdas gestacionais na espécie suína. / The study aimed to characterize the morphological and organology development of Landrace pigs embryos (Sus scrofa domesticus) at 20 days (n=6) and 30 days (n=6) post artificial insemination (p.i.) through macroscopic and microscopic techniques, besides morphometric analysis of the major organs (heart, lung, liver and mesonephros) inferring its importance in the conseptus maintenance. Embryos at 20 days p.i. macroscopically presented translucent skin; forebrain, midbrain and hindbrain; optic vesicle without retinal pigmentation; branquial arches; cervical curvature; forelimb budshaped \"paddle\"; liver; heart; mesonephros; somites and dermal vasculature. In the histological analysis were visualized the encephalic vesicles (forebrain, midbrain and hindbrain); branquial arches with its respective pouches and clefts; encephalic flexure; in the thoracic and abdominal portion the heart and liver respectively; mesonephros (primitive kidney); primitive gut and somites. Morphometrically, the major organs (heart, liver and mesonephros) of embryos at 20 days p.i. did not differ significantly (p<0.05) demonstrating organologycal appropriate development at this stage. The morphological and histological evaluations of embryos at 30 days p.i. revealed similar characteristics to the embryos at 20 days p.i., except for the presence of the 4th encephalic ventricle; accentuated cervical curvature; nasal pit; optic vesicles with pigmentation of the retina; thoracic and pelvic members with distinction of the digits; tail, voluminous liver, and vertebral column, macroscopically; and the presence of secondary encephalic vesicles; spinal cord; medulla oblongata; 3rd encephalic ventricle; vertebral column; lung; \"U-shaped\" intestine, and mesonephros, microscopically. However, statistical analyzes revealed that the morphometric evaluations the heart, lung, liver and mesonephros differ significantly (p<0,05) regarding the development of the major organs. The comparison between the means of the total areas of the heart, liver and mesonephros, through Man-Whitney test indicated that the embryos at 20 and 30 days p.i., demonstrated significant differences (p<0,05). This study suggested that the embryo uniformity and development rate may be crucial in the maintenance of the conceptus during the gestational period. However, more studies are necessary to elucidate the mechanisms of the embryonic development regarding the first third of pregnancy in order to minimize gestational losses in swine.

O avanço da cultura do maracujazeiro no país impulsionado pela agroindústria de suco e a crescente demanda de fruta fresca, acarretou o surgimento de problemas, principalmente de ordem fitossanitária, doenças causadas por fungos, bactérias e vírus. A espécie Passiflora cincinnata Mast. por apresentar resistência à doença da parte aérea causada pela ba ctéria Xanthomonas campestris f. sp. passiflorae e, potencial para a comercialização constitui um genótipo de interesse em programas de melhoramento. Visto que a cultura de tecidos tem sido ferramenta importante nesses programas, o presente projeto visa o estudo aspectos anatômicos e fisiológicos da organogênese in vitro dessa espécie. Os explantes utilizados: segmentos radiculares, discos foliares e a própria plântula, obtidos da germinação de sementes in vitro, foram inoculados em meio contendo diferentes concentrações de 6-BA (6-benziladenina) e acrescido de 5% de água de coco, a fim de estabelecer os protocolos de regeneração de plantas in vitro. A concentração de 0,5 mg.L -1 de 6-BA foi a mais adequada para os três explantes, porém, o tempo e a via (direta/indireta) de formação da gema diferiu para cada tipo de explante. Os eventos histológicos que levaram a formação de um novo órgão, via meristemóides (centros meristemáticos) foram descritos. Nos discos foliares a origem foi indireta, com formação de calo a partir das células subepidérmicas das camadas de parênquima clorofiliano. Nos segmentos de raiz e nas raízes das plântulas, a organogênese direta apresentou duas origens, a partir do periciclo, nas raízes com início da estrutura secundária, e a partir do câmbio vascular, nas raízes com estrutura secundária já estabelecida. Também nos segmentos de raiz observou-se a via indireta, esta a partir da proliferação do periciclo. / The progress of passionfruit culture in the country stimulated by the juice agroindustry and due to an increased demand of fresh fruit have brought phytosanitary problems, such as, diseases caused by fungis, bacterium and virus. The Passiflora cincinnata Mast. a resistant specie to Xanthomonas campestris f. sp. Passiflora bacterium shows a potential for commercialization creating an interest genotype in breedings programs. Whereas the tissue culture has been an important instrument for those programs, object of this program is to study the anatomical and physiologycal aspects of organogenesis “in vitro” of this specie. The explants used were: root segments, leaf discs and the seedlings obtained from germination of seeds “in vitro”. They were placed in different solutions of 6-BA (benzyladenine) and with 5% of coconut water, in order to establish protocol for plant regeneration “in vitro”. The concentration of 0,5 mg.L- 1 of 6-BA was the most adequate for all three explants, but the time and nourishement source (direct/indirect) to the shoots formation differed to each kind of explants. The histological events had lead the formation of a new organ, by meristemoids (meristematic centers) were described. In the leaf discs the indirect origin, was observed in which callus were formatted by the layer of chlorophyll parenchyma subepidermis cells. In the root segments and in the root plantets, the direct organogenesis showed two origins (source), from the pericycle, on the roots that starts at the secondary structure and from vascular cambium, on the roots that had already been established secondary structure. Also the root segments was seen by the indirect way, which callus were formatted by the pericycle proliferation.

O cultivo in vitro de células, tecidos e órgãos vegetais, iniciado no começo do século XX, propiciou avanços no conhecimento científico e biotecnológico. O processo de regeneração in vitro depende tanto das condições de cultivo quanto da base genética dos explantes utilizados. Alguns autores postulam que a regeneração pode ser dividida em etapas e o balanço entre hormônios vegetais é responsável por determinar o destino dos explantes (e.g. formação de raízes, gemas ou calos). Em estudo realizado anteriormente, foi constatada a alta capacidade de regeneração de gemas caulinares adventícias in vitro do mutante Mouse-ears, que apresenta folhas com maior complexidade. Diante disso, neste trabalho outros mutantes que afetam a arquitetura foliar, como entire, procera, clausa, potato-leaf e Mouse-ears, foram avaliados ex vitro e in vitro, no \"background\" da cultivar Micro-Tom (MT). A caracterização fenotípica dos genótipos demonstrou que as mutações estudadas afetam vários outros aspectos do desenvolvimento, além das folhas. Muitas das diferenças observadas ex vitro, são em parte devidas à transição de estágio vegetativo para reprodutivo. Ao analisarmos os resultados de regeneração in vitro (formação de gemas caulinares e raízes adventícias; e crescimento de calos), nota-se que a capacidade organogenética de cada mutante não tem correlação com o grau de complexidade foliar, mas sim com tipo de mutação envolvida. Análises morfológicas de eventos in vitro e ex vitro quanto à formação de gemas caulinares adventícias e do meristema apical caulinar, respectivamente, denotam que ocorrem tanto similaridades quanto disparidades entre os dois processos. Os resultados indicam que provavelmente os mutantes entire (respota constitutiva a auxina por perda de função de um AUX/IAA) e Mouse-ears (super expressão do gene KNOX TKN2) atuam na etapa de indução de raízes e gemas, respectivamente, no processo de regeneração in vitro. Em contra partida, procera (resposta constitutiva a giberelina) atuaria na etapa de aquisição de competência ou retardo do desenvolvimento pós-indução. Além disso, TKN2 demonstrou ter um importante papel na formação de gemas caulinares adventícias in vitro. As vias para a formação de orgãos ex vitro (e.g. folhas, raízes, gemas axilares etc.) são diferentes da in vitro. Apesar disso, vários genes e moléculas recrutados em uma via de desenvolvimento ex vitro podem interferir na organogênese in vitro. / The in vitro culture of plant cells, tissues and organs, started at the beginning of the 20th century, has been leading to scientific and biotechnological advances ever since. The process of in vitro regeneration depends on the growth conditions as well as the genotype of the explant. Several authors postulated that regeneration can bedivided into steps and that the hormonal balance will determinate the fate of the explant (e.g. formation of roots, shoots or callus). In a previous study, it was found that the mutant Mouse-ears, which exhibits a more complex leaf architecture, has high capacity of shoot regeneration. Hence, in the present work others mutants affecting leaf architecture such as entire, procera, clausa, potato-leaf and Mouse-ears were measured ex vitro and in vitro in the MT background. These assessments aimed to investigate if there are similarities in organogenesis between in vitro and ex vitro. The phenotypic characterization of the genotypes showed that these mutations affect several aspects of plant development and not only the leaf architecture. Many differences observed ex vitro are in part due to the transition from vegetative to reproductive phase. When analyzing the results of in vitro regeneration (formation of adventitious shoots and roots; and callus growing) it is noticed that the organogenetic capacity of each mutant have no correlation with the degree of leaf complexity but with the type of mutation involved. Morphological analysis of in vitro and ex vitro events, such as formation of adventitious shoots and shaping of shoot apical meristem, respectively, denotes similarities and divergences between the processes. The results indicate that probably the mutants entire (constitutive response to auxin due to a loss-of-function in an AUX/IAA) and Mouse-ears (overexpression of a KNOX TKN2) act at the induction step of root and shoot, respectively, in the in vitro regeneration process. On the other hand, procera (constitutive response to gibberellin) acts at the competence step or the arrest of the development after induction. Furthermore, TKN2 showed an important role in the formation of in vitro adventitious shoots. The pathways for ex vitro organ formation (e.g. leaf, root, axillary buds, etc.) are different from that for in vitro. Nevertheless, genes and molecules recruited in the pathway of ex vitro development may interfere in the in vitro organogenesis.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:59:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_mirian_de_farias_ribeiro.pdf: 2449435 bytes, checksum: 6695d40137c267cf6058be71ba7803e7 (MD5) Previous issue date: 2013-03-28 / Pear orchards with high density planting were possible due to the use of rootstock quince (Cydonia oblonga Mill.), thus obtaining small plants and rapid fruiting, and provide uniformity to these orchards. Techniques that may improve the ability to propagation this rootstock are of great interest. The aim of this study was to adjust protocols for in vitro multiplication and regeneration of quince cultivars MC and Adams. The results of this word are presented in chapter. Material used in the experiments was obtained from in vitro propagation in culture medium consisting of MS salts and vitamins supplemented with myo-inositol (100 mg L-1), 6 - benzylaminopurine (BA) (0.3 mg L-1), sucrose (30 g L-1) and agar (8 g L-1). Chapter 1 we used MS medium added agar (8 g L-1) on solidified medium and vermiculite (3 g flask-1) in the liquid medium and the flasks were sealed with aluminum foil, PVC film and polypropylene cap. In Chapter 2 how carbon source in culture medium was added sucrose, fructose or sorbitol at concentrations 0, 15, 30, 45 and 60 g L-1. For in vitro regeneration the Chapter 3 was divided in two experiments. In experiment 1 the culture medium consisted of salts and vitamins MS and SH supplemented with myoinositol (100 mg L-1), sucrose (30 g L-1), agar (8 g L-1), NAA (2 mM) and TDZ at concentrations 0, 1.5, 3, 4.5 and 6 μM. In experiment 2 the culture medium consisted of SH salts and vitamins supplemented with myo-inositol (100 mg L-1), sucrose (30 g L-1), agar (8 g L-1), TDZ (0 , 1.5, 3, 4.5 and 6 μM) combined with NAA or IBA at concentrations of 0, 1.0, 1.5 and 2 μM. All experiments were evaluated after 60 days. Considering the results presented in Chapter 1 is possible to conclude that the use of culture medium solidified with agar and the flasks sealed with aluminum foil or polypropylene cap favored the in vitro multiplication of quince 'MC' and 'Adams'. In the second chapter it was found that the sucrose concentration of 45 g L-1 to cultivar MC and 30 g L-1 to cultivar Adams are the best concentrations and carbon source for in vitro multiplication quince. In the Chapter 3 first verified in experiment 1 that the in vitro regeneration of adventitious shoots quince cultivars MC and Adams was favored by the use of SH culture medium and addition of 4.5 μM TDZ to cultivar MC and 6 μM TDZ for cultivar Adams. And in experiment 2 it was concluded that multiple shoots were formed from the combination of 4.5 μM TDZ and 2 μM NAA for cultivar MC and 6 μM TDZ and 2 μM NAA to cultivar Adams. / Pomares de pereira com plantio em alta densidade foram possíveis devido a utilização de portaenxerto de marmeleiro (Cydonia oblonga Mill.), obtendo-se assim plantas de pequeno porte e rápida frutificação, além de proporcionar uniformidade a esses pomares. Técnicas que venham melhorar a capacidade de propagação deste portaenxerto são de grande interesse. O objetivo desse trabalho foi ajustar protocolos de multiplicação e regeneração in vitro de marmeleiro cultivares MC e Adams. Os resultados do trabalho estão apresentados na forma de capítulos. O material vegetal utilizado nos experimentos foi obtido a partir da multiplicação in vitro em meio de cultura básico composto dos sais e vitaminas MS, suplementados com mio-inositol (100 mg L-1), 6- benzilaminopurina (BAP) (0,3 mg L-1), sacarose (30 g L- 1) e ágar (8 g L-1). No capítulo 1, utilizou-se meio básico acrescentado de ágar (8 g L- 1) no meio solidificado e vermiculita (3 g frasco-1) no meio líquido e os frascos foram vedados com papel alumínio, filme PVC e tampa de polipropileno. No capítulo 2, como fonte de carbono no meio de cultura foi utilizado sacarose, frutose ou sorbitol nas concentrações de 0, 15, 30, 45 e 60 g L-1. Para regeneração in vitro o capítulo 3 foi dividido em dois experimentos. No experimento 1 os meios de cultura constituíram-se dos sais e vitaminas MS e SH, suplementados com mio-inositol (100 mg L-1), sacarose (30 g L-1), ágar (8 g L-1), ANA (2 μM) e TDZ nas concentrações de 0, 1,5, 3, 4,5 e 6 μM. No experimento 2 o meio de cultura constituiu-se dos sais e vitaminas SH, suplementado com mio-inositol (100 mg L-1), sacarose (30 g L-1), ágar (8 g L-1), TDZ (0, 1,5, 3, 4,5 e 6 μM) combinado com ANA ou AIB nas concentrações de 0; 1,0; 1,5 e 2 μM. Todos os experimentos foram avaliados após 60 dias. Diante dos resultados apresentados no capítulo 1 é possível concluir que a utilização de meio de cultura solidificado com ágar e os frascos vedados com papel alumínio ou tampa de polipropileno favorecem a multiplicação in vitro de marmeleiro 'MC' e 'Adams'. No capítulo 2 constatou-se que a sacarose na concentração de 45 g L-1 para cultivar MC e 30 g L-1 para cultivar Adams são as melhores concentrações e fonte de carbono para multiplicação in vitro dos portaenxertos de marmeleiro testados. No capítulo 3, primeiro verificou-se no experimento 1 que a regeneração in vitro de brotos adventícios de marmeleiro das cultivares MC e Adams foi favorecida pelo uso do meio de cultura SH e pela adição de 4,5 μM de TDZ para cultivar MC e 6 μM de TDZ para a cultivar Adams. No experimento 2 concluiu-se que houve maior taxa de regeneração a partir da combinação de 4,5 μM de TDZ e 2 μM de ANA para cultivar MC e 6 μM de TDZ e 2 μM de ANA para cultivar Adams.

Kiso H, Takahashi K, Saito K, Togo Y, Tsukamoto H, et al. (2014) Interactions between BMP-7 and USAG-1 (Uterine Sensitization-Associated Gene-1) Regulate Supernumerary Organ Formations. PLoS ONE 9(5): e96938. / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18545号 / 医博第3938号 / 新制||医||1006(附属図書館) / 31445 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 斎藤 通紀, 教授 戸口田 淳也, 教授 妻木 範行 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

This thesis investigates the applicability of novel approaches designed to study the molecular mechanisms required for the initiation of organogenesis within the early endoderm. The endoderm is the germ layer that gives rise to the gut-tube and associated organs including the thyroid, lung, liver and pancreas. Our laboratory focuses on understanding the molecular mechanisms governing the developmental transition from endoderm to liver and pancreas. Several signaling pathways including Wnt, Retinoic Acid (RA), Bone Morphogenetic Protein (BMP) and Transforming Growth Factor-β (TGFβ) have been implicated in the emergence of the liver bud from the endoderm in the mouse or other vertebrate species. However, neither the exact signals nor the precise roles during budding process have been identified, due to the complexity of specifically altering these essential pathways using traditional genetic approaches during the earliest stages of endoderm organogenesis. These traditional techniques include transgenic, knockout or conditional knockouts strategies. To overcome the difficulties of genetic accessibility, our laboratory has optimized two complementary approaches, electroporation and addition of activators or inhibitors directly to the culture media, to study the earliest stages of organ formation using an ex vivo culture system (whole embryo culture), that allow us for normal embryonic development for up to two days. This ex-vivo technique also provides the opportunity to access and manipulate the endoderm, specifically the liver and pancreas precursor cells, prior to organ specification. Because the endoderm undergoes normal liver and pancreas specification in our ex vivo system by 24 hours after culture begin, we reason that it is possible to manipulate gene expression at the onset of culture. We then determine the effects of this manipulation on liver or pancreas development by molecular and morphological analysis after culture. The first approach we developed is the use of directional electroporation of nucleic acids to manipulate a specific region of the endoderm, particularly on liver and pancreas developmental processes. The second method is global inhibition or activation using inhibitors or growth factors activators, focusing on the TGFβ signaling pathway. These techniques will be performed prior to, or concurrent with, liver and pancreas specification, followed by embryo culture until after the onset of organogenesis. The combination of these techniques constitutes a practical approach to stage-manage the endoderm in a temporally and spatially distinct manner. In addition, it will allow us to alter specific signaling pathways without the labor-intensive generation of genetically modified animals. Indeed, establishment of these methodologies may provide a robust tool for rapid screening of candidate genes and signaling molecules underlying organogenesis in any endodermally derived organ in mouse embryos.

<p>  </p> <p>Traditionally, the exocrine and endocrine cellular compartments of the pancreas have been considered distinct functional systems. However, recent studies suggest a more intricate relationship between the exocrine and endocrine, which may impact pancreatic growth and health. Additionally, translational control mechanisms have been linked to organ development. Our lab has shown that the mRNA translation factor eukaryotic initiation factor 5A (eIF5A), when in its post-translationally modified “hypusinated” form, plays a role in pancreas development. The hypusination of eIF5A requires the rate-limiting enzyme deoxyhypusine synthase (<em>Dhps</em>) to post-translationally modify a critical lysine residue which in turn produces the active form of eIF5A that functions in mRNA translation. When we generated animals with a deletion of <em>Dhps</em> in the pancreatic progenitor cells, there was no alteration in islet mass but significant exocrine insufficiency at embryonic (E) day 18.5 concomitant with downregulation of proteins required for exocrine pancreas development and function. Resultantly these animals died by 6 weeks-of-age. These observations prompted the question, is the phenotype caused by the absence of hypusinated eIF5A or the increase of unhypusinated eIF5A? To address this, we generated a mouse model wherein <em>Eif5a</em> is deleted in the pancreas (eIF5A∆PANC) and these mutant animals also display exocrine insufficiency. Interestingly, beta cell mass is increased at E18.5, and the mutant animals maintain euglycemia and survive up to 2 years. Ongoing analyses are interrogating the differences between these animal models with the goal to determine if mRNA translation facilitates cellular communication between the exocrine and endocrine pancreas.</p>