Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Paracoccidioides brasiliensis é o fungo dimórfico responsável pela paracoccidioidomicose (PCM). A diferenciação celular do P. brasiliensis de micélio para levedura nos pulmões é essencial para a ocorrência da PCM e é dependente de temperatura. Parte das alterações sofridas pelo fungo está provavelmente relacionada com a expressão de proteínas de estresse (Hsp), pouco conhecidas no P. brasiliensis. Em nosso laboratório foram clonados os genes de P. brasiliensis homólogos aos de duas proteínas mitocondriais de choque térmico: o PbLON, da proteinase Lon, e a porção 5’ do PbMDJ1, da chaperone Hsp40/Mdj1. Estes genes estão ligados por uma região 5’ intergênica comum (ML), o que pode ser relevante em relação à regulação transcricional não apenas porque ambos respondem ao estresse, mas também pela relação funcional. Mdj1p é o membro da família DnaJ localizado na matriz mitocondrial, o qual é essencial na digestão de proteínas desnaturadas pela Lon. Neste trabalho o gene PbMDJ1 de P. brasiliensis foi totalmente caracterizado. Sua sequência apresenta uma ORF de 1659pb, organizada em três exons interrompidos por dois introns. PbMdj1 apresenta 551 aminoácidos com alta similaridade com as homólogas de Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis. O alinhamento destas sequências permitiu mapear todos os domínios que caracterizam a família da DnaJ, a saber, um domínio J, um domínio rico em G/F e um domínio ligante de zinco organizado em quatro repetições de CXXCXGXG. Para a expressão de PbMdj1 recombinante em bactéria, um fragmento de cDNA de 757pb da região 5´ foi subclonado no vetor pHIS3. A proteína PbMdj1r foi purificada e utilizada na obtenção de anticorpos policlonais de coelho. Em microscopia eletrônica e confocal, os anticorpos anti-PbMdj1r localizaram a molécula na mitocôndria de leveduras de P. brasiliensis Pb18, mas também abundantemente na parede celular e região de brotamento. Em ensaios de “imunoblotting”, os anticorpos revelaram uma proteína nativa de 55 kDa tanto em extratos mitocondriais, com significativo aumento da expressão em condições de estresse térmico, como em uma fração de parede. Sua localização extramitocondrial foi confirmada ainda por citometria de fluxo (FACS). Alguns soros de pacientes com PCM reagiram com a PbMdj1r em “immunoblotting”, sugerindo que os pacientes reconhecem essa proteína durante a infecção. Obervamos que locus cromossômico dos genes MDJ1/LON é comum entre fungos dimórficos e Aspergillus. Na região intergênica 5’ compartilhada pelos genes MDJ1/LON de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 foram mapeados e validados 4 elementos de transcrição usando o ensaio de proteção contra DNase I “footprinting” e em experimentos de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Essas regiões abrigam um elemento de choque térmico convencional, dois não-convencionais e outro ligante de AP-1 (ARE), associado ao estresse oxidativo. Foram encontrados motivos similares nos locus correspondente de B. dermatitidis e H. capsulatum. O Pb3, que pertence a uma espécie críptica filogeneticamente distinta, apresentou polimorfismo na região ML. As análises comparativas entre Pb18 e Pb3 mostraram diferenças no número de elementos de transcrição no padrão da regulação transcripcional de PbLON e PbMDJ1 durante a transição de fase. Em Pb18, PbMDJ1 parece ser preferencialmente expresso na fase leveduriforme. Ambos os genes apresentaram aumento nos níveis de transcrição após choque térmico a 42 ºC, porém em Pb3 esse efeito foi mais lento. Este é o primeiro trabalho que detecta elementos de trancrição em P. brasiliensis e pode contribuir significativamente para entendimento da regulação de genes de estresse em fungos dimórficos. As diferenças detectadas em Pb18 e Pb3 quanto à regulação transcricional dos genes aqui estudados e eventualmente outros poderá explicar a distinta relação parasitahospedeiro que os isolados apresentam em camundongos B10.A. / Paracoccidioides brasiliensis is the dimorphic fungus responsible for paracoccidioidomycosis in man, who is infected by inhalation of conidia. The cellular differentiation of P. brasiliensis from mycelium (M) to yeast (Y) in the lungs is essential for infection to occur. J-domain (DnaJ) proteins, of the Hsp40 family, are essential cofactors of their cognate Hsp70 chaperones, besides acting as independent chaperones. In the present study, we have cloned and sequenced the heat shock gene PbMDJ1, which encodes an Mdj1 homologue that is a mitocondrial DnaJ in yeasts. The gene sequence consists of an ORF of 1719bp interrupted by three introns and translates 551 amino acid residues. PbMdj1 is organized in modules consisting of a J domain, followed by a glycine/phenylalanine-rich segment and four CXXCXGXG (zinc finger) domains. The C-terminal is not conserved. We expressed a His-tagged N-terminal region of PbMdj1 and used the recombinant protein to immunize rabbits to obtain anti-PbMdj1r serum. Immune-localization was performed using confocal and electron microscopy, and also flow cytometry. We demonstrated the presence of PbMdj1 not only in the mitochondria, where it is apparently sorted, but also in the cell wall of P. brasiliensis. Labeling was abundant throughout the cell wall and especially in the budding regions; however, anti-PbMdj1r did not affect fungal growth in the concentrations tested in vitro, possibly due to the poor access of the antibodies to their target in growing cells. Labeled mitochondria stood preferentially close to the plasma membrane and gold particles were detected in the thin space between them, towards the cell surface. The anti-rPbMdj1 antibodies used in the reactions specifically recognized a single 55 kDa mitochondrial and cell wall (alkaline β-mercaptoethanol extract) component, compatible with the predicted size of the protein devoid of its matrix peptidetargeting signal. This is the first time a DnaJ member has been observed on the cell surface, where its function is speculative. In the present work we show that Mdj1 and the mitochondrial proteinase Lon homologues are heat shock proteins in the P. brasiliensis and that their gene organization is conserved among thermodimorphic fungi and Aspergillus, where the genes are adjacent and have a common 5´region. We mapped and validaded transcription elements in the 5´-shared intergenic (ML) region of MDJ1/LON from P. brasiliensis using both DNAse I protection footprinting and mobility shift assays. Three of them were similar to canonical and nonconventional heat shock elements and one is a putative AP-1 binding domain (ARE), related to oxidative stress. Similar motifs were detected in the correspondent locus of B. dermatitidis and H. capsulatum. Our studies compared P. brasiliensis Pb18 with genetically distinct Pb3, where the ML region is polymorphic outside mapped motifs. In these isolates, different numbers of elements were detected and the pattern of mRNA accumulation of the genes was distinct during phase transition. In Pb18, PbMDJ1 was preferentially expressed in the yeast phase. This is the first study of transcription elements in P. brasiliensis that might help to understand regulation of stress-related genes involved in fungal adaptation to the host. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2009-08-06T14:04:46Z No. of bitstreams: 1 Tese_JulianaFariaFraconRomao.pdf: 2133295 bytes, checksum: a735f539bee10ae60e6294651f6f1af6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-08-06T14:18:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_JulianaFariaFraconRomao.pdf: 2133295 bytes, checksum: a735f539bee10ae60e6294651f6f1af6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-08-06T14:18:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_JulianaFariaFraconRomao.pdf: 2133295 bytes, checksum: a735f539bee10ae60e6294651f6f1af6 (MD5) Previous issue date: 2007 / No presente trabalho, camundongos BALB/c foram infectados por via endovenosa com leveduras viáveis do P. brasiliensis e foram analisadas a morfologia e a mecânica pulmonares no curso da infecção experimental causada pelo fungo, em diferentes ocasiões (15, 30, 45 e 60 dias após a infecção). Os animais foram sedados, anestesiados e ventilados mecanicamente e foram mensuradas as elastâncias estática (Est), dinâmica (Edyn) e a diferença entre elas ( E), bem como as pressões resistivas ( P1), viscoelásticas/inomogêneas ( P2) e a variação total das pressões ( Ptot) dos pulmões, obtidas pelo método de oclusão ao final da inspiração. Foram coletadas amostras de sangue arterial para análise através da gasometria arterial dos parâmetros: potencial hidrogeniônico (pH), pressão parcial do oxigênio arterial (PaO2), pressão parcial do gás carbônico arterial (PaCO2), percentagem de hemoglobina saturada pelo oxigênio (SaO2), excesso de base (BE) e íon bicarbonato (HCO3). Após as coletas os animais foram sacrificados e os pulmões foram retirados e enviados para a análise histopatológica e para a dosagem de quimiocinas. A análise histopatológica revelou resposta inflamatória progressiva, de padrão granulomatoso, com aumento na quantidade de fungos e formação de tecido fibroso, graduais ao desenvolvimento da infecção, comprometendo o tecido pulmonar. A dosagem de quimiocinas detectou a presença de MIP-1?, RANTES, MIG e KC, com aumento significativo diretamente proporcional ao tempo de infecção. A presença de acidose mista seguida de acidose metabólica, com alterações mais acentuadas na fase aguda, foram observadas no sangue arterial. Na avaliação da mecânica respiratória evidenciou-se aumento das elastâncias estática e dinâmica, da pressão viscoelástica/inomogênea e da variação total das pressões pulmonares. Os resultados indicam que o comprometimento pulmonar é progressivo, com o estabelecimento de fibrose tecidual, determinando um padrão pulmonar provavelmente do tipo restritivo como conseqüência da redução da distensibilidade tecidual. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the present work, mice BALB/c were infected intravenously with variable yeast cells of P. brasiliensis and were analyzed the morphology and pulmonary mechanics in the course of the experimental infection caused by the fungus, at different occasions (15, 30, 45 and 60 days after infection).Mice were sedated, anesthetized and mechanically ventilated and static (Est) and dynamic (Edyn) elastances, their differences (~E) and resistive (~P1) and viscoelastic/inhomogeneous (~P2) pressures and the total variation of pressures (~Ptot) of the lungs, were obtained by end-inflation occlusion method. Arterial blood samples were collected for arterial blood gas analysis of the parameters: hidrogenionic potential (pH), partial pressures of oxygen (Pa02), and carbon dioxide (PaC02), oxygen saturation (Sa02), base excess (BE) and bicarbonate (HC03). After the collecting data the animais were sacrificed and the lungs were removed and sent for histopathology and for the analysis of the concentration of chemokines.Histopathology revealed progressive inflammatory response, leading to granuloma formation, with increase in the fungus counts and formation of fibrosis, gradual to the development of infection, compromising the pulmonary tissue. The dosage of chemokines detected the presence of: MIP-1 a, RANTES, MIG and KC, demonstrating significant increase Directly proportional to the time of infection. The presence of mist acidosis followed by metabolic acidosis, indicating alterations more pronounced in the acute phase, were observed in the arterial blood. In the avaliation of pulmonary mechanics showed increases in static and dynamic elastances and increases in viscoelastic/inhomogeneous pressure and in the total variation of pressures of the lungs. Results indicate that the lung injury is progressive, with the establishment of tissue fibrosis, robably determining a restrictive functional pattern as a result of lower distensibility of lung tissue.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-15T19:37:58Z No. of bitstreams: 1 2008_NadiaSilvaCastro.pdf: 1694398 bytes, checksum: 0128cdccb93616f46069ecd716dbb71a (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-09-21T12:39:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_NadiaSilvaCastro.pdf: 1694398 bytes, checksum: 0128cdccb93616f46069ecd716dbb71a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-09-21T12:39:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_NadiaSilvaCastro.pdf: 1694398 bytes, checksum: 0128cdccb93616f46069ecd716dbb71a (MD5) Previous issue date: 2008-05 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose. Em humanos, a infecção inicia-se pela inalação de propágulos fúngicos que alcançam os pulmões. A parede dos microrganismos constitui um importante reservatório de macromoléculas imunoreativas e um potencial alvo para a procura de candidatos a vacinas. Em muitos patógenos, as proteínas com âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) mostraram-se imunogênicas e importantes fatores de virulência. Assim, com o objetivo de estudar as proteínas de superfície foram efetuadas análises no banco de dados do transcriptoma de P. brasiliensis, onde pesquisou-se por proteínas GPI-ancoradas localizadas na membrana plasmática ou parede celular, bem como por proteínas que estivessem envolvidas na síntese, ligação e clivagem da âncora de GPI. Estas proteínas foram identificadas em várias categorias funcionais, tais como: (i) enzimas: glicanosiltransferases (1-3), (ii) prováveis antígenos de superfície, (iii) proteínas com papel estrutural e envolvidas na biossíntese da parede celular. Foram identificados transcritos codificantes para proteínas da via de biossíntese e hidrolise da âncora de GPI. Visando o conhecimento de mecanismos moleculares que participem da montagem e morfogênese da parede celular de P. brasiliensis, foi realizado o estudo de ?-1,3-glicanosiltransferas e 3 (PbGel3). PbGel3 mostrou-se em cópia única no genoma deste fungo com maiores níveis do transcrito e de proteína na fase miceliana. A proteína foi imunolocalizada na superfície de células leveduriformes e de micélio de P. brasiliensis. O potencial papel de PbGel3p na biossíntese e remodelamento foi evidenciado pela habilidade em recuperar o fenótipo do mutante gas1? de Saccharomyces cerevisiae. O homólogo da proteína DFG5 (deficiente para o crescimento filamentoso 5) de P. brasiliensis, uma proteína glicosilada provavelmente ligada à parede celular pela rede de ?-glicana foi estudado. Estudos de interação demonstraram que a proteína PbDfg5p recombinante se liga aos componentes da matriz extracelular, sugerindo um papel importante nos passos iniciais de colonização e aderência de P. brasiliensis aos tecidos do hospedeiro. Em função de seu papel biológico, bioquímica única, organização estrutural e a ausência da maioria de seus constituintes em células de mamíferos, a parede celular é um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos e essencial para o entendimento da patogênese fúngica. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a temperature dependent dimorphic fungus, the etiological agent of paracoccidioidomycosis. In human, infection starts by inhalation of fungal propagules reaching the pulmonary epithelium, where the morphogenetic conversion is correlated with changes in the cell wall composition, organization and structure. The cell wall constitute an important reservoir of immunoreactive molecules and potential target for the search of vaccine candidates. In many pathogens, the proteins with glicosilfosfatidilinositol (GPI)-anchors are immunogenic and important virulence factors. Thus, P. brasiliensis transcriptome data were analyzed for potential GPI-anchored proteins localized in plasma membrane or cell wall, as well as for proteins involved in synthesis, attachment and cleavage of the GPI anchor. The proteins were identified in several functional categories: (i) enzymes: glucanosyltransferases(1- 3), (ii) probable surface antigens, (iii) proteins involved in cell wall biosynthesis and structural role. It was identificated transcript encoding to proteins involved in GPI anchor biosynthesis and hydrolysis. In an effort to elucidate the molecular mechanisms involved in the fungus cell wall-assembling and morphogenesis it was performed the study of the B-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3). PbGel3 showed one copy in genome of this fungus with the highest level of transcript and protein in the mycelium phase. The protein was immunolocalized at the surface in both mycelium and yeast phase. The potential role of PbGel3p in cell wall biosynthesis and remodeling was evidenced by its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae gas1 mutant. The DFG5 (defective in filamentous growth) homologue of P. brasiliensis, a probably glicosylated and B-glucan linked cell-wall protein was also studied. Studies demonstrated that the recombinant PbDfg5p binds to extracellular matrix components, indicating that it can be important for initial steps leading of P. brasiliensis attachment and colonization of host tissues. Because of its essential biological role, unique biochemistry, structural organization and the absence of the most of their constituents in mammalians cells, the cell wall is an attractive target for the development of new antifungal agents and essential for understanding the fungal pathogenesis.

Pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) podem apresentar comorbidades de natureza não infecciosa, tais como a doença de Hodgkin, leucemias e carcinomas. Neste sentido, o presente trabalho tem como objetivo avaliar clinicamente a associação entre paracoccidioidomicose e neoplasia. Foi realizado um estudo retrospectivo durante um período de 35 anos (1972- 2007), das fichas clínicas de 802 pacientes com diagnóstico da micose, provenientes dos arquivos do Laboratório de Micologia, Santa Casa - Complexo Hospitalar, Porto Alegre. Vinte e quatro casos (3,18%) apresentaram concomitantemente algum tipo de neoplasia. Foram estudados aspectos demográficos, hábitos de vida, manifestações clínicas, radiológicas e laboratoriais, evolução e tratamento realizado em ambas as doenças. O diagnóstico da paracoccidioidomicose foi feito através do exame micológico direto, histopatologia e/ou soromicologia; todos os casos de neoplasia tiveram confirmação histopatológica e/ou citopatológica. Todos os pacientes eram do sexo masculino, com idade entre 40 e 65 anos, com uma mediana de 53 anos. Manifestações relacionadas ao aparelho respiratório foram as principais queixas quando do diagnóstico da micose. Predominou o envolvimento pulmonar seguido por tegumentar e ganglionar. Em 12 pacientes o diagnóstico da PCM precedeu o da neoplasia, em 10 foram simultâneos, e em dois a neoplasia foi identificada anteriormente à micose. Houve concomitância de lesões entre as duas doenças em 66,6% dos casos. Os carcinomas representaram 95,8% das neoplasias, dos quais o de pulmão foi o mais freqüente, com 15 casos (62,5%); um paciente tinha doença de Hodgkin. A diferença entre a freqüência de carcinoma brônquico na população estudada e na população sem a micose foi estatisticamente significante (p = 0,0015). A terapêutica da PCM consistiu, isoladamente, de sulfas (29,2%), sulfametoxazol-trimetoprim (20,8%), cetoconazol (12,5%), itraconazol (12,5%) e anfotericina B (4,2%); houve combinação entre drogas em dois casos e substituição em uma oportunidade. A conduta antineoplásica mais empregada foi cirúrgica (11/24) seguida da radioterápica (9/24), quimioterápica (3/24) de um não se obteve relato. Cura micológica foi observada em doze casos, em nove a evolução é desconhecida e três pacientes foram ao óbito. Em conjunto, os resultados mostraram que existe uma associação entre a paracoccidioidomicose e neoplasia. / Patients with paracoccidioidomycosis may have comorbidities of non-infectious, such as Hodgkin's disease, leukaemia and cancers. Thus, the present study aims to evaluate the clinical association between the paracoccidioidomycosis and neoplasia. A retrospective study was conducted over a period of 35 years (1972-2007) through the revision of chips clinics from 802 patients with clinical diagnosis of mycosis, from the archives of Mycology Laboratory, Santa Casa - Complex Hospital, Porto Alegre. Twenty-four cases (3.18%) had some form of cancer concurrently. They were studied demographics, habits of life, leading clinical, radiological and laboratory, as well as developments in treatment done in both diseases. Paracoccidioidomycosis was diagnosed based on direct mycological exam, serologic and/or histopathologic evidence. All cases of cancer were confirmed by histopathologic and/or cytopathologic examination. All patients were male, aged between 40 and 65 years, with a median of 53 years. Disturbs related to the respiratory system were the main complaints. Lung involvement was the most predominant, followed by the tegumentary and lymphatic. In 12 patients the diagnosis of paracoccidioidomycosis preceded that of neoplasia, 10 were simultaneous, and in two to neoplasia was identified prior to mycosis. There was a concomitance between both of the illnesses in 66,6% of the cases. The cancers accounted for 95.8% of the cancers of the lung, which was the most frequent, with 15 cases (62.5%); one patient had Hodgkin's disease. The difference between the frequency of bronchial carcinoma in the studied population and the population without mycosis was statistically significant (p = 0.0015). The paracoccidioidomycosis therapy consisted alone of sulfas (29,2%), sulfamethoxazoletrimethoprim (20,8%), ketoconazole (12,5%), itraconazole (12,5%) and amphotericin B (4,2%); there was a drug combination in both cases and a substitution in a given opportunity as well. The most used antineoplastic procedure was the surgical one (11/24), followed by radiotherapy (9/24) and chemotherapy (3/24). The mycological cure was noticed in twelve cases; in nine of the cases the evolution is unknown and three patients died. Together, the results showed that there is an association between paracoccidioidomycosis and cancer.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho mostra o envolvimento de motivos de ligação do tipo NIT2 na modulação da transcrição do gene PbGP43, que codifica um importante antígeno do patógeno humano Paracoccidioides brasiliensis. Esta investigação foi motivada pela descoberta de um elevado número de motivos do tipo GATA (ou TATC) dentro dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 do isolado Pb339, presentemente clonado e sequenciado neste trabalho. Este fragmento de 2047 pb contém 23 sítios NIT2, que formam 4 “clusters” putativos, dois deles idênticos. Nossa análise foi baseada em ensaios de EMSA (“electrophoretic mobility shift assay”) usando sondas selecionadas e ensaios de PCR em tempo real do gene PbGP43 de culturas de P. brasiliensis expostas a, ou depletadas, de sulfato de amônio e glutamina. Os resultados sugerem que pelo menos alguns motivos NIT2 podem ser funcionais e que o PbGP43 é modulado por fontes primárias de nitrogênio. Nós mapeamos 4 oligonucleotídeos contendo motivos TATC que formaram complexos DNA-proteína possivelmente envolvendo um fator NIT2. Esta afirmação é baseada nas seguintes observações: i) eles formaram bandas de maior intensidade nos ensaios de EMSA com extrato de células que cresceram na ausência de sulfato de amônio; ii) uma mutação pontual no núcleo TATC (para GATC) diminuiu a intensidade das bandas formadas e iii) todos os complexos migraram de forma semelhante. Tanto sulfato de amônio quanto glutamina provocaram diminuição no acúmulo de mRNA do PbGP43, sendo que o efeito pôde ser revertido quando o sal foi retirado do meio. Esta modulação foi vista não só em Pb339, mas também nos isolados Pb3 e Pb18. Os oligonucleotídeos usados para iniciar a reação para amplificação dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 usando DNA do isolado Pb339 também amplificaram um fragmento de tamanho similar usando DNA do Pb18 e de seis outros isolados. Para os isolados Pb2, Pb3, Pb4 e Pb5 os amplicons foram de ~1500 pb e para Pb9 e Pb17 foi de ~3000 pb. No Pb18, esta sequência é 98% idêntica à de Pb339. No Pb3, além do amplicom de menor tamanho, o número de motivos NIT2 e “clusters” é menor. Ensaios de gene repórter conduzidos em A. nidulans mostraram que os primeiros 480 pb da região 5´ intergênica não só foram responsáveis pela transcrição do gene, mas também continham os elementos necessários para a regulação negativa na presença de sulfato de amônio como fonte de nitrogênio. Além de terem sido testadas fontes de nitrogênio na modulação do PbGP43, o efeito da adição de glicose e soro fetal bovino também foi analisado. Nas condições testadas, o aumento de glicose de 0,18 para 1,5% levou a uma queda no acúmulo de mRNA do gene, no entanto, o contrário foi visto quando a concentração do açúcar subiu de 1,5 para 3%. Para o soro fetal bovino, não houve alteração significativa. Por fim, o mapeamento de elementos de transcrição da região proximal ao ATG (-1 a –326 pb) pelas técnicas de DNAse I footprinting e EMSA levaram à identificação de três regiões de proteção localizadas entre os nucleotídeos –216 e –260 da região promotora proximal. Este é o primeiro relato de modulação por fontes de nitrogênio primárias do gene PbGP43. / The present work shows the involvement of NIT2-like binding motifs in transcription modulation of the PbGP43 gene, which encodes an important antigen from the human pathogen Paracoccidioides brasiliensis. This investigation was motivated by the finding of a high number of GATA (or TATC)-like motifs within the first 2,047 nucleotides of the PbGP43 5’ intergenic region from Pb339 isolate, which has been presently cloned and sequenced. This fragment contains 23 NIT2- like sites, which form 4 putative clusters, two of them identical. Our analysis was based on electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with selected probes and real time reverse transcription (RT)-PCR of PbGP43 from P. brasiliensis cultures exposed to, or depleted of, ammonium sulfate and glutamine. The results suggested that at least some NIT2-like motifs may be functional and that PbGP43 is modulated by nitrogen primary sources. We have mapped 4 oligonucleotides containing TATC motifs that formed DNA-protein complexes possibly involving a NIT2-like factor. This suggestion is based on the following observations: i) they formed more intense EMSA bands with extracts from ammonium sulfate-depleted cells; ii) a point mutation in the TATC core (to GATC) decreased shifted band intensity; iii) all the complexes migrated similarly. Both ammonium sulfate and glutamine provoked rapid decrease in PbGP43 mRNA accumulation, but this effect could be reversed upon salt depletion. This kind of modulation was observed not only in Pb339, but also in Pb3 and Pb18. The oligonucleotides that prime amplification of a 2,047-bp PbGP43 intergenic fragment using Pb339 DNA elongated a fragment of similar size with template from Pb18 and six other isolates, while for Pb2, Pb3, Pb4 and Pb5 the amplicon was ~1,500 bp and for Pb9 and Pb17 it was ~3,000 bp. The Pb18 genome sequence of this amplicon is 98% identical to that of Pb339. In Pb3, the number of NIT2-like motifs and clusters is lower. Gene reporter assays conducted in Aspergillus nidulans WG355 showed that the first -480 bp of the PbGP43 5´intergenic region are responsible for promoter activation and contains the minimal elements responsable for down regulation of gene when tested in minimal medium containing sodium nitrate as the only nitrogen source. Besides nitrogen sources, alterations in the concentration of glucose and addition of fetal serum bovine (FSB) in the medium were tested. In our conditions, when glucose concentration increased from 0,18 to 1,5%, mRNA accumulation decreased. The opposite was seen when concentration raised from 1,5 to 3%. FSB, on the other hand, did not alter PbGP43 expression. When the proximal promoter region was mapped by DNAse I footprinting and EMSA, we identified three protected regions localized between – 216 and –260 bp far from the initial codon (ATG). This is the first report on PbGP43 transcription modulation with primary nitrogen sources. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidiodes brasiliensis é o fungo termodimórifco patogênico causador da Paracoccidioidomicose (PCM). Esse agente infeccioso produz antígenos importantes como a gp43, já bem caracterizada, e a glicoproteína de 70 kDa (gp70) que é reconhecida por 96% dos soros de pacientes com PCM. No presente estudo reportamos que o gene codificador do antígeno gp70 possui uma fase de leitura aberta de 2.154 pares de bases. A estratégia utilizada na clonagem do gene PbGP70 incluiu análises in silico de sequências contidas no banco de dados de sequências expressas de P. brasiliensis (P. brasiliensis’ Expressed Sequence Tags Databank) e sequenciamento por meio da técnica de primer-walking. A análise da sequência da proteína deduzida mostrou a presença de dois motivos para Nglicosilação, epítopos para células B e T com putativas funções antigênicas e protetoras, respectivamente. Análises comparativas in silico classificaram a proteína pertencente à família das flavoproteínas monoxigenases. Muitas proteínas dessa família possuem funções antioxidativas em diversos modelos biológicos e são compostos bioativos importantes. Anticorpos policlonais produzidos contra gp70 recombinante foram capazes de reconhecer a proteína nativa no extrato celular total de P. brasiliensis. A proteína recombinante parcial foi reconhecida por 5 de 7 soros de pacientes com PCM e pelo anticorpo monoclonal previamente produzido contra gp70 nativa (MAb C5F11). Experimentos de microscopia confocal com o anticorpo policlonal anti-gp70 recombinante e o MAb C5F11 mostraram co-localização da marcação citoplasmática, como esperado para gp70. Análises da expressão gênica por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram baixos níveis de expressão do gene PbGP70 em condições normais, porém sob condições de estresse oxidativo, induzido pela adição de H2O2 e durante o crescimento do fungo, a expressão foi significativamente aumentada. Por fim, após incubação de células leveduriformes de P. brasiliensis com macrófagos derivados de medula óssea, foi observado aumento da expressão gênica nas leveduras aderidas ou fagocitadas após 24 horas e, nas leveduras não aderidas, a expressão foi aumentada após 48 horas. Esses achados sugerem que a gp70 possa desempenhar um papel duplo na biologia e infecção por P. brasiliensis. Por um lado, a molécula estimula resposta imune celular e humoral no hospedeiro e por outro protege o fungo do estresse oxidativo gerado por células fagocíticas. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic pathogenic fungus that causes Paracoccidioidomycosis (PCM). This infectious agent produces important antigens as gp43, already fully characterized, and a 70 kDa glycoprotein (gp70) recognized by 96% PCM patients’ sera. In the present study, we report that the gene encoding gp70 antigen has an open reading frame in a 2,154 base pair fragment. The gp70 gene in P. brasiliensis (PbGP70) has been cloned using in silico screening of the P. brasiliensis' Expressed Sequence Tag databank and primer-walking sequencing approach. In the deduced protein sequence, we found two motifs for Nglycosilation, B and T-cell epitopes, with putative antigenic and protector functions, respectively. Comparative in silico analysis showed that this protein belongs to flavoprotein monooxygenasis family. Many proteins of this family show anti-oxidative functions in several biologic models thus, being important bioactive compounds. Antirecombinant gp70 polyclonal antibodies recognized the native protein in the total cell extract of P. brasiliensis. Moreover, the partial recombinant protein was recognized by 5 out of 7 PCM pacients’ sera and by the gp70 C5F11 monoclonal antibody previously produced against native gp70. Confocal microscopy with polyclonal antibodies anti-gp70 recombinant and C5F11 MAb anti-native gp70, showed colocalization in the cell cytoplasm, as expected for gp70. Gene expression analysis using Real-Time PCR showed low levels of gp70 gene expression in normal conditions, but under oxidative stress induced by H2O2 and during the fungal growth, expression is significantly increased. Finally, when we incubated P. brasiliensis with bone-marrow derived macrophages, the phagocyted or attached cells showed increased gp70 gene expression at 24 hours and, in the non-phagocyted cells, the expression was increased after 48 hours. These findings suggest that gp70 might play a dual role in P. brasiliensis, both eliciting immune cellular and humoral responses in the host and protecting the fungus from oxidative stress generated by phagocytic cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-29Bitstream added on 2014-06-13T18:53:57Z : No. of bitstreams: 1 machado_gc_me_botib.pdf: 359425 bytes, checksum: 96a3b6e269405927664fd4f77072b888 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O fungo termodimórfico Paraccocidiodes brasiliensis, em sua fase leveduriforme, é o agente etiológico de uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina, a paracoccidioidomicose. A doença pode ser fatal em sua forma aguda, além de gerar, na forma crônica, lesões principalmente de ordem dermatológica e pulmonar. O fato de P. brasiliensis ser considerado uma única entidade biológica vem sendo questionado pelos recentes achados de filogenia molecular. Atualmente acredita-se que P. brasiliensis seja um complexo de quatro espécies crípticas, S1, PS2, PS3 e P. lutzii, sendo esta última a mais distante filogeneticamente. É possível que o fato esteja interferindo em aspectos relacionados à doença, como, por exemplo, a positividade do diagnóstico sorológico. Além disso, tal especiação pode significar diferenças na biologia do fungo, em aspectos como sua morfologia, fisiologia e ocupação de nichos ecológicos.A primeira frente deste trabalho visou produzir e caracterizar antígenos a partir de cepas pertencentes às diferentes espécies de P. brasiliensis, e avaliar o desempenho das mesmas em testes de imunodifusão (ID) contra pacientes das diferentes regiões do Brasil. Melhores resultados foram obtidos com o antígeno produzido por filtrado de cultura de um isolado pertencente ao grupo PS3, o qual apresentou altas taxas do antígeno imunodominante, a glicoproteína gp43, detectável por SDS-PAGE, e apresentou boa positividade nas IDs quando cruzados com soros de pacientes da região de Botucatu, reagindo inclusive com alguns soros falso-negativos para o antígeno considerado padrão, produzido pela cepa B-339. Entretanto, este antígeno, bem como outros aqui avaliados, não foi capaz de apresentar desempenho satisfatório frente a soros de pacientes da Região Centro-Oeste, justamente os que apresentam maiores taxas de negatividade, provavelmente por serem... / The thermo-dimorphic fungus Paraccocidiodes brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis, one of the most important systemic mycosis in Latin America. The disease can be fatal in its acute form, besides causing important lesions especially in lungs and skin when occurs in its chronic form. The fact that P. brasiliensis is considered a single biological entity has been challenged by the recent findings in molecular phylogenetics. Currently, it has been observed that P. brasiliensis is a complex of four cryptic species, S1, PS2, PS3 and Pb01-like, which is the most distantly related, being proposed as new formal species, P. lutzii. It is possible that these facts are interfering with the host/pathogen interactions, as well as with the results of serological diagnosis. Furthermore, this speciation could reflect differences in the biology of the fungus, especially on their morphology, physiology and occupation of ecological niches.The first approach of this work was to produce and characterize antigens from strains belonging to different species of P. brasiliensis, and evaluate their performance in immunodiffusion tests (ID) against sera of pacients from different regions of Brazil. The better results were obtained with the antigen produced by culture filtrate of an isolate belonging to the PS3, AgEpm83, which showed high positivity rates in IDs, against sera of patients from Botucatu. This antigen, in addition, presented high levels of the glycoprotein gp43, the immunodominant component, detectable by SDS-PAGE. However, this antigen, as well as other here evaluated, was unable to provide satisfactory performance against the sera of patients from the Brazilian Midwest Region, probably because they are infected with P. lutzii isolates. The in silico analysis of exon2 of the gene that encodes gp43 indicated that this gene is under purifying selection both... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-31Bitstream added on 2014-06-13T19:01:44Z : No. of bitstreams: 1 valerio_mja_dr_botfm.pdf: 1362288 bytes, checksum: 92bb90e388b3c540e45ec3f19d6b0e1d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Na paracoccidioidomicose, os estudos sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro destacam o papel das células fagocitárias que participam ativamente dos mecanismos efetores diretos contra o fungo e da modulação da resposta inflamatória. Dentre essas células, nos últimos anos, os estudos têm se voltado para os neutrófilos, que exercem um importante papel efetor e modulador principalmente durante os estágios iniciais da infecção. As funções dessas células, incluindo as antimicrobicidas, podem ser reguladas por citocinas pró e anti-inflamatórias. Apesar dos mecanismos celulares e moleculares desse processo não estarem completamente entendidos, trabalhos nos últimos anos têm mostrado de forma bastante consistente o envolvimento dos “Toll Like Receptors” (TLRs). Neste contexto, os objetivos do presente trabalho foram: 1- Avaliar a expressão de TLR2 e TLR4 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a ou IFN-g e desafiados com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis cepa 18 (Pb18). 2- Avaliar a participação desses receptores na atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas: IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a, IFN-g e desafiados com Pb18. Nos ensaios referentes ao primeiro objetivo, as células foram tratadas por 18 horas com cada uma das citocinas ou LPS, posteriormente desafiadas com Pb 18 por 4 horas e avaliadas quanto a expressão de TLR2 e TLR4 por citometria de fluxo. Nos referentes ao segundo objetivo, as células foram ativadas com os mesmos estímulos, submetidas ao bloqueio de TLR2 e TLR4, através da incubação das células com anticorpos monoclonais específicos, desafiadas com Pb18 por 4 horas e analisadas quanto a atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10, por Elisa. Os resultados... / In paracoccidioidomycosis, phagocytic cells appear to provide one of the major lines of host defense. In this context, in last years, various studies have focused on the role of neutrophils that are involved in primary response to the fungus. Neutrophil functions are regulated by pro and anti-inflammatory cytokines. The molecular and cellular mechanisms involved in this process are not fully understood, but there are strong evidences about the involvement of “Toll Like Receptors” (TLRs). In this context, we aimed to evaluate TLR2 and TLR4 expression on human neutrophils primed with the cytokines GM-CSF, IL- 15, TNF-a or IFN-g and challenged with a virulent strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Moreover, we asked if these receptors have a role on fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by primed and challenged cells. In first assays, neutrophils were incubated with each of cytokines or LPS by 18 h, challenged with Pb18 by 4 h and evaluated by TLR2 and TLR4 expression by flow cytometry. In other assays, cells were incubated with each of cytokines or LPS by 18h, submitted to TLR2 and TLR4 blocking by specific monoclonal antibodies, challenged with Pb18 for 4 h and evaluated for fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by ELISA. All cytokines increased TLR2 and TLR4 expression. Pb18 increased TLR2 expression inducing an additional effect to that of cytokines. On the contrary, it inhibited TLR4 expression. All cytokines increased neutrophils fungicidal activity, but this process was not associated with TLR2 or TLR4 expression. All cytokines and Pb18 increased H2O2 production, but in the same manner to fungicidal activity, the process was not associated to TLR2 or TLR4 expression. Neutrophils activation with GM-CSF and TNF-a resulted in a significative increase on IL-8... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-19Bitstream added on 2014-06-13T20:22:14Z : No. of bitstreams: 1 000733096.pdf: 1684706 bytes, checksum: f3187a023c62c55ced4cacb9d3f6028c (MD5) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. O estabelecimento da paracoccidioidomicose-infecção ou paracoccidioidomicose-doença depende das interações parasita-hospedeiro que podem resultar em uma resposta imune mais ou menos eficaz por parte deste último. Embora vários dos mecanismos decorrentes dessa interação já estejam descritos, estudos sobre a participação de outros fatores potenciais podem ampliar sobremaneira o nosso entendimento sobre a imunopatogênese da PCM. Nesse sentido, os eicosanóides como as prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) devem ser avaliados. Em trabalhos anteriores detectamos que o fungo induz a produção de PGs e LTs por monócitos humanos que, de uma forma autócrina, suprimem ou aumentam respectivamente, as atividades antifúngicas dessas células. No entanto, os estudos têm mostrado que além de induzir a produção de eicosanóides, os próprios fungos podem produzir esses mediadores, revelando um mecanismo de virulência que tem potencialmente grandes implicações para o entendimento dos mecanismos das infecções fúngicas. Baseados nesses estudos detectamos que o P. brasiliensis produz tanto PGs como LTs, usando fontes endógenas e exógenas de ácido araquidônico, e que ambos são importantes para a manutenção da viabilidade do fungo. Adicionalmente, os resultados sugeriram que o fungo utiliza as vias metabólicas da ciclooxigenase (COX) para a produção de PGs e da lipoxigenase (5-LO) para LTs. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos objetivando avaliar se o fungo produz outras classes de eicosanóides, além da PGE2 e LTB4, se as PGs e LTs liberados pelo P. brasiliensis podem ser considerados como PGE2 e LTB4 autênticos, isto é semelhantes aos detectados para os mamíferos, assim como estabelecer de uma forma definitiva se a COX e a 5-LO são as vias metabólicas utilizadas... / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The establishment of paracoccidioidomycosis-infection or the evolution to paracoccidioidomycosis-disease in its more or less severe forms, primarily depends on complex host-parasite interaction, in which immune response mechanisms play an essential role. While many of these mechanisms have been elucidated, studies on the participation of other potential factors can greatly expand our understanding of PCM immunopathogenesis. Accordingly, eicosanoids such as prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) should be evaluated. In previous studies we found that the fungus induces the production of prostaglandins and leukotrienes by human monocytes that in an autocrine way suppress and increase, respectively, the antifungal activities of these cells. However, studies have shown that in addition to inducing the production of eicosanoids, fungi themselves can produce these mediators, showing a mechanism for virulence that has potentially important implications for understanding the mechanisms of fungal pathogenicity. Based on these studies, we found that P. brasiliensis produces both PGs and LTs, using exogenous and endogenous sources of arachidonic acid and that both are important for fungus viability. Additionally, the results suggested that the fungus uses cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (5-LO) metabolic pathways for PGs and LTs production, respectively. Here, we profound these studies evaluating whether PGs and LTs released by P. brasiliensis can be considered as authentic LTB4 and PGE2, i.e. similar to those detected for mammals. We also asked whether the fungus, in addition to PGE2 and LTB4, produces other classes of eicosanoids. Finally, we intended to definitively determine whether COX and 5-LO are the metabolic pathways used for this production. We found that fungus PGE2 and LTB4 ...