Orientadores: Lucila Costallat Ricci, Maria Jose Soares Mendes-Giannini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T18:45:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Uemura_MarciaAkemi_M.pdf: 9642195 bytes, checksum: e7486d439dee261adb01b7891294c0d5 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), fungo dimórfico, é o agente etiológico de micose sistêmica, a paracoccidioidomicose (PCM). Esta doença, invasiva no homem, é endêmica na América Latina, principalmente no Brasil, Venezuela e Colombia. Os mecanismos de patogenicidade deste fungo ainda não estão bem esclarecidos, porém, existem indícios de que a constituição da parede celular e a produção de antígenos solúveis, como a glicoproteína de 43 kDa (gp43), sejam fatores de virulência responsáveis pelo seu estabelecimento no hospedeiro. Neste sentido, foram realizados estudos in vitro para avaliar possíveis mecanismos e fatores de virulência envolvendo adesão e invasão celular. No presente trabalho, foi analisado o processo de infecção de cinco diferentes cepas do P. brasiliensis em células HeLa (adenocarcinoma cervical humano) e revelados por diferentes técnicas de coloração (May-Grünwald/Giemsa, PAS e Imunofluorescência Indireta). Através de observações em microscopia óptica destas preparações, verificouse que todas as cepas aderiram e invadiram as células em cultura. Em provas imunoenzimáticas, observou-se diferenças quanto a concentração de células fúngicas aderidas às células HeLa. Desta forma, a cepa Pb18 apresentou maior índice de adesão, seguida pelas cepas Pb113 e Pb265. Estes dados apresentam concordância aos diferentes graus de patogenicidade, já descritos na literatura, para estas cepas em experimentos in vivo. Ainda por esta metodologia, foi analisada a inibição da adesão do fungo através de tratamento prévio com diferentes soros imunes (anti-gp43 e "pool" de soros de pacientes com PCM). Dentre estes soros, o tratamento com o "pool" de soros de pacientes apresentou maior índice de inibição da adesão do P. brasiliensis em células HeLa. Ainda pela técnica de contagem de unidades formadoras de colonias (ufc) foi constatada a viabilidade das células fúngicas intracelulares. Estudos complementares foram realizados através de observações em Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), onde foram observadas avaliação do processo de infecção. Nesta abordagem, foi verificada uma provável sequência de infecção do P. brasiliensis às células HeLa. Devido a presença de formas intracelulares não usuais deste agente, apresentando-se como protoplastos, a utilização da técnica de "immunegold" foi conclusiva na comprovação do processo de adesão e invasão celular deste importante patógeno do nosso meio / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica e endêmica na América Latina com maior prevalência no Brasil, Colômbia e Venezuela. A doença é causada pelos fungos P. brasiliensis e P. lutzii. As células dendríticas são eficientes apresentadoras de antígenos e quando utilizadas como adjuvante podem ser de 100 a 1000 vezes mais efetiva nesta função. O peptídeo P10 corresponde a um trecho específico de 15 aminoácidos derivado da gp43, principal antígeno diagnóstico, e é reconhecido pelos linfócitos T CD4+ capaz de induzir resposta preferencialmentedo tipo Th1 e conferindo proteção no modelo experimental. Células indiferenciadas foram obtidas a partir de medula óssea de camundongos machos BALB/c B10.A, cultivadas na presença de GM-CSF e IL-4 por 9 dias, para a diferenciação de células dendríticas (DC). As células foram incubadas na presença do P10 por 2 horas, em estufa com 5% de CO2 a 37°C, e foram utilizadas nas imunizações. A maturação das células foi observada por citometria de fluxo com os marcadores CD11c, MHC-II, CD80 e CD86. Camundongos da linhagem BALB/c e B10.A foram submetidos à imunossupressão com dexametasona, por 20 dias, seguido pela infecção intratraqueal com o isolado Pb18. Após 30 dias, os grupos foram tratados com DCs ou DCs pulsadas com P10 em associação ou não com sulfametoxazol/Trimetoprim, por um período de 15 dias. O sacrifício ocorreu 45 dias após a infecção e foram retirados os pulmões, baço e fígado para quantificação de carga fúngica, análise histológica e dosagem de citocinas. Observamos diminuição significativa da carga fúngica nos pulmões dos animais que receberam DCs pulsadas com P10 associada ou não ao tratamento medicamentoso. Não foi observado crescimento fúngico em outros órgãos como fígado e baço em ambos os grupos. A análise histológica revelou redução da carga fúngica e preservação do parênquima pulmonar nos grupos tratados com Dcs pulsadas com P10. As dosagens das citocinas indicaram uma resposta imune mista Th1/Th2. Inicialmente reportamos que as DCs pulsadas com P10 reduz a carga fúngica em camundongos infectados. Neste trabalho, reportamos que as DCs pulsadas com P10 podem também reduzir a carga fúngica em animais anérgicos, mimetizando pacientes com a forma aguda/subaguda da doença / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic and endemic mycosis in South America, with higher prevalence in Brazil, Colombia and Venezuela. This disease is caused by fungi P. brasiliensis and P. lutzii. The peptide P10 matches a specific path of 15 amonoacids which is derived from gp43, main diagnostic antigen. This peptide is recognized by the T CD4+ lymphocytes and induces a response type Th1, giving protection at an experimental mode. Some dendritic cells (DC) have an efficient antigen and, when used as adjuvant, they can be 100 to 1000 times more effective. Undifferentiated cells were obtained from bone marrow of male mice type BALB/c and B10.A and cultivated in the presence of GM-CSF and IL-4 for 9 days, so that DCs would be differentiated. The cells were incubated in the presence of P10 for 2 hours in incubator at 37°C with 5% of CO2, and later utilized in the immunizations. Maturation of the cells was observed by flow cytometry with CD11c, MHC-II, CD80 and CD86 markers. Mice types BALB/c and B10.A had been submitted to an immunosuppression with dexamethasone for 20 days, before being intratracheally infected with isolate Pb18. After 30 days, the group of animals received immunizations with DCs or DCs pulsed with P10 associated or not with the treatment by Sulfametoxazol/Trimetoprim, this for a period of 15 days. The sacrifice occurred 45 day after the animals had been infected, and their lungs, spleen and liver were taken out for quantification of fungal burden, histology and cytokine assay. We observed a significant decrease of fungal burden in the lungs of animal that received DC pulsed with P10, associated or not with the drug treatment. In both groups we didn\'t observe fungal growth in organs such as liver and spleen. The histological analyses showed reduced fungal burden and preservation of lung parenchyma. The dosages of cytokines showed an immune response mixed Th1/Th2 type. At first we reported that the DCs pulsed with P10 were responsible for reducing the fungal burden in infected mice. In this paper we report that the DCs pulsed with P10 may also be responsible for reducing fungal burden in anergic animals, mimicking patients with the acute/subacute form of the disease

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2017-09-29T19:49:45Z No. of bitstreams: 2 Tese- Laurine Lacerda Pigosso - 2016.pdf: 7314504 bytes, checksum: fad2e169b6b855dccd4a9cad2626868d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-02T13:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese- Laurine Lacerda Pigosso - 2016.pdf: 7314504 bytes, checksum: fad2e169b6b855dccd4a9cad2626868d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-02T13:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese- Laurine Lacerda Pigosso - 2016.pdf: 7314504 bytes, checksum: fad2e169b6b855dccd4a9cad2626868d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidoides brasiliensis and Paracoccidioides lutzii, the etiologic agents of paracoccidioidomycosis, cause disease in healthy and immunocompromised persons in Latin America. We developed a method for harvesting P. brasiliensis yeast cells from infected murine lung to facilitate in vivo transcriptional and proteomic profiling. P. brasiliensis harvested at 6 h post-infection were analyzed using RNAseq and LC-MSE. In vivo yeast cells had 594 differentially expressed transcripts and 350 differentially expressed proteins. Integration of transcriptional and proteomic data indicated that early in infection (6 h), P. brasiliensis yeast cells underwent a shift in metabolism from glycolysis to β-oxidation, upregulated detoxifying enzymes to defend against oxidative stress, and repressed cell wall biosynthesis. Bioinformatics and functional analyses also demonstrated that a serine proteinase was upregulated and secreted in vivo. To our knowledge this is the first study depicting transcriptional and proteomic data of P. brasiliensis yeast cells upon 6 h post-infection of mouse lung. / Paracoccidoides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii, os agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, causam doenças em pessoas saudáveis e imunocomprometidas na América Latina. Desenvolvemos um método para coletar células de levedura de P. brasiliensis de pulmão murino infectado para facilitar o estudo do perfil transcricional e proteômico in vivo. P. brasiliensis recuperados após 6 horas de infecção foram analisados usando RNAseq e LC-MSE. As células de levedura após passagem in vivo apresentaram 594 transcritos expressos diferencialmente e 350 proteínas diferencialmente expressas. A integração dos dados transcricionais e proteômicos indicou que ainda no início da infecção (6 h), as células de levedura de P. brasiliensis sofreram uma mudança no metabolismo da glicólise para β-oxidação, enzimas desintoxicantes reguladas para se defender contra o estresse oxidativo e repressão da biossíntese de parede. Análises de bioinformática e funcionais também demonstraram que uma serino proteinase foi regulada e secretado in vivo. Pelo o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que descreve a transcrição e dados proteômicos de células de levedura de P. brasiliensis após 6 h de infecção no pulmão de camundongo.

Orientador : Liana Maria Cardoso Verinaud / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T20:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_PaulaCristinadeSouza_M.pdf: 3995762 bytes, checksum: 7f9e4f34b6614515ca9fa1179150d942 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

Orientador: Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T08:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fornazim_MarciaCristina_M.pdf: 977684 bytes, checksum: 6e57e24188b29731261e168251676a0d (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Para investigar a resposta imune local versus sistêmica em pacientes com paracoccidioidomicose pulmonar analisamos o fenótipo de diferentes populações celulares e o padrão de produção de citocinas por células do lavado broncoalveolar (LBA) e do sangue periférico. O grupo estudado foi constituído por 19 pacientes com idade entre 36 a 65 anos. O diagnóstico foi confirmado pela demonstração do fungo P. brasiliensis no escarro, LBA e/ou biópsia. A análise do LBA mostrou aumento de linfócitos e neutrófilos em relação ao descrito para indivíduos normais saudáveis. Linfócitos T CD8+ encontravam-se em maior número no LBA do que no sangue periférico. A expressão de moléculas do MHC classe II, ICAM-1 (CD54) e B7-2, foi aproximadamente 3 vezes maior em macrófagos alveolares (MA), do que em monócitos do sangue periférico. Sobrenadantes de culturas de curta duração de MA apresentaram níveis mais elevados de IL-6, TNF-a, IL-12 p40 e MIP-1a, do que sobrenadantes de monócitos do sangue periférico. No LBA destes pacientes também foi possível detectar IL-6, TNF-a e MIP-1a, assim como anticorpos específicos anti-gp43 de P. brasiliensis, principalmente da classe IgG2. Como foi demonstrado que MIP-1a atrai seletivamente linfócitos T CD8+ e esta população celular está aumentada no LBA, nossos achados sugerem que além de macrófagos ativados, células T CD8+ devem ter um importante papel no desenvolvimento da PCM pulmonar / Abstract: To investigate the local immune response we analyzed the cellular infiltrate and patterns of cytokine production in bronchoalveolar lavage cells and fluid from patients with pulmonar paracoccidioidomycosis (PCM). The group consisted of 19 patients, 16 male and 3 female, with age ranging from 36 to 65 years. The diagnosis was confirmed by demonstration of fungus in the sputum or bronchoalveolar lavage fluid (BAL), in addition to serological tests. Cytospin preparations from patients with PCM showed an increased number of lymphocytes in BAL, mostly CD8+T cells. Cultured alveolar macrophages produced higher levels of IL-6, TNF-a ??and MIP-1a as compared with PBMC. No differences were detected in relation to IL-8, IL-12p40, IL-10 and TGF-a. BAL fluid from PCM patients contained low but significant levels of IL-6, TNF-a and MIP-1a, and specific antibodies to Paracoccidioides brasiliensis, mainly of the IgG2 isotype. These findings indicate that the local inflammatory reaction in the lungs of patients with pulmonary paracoccidioidomycosis is mediated by the inflammatory cytokines TNF-a ??IL-6 and MIP-1a characterized by a lymphocytic infiltration and local release. MIP-1a may play an important role in the pathogenesis of PCM, mediating the recruitment of lymphocytes and macrophages to the site of infection / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

A paracoccidioidomicose (PCM) é a infecção fúngica sistêmica de maior prevalência na América Latina, cujo agente etiológico, Paracoccidioides brasiliensis, é um fungo com estrutura de parede celular complexa constituída de proteínas, glicoproteínas, polissacarídeos, lipídeos, polipeptídios e melanina que reúnem condições físico-químicas e biológicas para atuarem como antígenos. Anticorpos direcionados contra antígenos presentes na parede de P. brasiliensis podem interferir no curso da doença. Os mecanismos com os quais anticorpos específicos medeiam à proteção contra fungos estão em processo de elucidação por vários grupos de pesquisadores. No entanto, estas moléculas podem ser protetoras, proporcionando o aumento da eficácia de células efetoras do hospedeiro contra o fungo e modular a produção de citocinas, entre outros processos. O tratamento da PCM é relativamente eficiente, porém, é muito longo, por isso alguns pacientes desistem ou não seguem adequadamente o tratamento, resultando em reativação do foco infeccioso. Nesse sentido, avaliamos o efeito da transferência passiva de anticorpos policlonais contra glicolipídios acídicos por meio de protocolos profiláticos e terapêuticos em animais infectados com P. brasiliensis. Nos ensaios in vivo, os resultados mostraram que os animais tratados apresentaram diminuição significante da carga fúngica e de danos nos tecidos dos pulmões. A dosagem de citocinas apontou aumento de IFN-? e IL-12, modulando a resposta imune para o padrão Th1. Ensaios in vitro demonstraram que o tratamento com anticorpos policlonais gerados contra os glicolipídios acídicos foram capazes de aumentar a atividade fagocítica, a produção de óxido nítrico e morte das leveduras de Pb 18, por macrófagos peritoneais J774. O tratamento com anticorpos policlonais contra antígenos de natureza glicolipídica mostrou ser importante ferramenta para a busca da cura da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection most prevalent in Latin America, whose etiologic agent, Paracoccidioides brasiliensis, is a yeast with a complex cell wall structure consisting of proteins, glycoproteins, polysaccharides, lipids, and melanin polypeptides that gather physical, chemical and biological conditions to serve as antigens. Antibodies against antigens present in the wall of P. brasiliensis can interfere with the course of the disease. The mechanisms by which antibodies mediate protection against fungi are in the process of elucidation by several research groups. However, these molecules may be protective, providing increased efficiency of effector cells of the host against the fungus and modulating the production of cytokines, among other things. Treatment of PCM is relatively efficient, however, it takes long time and some patients drop out before it ends or do not follow the treatment properly resulting in reactivation of infectious focus. Accordingly, we evaluated the effect of passive transfer of antibodies against acidic glycolipids by prophylactic and therapeutic protocols in animals infected with P. brasiliensis. The results of in vivo tests, showed that the treated animals had a significant reduction in fungal load and tissue damage in the lungs. The noted increase in cytokine IFN-? and IL-12 modulated the immune response to Th1. In vitro assays have shown that treatment with polyclonal antibodies generated against the acidic glycolipids were able to increase the phagocytic activity, production of nitric oxide and killing of yeast Pb 18 by peritoneal macrophages. Treatment with antibodies against glycolipids antigens proved to be an important tool to search for the cure of PCM.

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa sistêmica, que tem como agentes etiológicos fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides. A produção de melanina por vários fungos interfere no mecanismo da patogênese, como ocorre na paracoccidioidomicose. O presente projeto visou avaliar a produção de melanina pelos isolados de P. lutzii, e seus efeitos in vitro, avaliando o processo de fagocitose. Os resultados obtidos durante este trabalho mostraram que os isolados de P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 e Pb8334) melanizam de formas diferenciadas entre eles e quando comparados com isolados de P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 e Pbcão). Ensaios de fagocitose, com os isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, mostraram que a melanina reduziu a porcentagem de fagocitose das leveduras não tratadas de Pb18 e Pb60855, e o contrário aconteceu com Pb01. As análises dos perfis proteicos e enzimáticos dos isolados Pb18, Pb60855 e Pb01, permitiram determinar que o isolado Pb01 produz uma menor quantidade de proteínas que Pb18 e Pb60855 nas condições ensaiadas. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a granulomatous systemic mycosis, whose etiological agents are dimorphic fungi of the genus Paracoccidioides. Melanin production by various fungi interferes in the mechanism of pathogenesis, as in paracoccidioidomycosis. Thus, this project aimed to evaluate the production of melanin by isolates of P. lutzii and its in vitro effects by assessing the process of phagocytosis. The results obtained during this work showed that the isolates of P. lutzii (Pb01, Pb66, ED01, Pb1578 and Pb8334) produce melanin in different ways between them and also when compared with isolates of P. brasiliensis (Pb60855, Pb18 and Pbcão). Phagocytosis assays, with Pb18, Pb60855 and Pb01, showed that melanin reduced the percentage of phagocytosis of untreated yeast of Pb60855 and Pb18 and the opposite happened with Pb01. The analysis of the protein and enzymatic profiles, of the isolates Pb18, Pb60855 and Pb01, enabled to determine that the isolated Pb01 produces a smaller amount of proteins compared with Pb18 and Pb60855 in the tested conditions.

A presença de IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN e MMPs foi avaliada em camundongos infectados com o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Aos 15 dias, IFN-<font face=\"symbol\">g foi observado em granulomas (Gr), aumentando em resistentes (A/J) aos 120d. Suscetíveis (B10.A) tiveram mais macrófagos e células gigantes (CGs) OPN+, alta carga fúngica e baixo NO aos 15d. A/J tiveram aumento em OPN, maior NO e menor carga fúngica do que B10.A aos 120d. Camundongos infectados apresentaram MMP9 em macrófagos, GCs e Pb e atividade de MMP9 e MMP2. Aos 15d, KOiNOS tiveram Gr com necrose, debris de Pb e OPN e seus controles, Gr com muitos Pbs e OPN. Aos 120d, os controles apresentaram Gr extensos contendo muitos Pbs e expressão de OPN; KOiNOS tiveram Gr compactos com células OPN+ ou lesões residuais com pouca OPN e baixa carga fúngica. Maiores níveis de OPN foram detectados em KOiNOS. A OPN está associada com gravidade no início da infecção, mas com certo controle na fase tardia e no desenvolvimento e organização do Gr. Sugere-se que a presença de MMPs exerça influência no padrão do Gr e na disseminação fúngica. / We studied IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN and MMPs in mice infected with the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). IFN-<font face=\"symbol\">g was found in granulomas (Gr) at 15d and increased in resistant mice (A/J) at 120d. At 15d, macrophages and giant cells (MGCs) were more OPN+ in susceptible mice (B10.A) which had high fungal load and low NO. At 120d, A/J had numerous intensely stained OPN(+) cells and higher NO and lower fungal load than B10.A. MMP9 was found in macrophages, MGCs and Pb of infected mice, which had MMP9 and MMP2 activity. At 15d, KOiNOS had Gr with necrosis, altered Pb and OPN; controls had Gr with many Pb and OPN. At 120d, controls had large Gr with many Pb and OPN expression; KOiNOS had compact Gr with OPN+ cells or residual Gr with weak OPN and decreased fungal load. More OPN levels were detected in KOiNOS. OPN is associated with infection severity at the beginning and with some control at later stages of infection and is involved in Gr development and organization. We show the presence of MMPs and suggest their influence in Gr pattern and in Pb dissemination.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis e é considerada a 10º causa de morte dentre doenças infecciosas e parasitárias no Brasil. As células dendríticas (DCs) são as mais eficientes na apresentação de antígenos, e sendo de 100 a 1000 vezes mais eficientes que um adjuvante não específico. P10, motivo específico de 15 aminoácidos derivado da gp43 excretada pelo fungo, é reconhecido por linfócitos T, direciona para resposta Th1 e confere proteção no modelo experimental. Nesse sentido, analisamos a capacidade de DCs pulsadas com P10 em ativar uma resposta protetora. In vitro observamos que a proliferação de esplenócitos foi maior quando a reestimução era feira com P10 e DCs juntos. In vivo, camundongos infectados e tratados com DCs pulsadas com P10 apresentaram diminuição da carga fúngica e melhoria do tecido pulmonar, aumento de IFN-<font face=\"Symbol\">g/IL-12 e diminuição de IL-4/IL-10. Esses resultados evidenciam o potencial das DCs atuando como adjuvante para o P10 em uma vacina para o tratamento e cura da PCM. / Paracoccidiodomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis. In Brazil, it is ranked as the tenth cause of death among the chronic infectious and parasitic diseases. Dendritic cells (DCs) are the most efficient antigen presenting cells, and they are at least 100-1000 times more efficient than a non specific adjuvant. The P10, 15-amino acid peptide motif derived from gp43 secreted by the fungus, is recognized by T cells, induces Th1 response and protects mice in a murine model of the disease. In the present work we analyzed the ability of DCs pulsed with P10 to elicit a protective response. In vitro results showed that a stronger proliferation of the splenocytes was reached when induced by DCs with P10. In vivo, mice infected and treated with DCs pulsed with P10 showed reduce of the fungi burden with less inflamed areas, higher levels of IFN-<font face=\"Symbol\">g/IL-12 and lower levels of IL-10/IL-4. All that point out the importance of the adjuvant role of DCs when developing a vaccine using P10 for the treatment or cure of PCM.