Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mirelle Bb.pdf: 2549462 bytes, checksum: 7f8ae645314de6fb536a8445eb69e03e (MD5) Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in South America. In humans, infection starts by inhalation of fungal propagules that reach the pulmonary epithelium. The cell wall presents an essential role in the pathobiology of P. brasiliensis, since it is involved in the morphogenetic changes associated with the life cycle of this pathogen. The biosynthesis and remodeling of the cell wall polysaccharide network is required for fungal growth and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins are involved in these processes. The enzymes of the glucan-elongating (GEL) family are GPI-anchored proteins which have beta-1,3-glucanosyltransferase activity and play important role in the cross-linking of cell wall components in fungi. The P. brasiliensis genome possess 3 genes that encode for beta-1,3-glucanosyltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). With the aim of searching for other possible functions for beta-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3p) in P. brasiliensis, the interactions between this protein and others proteins of the fungus were investigated through the Saccharomyces cerevisiae two-hybrid system and pull-down assay. The two-hybrid system enables the study of interactions in vivo and, through this approach, 8 proteins which interact with PbGel3p were identified. The interaction with phosphatidylinositol- 4-phosphate 5-kinase its3 and protein kinase Dsk1p suggest the participation of PbGel3p in the cell division cycle. The RNA helicase Dbp5p, whose interaction with PbGel3p was in vitro confirmed by coimunoprecipitation, and the 5'-3' exoribonuclease are involved in the mRNA metabolism suggesting a function for PbGel3p in this process. The interaction between PbGel3p and the lipase/serine esterase, which participates on the biosynthesis of the GPI-anchor, was also confirmed by coimunoprecipitation. PbGel3p also interacts with the transcription factor Ctf1Bp and the 3-oxoacyl reductase enzyme, which suggests its involvement in the lipid metabolism. The interaction with the leptomycin B resistance protein Pmd1p suggests a role for PbGel3p in the response to antifungal drugs. The in vitro pull-down assay resulted in the identification of P. brasiliensis 70 kDa heat shock protein. The interaction with this protein suggests that PbGel3p may act in the response to stress conditions, as in the temperature increase. On basis of these data, functional studies may be carried out in order to confirm the Gel3p multifunctionality in P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica prevalente na América do Sul. A infecção em humanos inicia-se com a inalação de propágulos fúngicos que atingem o epitélio pulmonar. A parede celular desempenha um papel importante na patobiologia do P. brasiliensis, pois está envolvida nas mudanças morfogenéticas associadas com o ciclo de vida deste patógeno. A biossíntese e o remodelamento dos polissacarídeos da parede celular são essenciais para o crescimento do fungo e proteínas glicosilfosfatidilinositol (GPI)-ancoradas estão envolvidas nesses processos. As enzimas da família glicanosiltransferase alongando glicana (GEL) são proteínas GPI-ancoradas que possuem atividade de beta-1,3-glicanosiltransferase e desempenham um importante papel nas ligações cruzadas dos componentes da parede celular em fungos. O genoma de P. brasiliensis possui 3 genes codificantes para beta-1,3-glicanosiltransferases (Gel1p, Gel2p e Gel3p). Com o objetivo de se buscar outras possíveis funções da beta- 1,3-glicanosiltransferase 3 (PbGel3p) em P. brasiliensis, as interações entre essa proteína e outras proteínas do fungo foram investigadas através do sistema de duplohíbrido em Saccharomyces cerevisiae e do ensaio de pull-down. O sistema duplohíbrido permite o estudo das interações in vivo e, através dele, foram identificadas 8 proteínas que interagem com PbGel3p. A interação com a fosfatidilinositol-4-fosfato 5- quinase its3 e com a Dsk1 proteína quinase sugere a participação de PbGel3p no ciclo de divisão celular. A RNA helicase Dbp5p, cuja interação com PbGel3p foi confirmada in vitro através do ensaio de coimunoprecipitação, e a 5'-3' exoribonuclease estão envolvidas no metabolismo de RNAm, sugerindo uma função para PbGel3p nesse processo. A interação entre PbGel3p e a enzima serina esterase/lipase, que participa da via de biossíntese da âncora GPI, também foi confirmada por coimunoprecipitação. PbGel3p interage com o fator de transcrição Ctf1Bp e enzima 3-oxoacil redutase, fato que sugere seu envolvimento no metabolismo de lipídeos de P. brasiliensis. A interação com a proteína de resistência à leptomicina B Pmd1p sugere um papel para PbGel3p na resposta à agentes antifúngicos. O ensaio de pull-down in vitro resultou na identificação da proteína de choque térmico de 70 kDa de P. brasiliensis. A interação com essa proteína sugere que PbGel3p pode atuar na resposta à condições de estresse, como o aumento de temperatura. Com base nesses dados, estudos funcionais devem ser realizados para confirmar a multifuncionalidade de Gel3p em P. brasiliensis.

Lentilhas d´água são as menores angiospermas aquáticas monocotiledôneas, as quais são classificadas em duas subfamílias (Lemnoideae e Wolffioideae) que contemplam trinta e sete espécies representando cinco gêneros: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffiella e Wolffia (APPENROTH; BORISJUK; LAM, 2013; BORISJUK et al ., 2015; FAO, 1999; LANDOLT, 1992, LES et al ., 2002). Essas plantas apresentam rápida reprodução vegetativa o que implica no acúmulo acelerado de carboidratos e proteínas, que por sua vez, confere uma enorme aplicação industrial e biotecnológica, especialmente na bioenergia (APPENROTH; BORISJUK; LAM, 2013; FAO, 1999). O balanço de carbono no crescimento relaciona-se com à assimilação fotossintética, armazenamento e consumo desses compostos, que são influenciados pela intensidade de luz (SMITH; STITT, 2007; STITT; ZEEMAN, 2012). O maior dreno de carbono assimilado é para a síntese de parede celular e sacarose, portanto, conhecendo a composição dos polissacarídeos e suas interações junto com o conteúdo de carboidratos não estruturais impacta a produção de combustíveis alternativos. O presente trabalho visou quantificar e analisar os carboidratos estruturais (açúcares de parede celular apiose, arabinose, fucose, ramnose, glicose, xilose, galactose e manose) e não estruturais (açúcares solúveis e de armazenamento sacarose, frutose, rafinose, glicose e amido) de três espécies de Lemnoideae e duas Wolffioideae comparando com as taxas de crescimento dessas plantas. / Duckweeds are the smallest aquatic monocots classified in two subfamilies (Lemnoideae and Wolffioideae) that contemplates thirty-seven species representing five genera: Spirodela, Lemna, Landoltia, Wolffia and Wolffiella . These plants display fast vegetative reproduction, which implies a rapid accumulation of carbohydrates and protein, conferring them biotechnological and industrial applications, especially in bioenergy. Carbon balance among growth is related to photosynthetic assimilation, storage, and consume of compounds which are influenced by light intensity. The major sink of the carbon assimilated is to cell wall and sucrose synthesis, thereby knowing the polysaccharides composition and their interactions together with the non-structural carbohydrates content may impact the alternative fuels production. The present work aimed to quantify and comparative analyze structural (cell wall sugars apiose, arabinose, fucose, rhamnose, glucose, xylose, galactose, and mannose) and nonstructural (storage and soluble sugars starch, sucrose, glucose, raffinose, and fructose) carbohydrates of three Lemnoideae and two Wolffioideae species correlating to its growth rates.

This study provides information to support the use of plant cell wall, from sugarcane bagasse, to produce cellulosic ethanol. Therewith, cell wall proteins from sugarcane cells cultures, leaves and culms were identified. To do so, different protocols were used. Using two-month-old leaves and culms, the extractions were performed using a destructive method, based on griding the tissues, submitting them to a growing gradient of succrose and centrifugation, being the cell wall extract later isolated by washing on a nylon net. After that, the cell wall proteins were extracted using two salts, 0,2 M CaCl2 and 2 M LiCl. Using cultured cells, a similar protocol was used, but it had a previous step of separation of the cell wall through grinding and precipitation in glycerol 15%. Using culms of the same age, a nondestructive protocol was tested based on vacuum infiltration of the tissues in the same salts already described, 0,2 M CaCl2 and 2 M LiCl, and posterior centrifugation. Two replicates were used from two-month-old plants and three in the case of suspension cells. The complex samples were digested, fractionated and sequenced through mass spectrometry, using SYNAPT G2HDMS coupled to nanoACQUITY, both from Waters. Peptides were processed using ProteinLynx 2.5 Global Server against sugarcane translated-EST database. Using bioinformatic programs, such as Blast2GO, it was possible to find the annotation and classification of similar proteins. Only proteins equally found in all repetitions were considered in the main analysis. SignalP, WolfPSORT, TargetP, TMHMM and Predotar were used to predict the subcellular location, both from ESTs and blasted proteins, and only the proteins predicted to be secreted in two or more programs were considered as cell wall proteins. Altogether, 157 different SAS related to sugarcane cell wall were found. Among these, 101 different cell wall proteins were characterized from eight functional classes. The method based on vacuum infiltration seems to be the most efficient one, since it had almost half, 48,84% of the proteins predicted to be secreted, which is a good percentage when comparing to other studies. From secreted proteins most of them were related to lipid metabolism, as lipid-transfer proteins, oxido-reductases, such as peroxidases, cell wall modifying enzymes, like glycoside-hydrolases, proteases, proteins with interacting domains, signaling proteins and several others. Results are in agreement with the expected role of the extracellular matrix in polysaccharide metabolism and signaling phenomena. Therefore, this work provided valuable information about sugarcane cell wall that can lead to future studies to enhance cellulosic ethanol production. / Este estudo fornece informação para auxiliar o uso da parede celular vegetal, a partir do bagaço de cana, para a produção de etanol celulósico. Com isso, as proteínas da parede celular de folhas, colmos e células em suspensão foram identificadas. Para isso, foram utilizados diferentes protocolos. Utilizando folhas e colmos de cana-de-açúcar de dois meses de idade, as extracções foram realizadas por meio de método destrutivo, com base na trituração dos tecidos, submetendo-os a gradiente crescente de sacarose e centrifugação, sendo a parede da célula extraída e depois isolada por lavagem sobre uma rede de nylon. Depois disso, as proteínas de parede celular foram extraídas utilizando dois sais, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl. Para células em suspensão, um protocolo semelhante foi utilizado, contendo, no entanto, um passo anterior de separação da parede celular por meio de maceração e precipitação em glicerol 15%. Usando colmos da mesma idade, dois meses, um protocolo não destrutivo foi testado com base na infiltração a vácuo dos tecidos nos mesmos sais já descritos, 0,2 M de CaCl2 e 2 M de LiCl, e posterior centrifugação. Duas repetições foram usadas nos experimentos com plantas de dois meses de idade, e três, no caso de células em suspensão. As amostras complexas foram digeridas, fracionadas e seqüenciadas por espectrometria de massas, utilizando o equipamento SYNAPT G2HDMS acoplado ao cromatógrafo nanoACQUITY, ambos da Waters. Os peptídeos foram processadas utilizando ProteinLynx 2,5 comparando com a base de dados de ESTs traduzidos da cana. Utilizando programas de bioinformática, como Blast2GO, foi possível encontrar a anotação e classificação de proteínas semelhantes. Apenas proteínas igualmente encontradas em todas as repetições foram consideradas na análise principal. SignalP, WolfPSORT, TargetP, TMHMM e Predotar foram softwares utilizados para prever a localização subcelular, tanto para ESTs como proteínas, e apenas as proteínas preditas para serem secretadas por dois ou mais programas foram consideradas como proteínas de parede celular. Ao todo, 157 SAS diferentes relacionados à parede celular da cana foram encontrados. Dentre eles, 101 diferentes proteínas de parede foram caracterizadas em oito classes funcionais. O método baseado na infiltração a vácuo mostrou-se o mais eficiente, uma vez que apresentou quase metade, 48,84%, das proteínas preditas para serem secretadas, o que é um bom valor quando comparado com outros estudos. A maioria das proteínas secretadas estava relacionada com o metabolismo lipídico, como proteínas de transporte de lípidos, oxido-redutases, tais como peroxidases, enzimas modificadoras da parede, como as glicosil-hidrolases, proteases, proteínas com domínios de interação, proteínas sinalizadoras, entre outras. Os resultados estão de acordo com o papel que se espera da matriz extracelular no metabolismo de polissacarídeos e fenômenos de sinalização. Portanto, este trabalho forneceu informações valiosas sobre a parede celular da cana, tornando possível a utilização desses dados em futuros estudos para otimizar a produção de etanol celulósico.

Fitoplasmas são organismos procarióticos desprovidos de parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios de floema e patogênicos às plantas. Numerosas doenças associadas a este tipo de agentes patogênicos têm sido frequentemente relatadas em espécies cultivadas e plantas daninhas. No presente estudo, sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, tais como clorose e avermelhamento foliar, redução no tamanho das folhas, diminuição dos órgãos florais, superbrotamento de ramos e declínio da planta, foram observados em pomares de fruteiras de caroço como pessegueiro e nectarineira. Além disto, em campos de couve-flor, plantas daninhas conhecidas como mostarda-do-campo também manifestaram sintomas que pareciam ter sido provocados por fitoplamas, expressados por superbrotamento de ramos finos e redução no tamanho de folhas e flores. Assim, o presente trabalho teve por objetivos detectar, identificar e classificar a nível molecular os possíveis fitoplasmas associados às plantas sintomáticas citadas anteriormente, utilizando as técnicas de PCR, análise de RFLP virtual e o método de classificação on-line denominado de iPhyclassifier. Para tanto, o DNA das amostras das fruteiras de caroço e da erva daninha foi extraído com o auxílio de um kit comercial ou através do protocolo 2X CTAB. A detecção dos fitoplasmas foi conduzida por duplo PCR com os primers universais R16mF2/mR1 e SN910601/SN011119 na primeira reação e com o par R16F2n/R2 na segunda reação. Para a mostarda, a identificação dos fitoplasmas também foi realizada através de duplo PCR com os primers e R16(III)F2/R16(III)R1 específicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII. A aplicação de PCR com primers universais permitiu a detecção consistente desses agentes nos tecidos das plantas sintomáticas de pessegueiro, nectarineira e mostarda-do-campo pela amplificação de um fragmento genômico de 1250 pb, correspondente ao gene 16S rRNA. Para todos os hospedeiros analisados, os produtos amplificados por duplo PCR com os primers universais foram purificados, clonados em Escherichia coli e submetidos ao sequenciamento. A análise de RFLP virtual e iPhyclassifier permitiram classificar os fitoplasmas encontrados em mostarda nos grupos 16SrIII e 16SrVII. Os fitoplasmas detectados na mostarda-do-campo, foram definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrIII-B, 16SrIII-J e 16SrIII-U e 16SrVII-B. Em relação aos fitoplasmas encontrados no pessegueiro e nectarineira, foi possível classificar os fitoplasmas nos grupos 16SrI e 16SrIII, sendo definitivamente classificados como representantes dos subgrupos 16SrI-B em pessegueiro, e em nectarineira, classificados em 16SrI-B e 16SrIII-J. / Phytoplasmas are prokaryotic organisms devoid of cell wall, obligate intracellular phloem parasites and pathogenic to plants. Numerous diseases associated with this type of pathogen have been frequently reported in cultivated species of plants and weeds. In this present study, symptoms typically induced by phytoplasmas, such a yellowing an reddeling leaves, small leaves and flowers, \"witches\' broom\" appearance on terminal new bud growth, and death in plants, were observed in orchards of stone fruit trees such as peach and nectarines. In addition, in fields of cauliflower, weeds known as mustard-field also exhibited symptoms that appeared to have been caused by phytoplasmas, expressed by thin branches and reduced leaf and flower size. The objective of this present study was to detect, identify and classify at molecular level the phytoplasmas possibly associated with the symptomatic plants. PCR techniques, virtual RFLP analysis and the online method known as iPhyclassifier were used. Total DNA was extracted using a commercial kit or through the CTAB protocol. The detection of phytoplasmas was conducted by nested PCR with the universal primers R16mF2/mR1 and SN910601/SN011119 in the first reaction and R16F2n/R2 pair in the second reaction. For mustard-field, the identification of the phytoplasmas was also performed through nested PCR with the primers R16(III) F2/R16(III) R1, which are specific to detection of 16SrIII group phytoplasmas. The application of PCR with universal primers allowed the consistent detection of these agents in the tissues in symptomatic plants of peach, nectarine and mustard-field by the amplification of a 1250 bp genomic fragment, corresponding to the 16S rRNA gene. For all hosts analyzed, the products amplified by nested PCR with the universal primers were purified, cloned in Escherichia coli and sequenced. The analysis of virtual RFLP and iPhyclassifier allowed to classify the phytoplasmas found in mustard in the 16SrIII and 16SrVII groups. The phytoplasmas detected in mustard-field were definitively classified as representatives of the subgroups 16SrIII-B, 16SrIII-J and 16SrIII-U and 16SrVII-B. The phytoplasmas found in the peach and nectarine were classified within the 16SrI and 16SrIII groups, as representatives of the subgroups 16SrI-B for peach and 16SrI-B and 16SrIII-J for nectarine.

Atualmente há o reconhecimento de que critérios de seleção que favorecem a produção de grãos podem ser indesejáveis para o valor nutricional de silagens de milho. Híbridos de milho para silagem devem maturar mais lentamente com declínio gradual da umidade da planta, ter grãos macios e colmo com alta digestibilidade da fibra. Assim, objetivou-se avaliar o efeito da idade de corte sobre a qualidade nutricional do colmo de genótipos de milho, permitindo a seleção de materiais de melhor qualidade, com o intuito de definir critérios de seleção em programas de melhoramento de híbridos de milho para ensilagem que visem o aumento da digestibilidade da fibra do colmo. Objetivou-se ainda a classificação dos genótipos em grupos de acordo com suas características produtivas e de qualidade nutricional. Foram avaliados 15 híbridos de milho do programa de melhoramento do Instituto Agronômico de Campinas, em ensaio sob delineamento de blocos ao acaso, com três repetições, colhidos com 90, 120 e 150 dias após a germinação. O 4º e 5º internódios do colmo, acima do solo, foram retirados para determinação da composição bromatológica e digestibilidade in vitro. Houve queda no teor de fibra e aumento na concentração de lignina com avanço da maturidade, em ambos os internódios. Houve aumento na digestibilidade da MS do 5º internódio com o avanço da maturidade, enquanto que não houve efeito sobre o 4º internódio. Ocorreu redução na digestibilidade da fibra do 4º internódio com o avanço da maturidade, enquanto que não houve efeito sobre o 5º internódio. A digestibilidade da fibra do 4º internódio foi negativamente correlacionada com a lignificação, enquanto que esta correlação foi inexistente no 5º internódio, indicando que o 4º internódio do colmo pode ser utilizado como indicador da queda de digestibilidade da fibra da haste de híbridos de milho que ocorre com o avanço da maturidade. Verificou-se entre os 15 genótipos nas três idades de corte, grande variabilidade genética para os parâmetros de qualidade, o que realça a necessidade de seleção criteriosa do material a ser utilizado para silagem e a possibilidade de implantação de programas de melhoramento genético voltados para qualidade nutricional de híbridos de milho para silagem. / Nowadays there is the recognition that selection criteria that favors grain production can be undesirable for nutritional value of corn silages. Corn hybrids for silage should mature slower with gradual decline of plant moisture, have softer grains and stalk with high fiber digestibility. Therefore, it was our objective to evaluate the effect of age of harvest on the stalk nutritional quality of corn hybrids, aiming to define selection criteria in breeding programs focused on improving the stalk fiber digestibility. It was still our objective the classification of genotypes in groups according to their production and nutritional qualities. Fifteen hybrids from the Instituto Agronômico de Campinas breeding program were evaluated in a random block design with three repetitions, harvested with 90, 120 and 150 days after germination. The 4th and 5th above soil stalk internodes were removed to determination of chemical composition and in vitro digestibility. The fiber content decreased and lignin content increased with advanced maturity, in both internodes. The DM digestibility of the 5th internode increased with maturity, while there was no change in the 4th internode. The fiber digestibility of the 4th internode was reduced with advanced maturity while there was no effect on the 5th internode. Fiber digestibility of the 4th internode was negatively correlated with lignifications, while this correlation was inexistent for the 5th internode, indicating that the 4th internode could be used as an indicator of the decrease in stalk fiber digestibility that occurs with advanced maturity of corn hybrids. There was great genetic variability among the 15 genotypes in the three stages of maturity for the quality parameters, highlighting the necessity of careful selection of the material to be used for silage production and the possibility of implementing breeding programs focused on improving the nutritional quality of corn hybrids for silage.

O presente trabalho visa compreender o processo de degradação da parede celular vegetal de hospedeiros de fitopatógenos da família Xanthomonadaceae. Criamos e aperfeiçoamos uma técnica de enumeração dos genes relacionados ao metabolismo de polissacarídeos, com enfoque na distinção entre aqueles que agem sobre os componentes da parede celular vegetal e sobre outros polissacarídeos. A história evolutiva desse conjunto de enzimas foi delineada através de inferências sobre as relações de homologia entre os genes enumerados, sua presença ou ausência nos diversos genomas abordados e comparação das taxas de mutação entre grupos de homólogos. Além disso, procuramos também, com essa etapa de bioinformática e a etapa seguinte, incrementar a anotação desses genes, muitos descritos como hipotéticos ou com vaga definição de sua função. Na segunda parte do desenvolvimento do projeto foram feitos experimentos de expressão heteróloga e verificação da atividade enzimática para validação da anotação de alguns dos genes identificados. / This study aims to understand the process of degradation of host plant cell walls by plant pathogens of the Xanthomonadaceae family. We created and perfected a technique for enumeration of genes related to the metabolism of polysaccharides, focusing on the distinction between those who act on components of plant cell wall and on other polysaccharides. The evolutionary history of this group of enzymes has been outlined through inferences about the relations of homology between the genes listed, their presence or absence in different genomes and comparison of mutation rates between groups of homologues. Moreover, we also attempted with this bioinformatics step and the next step, to enhance the annotation of these genes, many described as hypothetical or vague in the determination of its function. In the second part of the project development heterologous expression and enzymatic activity assays were made to validate the annotation of some of the genes identified.

Os estudos com traqueídes vasculares em Caryophyllales têm focalizado questões filogenéticas e funcionais. Embora sejam descritas como traqueídes, com espessamento da parede secundária superior a 2µm, o relato de WBTs em diferentes tecidos em outras famílias evidencia que a definição dessas células não está bem estabelecida. O objetivo deste trabalho é compreender a ontogenia das traqueídes vasculares de Pilosocereus aurisetus (cacto colunar), descrevendo a sua estrutura em nível celular e bioquímico, bem como suas implicações funcionais e evolutivas. Para isso foi descrita a ontogênese, como base para o estudo de composição de parede, e anticorpos foram utilizados para melhor entendimento das moléculas de relevância funcional. Além disso, uma revisão anatômica que sintetiza o conhecimento atual sobre ocorrência das WBT, polimorfismo do lenho e diversidade de hábitos foi inserida em um contexto filogenético, a fim de esclarecer o papel do polimorfismo do lenho na evolução de Cactoideae. Plântulas foram incluídas em parafina para obtenção de cortes seriados, analisados em microscopia óptica e confocal. A análise de composição de parede celular foi feita com tecido xilemático de plântulas, cujos polissacarídeos foram sujeitos a hidrólise ácida, seguida de análise em cromatografia. Na imunolocalização foram utilizados os anticorpos anti-galactano LM5 e anti-arabinano LM6, para pectinas, e anti-manano, para hemiceluloses. Dados sobre a presença de traqueídes vasculares e do tipo de lenho em Cactaceae foram coletados da literatura e mapeados em uma filogenia robusta. A grande proporção de parede primária, associada à deposição de galactano, permite a função de armazenamento de água. Além disso, o aumento de parede secundária associada à deposição de manano na base, sugere função de sustentação nesta região, ainda que, somente a formação do lenho fibroso pareça fornecer o suporte necessário para que um cacto colunar atinja a altura de um adulto. Tal processo parece ter sido a predisposição anatômica crucial para a evolução dos cactos colunares. O presente estudo fornece um panorama amplo e novas evidências sobre a origem e função das traqueídes vasculares de Cactaceae. / Studies with wide-band tracheids have adressed phylogenetic and functional questions. Although these cells have been described as tracheids, with secondary cell walls thicker than 2µm, their recent register in different tissues of other families has pointed out that this definition may not be well established. The aim of the present study is to understand the ontogeny of the wide-band tracheids in Pilosocereus aurisetus (a columnar cactus), describing their structure at both celular and biochemical levels, and to investigate their possible functional and evolutionary implications for the Cactoideae as a whole. Therefore, Pilosocereus aurisetus ontogeny was studied as basis to cell wall composition analyses. Such analyses involved the use of antibodies and the identification of molecules of functional relevance. Furthermore, an anatomical review that summarizes the current knowledge about wide-band tracheid occurrence, wood polymorphism, and habit diversity was analyzed within a phylogenetic framework to investigate the role of polymorphic wood in Cactoideae evolution. Seedlings were embedded in paraffin, and the resulting sections were analyzed in optical and confocal microscopy. Studying the cell wall composition in seedling xylem involved the use of acid hydrolization of polysaccharides followed by chromatography analysis. The antibodies used for imunocitolocalization were anti-galactan LM5 and anti-arabinan LM6, for pectins, and anti-mannan, for hemicelluloses. Data about wide-band tracheids occurrence and wood polymorphism in Cactaceae were collected from the literature and mapped in a robust phylogeny for the subfamily. The prevalent proportion of primary cell wall with galactan suggests a water storage function for the wide-band tracheids. Furthermore, the rise of secondary cell wall deposition, and the high concentration of mannan in the cactus base suggest a sustaining function for this region. However, the fibrous wood development alone seems to provide enough support to sustain a mature columnar cactus. Such process may have been the most important anatomical prerequisite in the evolution of columnar cacti. The present study offers an overview and new evidences for the origin and function of wide-band tracheids.

Para quantificar o teor de lignina em alguns cultivares de aveia, foi utilizado o método espectrofotométrico "lignina solúvel em brometo de acetila – LSBA", onde a lignina é solubilizada em uma solução a 25% de brometo de acetila em ácido acético glacial e em seguida sua absorbância lida a 280 nm; como padrão de referência foi utilizada a lignina extraída da aveia através de uma solução ácida de dioxana. A quantificação da lignina foi realizada em oito cultivares de aveia, nas frações planta inteira, caule e folha, em três estádios de maturidade (45, 55 e 65 dias de idade). Os resultados obtidos foram comparados com três métodos gravimétricos: lignina detergente ácido (LDA), lignina permanganato de potássio (LPer) e lignina Klason (LK). Os quatro métodos estudados mostraram teores de lignina diferentes entre si. Os resultados de LSBA foram superiores para quase todos os cultivares, ocorrendo o inverso para a LDA. Houve uma pequena diferença em relação aos dias de corte, com dados superiores para LSBA, onde o caule apresentou maior variação em relação às demais frações. As curvas de regressão e os espectrogramas indicaram presença de diferenças qualitativas entre as ligninas provenientes da aveia forrageira nos diferentes estádios de maturidade. / To quantify lignin content in some varieties of oat, it was employed the spectrophotometric method acetyl bromide soluble lignin – ABSL where lignin is dissolved into a 25% acetyl bromide solution in glacial acetic acid and its absorbance read at 280 nm; as a standard it was employed a, lignin extracted by mild acidic dioxane solution from the same sample. Lignin quantification was evaluated in eight oat cultivars, divided in three vegetable parts (whole plant, stem and leaf), and three different maturity stages (cuts at 45, 55 and 65 days). Obtained results were compared with three gravimetric methods: acid detergent lignin (ADL), potassium permanganate lignin (PerL) and Klason lignin (KL). All four methodologies yielded different results. Overall, ABSL yielded highest values whereas ADL yielded the lowest ones. There was a slight difference related to maturity, with higher values for ABSL, where stem fraction showed higher variation when comparing to the two other vegetable parts. Regression equations and espectrograms indicated the presence of qualitative differences between lignins from at distinct maturity stages.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-01-20T14:43:57Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-20T14:44:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-20T14:44:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle Silva Araújo - 2014.pdf: 3446735 bytes, checksum: 4f2dc4a0223fe6a9d4d23c00cba6af45 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the important systemic mycosis in Latin America, with high incidence in Brazil, Argentina, Colombia and Venezuela. The disease has been attributed to the thermodimorphic fungus Paracoccidioides sp.. During the infective process, we can highlight the role of the cell wall, which is a dynamic structure, vital for growth, survival and morphogenesis of the fungus. In addition, this structure is constantly changing in response to environmental signals and different stages of the cycle of the fungus. The interest in the fungal cell wall occurs primarily by lack of this structure in mammalian cells; for this reason cell wall components are promising targets for antifungal drug design. In order to describe the profile of cell wall proteins (CWPs) of Paracoccidioides sp., it was used a proteomic approach coupling nanoscale liquid chromatography to multiplexed mass spectrometry (nanoUPLC-MSE) to identify the CWPs isolated from Paracoccidioides sp. yeast cells and mycelia. Among the identified proteins, it was found a transglycosylase orthologue to the Crh1p, which is a GPI anchored protein, known to be involved in attaching chitin to β-glucan. Adhesins previously described in Paracoccidioides sp. such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate, alcohol dehydrogenase, fructose-1,6-biphosphate aldose and some chaperones were also identified. Moreover, we identified formamidase that was previously described as localized in the fungus cell wall and may be involved in nitrogen metabolism besides contributing with antigenic properties. / Paracoccidioidomicose é uma importante micose sistêmica na América latina, com alta incidência no Brasil, Argentina, Colômbia e Venezuela. A doença é atribuída ao fungo termodimórfico Paracoccidioides spp.. Durante o processo infecioso podemos destacar o papel desempenhado pela parede celular, estrutura esta, vital para o crescimento, sobrevivência, e morfogênese do fungo, a qual está em constante mudança em resposta a sinais do ambiente. O interesse no estudo da parede celular de fungos ocorre principalmente pela ausência dessa estrutura nas células de mamíferos; por esse motivo os componentes da parede são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas. Para descrever o perfil das proteínas constituintes da parede celular (PPCs) de Paracoccidioides sp. nas formas leveduriforme e miceliana, foi utilizada uma abordagem proteômica combinando cromatografia líquida em nanoescala com espectrometria de massas multiplexada (nanoUPLC-MSE). Entre as proteínas identificadas foi encontrada uma transglicosidase, homologa a Crh1p, correspondendo a uma proteína GPI ancorada, conhecida por estar envolvida em ligar quitina à β-glucana. Adesinas anteriormente descritas em Paracoccidioides sp. como enolase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, álcool desidrogenase, frutose-1,6-bifosfato aldolase e algumas chaperonas também foram identificadas. Além disso, nós identificamos a formamidase que tem sido descrita como localizada na parede celular e pode estar envolvida no metabolismo de nitrogênio, além de contribuir com propriedades antigênicas.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-30T12:45:52Z No. of bitstreams: 2 Philippsen, Hellen Kempfer-2011-dissertação.pdf: 1457910 bytes, checksum: 4ee585b7a28a164d44414a0a2ef76ae5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-30T15:28:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Philippsen, Hellen Kempfer-2011-dissertação.pdf: 1457910 bytes, checksum: 4ee585b7a28a164d44414a0a2ef76ae5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-30T15:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Philippsen, Hellen Kempfer-2011-dissertação.pdf: 1457910 bytes, checksum: 4ee585b7a28a164d44414a0a2ef76ae5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-08-30 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus, the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis that affects mainly people from Latin America. In order to establish infection, many factors are required for P. brasiliensis, such as cell wall remodeling and the ability to capture nutrients from the host. As iron is an important cofactor of many reactions, the host reduces the availability of free iron ions to the pathogen. Therefore, this study aims to elucidate the proteomic profile of the cell wall in response to iron depletion. The extraction of surface proteins of the cell wall in iron restriction and iron replete conditions was performed and the proteomic profile was obtained by two-dimensional electrophoresis with subsequent analysis of images. Statistical analysis demonstrated proteins with differential level of expression in each condition, which were subjected to tryptic digestion and identification by mass spectrometry. It was identified 26 proteins by peptide mass fingerprint (PMF) and/or ions fragmentation (MS/MS). The majority of these proteins have post - translational modifications and only some have in their sequences signal peptide, suggesting that they are addressed to the surface by non-classical pathways. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo patogênico termodimórfico, agente causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica que afeta principalmente indivíduos da América Latina. Muitos fatores são necessários para que P. brasiliensis estabeleça infecção, como o remodelamento da parede celular e a capacidade de captar nutrientes do hospedeiro para seu metabolismo. Como o íon ferro é um cofator de diversas reações, o hospedeiro diminui a disponibilidade de íons ferro na forma livre para o patógeno. Portanto, o presente trabalho visa investigar o perfil de proteínas da parede celular de P. brasiliensis quando em condição de depleção do íon ferro. Para esse fim, realizou-se a extração das proteínas da parede das células de P. brasiliensis em meio com restrição do íon ferro. O perfil proteômico das condições experimental e controle foram obtidos por eletroforese bidimensional com posterior análise de imagens. Análises estatísticas demonstraram as proteínas reguladas nas condições de depleção de ferro, que foram submetidas à digestão tríptica e identificação por espectrometria de massas. Foram identificadas 26 proteínas por perfil de digestão tríptica (PMF) e/ou perfil de fragmentação dos íons (MS/MS). A maioria dessas proteínas apresenta preditas modificações pós - traducionais e apenas algumas apresentam peptídeo sinal em suas sequências, o que sugere que elas são endereçadas à superfície por vias não clássicas.