Os modelos experimentais têm sido utilizados para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC). O modelo que melhor mimetiza a doença em humanos é o que utiliza a exposição à fumaça de cigarro. No entanto, a utilização deste modelo experimental requer um longo tempo de exposição (6 meses) e a lesão do parênquima obtida é considerada leve. O desequilíbrio protease/anti-protease é considerado um importante mecanismo fisiopatológico envolvido no desenvolvimento da DPOC. Desta forma, neste estudo propomos o desenvolvimento de um modelo experimental no qual associamos a instilação de elastase previamente ao início da exposição ao fumo na tentativa de obter um maior grau de lesão tecidual em um menor espaço de tempo. Para tanto, camundongos C57Bl/6 foram divididos em quatro grupos: Controle, Elastase, Fumo, Fumo/Elastase 1 dose e Fumo/Elastase 2 doses e analisados após dois meses de exposição. Os animais do grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses foram submetidos à instilação intranasal de elastase pancreática de porco (0,33UI) e expostos a fumaça de cigarro por dois meses. O grupo controle recebeu o mesmo tratamento com solução fisiológica (NaCl 0.9%). A exposição ao fumo foi feita por 30min, 2 vezes/dia, 5 dias da semana. Após dois meses, os animais foram sacrificados e observamos aumento de LM no grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses comparado aos grupos Controle e Fumo; aumento de células positivas para MAC-2 no parênquima (Fumo/Elastase 2 doses) e vias aéreas (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses), MMP-12 no parênquima pulmonar (Fumo/Elastase 2 doses), GP91 no parênquima (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses) e vias aéreas (Fumo e Fumo/Elastase 1 dose) e aumento de proporção de fibras elásticas no parênquima pulmonar do grupo Fumo/Elastase 1 dose e do grupo Fumo, caracterizando presença de enfisema pulmonar. A instilação de elastase pancreática de porco juntamente com a exposição à fumaça de cigarro aumentou a susceptibilidade ao desenvolvimento do enfisema / Experimental models have been used to study the pathophysiological mechanisms involved in the development of COPD. Cigarette Smoke exposure (CS) is considered the best model to mimetize the disease in humans. However, the CS requires a long exposure time (6 months) and the parenchymal destruction obtained is considered mild. The protease / anti - protease imbalance is considered an important pathophysiological mechanism involved in the development of COPD. Thus, in this study we propose the development of an experimental model in which we associate instillation of elastase before the start of exposure to smoke, trying to increase the parenchymal destruction degree in a shorter time. For that, C57BL / 6 mice were divided into four groups: Control, Elastase, Smoke and Smoke/Elastase 1 dose and Smoke/Elastase 2 doses and analyzed in two months after the CS exposition. The Smoke/Elastase 1 dose and 2 doses animals group received an intranasal instillation of porcine pancreatic elastase (0.33 IU) and exposed to cigarette smoke for two months. The control group received the same treatment with saline (NaCl 0.9 %). Animals were exposed to CS for 30min, 2 times / day, 5 days a week. After two months, we observed increased mean linear intercept (LM) and positive cells for MAC-2, MMP-12 and GP91 in the airways and lung parenchyma and increase of elastic fibers in the lung parenchyma characterizing the presence of pulmonary emphysema. The instillation of porcine pancreatic elastase along the exposure to cigarette smoke increased susceptibility to the development of emphysema

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Este trabalho teve o objetivo de estudar o efeito de medicamentos com diferentes ações agonista PPAR (rosiglitazona, fenofibrato e bezafibrato) sobre o perfil lipídico, glicídico e alterações na massa corporal e morfologia do tecido adiposo e pancreático em modelo de diabetes e sobrepeso induzido por dieta. Camundongos C57BL/6 (2 meses de idade) foram alimentados com dieta padrão (SC, n=10) ou dieta hiperlipídica rica em sacarose (HFHS, n=40) por 6 semanas. Logo após, os animais HFHS foram subdividos em: HFHS não tratado e HFHS tratado com rosiglitazona (HFHS-Ro), fenofibrato (HFHS-Fe) ou bezafibrato (HFHS-Bz) (5 semanas). Os camundongos alimentados com dieta HFHS apresentaram maior glicemia e insulina de jejum (+33% e +138%, respectivamente), intolerância à glicose, resistência à insulina, aumento da massa corporal (MC) (+20%) e adiposidade, hipertrofia de adipócitos e redução da imunocoloração para adiponectina no tecido adiposo. No pâncreas houve aumento da massa (+28%), acúmulo de gordura (+700%), hipertrofia da ilhota (+38%) e redução da imunocoloração para GLUT-2 (-60%). A rosiglitazona diminuiu a glicemia e insulina de jejum, porém induziu o ganho de MC e hipertrofia cardíaca. O fenofibrato estabilizou a MC, enquanto o bezafibrato levou a perda de MC. Apenas o bezafibrato impediu a hipertrofia da ilhota. A imunocoloração para GLUT-2 foi aumentada por todos os medicamentos, e não houve alterações na imunocoloração para o PPARα. Sinais morfológicos de pancreatite foram vistos no grupo HFHS-Fe, apesar dos níveis normais de amilase e lipase séricos. A rosiglitazona exacerbou a infiltração intrapancreática de gordura (+75% vs. HFHS), e o bezafibrato aumento a imunocoloração para o PPARβ/δ nas ilhotas pancreáticas. Em conclusão, o bezafibrato apresentou um efeito mais amplo sobre as alterações metabólicas, morfológicas e biométricas decorrentes da dieta HFHS, sugerindo que a inibição das três isoformas do PPAR seria melhor do que a inibição de apenas uma isoforma. A rosiglitazona exacerbou o ganho de MC, a infiltração de gordura no pâncreas e induziu hipertrofia cardíaca, assim, é necessário cautela ao prescrever este medicamento a um paciente obeso. / This work aimed to evaluate the effect of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists (rosiglitazone, fenofibrate and bezafibrate) on lipid and glucose metabolism, body mass, and adipose and pancreatic tissue morphology in a model of diet-induced type 2 diabetes and overweight in mice. Two-month-old male C57BL/6 mice were fed a standard chow (SC, n=10) or a high-fat high-sucrose chow (HFHS, n=40) for 6 weeks, and then HFHS-fed mice were subdivided by treatment: untreated HFHS and HFHS treated with rosiglitazone (HFHS-Ro), fenofibrate (HFHS-Fe), or bezafibrate (HFHS-Bz) (5 weeks on medication). HFHS-fed mice have altered fasting glucose (+33%) and insulin (+138%), GI, IR, increased body mass (+20%) and fat pad weight, adipocyte hypertrophy, and decreased adiponectin immunostain. They also presented increased pancreatic (+28%) mass, intrapancreatic fat (+700%), islet hypertrophy (+38%), and decreased GLUT-2 immunostain (-60%). Rosiglitazone reduced fasting glucose and insulin but induced weight gain and heart hypertrophy. Fenofibrate impaired body mass gain, while bezafibrate induced weight loss. Only bezafibrate impaired islet hypertrophy. GLUT-2 immunostain was improved by all treatments, and there were no alterations in PPAR-α stain. There were morphological signs of pancreatitis in fenofibrate-treated mice, although there was no alteration in serum amylase and lipase. Rosiglitazone exacerbated pancreatic fat infiltration (+75% vs. HFHS group), and bezafibrate increased PPAR-β expression in pancreatic islets. In conclusion, bezafibrate showed a wider range of action on metabolic, morphologic, and biometric alterations due to HFHS intake, suggesting that inhibiting the three PPAR isoforms is better than inhibiting each isoform alone. Rosiglitazone exacerbated body mass gain, pancreatic fat infiltration and induced heart hypertrophy as well, thus, precaution has to be taken in prescribing rosiglitazone to obese patients.

Introdução: O desequilibrio protease-antiprotease é fundamental para a fisiopatologia da doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC). No entanto, poucos estudos para a inibição da elastase têm sido investigados. Objetivo: O nosso estudo avaliou a capacidade do inibidor proteinase derivada da planta Bauhinia bauhinioides (BbKI) na modulação da inflamação pulmonar induzida pela elastase. Métodos: Camundongos C57BL receberam instilação intratraqueal de elastase (0,025 mg, ELA n=6) ou solução salina (SAL n=6) e foram tratados por via intraperitoneal com BbKI (2 mg/kg, de ELA-BbKI n=6, SAL-BbKI n=6) nos dias 1, 14 e 21. No dia 28 foram realizadas as seguintes análises: (I) avaliação da mecânica pulmonar (II) medida do óxido nítrico exalado (ENO), (III) a determinação do número de céluas no lavado broncoalveolar (FLBA), e ( IV) coloração imunohistoquímica do fluído pulmonar, (V) intercepto linear médio (Lm), Resultados: Além de diminuir alterações mecânicas e a lesão do septo alveolar (Lm), BbKI reduziu o número de células no fluido de FLBA e diminuiu a expressão celular de TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS e iNOS em vias aéreas e nas paredes alveolares em comparação com o grupo de ELA (p < 0,05). BbKI diminuiu a proporção de volume de 8-iso-PGF2, as fibras colagenas e as elásticas nas vias aéreas e paredes alveolares em comparação com o grupo de ELA (p < 0,05). Houve redução do número de células para positivas MUC-5 nas paredes das vias aéreas (p < 0,05). Houve redução do número de neutrófilos em vias aereas e parenquima e de macrófagosnas paredes alveolares. Conclusão: BbKI foi eficaz na redução da inflamação pulmonar, mecânica pulmonar e do remodelamento da matriz extracelular induzida por elastase. BbKI pode ser uma ferramenta farmacológica potencial para o tratamento da DPOC; no entanto, são necessárias análises adicionais / Introduction: The protease-antiprotease imbalance is essential to the pathophysiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). However, few studies for inhibition of elastase have been investigated. Objective: Our study evaluated the ability of proteinase inhibitor derived Bauhinia bauhinioides plant (BbKI) in modulating lung inflammation induced by elastase. Methods: Mice C57BL received intratracheal elastase instillation (0.025 mg, ELA n = 6) or saline (SAL n = 6) and were treated intraperitoneally with BbKI (2 mg/kg of ELA-BbKI n = 6, SAL-BbKI n = 6) on days 1, 14 and 21. On the 28th the following analyzes were performed: (i) assessment of pulmonary mechanics (II) measurement of exhaled nitric oxide (ENO), (III) determining the number of cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and (IV) immunohistochemical staining of lung fluid, (V) mean linear intercept (Lm) Results: In addition to reducing mechanical changes and Lm, BbKI reduced the number of cells in BALF fluid and decreased cellular expression of TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS and iNOS in the airway and alveolar walls compared with ELA group (p < 0.05). BbKI decreased volume proportion of 8-iso-PGF2, collagen fibers and elastic airway and alveolar walls compared with ELA group (p < 0.05). There was a reduction from MUC-5 positive cells in the airway walls (p < 0.05). There was a reduction in the number of neutrophils in airway and alveolar walls (p < 0.005) and a reduction in macrophages in alveolar walls (p < 0.005). Conclusion: BbKI was effective in reducing inflammation, pulmonary mechanics and remodeling of the extracellular matrix induced by elastase. BbKI may be a potential pharmacological agent for the treatment of COPD; however, additional tests are required

O objetivo deste trabalho foi avaliar se a proteína bifuncional de planta, CrataBL, que tem lectina e as propriedades inibidoras de enzima, modula alterações de mecânica pulmonar, inflamatórias e remodelamento induzidas por elastase intratraqueal em camundongos. Métodos: 36 camundongos C57BL6 receberam elastase (0,025 mg) por instilação intratraqueal (grupo ELA e ELA-CrataBL). Os grupos controles receberam salina (grupo SAL e SAL-CrataBL). Os camundongos foram tratados com instilação intraperitoneal de CrataBL (2mg/kg) nos dias 1, 14 e 21 após a instilação intratraqueal de elastase (grupo SAL-CrataBL e ELA-CrataBL) os animais controle receberam salina no mesmo volume. No dia 28, os camundongos foram anestesiados, ventilados mecanicamente e foram analisados a resistência e elastância do sistema respiratório (Ers e Rrs), elastância e resistência tecidual (Htis e Gtis), resistência das vias aéreas (Raw) e óxido nítrico exalado (NOex). Após, o lavado broncoalveolar (LBA) foi realizado, os pulmões foram retirados e por morfometria, e foram quantificados o intercepto linear médio (Lm), a quantidade de neutrófilos, células positivas para TNF-alfa, fibras colágenas, elásticas, células positivas para MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS e iNOS e isoprostano no parênquima pulmonar e vias aéreas. No parênquima foram avaliados os macrófagos nos septos alveolares e nas vias aéreas, foram também avaliadas as células para MUC-5. Resultados: No grupo ELA houve um aumento na Ers, Raw, Gtis, Htis, Lm, NOex, nas células totais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e linfócitos no LBA em relação aos controles (p < 0,05), sendo que Raw, diminuiu também nos grupos SAL-CrataBL e ELA-CrataBL. Nos grupos tratados com CrataBL houve uma diminuição de Ers (37,0±2,2 cmH2O/L), Htis (37,9±3,5 cmH2O/ml/s), ENO (14,7±0,7 ppb), comparativamente ao grupo ELA (p < 0,05). No LBA houve atenuação de neutrófilos (0,003±0,001 104células/ml), linfócitos (0,003±0,001 104células/ml) e de Lm (54,6±6,0 mm). Complementando a avaliação, no grupo que recebeu elastase houve um aumento no número de macrófagos (22,88 +- 2,24 células/104um2), neutrófilos (1,18 +- 0,15 células/10 4um2), células positivas para TNF-ala (12,52 +- 0,42 células/104um2) no parênquima pulmonar. Nas alterações de remodelamento no parênquima pulmonar, houve um aumento da proporção de volume de fibras colágenas (11,5 +- 0,11%), elásticas (0,5 +- 0,03%), na quantidade de células positivas para MMP-9 (18,59 +- 1,87 células/104?m2), MMP-12 (20,17 +- 1,92 células/104?m2), TIMP-1 (14,42 +- 2,05 células/104um2) em comparação com os controlos (p < 0,001). No estresse oxidativo, houve um aumento de eNOS (13,15 +- 0,40 células/104um2), iNOS (10,49 +- 0,65 células/104um2) e isoprostano (18,11 =- 5,38%). O tratamento CrataBL (grupo ELA-CrataBL) reduziu no parênquima pulmonar a quantidade de macrófagos (9,58 +- 1,36 células/104um2), neutrófilos (0,75 +- 0,1 células/104um2), células positivas para TNF-alfa (10.4±0,49 células/104?m2), fibras colágenas (10,8 +- 0,13%), elásticas (0,3 +- 0,02%), a quantidade de células positivas para a MMP-9 (10,35±0,65 células/104um2), MMP-12 (14,15±0,59 células/104um2), TIMP-1 (9,89 +- 2,79 células/104um2), MUC-5 (3,56 +- 0,54 células/104um2), eNOS (6.98 +- 0.32 células/104um2) e iNOS (6,21 +- 0,42 células/104um2) e isoprostano (8,96 +- 3,08 %) em relação ao grupo ELA (p < 0,001). Nas vias aéreas também ocorreu um aumento significativo de neutrófilos (5,97 +- 1,03 células/104um2), células positivas para TNF-alfa (15,82 +- 1,03 células/104um2). Nas alterações de remodelamento pulmonar nas vias aéreas também ocorreu um aumento da proporção de volume de fibras colágenas (8,73 +- 2,59%), elásticas (2,56 +- 0,18%), na quantidade de células positivas para MMP-9 (14,86 +- 1,77 células/104um2), MMP-12 (18,56 +- 1,79 células/104um2), TIMP-1 (1,31 +- 0,12 células/104um2) e MUC-5 (7,09 +- 1,71 células/104um2) em comparação com os controlos (p < 0,001). No estresse oxidativo, houve um aumento de células positivas para eNOS (3,09 +- 0,08 células/104um2), iNOS (5,4 +- 0,3 células/104um2) e isoprostano (18,11 +- 5,38%) em comparação com os controlos (p < 0,001). O tratamento CrataBL (grupo ELA-CrataBL) reduziu nas vias aéreas a quantidade de neutrófilos (4,62 +- 0,61 células/104um2), TNF- alfa (14,30 +- 1,28 células/104um2), fibras colágenas (7,80 +- 1,37%), elásticas (1,4 +- 0,13%), a quantidade de células positivas para a MMP-9 (9,93 +- 1,39 células/104um2), MMP-12 (12,06 +- 1,15 células/104um2), TIMP-1 (0,73 +- 0,05 células/104?m2), MUC-5 (3,56 +- 0,54 células/104um2), eNOS (1,89 +- 0,16 células/104um2) e iNOS (4,3 +- 0,31 células/104um2), isoprostano (7,34 +- 2,31%) em relação ao grupo ELA (p < 0,001). Conclusão: CrataBL atenua as alterações de mecânica pulmonar, lavado bronco alveolar, responsividade inflamatória, controle do remodelamento e estresse oxidativo induzidas pela elastase. Embora mais estudos devam ser realizados, esta proteína bifuncional pode contribuir como potencial ferramenta terapêutica para o tratamento da DPOC / The aim of this study was to evaluate whether the bifunctional protein plant, CrataBL, which has lectin and enzyme inhibitory properties, modulates changes in lung mechanics, inflammatory and remodeling induced by intratracheal elastase in mice.Methods : 36 C57/Bl6 mice received elastase (0.025 mg) by intratracheal (group ELA and ELA-CrataBL). Control groups received saline (group SAL and SAL-CrataBL).The mice were treated with intraperitoneal instillation of CrataBL (2mg/kg) on days 1, 14 and 21 after intratracheal instillation of elastase (group SAL-CrataBL and ELA-CrataBL), control animals received saline in the same volume. On day 28, the mice were anesthetized and mechanically ventilated were analyzed resistance and respiratory system elastance (Ers and Rrs), elastance and tissue resistance (Htis and Gtis), airway resistance (Raw) and exhaled nitric oxide (ENO). After the bronchoalveolar lavage (BAL) was performed, the lungs were removed and morphometry were quantified and the linear intercept mean (Lm), the number of neutrophils, positive cells for TNF-alfa, collagen fibers, positive cells for MMP-9, MMP-12, TIMP-1, eNOS, iNOS and isoprostane in lung parenchyma and airways. Parenchyma was also evaluated macrophages in the alveolar septa. Airway was also evaluated MUC-5 cells. Results: In group ELA was an increase in Ers, Raw, Gtis, Htis, Lm, ENO, in total cells, macrophages, neutrophils, eosinophils and lymphocytes in BAL compared to controls (p < 0.05), and Raw, decreased in both groups SAL-CrataBL and ELA-CrataBL. In the groups treated with CrataBL there was a decrease in Ers (37.0±2.2 cmH2O/L) Htis (37 9±3.5 cmH2O/ml/s) and ENO (14.7±0.7 ppb) compared to the ELA group (p < 0.05). In BAL there was attenuation of neutrophils (0.003±0.001 104cells/ml), lymphocytes (0.003±0.001 104cells/ml) and Lm (54.6±6.0 mm). Complementing the assessment, the group that received elastase was an increase in the number of macrophages (22.88±2.24 cells/104um2), neutrophils (1.18±0.15 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (12.52±0.42 cells/104um2) in the lung parenchyma. In remodeling changes in lung parenchyma, there was an increase in the volume ratio of collagen fibers (11.5 ± 0.11%), elastic (0.5±0.03%), the number of positive MMP-9 cells (18.59±1.87 cells/104um2), MMP-12 (20.17 ± 1.92 cells/104um2) TIMP-1 (14.42±2.05 cells/104um2) compared to controls (p < 0.001). Oxidative stress, was an increased of eNOS (13.15±0.40 cells/104um2), iNOS (10.49 ± 0.65 cells/104um2) and isoprostane (18.11±5.38%). Treatment CrataBL (ELA-CrataBL group) reduced the amount of parenchymal lung macrophages (9.58±1.36 cells/104um2), neutrophils (0.75±0.1 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (10.4±0.49 cells/104um2), collagen (10.8±0.13%), elastic (0.3±0.02%), the number of positive MMP-9 cells (10.35±0.65 cells/104?m2), MMP-12 (14.15±0.59 cells/104um2), TIMP-1 (9.89±2.79 cells/104um2) MUC-5 (3.56±0.54 cells/104um2), eNOS (6.98±0:32 cells/104um2) and iNOS (6.21±0.42 cells/104um2) and isoprostane (8.96 ± 3.08%) compared to group ELA (p < 0.001). Airway was also a significant increase in neutrophils (5.97±1.03 cells/104um2), positive TNF-alfa cells (15.82±1.03 cells/104um2). Changes in lung airway remodeling also occurred an increase in the volume ratio of collagen fibers (8.73±2.59%), elastic (2.56±0.18%), the number of positive MMP-9 cells (14.86±1.77 cells/104um2), MMP-12 (18.56±1.79 cells/104um2) TIMP-1 (1.31±0.12 cells/104um2) and MUC-5 (7.09±1.71 cells/104um2) compared to controls (p < 0.001). Oxidative stress, an increase of eNOS (3.09 ± 0.08 cells/104um2), iNOS (5.4±0.3 cells/104um2) and isoprostane (18.11±5.38%) compared to controls (p < 0.001). Treatment CrataBL (ELA-CrataBL group) reduced the amount airway neutrophils (4.62±0.61 cells/104um2), TNF-alfa (14.30 ± 1.28 cells/104um2), collagen fibers (7 80±1.37%), elastic (1.4±0.13%), the number of positive MMP-9 cells (9.93±1.39 cells/104um2), MMP-12 (12.06±1.15), TIMP-1 (0.73±0.05 cells/104um2), MUC-5 (3.56±0.54 cells/104um2), eNOS (1.89±0,16 cells/104um2) and iNOS (4.3±0.31 cells/104um2), isoprostane (7.34±2.31%) compared to group ELA (p < 0.001). Conclusion: CrataBL attenuates changes in lung mechanics, broncho alveolar inflammatory responsiveness, control remodeling and oxidative stress induced by elastase. Although more studies should be conducted, this bifunctional protein may contribute as a potential therapeutic tool for the treatment of COPD

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI.L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques.Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació.Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal.Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI.Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització. / The main objective of this thesis is to study the molecular bases of the cytotoxicity of certain ribonucleases. With the final aim to obtain cytotoxic variants derived from human pancreatic ribonuclease. For this purpose, we created variants derived from HP-RNase by using two different strategies. In the first, variants of the enzyme that were resistant to the action of the protein inhibitor of the ribonuclease (RI) were generated, replacing residues involved in the contact interfase between the ribonuclease and RI. In the second, RGD motifs were added to the surface of the proteins involved in the formation of the RI complex, with the aim of promoting their interaction with the cell plasmatic membrane, whilst at the same time decreasing the variant's affinity for RI. We showed that only variants carrying multiple substitutions acquired the capacity to resist the RI.The study of the percentage of inhibition of protein synthesis in incubated cells using each of the variants showed that only two variants had acquired cytotoxic properties. The highest level of cytotoxicity found in a non-resistant variant to RI had a value that was only 5 and 25 times lower than those registered by Onconase®. This result shows that RI sensitivity is not a limiting factor for the cytotoxicity of the ribonuclease. None of the variants which contained RGD motifs showed any sign of toxicity, suggesting that for this reason it is not effective in giving pancreatic ribonuclease cytotoxic properties.The cytotoxic molecular bases of the most cytotoxic variant were studied. Firstly by the analysis of the internalisation of this particular variant by radioactive marking in relation to Onconase and other non-cytotoxic variants of HP-RNase, which showed that only Onconase was effectively internalised. Thus the possibility that the cytotoxic action of the enzyme under observation was a result of a more efficient endocytosis was ruled out. It was also shown that the addition of the RGD motif was unable to encourage the internalisation of the proteins more effectively. Using confocal microscopy, the human variants only began to be noted inside the cell after 24 hours incubation.All the variants that were created retained a catalytic efficiency that was never less than 50 % of the catalytic activity achieved by the parent protein PM5. This suggests that the structure within the active centre had not been affected in any serious way by the introduction of the substitutions. However a decrease in thermostabilty was noted across the board with regards to PM5. This result indicates that the correlation mentioned in the bibliography between the increase of thermostability and the increase of cytotoxicity of the ribonuclease does not always exist.Using a confocal microscope, we confirmed that both the most cytotoxic protein, such as a non-cytotoxic variant resistant to RI, and the parent protein, followed the same lysosomal pathway of degradation. This outcome was unaffected by the addition of drugs which can change retrograde transit pathways (monensine and brefeldine A), but was effected by the addition of bafilomicine A1 a drug which neutralises endosomal pH and which in this case acted by slowing down the movement of proteins to lysosomes. In accordance with these results, the cytotoxicity values of the variants were significantly increased only by the presence bafilomicine A1 suggesting that the ribonuclease translocate into the cytoplasm starting from a point somewhere along the endosomal transit pathway.We confirmed that the behaviour of the most cytotoxic variant was due to the fact that the addition of a second motif of 3 Arg in PE5 endowed the protein with a nuclear transport signal. The division of the enzyme that translocates into the cytoplasm (from somewhere along the endosomal transit path before the lysosomes) is rapidly moved towards the core of the cell via the conventional mechanism for nucleus transport. Due to its affinity for rRNA, the enzyme gathers in the nucleolus, where it probably carries out its catalytic activity. On the other hand, the interaction of this variant with nucleocytoplasmatic receptors will prevent the RI from inhibiting the enzyme.These results offer a new strategy for the design of cytotoxic ribonuclease, based on the addition of NLS motifs, with the aim of encouraging the nuclear transport of enzymes. This strategy could allow one to overcome limitations that up until now have been the down-side to the cytotoxicity of pancreatic ribonuclease, such as a sensitivity for RI or the limited efficiency of internalisation.

El virus de l'hepatitis C (VHC) provoca una hepatitis crònica que afecta a més de 170 milions de persones d'arreu del món. És un virus petit que es classifica dins de la família Flaviviridae i és un virus d'RNA de cadena positiva amb un genoma d'aproximadament 9.600 nucleòtids. A l'extrem 5' del genoma viral s'hi troba una regió no codificant (5'NCR) que comprèn els primers 341 nucleòtids i la seva funció està relaciona amb la traducció. Immediatament després hi ha una pauta de lectura oberta ORF que acaba en un únic codó d'aturada i codifica una poliproteïna de 3.010 aminoàcids. A continuació l'extrem 3' no codificant (3'NCR), que malgrat es desconeixen les seves funcions exactes, s'ha demostrat que és essencial per a la replicació vírica. La única poliproteïna generada és processada co- i postraduccionalment mitjançant proteases de l'hoste i víriques, donant lloc a les proteïnes estructurals (Core, E1 i E2-p7) i no estructurals (NS2-NS5B). Igual que la majoria de virus RNA, el VHC es caracteritza per tenir una taxa de mutació elevada. De fet, el genoma del virus no es pot definir com una única seqüència sinó per una població de variants molt relacionades entre sí. A aquesta manera d'organitzar la informació genètica se l'anomena quasiespècie viral i una de les seves implicacions principals és la facilitat amb què sorgeixen resistents al tractament. Els tractaments disponibles són llargs, cars, provoquen efectes secundaris considerables i només es resolen completament el 40% dels casos. Per aquesta raó es busquen altres solucions terapèutiques per combatre el virus entre les quals s'hi inclouen diferents estratègies. Una de les més innovadores i prometedores és la utilització de ribozims dirigits directament contra el genoma del virus. Aquest treball es centra en l'estudi de les noves estratègies terapèutiques basades en ribozims, concretament la ribonucleasa P. La ribonucleasa P és un ribozim que està present en tots els organismes ja que és l'enzim responsable de la maduració dels precursors d'RNA de transferència. El més interessant a nivell terapèutic és que s'ha demostrat que es pot dirigir la seva activitat cap a qualsevol RNA utilitzant una seqüència guia d'RNA que quan hibrida amb l'RNA diana, l'híbrid imita l'estructura secundària del substrat natural. En el cas del VHC, s'han estudiat ribozims dependents de seqüència (ribozims derivats d'RNAs satèl·lits i de viroides de plantes), sempre dirigits contra la regió més conservada del virus per evitar una disminució de l'eficiència del ribozim deguda a la variació de la diana. La ribonucleasa P és una endonucleasa d'activitat molt específica i es diferencia dels altres ribozims naturals en el sistema de reconeixement del substrat, reconeix elements estructurals i no de seqüència. L'objectiu final del treball és tallar in vitro l'RNA del VHC aprofitant la propietat que presenta aquest ribozim de reconèixer elements estructurals i no de seqüència ja que per a un mateix nombre de seqüències, el nombre d'estructures viables que pot adoptar l'RNA genòmic és molt més petit i per tant la variabilitat de la diana disminueix. S'han estudiat dos models d'RNasa P, la RNasa P humana guiada per seqüència guia externa (EGS) i l'RNA M1 de l'RNasa P d'E.coli unit a la seqüència guia per l'extrem 3' (ribozim M1GS). Abans però de dirigir el ribozim, s'han estudiat l'estructura i la variabilitat d'una regió del genoma del virus ja que s'ha descrit que són factors que poden limitar l'eficiència de qualsevol ribozim. Derivat d'aquests estudis s'aporten dades sobre accessibilitat i variabilitat d'una regió interna del genoma del virus de l'hepatitis C, la zona d'unió de la regió E2/NS2 (regió 2658-2869). L'estudi d'accessibilitat revela que la regió 2658-2869 del genoma del virus conté dominis oberts i tancats i que la transició entre uns i altres no és brusca si es compara amb altres regions d'estructura coneguda (regió 5' no codificant). Els resultats dels assajos in vitro amb els dos models de RNasa P mostren que s'ha aconseguit dirigir tant la ribonucleasa P humana com el ribozim M1GS cap a una zona, predeterminada segons l'estudi d'accessibilitat, com a poc estructurada i tallar l'RNA del virus. De l'anàlisi de mutacions, però, es dedueix que la regió estudiada és variable. Tot i dirigir el ribozim cap a la zona més accessible, la variació de la diana podria afectar la interacció amb la seqüència guia i per tant disminuir l'eficiència de tall. Si es proposés una estratègia terapèutica consistiria en un atac simultani de vàries dianes.D'altra banda i derivat d'un resultat inesperat on s'ha observat en els experiments control que l'extracte de RNasa P humana tallava l'RNA viral en absència de seqüències guia externes, s'ha caracteritzat una nova interacció entre l'RNA del VHC i la RNasa P humana. Per a la identificació de l'enzim responsable dels talls s'han aplicat diferents tècniques que es poden dividir en mètodes directes (RNA fingerprinting) i indirectes (immunoprecipitació i inhibicions competitives). Els resultats demostren que la ribonucleasa P humana, i no un altre enzim contaminant de l'extracte purificat, és la responsable dels dos talls específics observats i que es localitzen, un a l'entrada interna al ribosoma (IRES) i molt a prop del codó AUG d'inici de la traducció i l'altre entre la regió codificant estructural i no estructural. La ribonucleasa P és un dels enzims del metabolisme del tRNA que s'utilitza per identificar estructures similars al tRNA en substrats diferents del substrat natural. Així doncs, el fet que la ribonucleasa P reconegui i talli el genoma del VHC en dues posicions determinades suggereix que, a les zones de tall, el virus conté estructures semblants al substrat natural, és a dir estructures tipus tRNA. A més, tot i que el VHC és molt variable, els resultats indiquen que aquestes estructures poden ser importants per el virus, ja que es mantenen en totes les variants naturals analitzades. Creiem que la seva presència podria permetre al genoma interaccionar amb factors cel·lulars que intervenen en la biologia del tRNA,particularment en el cas de l'estructura tipus tRNA que es localitza a l'element IRES. Independentment però de la seva funció, es converteixen en unes noves dianes terapèutiques per a la RNasa P. S'ha de replantejar però l'estratègia inicial ja que la similitud amb el tRNA les fa susceptibles a l'atac de la ribonucleasa P, directament, en absència de seqüències guia externes. / Hepatitis C virus is a human pathogen causing chronic liver disease in 170 million people worldwide. The virus is classified within the family Flaviviridae. The RNA genome is single-stranded and functions as the sole mRNA species for translation. It comprises a 5'-untranslated region, which functions as an internal ribosome entry site, and a long open reading frame, which encodes a polyprotein precursor of about 3010 amino acids, that is cleaved into structural (core, envelope 1, envelope 2 and p7) and non-structural (NS-2, NS-3, NS-4 and NS-5) proteins; followed by a 3' non-coding region. Analyzing significant numbers of cDNA clones of hepatitis C virus (HCV) from single isolates provides unquestionable proof that the viral genome cannot be defined by a single sequence, but rather by a population of variant sequences closely related to one another. In the infected patient, a master (the most frequently represented sequence) and a spectrum of mutant sequences may be isolated at any given time during chronic infection. This manner of organizing genetic information, which characterizes most RNA viruses, is referred to as quasispecies. HCV resistance to treatment (either alone or in combination with ribavirin) is one of the most important clinical implications predicted by the quasispecies model suggesting the necessity to seek new therapies. HCV therapeutic strategies based on ribozyme cleavage are leading candidates. The ribozyme activity of Ribonuclease P (RNase P) is among proposed antiviral agents. RNase P is a ubiquitous cellular endonuclease and one of the most abundant and efficient enzymes in the cell. This enzyme is a ribonucleoprotein complex that catalyzes a hydrolysis reaction to remove the leader sequence of precursor tRNA to generate the mature tRNA. Substrate recognition by the RNase P ribozyme does not rely on sequence requirements but on structural features of the RNA substrate. Custom-designed ribo-oligonucleotides, which hybridize with the target, called external guide sequences (EGSs), may provide the RNA structure which RNase P recognizes and cleaves in the hybridized complex. Recognition of structures instead of sequences may represent a great advantage in the fight against variable viruses because single or even double mutations in the target may be tolerated for RNase P recognition. One of the major aims of this work is to cleave HCV RNA using the RNase P ribozyme guided by EGS. To expand investigation of targeting in the HCV genome we assessed accessibility and low potential of variation of the target RNA since it is described that are crucial requirements for ribozyme therapy against viral infections. In the hepatitis C virus, the sequence of the 5' non coding region is conserved but the highly folded RNA structure severely limits the number of accessible sites. We have considered an internal genomic region whose sequence variation has been widely investigated. We have first mapped the accessibility of the genomic RNA to complementary DNAs within an internal genomic region. We performed a kinetic and thermodynamic study. Accordingly, we have designed and assayed four RNase P ribozymes targeted to the selected sites. Considerations on RNA structural accessibility and sequence variation indicate that several target sites should be defined for simultaneous attack. While performing targeting experiments on HCV RNA transcripts with RNase P we have found that, surprisingly, purified RNase P (peak activity) from HeLa cells cleaved HCV genomic RNA efficiently at two sites in the absence of EGSs. We report the techniques used to prove that the cleavage is specific to human RNase P (indirect methods: immunoprecipitation and competitive inhibition), and to show where cleavage occurs (direct method: RNA fingerprinting). We have confirmed that human RNase P is responsible for HCV RNA processing and that the two cleavages sites are in the IRES HCV domain, close to AUG initiator triplet, and in the E2/NS2 junction fragment (between structural and non structural coding region). To define cleavage by RNase P as a general property of HCV, viral sequences obtained from different patients were compared for RNase P cleavage accessibility. Cleavage was consistently observed in all sequences tested although with different efficiencies. Since RNase P recognizes and cleaves tRNA-like structures, we believe that such recognition by RNase P is an indication for the presence of two possible tRNA-like structures in the HCV genome. Comparison of such results at the two HCV RNase P cleavage sites should help us to understand in greater detail HCV substrate structure, tRNA mimicry, rules underlying recognition by human RNase P, and, in the particular case of the IRES motif, possible participation in translation. Whatever the role of such tRNA-like structures, such a strong tendency to maintain them might be important in the development of therapeutic strategies against the virus because they can represent highly susceptible targets for RNase P.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Este trabalho teve o objetivo de estudar o efeito de medicamentos com diferentes ações agonista PPAR (rosiglitazona, fenofibrato e bezafibrato) sobre o perfil lipídico, glicídico e alterações na massa corporal e morfologia do tecido adiposo e pancreático em modelo de diabetes e sobrepeso induzido por dieta. Camundongos C57BL/6 (2 meses de idade) foram alimentados com dieta padrão (SC, n=10) ou dieta hiperlipídica rica em sacarose (HFHS, n=40) por 6 semanas. Logo após, os animais HFHS foram subdividos em: HFHS não tratado e HFHS tratado com rosiglitazona (HFHS-Ro), fenofibrato (HFHS-Fe) ou bezafibrato (HFHS-Bz) (5 semanas). Os camundongos alimentados com dieta HFHS apresentaram maior glicemia e insulina de jejum (+33% e +138%, respectivamente), intolerância à glicose, resistência à insulina, aumento da massa corporal (MC) (+20%) e adiposidade, hipertrofia de adipócitos e redução da imunocoloração para adiponectina no tecido adiposo. No pâncreas houve aumento da massa (+28%), acúmulo de gordura (+700%), hipertrofia da ilhota (+38%) e redução da imunocoloração para GLUT-2 (-60%). A rosiglitazona diminuiu a glicemia e insulina de jejum, porém induziu o ganho de MC e hipertrofia cardíaca. O fenofibrato estabilizou a MC, enquanto o bezafibrato levou a perda de MC. Apenas o bezafibrato impediu a hipertrofia da ilhota. A imunocoloração para GLUT-2 foi aumentada por todos os medicamentos, e não houve alterações na imunocoloração para o PPAR&#945;. Sinais morfológicos de pancreatite foram vistos no grupo HFHS-Fe, apesar dos níveis normais de amilase e lipase séricos. A rosiglitazona exacerbou a infiltração intrapancreática de gordura (+75% vs. HFHS), e o bezafibrato aumento a imunocoloração para o PPAR&#946;/&#948; nas ilhotas pancreáticas. Em conclusão, o bezafibrato apresentou um efeito mais amplo sobre as alterações metabólicas, morfológicas e biométricas decorrentes da dieta HFHS, sugerindo que a inibição das três isoformas do PPAR seria melhor do que a inibição de apenas uma isoforma. A rosiglitazona exacerbou o ganho de MC, a infiltração de gordura no pâncreas e induziu hipertrofia cardíaca, assim, é necessário cautela ao prescrever este medicamento a um paciente obeso. / This work aimed to evaluate the effect of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists (rosiglitazone, fenofibrate and bezafibrate) on lipid and glucose metabolism, body mass, and adipose and pancreatic tissue morphology in a model of diet-induced type 2 diabetes and overweight in mice. Two-month-old male C57BL/6 mice were fed a standard chow (SC, n=10) or a high-fat high-sucrose chow (HFHS, n=40) for 6 weeks, and then HFHS-fed mice were subdivided by treatment: untreated HFHS and HFHS treated with rosiglitazone (HFHS-Ro), fenofibrate (HFHS-Fe), or bezafibrate (HFHS-Bz) (5 weeks on medication). HFHS-fed mice have altered fasting glucose (+33%) and insulin (+138%), GI, IR, increased body mass (+20%) and fat pad weight, adipocyte hypertrophy, and decreased adiponectin immunostain. They also presented increased pancreatic (+28%) mass, intrapancreatic fat (+700%), islet hypertrophy (+38%), and decreased GLUT-2 immunostain (-60%). Rosiglitazone reduced fasting glucose and insulin but induced weight gain and heart hypertrophy. Fenofibrate impaired body mass gain, while bezafibrate induced weight loss. Only bezafibrate impaired islet hypertrophy. GLUT-2 immunostain was improved by all treatments, and there were no alterations in PPAR-&#945; stain. There were morphological signs of pancreatitis in fenofibrate-treated mice, although there was no alteration in serum amylase and lipase. Rosiglitazone exacerbated pancreatic fat infiltration (+75% vs. HFHS group), and bezafibrate increased PPAR-&#946; expression in pancreatic islets. In conclusion, bezafibrate showed a wider range of action on metabolic, morphologic, and biometric alterations due to HFHS intake, suggesting that inhibiting the three PPAR isoforms is better than inhibiting each isoform alone. Rosiglitazone exacerbated body mass gain, pancreatic fat infiltration and induced heart hypertrophy as well, thus, precaution has to be taken in prescribing rosiglitazone to obese patients.

Os modelos experimentais têm sido utilizados para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC). O modelo que melhor mimetiza a doença em humanos é o que utiliza a exposição à fumaça de cigarro. No entanto, a utilização deste modelo experimental requer um longo tempo de exposição (6 meses) e a lesão do parênquima obtida é considerada leve. O desequilíbrio protease/anti-protease é considerado um importante mecanismo fisiopatológico envolvido no desenvolvimento da DPOC. Desta forma, neste estudo propomos o desenvolvimento de um modelo experimental no qual associamos a instilação de elastase previamente ao início da exposição ao fumo na tentativa de obter um maior grau de lesão tecidual em um menor espaço de tempo. Para tanto, camundongos C57Bl/6 foram divididos em quatro grupos: Controle, Elastase, Fumo, Fumo/Elastase 1 dose e Fumo/Elastase 2 doses e analisados após dois meses de exposição. Os animais do grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses foram submetidos à instilação intranasal de elastase pancreática de porco (0,33UI) e expostos a fumaça de cigarro por dois meses. O grupo controle recebeu o mesmo tratamento com solução fisiológica (NaCl 0.9%). A exposição ao fumo foi feita por 30min, 2 vezes/dia, 5 dias da semana. Após dois meses, os animais foram sacrificados e observamos aumento de LM no grupo Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses comparado aos grupos Controle e Fumo; aumento de células positivas para MAC-2 no parênquima (Fumo/Elastase 2 doses) e vias aéreas (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses), MMP-12 no parênquima pulmonar (Fumo/Elastase 2 doses), GP91 no parênquima (Fumo/Elastase 1 dose e 2 doses) e vias aéreas (Fumo e Fumo/Elastase 1 dose) e aumento de proporção de fibras elásticas no parênquima pulmonar do grupo Fumo/Elastase 1 dose e do grupo Fumo, caracterizando presença de enfisema pulmonar. A instilação de elastase pancreática de porco juntamente com a exposição à fumaça de cigarro aumentou a susceptibilidade ao desenvolvimento do enfisema / Experimental models have been used to study the pathophysiological mechanisms involved in the development of COPD. Cigarette Smoke exposure (CS) is considered the best model to mimetize the disease in humans. However, the CS requires a long exposure time (6 months) and the parenchymal destruction obtained is considered mild. The protease / anti - protease imbalance is considered an important pathophysiological mechanism involved in the development of COPD. Thus, in this study we propose the development of an experimental model in which we associate instillation of elastase before the start of exposure to smoke, trying to increase the parenchymal destruction degree in a shorter time. For that, C57BL / 6 mice were divided into four groups: Control, Elastase, Smoke and Smoke/Elastase 1 dose and Smoke/Elastase 2 doses and analyzed in two months after the CS exposition. The Smoke/Elastase 1 dose and 2 doses animals group received an intranasal instillation of porcine pancreatic elastase (0.33 IU) and exposed to cigarette smoke for two months. The control group received the same treatment with saline (NaCl 0.9 %). Animals were exposed to CS for 30min, 2 times / day, 5 days a week. After two months, we observed increased mean linear intercept (LM) and positive cells for MAC-2, MMP-12 and GP91 in the airways and lung parenchyma and increase of elastic fibers in the lung parenchyma characterizing the presence of pulmonary emphysema. The instillation of porcine pancreatic elastase along the exposure to cigarette smoke increased susceptibility to the development of emphysema

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-01-11T17:31:37Z No. of bitstreams: 1 lidiamariacarneirodafonseca.pdf: 814638 bytes, checksum: 8aa87e2816d8e7e5c474900ab0798b04 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-01-25T17:10:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lidiamariacarneirodafonseca.pdf: 814638 bytes, checksum: 8aa87e2816d8e7e5c474900ab0798b04 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T17:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lidiamariacarneirodafonseca.pdf: 814638 bytes, checksum: 8aa87e2816d8e7e5c474900ab0798b04 (MD5) Previous issue date: 2015-07-16 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Introdução: A forma como pulmões com enfisema respondem a uma agressão sistêmica como a sepse não é conhecida. É possível que as alterações inflamatórias e estruturais nos pulmões com enfisema alterem a resposta dos mesmos à sepse influenciando no desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo. Objetivo: Comparar a lesão pulmonar secundária à sepse, induzida por lipopolissacarídeo (LPS) intraperitoneal, em ratos com e sem enfisema induzido pela administração intratraqueal de elastase. Métodos: Vinte e quatro ratos Wistar adultos foram randomizados para quatro grupos de seis animais: controle (C-C), enfisema (E-C), controle com sepse (C-LPS) e enfisema com sepse (E-LPS). O enfisema foi induzido pela injeção intratraqueal de elastase pancreática de porco (12 UI/ animal). Após três semanas deste procedimento, a sepse foi induzida pela injeção intraperitoneal de LPS da Escherichia coli (10 mg/Kg). Vinte e quatro horas após a indução da sepse, os animais foram submetidos à ventilação mecânica por 10 minutos para posterior coleta da gasometria arterial. A seguir, foram eutanasiados e as seguintes análises foram realizadas: lavado broncoalveolar (LBA), permeabilidade pulmonar e histologia. Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão ou mediana (intervalo interquartil), quando apropriado, e comparados por ANOVA seguida do teste de Tukey, ou por Kruskal-Wallis seguido do teste de Mann-Whitney. Resultados: O escore de lesão pulmonar foi significativamente maior nos grupos C-LPS [0,62 (0,19)] e E-LPS [0,59 (0,13)] em comparação com os grupos C-C [0,11 (0,09)] e E-C [0,15 (0,05)] (p < 0,05). A contagem total de células (C-LPS=2,37 ± 0,74; E-LPS=5,37 ± 0,13; C-C=0,73 ± 0,36; E-C=3,09 ± 7,53 x 105) e de neutrófilos [C-LPS=1,39 (1,48); E-LPS=4,39 (1,95); C-C=0,07 (0,11); E-C=0,68 (0,61) x 105] no LBA foi significativamente maior nos grupos C-LPS e E-LPS comparado aos grupos C-C e E-C (p < 0,05). Animais do grupo E-LPS apresentaram maior contagem de células totais e de neutrófilos no LBA em comparação com o grupo C-LPS (p < 0,05). Na avaliação da razão albumina LBA/soro, o grupo E-LPS apresentou aumento significativo quando comparado ao C-LPS [0,069 (1,243) vs. 0,007 (0,002), respectivamente, p < 0,05]. Não foram observadas diferenças significativas nas trocas gasosas entre os grupos. Conclusões: A presença de enfisema foi acompanhada de maior inflamação pulmonar em resposta à agressão sistêmica induzida pela injeção intraperitoneal de LPS, levando a uma maior lesão da barreira alvéolo-capilar. Palavras-chave: enfisema pulmonar, sepse, lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo, elastase pancreática, lipopolissacarídeos. / Introduction: The response of lungs with emphysema to a systemic insult such as sepsis is not known. Structural and inflammatory abnormalities in lungs caused by emphysema might alter their response to sepsis and thus influence the incidence and severity of acute respiratory distress syndrome. We therefore aimed to compare the severity and extension of acute lung injury in response to intraperitoneal lipopolysaccharide (LPS) injection in rats with and without emphysema induced by elastase. Methods: Twenty four adult Wistar rats were randomized into 4 groups, each of them with 6 animals: control (C-C), emphysema without sepsis (E-C), control with sepsis (C-LPS) and emphysema with sepsis (E-LPS). Emphysema was induced by intratracheal instillation of pancreatic porcine elastase (12 IU/animal). Three weeks later, sepsis was induced by intraperitoneal Escherichia coli LPS injection (10 mg/kg). Twenty four hours after sepsis induction, animals underwent mechanical ventilation for 10 minutes and then blood was sampled for gasometric analysis. Thereafter, euthanasia and the following analysis were performed: BAL, lung permeability and histology. Results were expressed as mean ± standard deviation or median (interquartile range), when appropriate, and compared using ANOVA followed by Tukey test or Kruskal-Wallis followed by Mann-Whitney test. Results: Significant increase in lung injury score was observed in the C-LPS [0.62 (0.19)] and E-LPS [0.59 (0.13)] compared to the groups C-C [0.11 (0.09)] and E-C [0.15 (0.05)] (p < 0.05). Total cell (C-LPS=2.37 ± 0.74; E-LPS=5.37 ± 0.13; C-C=0.73 ± 0.36; E-C=3.09 ± 7.53 x 105) and neutrophil counts [C-LPS=1.39 (1.48); E-LPS=4.39 (1.95); C-C=0.065 (0.11); E-C=0.68 (0.61) x 105] in the BAL were significantly higher in the groups that received LPS (p < 0.05). Significantly higher total cell and neutrophil counts in the BAL were also observed in the E-LPS group compared to C-LPS (p < 0.05). The group E-LPS showed a significant increase in the BAL/serum albumin ratio compared to C-LPS [0.069 (1.243) vs. 0.007 (0.002), respectively] (p < 0.05). There were no significant differences in the gas exchange levels among the groups. Conclusions: The presence of emphysema increases the inflammatory response in the lungs to a systemic stimulus, represented in this model by the intraperitoneal injection of LPS.