Os fitoplasmas são organismos procariotos sem parede celular, que habitam as células do floema das plantas e são transmitidos, principalmente, por cigarrinhas sugadoras de floema. Este patógeno é responsável por causar doenças em diversas espécies vegetais, provocando a expressão de diversos sintomas, entre os quais podem ser destacados a redução do tamanho foliar, amarelecimento das folhas, superbrotamento de ramos e enfezamento da planta hospedeira. Entre os anos de 2013 e 2014, plantas de três espécies vegetais com sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas foram observadas no estado de São Paulo. O DNA total foi extraído a partir de plantas de couve-flor com sintomas de nanismo, malformação da inflorescência e necrose dos vasos do floema; de plantas da ornamental conhecida por árvore-da-felicidade com sintomas amarelecimento e redução do limbo foliar; e de plantas de Alho-poró com sintomas de enfezamento. Por meio do teste de PCR conduzido em sua maioria com os primers P1A/16S-SR foi possível detectar fitoplasmas nas três espécies vegetais testadas. Os fragmentos genômicos correspondentes ao 16S rRNA dos fitoplasmas foram sequenciados e identificados. Nas plantas de couve-flor e da árvore-da-felicidade foram identificados fitoplasmas afilados ao grupo 16SrVII-B, através da análise virtual de RFLP, cálculo do coeficientes de similaridade (F) e análise filogenética. Para ambas as espécies, este é o primeiro relato da ocorrência de representantes deste grupo, nas condições brasileiras. Nas plantas de Alho-poró foram identificados fitoplasmas afiliados ao subgrupo 16SrIII-J e ao grupo 16SrXIII, com base na análise dos genes 16S rRNA, SecY e proteína ribossomal, conduzidas através de análise virtual de RFLP, valores de coeficientes de similaridade e análise filogenética. Para o fitoplasma membro do grupo 16SrXIII foram identificadas quatro estirpes, uma delas afiliada ao subgrupo 16SrXIII-E e as demais como prováveis representantes de novos subgrupos. O presente estudo se constitui em uma contribuição ao conhecimento de novos patossistemas envolvendo fitoplasmas, bem como à caracterização molecular de fitoplasmas baseadas em diferentes genes marcadores, atualmente usados para a classificação de representantes deste grupo emergente de agentes causais de doenças de plantas. / The phytoplasmas are prokaryotic organisms without cell walls, which inhabit the phloem cells of plants and are transmitted mainly by leafhoppers sucking the phloem. This pathogen is responsible for causing diseases in various plant species, leading to expression of many symptoms, among which can be highlighted the reduction of leaf size, leaf yellowing, shoots proliferation and stunting of the plant host. Between the years 2013 and 2014, three plant species with characteristic symptoms of infection caused by phytoplasma were observed in São Paulo. Total DNA was extracted from cauliflower plants with symptoms of stunting, malformation of the inflorescence and necrosis of the phloem; ornamental plants known for Ming Aralia with symptoms yellowing and little leaves; and leek plants with symptoms of stunting. Through the PCR test conducted mostly with the primers P1A/16S-SR was possible to detect phytoplasmas in the three species of plants. The genomic fragments corresponding of 16S rRNA gene of the phytoplasma were sequenced and identified. In plants of cauliflower and Ming Aralia were identified phytoplasmas belonging to 16SrVII-B group through virtual RFLP analysis, calculation of similarity coefficients (F) and phylogenetic analysis. For both species, this is the first report of the occurrence of representatives of this group, in Brazilian conditions. In leek plants were identified phytoplasmas affiliated with 16SrIII-J subgroup, and the 16SrXIII group, based on the analysis of the 16S rRNA, SecY and ribosomal protein genes, conducted through virtual analysis of RFLP, similarity coefficient values and phylogenetic analysis. For the phytoplasma member of group 16SrXIII were identified four strains, one affiliated with 16SrXIII-E subgroup and the others as probable representatives of new subgroups. This study constitutes a contribution to knowledge of new pathosystems involving phytoplasmas and the molecular characterization of phytoplasma based on different marker genes, currently used for the classification of representatives of this emerging group of plant pathogens.

Embora o cultivo de tomate seja muito antigo e amplamente distribuído, ainda enfrenta desafios para o melhoramento dos níveis de produção e, da qualidade para o processamento e consumo fresco. A grande maioria das características de interesse agronômico está determinada por loci de caracteres quantitativos (QTL), dificultando ainda mais a identificação e transferência gênica. Diversas características tornam o tomateiro um bom modelo para estudos de dissecação dos determinantes genéticos de QTL. Primeiro, a disponibilidade de fontes de germoplasma selvagens ainda inexploradas que podem aumentar a variabilidade genética, somada à possibilidade de cruzamento entre espécies não simpátricas e à autogamia. Segundo, a grande quantidade de informação genética como mapas, coleções de ESTs, QTL, e populações de mapeamento. Terceiro, o genoma de S. lycopersicum está completamente sequenciado. Por fim, devido a suas diferenças morfogenéticas em relação à espécie modelo Arabidopsis thaliana, o tomate se torna uma alternativa para estudos de eudicotiledonias, principalmente em estudos relacionadas a metabolismo de frutos carnosos. A partir da abundante plataforma de dados disponível e por meio de ferramentas de genômica, e genética reversa, este trabalho aborda o estudo de duas regiões do genoma do tomateiro envolvidas no metabolismo de aminoácidos e na determinação da estrutura da parede celular. O estudo de genômica comparativa de uma região do cromossomo 7 permitiu revelar a perfeita sintenia existente entre S. lycopersicum e a espécies selvagem S. pennellii e estimar o tempo de divergência em 2,7 MAA. Complementarmente, foi possível determinar que as diferenças fenotípicas entre as espécies são maiormente devidas a mudanças nas regiões regulatórias e à presença de SNPs. O estudo funcional do gene LFP (Low Free Putrescine) permitiu caracterizar uma proteína plastidial, até o momento desconhecida em tomateiro, que participa do metabolismo de poliaminas. O silenciamento de LFP resultou na redução da disponibilidade de putrescina livre e no aumento da biomassa vegetativa. Por outro lado, os resultados obtidos do estudo do gene GAUT4 (galacturonosiltransferase 4) demonstraram que a enzima codificada se localiza em Golgi e participa do metabolismo das pectinas. Em frutos, a redução dos níveis de GAUT4 resultou na diminuição de pectina e na alteração da sua composição, porém estes se apresentaram mais firmes. Adicionalmente, o silenciamento do gene GAUT4 modificou o particionamento de açúcares provocando o aumento de massa vegetativa em detrimento do índice de colheita, revelando assim um mecanismo regulatório que comunica o metabolismo da parede celular ao controle da relação fonte-dreno. Desta forma, os resultados obtidos aportam dados fundamentais para a melhor compreensão de caracteres de interesse agronômico, assim como de processos fisiológicos complexos e pouco explorados até o momento no tomateiro / Although tomato is an old and widely distributed culture, it still faces challenges to improve production levels and quality for processing and consumption. The vast majority of agronomical important characteristics are determine by quantitative trait loci (QTL), further hindering the gene identification and transfer. Several features make tomato a good model for studying the genetic determinants underneath QTL. First, the availability of unexploited sources of wild germplasm that can increase genetic variability, coupled with the possibility of interbreeding between no sympatric species and autogamy. Second, the large amount of available genetic information as maps, EST collections, QTL, and an extensive collection of mapping populations. Third, the genome of S. lycopersicum is completely sequenced. Finally, due to their morphogenetic differences in relation to model species Arabidopsis thaliana, tomato becomes an alternative to eudicotyledons studies, especially in studies related to fleshy fruits metabolism. From the abundant data platform available and by means of genomic tools, and reverse genetics, this work addresses the study of two tomato genomic regions involved in amino acids and cell wall metabolisms. The comparative genomic study in a region of chromosome 7 has revealed the perfect synteny between S. lycopersicum and the wild species S. pennellii, and estimated the time of divergence between both species in 2.7 MYA. Additionally, it was possible to determine that the phenotypic differences between species are mostly due to changes in regulatory regions and the presence of SNPs. The functional study of LFP gene (Low Free Putrescine) allowed us to characterize a plastid protein, yet unknown in tomato, which participates in the metabolism of polyamines. The LFP silencing resulted in reduced availability of free putrescine and increased vegetative biomass. Furthermore, the functional characterization of the GAUT4 (galacturonosyltransferase 4) gene demonstrated that the encoded enzyme is located in the Golgi apparatus and participates in the pectin metabolism. In fruits, the reduced levels of GAUT4 resulted in decreased pectin and in the change of its composition. Additionally, GAUT4 gene silencing modified sugars partitioning leading to an increased vegetative biomass together with a drastic reduction of the harvest index. Thus, revealing a regulatory mechanism that communicates the cell wall metabolism to source-sink relationship control. Concluding, the results obtained contribute to a better understanding of agronomical important traits, as well as of complex physiological processes little explored in tomato so far

Na maioria das sementes a emergência da radícula caracteriza o término da germinação e marca o início do desenvolvimento da plântula. A atividade das hidrolases da parede celular durante a pré-emergência pode estar associada ao amolecimento do tecido que circunda o embrião, principalmente na região micropilar, onde ocorre a protrusão da radícula. A atividade dessas enzimas após a emergência é associada à degradação de reservas polissacarídicas da parede celular, mobilizadas para suprir a plântula de açúcares antes que se torne autotrófica. No presente trabalho foram investigadas várias hidrolases da parede celular no endosperma de Euphorbia heterophylla durante a germinação e o desenvolvimento inicial pós-germinativo da plântula. Foi também realizada a purificação parcial de endo-b-1,4-glucanases da semente dessa espécie. As atividades da xiloglucano endotransglicosilase (XET), endo-b-mananase e b-manosidase são maiores no período de pré-emergência da semente de E. heterophylla, comparando-se com o período de pós-emergência. Por outro lado, as atividades da b-galactosidase, b-glucosidase, a-xilosidase, b-xilosidase e das glucanases que hidrolisam CMC, xiloglucanos de Hymenaea courbaril ou de Copaifera langsdorffii, xilano, Avicel e liquenano são elevadas no período de pós-emergência. A atividade sobre a laminarina ocorre durante ambos os períodos, de pré- e pós-emergência da radícula. A atividade da poligalacturonase não foi detectada nessa semente. Os resultados sugerem que XET, endo-b-mananase e b-manosidase podem estar envolvidas no processo de germinação, enquanto que as demais enzimas podem estar relacionadas ao processo de mobilização de reservas da semente. Em E. heterophylla o embrião está encerrado num endosperma rico em lipídios e proteínas, cujos produtos da degradação são absorvidos pelos cotilédones que iniciam a expansão 24 horas após o início da embebição. É possível que a hidrólise da parede celular do endosperma diminua a resistência contra a expansão em área do cotilédone facilitando, ao mesmo tempo, a rápida difusão dos produtos da degradação para os cotilédones. A purificação parcial das endoglucanases foi realizada utilizando-se colunas de Sephacryl S-100-HR numa primeira etapa, resultando em 2 grupos com atividade sobre CMC denominados I e II. Em uma segunda etapa, as endoglucanases do grupo I foram sequencialmente purificadas em coluna DEAE-Sephadex e de CF11-Celulose (afinidade). Através da focalização isoelétrica em gel de poliacrilamida e técnicas de sobreposição em gel de ágar para a determinação de atividade, foram detectadas endoglucanases de pIs de aproximadamente 3,0, 3,3, 3,8, 4,4, 4,9, 5,4 e 5,7 e um outro grupo de enzimas cujos pIs variam entre 8,5 e 10,0. As enzimas de pIs 3,0, 3,3 e 3,8 hidrolisam CMC e xiloglucano de C. langsdorffii; as de pIs entre 8,5 e 10,0 hidrolisam CMC e o xiloglucano de H. courbaril, mas não hidrolisam o de C. langsdorffii; as enzimas de pIs 4,4, 4,9 e 5,7 hidrolisam somente CMC; a de pI 5,4 hidrolisa somente xiloglucano de H. courbaril. As endoglucanases do grupo II foram purificadas em coluna de CM-celulose, tendo sido detectada uma enzima de pI 3,2 que degrada CMC bem como xiloglucano de C. langsdorffii e de H. courbaril. Foi também detectada uma xiloglucanase de pI 4,2 que hidrolisa somente xiloglucano de H. courbaril e um grupo de isozimas cujos pIs variam entre 8,5 e 10,0, que hidrolisa somente CMC. As xiloglucanases têm sido investigadas em sementes cujo xiloglucano é armazenado no cotilédone. O presente trabalho é o primeiro a relatar a ocorrência de xiloglucanases em uma semente endospérmica. / In most seeds radicle protrusion characterizes the termination of germination and the beginning of seedling development. The activity of cell wall hydrolases during the pre-emergence stage may be related to the softening of the tissue which involves the embryo, notably in the micropylar region where the radicle protrusion occurs. The activity of these enzymes following radicle emergence is related to the reserve degradation which may be cell wall polysaccharides mobilized to supply the seedling with sugars before it becomes autotrophic. In the present work it was investigated several cell wall hydrolases from the endosperm of Euphorbia heterophylla during germination and initial seedling development of this species. A partial purification of endo-b-1,4-glucanase was also performed. The activities of xyloglucan endotransglycosylase (XET), endo-b-mannanase and b-manosidase in E. heterophylla seeds are higher over the pre-emergence when compared to the post-emergence period. On the other hand the activities of b-galactosidase, b-glucosidase, a-xylosidase, b-xylosidase and glucanases which hydrolise CMC, xyloglucans from Hymenaea courbaril and Copaifera langsdorffii, xylan, Avicel and liquenan are higher over the post-emergence period. Activity on laminarin occurs over both periods. Polygalacturonase activity has not been detected in this seed. These results suggest that XET, endo-b-mannanase and b-manosidase may be involved in the process of germination whereas the other enzymes may be more related to reserve mobilization. In E. heterophylla the endosperm contains high contents of lipids and proteins and the degradation products of these reserves are absorbed by the cotyledons which expansion begins 24 hours since the start of imbibition. Probably endosperm cell wall hydrolysis facilitates cotyledon expansion by lowering endosperm resistance and at the same time the diffusion of degradation products into cotyledons. Partial purification of endoglucanases was carried out on Sephacryl S-100-HR as a first step resulting 2 active fractions (I and II) on CMC. Fraction I was further purified on DEAE-Sephadex and CF11-Cellulose (affinity) columns. Polyacrylamide gel isoelectric focusing followed by gel-overlay assay technique indicated several endoglucanases with pIs around 3.0, 3.3, 3.8, 4.4, 4.9, 5.4 and 5.7 and another group between 8.5 and 10.0. The pI 3.0, 3.3 and 3.8 enzymes hydrolyse both CMC and xyloglucan from Copaifera langsdorffii; the group between 8.5 and 10.0 hydrolyse both CMC and xyloglucan from Hymenaea courbaril but not from C. langsdorffii; pIs 4.4, 4.9 and 5.7 enzymes hydrolyse only CMC; pI 5.4 enzyme hydrolyse only xyloglucan from H. courbaril. Fraction II was further purified on CM-celullose column. It was detected a pI 3.2 endoglucanase which degrades CMC and xyloglucan from both C. langsdorfii and H. courbaril, a pI 4.2 xyloglucanase which hydrolyses only xyloglucan from H. courbaril, and a group of isozymes (pI 8.5 to 10.0) which hydrolyses only CMC. Xyloglucanases have been investigated only in seeds that have stored xyloglucan in the cotyledon. The present work is the first one to report the occurrence of xyloglucanases in an endospermic seed.

As características físico-químicas da parede celular constituem um grande gargalo na obtenção dos açúcares fermentáveis a partir dos polissacarídeos de parede celular presentes na biomassa, fato conhecido como recalcitrância da biomassa vegetal. A utilização da biomassa na produção de biocombustíveis requer um melhor entendimento sobre os mecanismos que permeiam os processos de deposição de parede celular e metabolismo de lignina. Nesse contexto, a maior parte do conhecimento foi gerado em espécies eudicotiledôneas, havendo uma significativa lacuna para gramíneas, apesar do seu grande potencial para acúmulo de biomassa. Portanto, há uma necessidade de se estabelecer ferramentas-modelos que permitam elucidar características exclusivas da parede celular secundária de gramíneas C4, cujo conhecimento não pode ser extrapolado a partir de eudicotiledôneas. O presente trabalho propôs estabelecer um sistema de células em suspensão como ferramenta-modelo em estudos sobre parede celular secundária em gramíneas C4. Para tal, três espécies foram inclusas: Sorghum bicolor, Setaria viridis e cana-de-açúcar. Devido às características recalcitrantes do sorgo, apenas as suspensões celulares de S. viridis e cana-de-açúcar foram estabelecidas. Subsequentemente, estas culturas foram utilizadas na tentativa de se desenvolver duas aplicações para o estudo de parede secundária: i) culturas xilogênicas, em que as células em suspensão são induzidas a se transdiferenciar em elementos traqueais; e ii) sistema de protoplastos para ensaios de transativação para testar o potencial papel de fatores de transcrição na regulação transcricional da deposição de parede celular. Somente as culturas de cana-de-açúcar responderam aos tratamentos testados para indução da transdiferenciação de elementos traqueais, baseados em protocolos estabelecidos para outras gramíneas. Análises de expressão gênica por RT-qPCR foram utilizadas para caracterizar a variação da expressão de genes-alvo durante este processo. Ademais, as paredes celulares das células em suspensão de cana-de-açúcar foram digeridas com um coquetel de hidrolases para a produção de protoplastos. A cultura de células em suspensão de cana-de-açúcar e suas aplicações aqui estabelecidas poderão ser utilizadas na elucidação de aspectos únicos do processo de deposição de parede celular secundária em gramíneas C4 / The physicochemical features of the cell wall represent a major bottleneck for the processing of cell wall polysaccharides present in biomass into fermentable sugars, a fact known as plant biomass recalcitrance. Biofuels production from biomass requires a better understanding on the molecular mechanisms underlying secondary cell wall deposition and lignin metabolism. In this context, most of the current knowledge has been generated in eudicots species, whereas significantly less is known for grasses, despite of their great potential for biomass accumulation. Therefore, the development of tools that allow the discovery of specific aspects of C4 grasses secondary cell walls is of great interest, because this knowledge cannot be extrapolated from data generated for eudicots. In the present work, we aimed to develop suspension cell cultures as a tool for the study of secondary cell wall metabolism in C4 grasses. For this purpose, three species were employed: Sorghum bicolor, Setaria viridis and sugarcane. Because of the recalcitrant nature of sorghum, only suspensions cells of S. viridis and sugarcane were successfully established. Subsequently, these cultures were used in an attempt to develop two applications to study secondary cell walls: i) xylogenic cultures, in which the suspension cells are induced to transdifferentiate into tracheary elements; and ii) a protoplast system to be used in transactivation assays to test the potential role of transcriptional factors in the regulation of secondary wall deposition. Only the suspension cultures of sugarcane showed a positive response to the tested treatments for the induction of tracheary elements formation, which were based on modifications of previous protocols established for other grasses. Gene expression analysis by RT-qPCR was used to characterize the variation of the expression of target genes during this process. Moreover, the cell walls of sugarcane suspension cells were digested with a cocktail of hydrolases to produce protoplasts, which were used in transactivation assays between transcriptional factors known to be involved in secondary cell wall deposition and their putative target genes, as a proof-of-concept. The sugarcane suspension cells and their applications established in this work might be used to further elucidate unique aspects of secondary cell wall deposition in C4 grasses

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-03-22T13:36:02Z No. of bitstreams: 1 Andrezza Araujo de Franca.pdf: 529792 bytes, checksum: 4398977026fd32c6a9f3e713e306c916 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T13:36:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrezza Araujo de Franca.pdf: 529792 bytes, checksum: 4398977026fd32c6a9f3e713e306c916 (MD5) Previous issue date: 2007-02-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Aiming to relate the structural components of cell wall with its degradability, the chemical composition, the secondary compounds, the in situ degradability, anatomy and tissue degradability of hay of “maniçoba” (wild cassava) were evaluated. The stem showed cells with varied degrees of lignification, highlighting the presence of gelatinous fibers, pith parenchyma lignified and tick cell walls inside the xylem. The leaves were highlighted by the presence of a girder structure, which can influence the degradability; it is characterized by the great quantity of mesophyll, constituted by cells with thin walls, contributing for degradability of dry matter. Idioblasts with druses of oxalate were observed around the vascular tissues, in the midrib. It works like defense mechanisms of plant against herbivores and can affect the availability of minerals for animals. The “maniçoba” hay, in spite of its advanced maturity stage (early fruit development), present adequate chemical composition and low concentration of HCN and tannins. The limits mains to degradability are wall cell thickness and lignifications, particularly in tissue of stem. Additionally, several aspects here reported induce to the continuity of researches in several focuses and aim the improvement to use this specie as forage. / Objetivando relacionar os componentes estruturais da parede celular com sua degradabilidade, avaliou-se a composição química, teor de compostos secundários, degradabilidade in situ, anatomia e degradabilidade dos tecidos do feno de maniçoba. O caule apresentou células com variados graus de lignificação, destacando-se a presença de fibras gelatinosas, parênquima medular lignificado e espessas paredes celulares no xilema. As folhas se destacam pela presença da estrutura girder, a qual pode influenciar a degradabilidade se caracterizam pela grande quantidade de mesofilo, constituído por células com paredes delgadas, contribuindo para degradabilidade de matéria seca. Idioblastos contendo drusas de oxalato foram encontrados nos tecidos vasculares, na nervura principal da folha. Eles funcionam como mecanismos de defesa do vegetal contra herbívoros e podem afetar a disponibilidade de minerais para o animal. O feno de maniçoba, apesar de obtido de planta em avançado estágio de maturidade (início da frutificação), possui adequada composição química e baixos teores de HCN e taninos. Os principais limitantes à degradabilidade são o espessamento e lignificação das paredes celulares, especialmente nos tecidos do caule. Adicionalmente, os diversos aspectos aqui relatados induzem à continuidade de pesquisas em diversos focos e visam o melhoramento e a utilização desta espécie como forrageira.

A ocorrência de mamões Golden com casca verde e polpa mole, em determinadas épocas do ano, tem sido relatada por produtores da região Norte do Espírito Santo. Não sendo possível distinguir frutos com o distúrbio do amolecimento precoce (DAP) apenas pela análise da cor da casca e da firmeza da polpa no momento da colheita, o objetivo deste trabalho foi estudar aspectos da fisiologia e bioquímica do amadurecimento que pudessem auxiliar no entendimento da perda precoce da firmeza. As coletas ocorreram no período de maior frequência de frutos com o distúrbio (meados de verão a final de outono). Os frutos foram coletados no estádio 1 de maturação, armazenados a 10º±1oC e 85±10% UR, durante 10 dias e submetidos à metodologia do Índice de Amolecimento (IA). O sintoma do amolecimento precoce foi observado claramente no 4°dia após o armazenamento sendo verificada a perda de firmeza nos frutos com DAP entre o 2° e o 8°dia a 10°C, sendo o decréscimo na firmeza equivalente a 71% da firmeza inicial, comportamento atípico para frutos armazenados sob refrigeração. Frutos com e sem DAP não apresentaram diferença significativa no teor de sólidos solúveis, acidez titulável e ácido ascórbico. A atividade respiratória e a produção de etileno foram reduzidas com o armazenamento refrigerado, sem diferença entre os frutos com e sem DAP, o que sugere que o aparecimento do distúrbio não se deve ao aumento na produção de etileno no período póscolheita. Os resultados indicam forte associação entre o amolecimento precoce e mudanças na parede celular. O rendimento das frações solúvel em água (FSA) e em NaOH (FSH) nos frutos com DAP, foi superior ao observado nos frutos sem DAP, durante todo o período de armazenamento. O menor nível da fração solúvel em imidazol (FSI) no tempo 0 pode estar associado à maior atividade da pectinametilesterase nos frutos com DAP. O decréscimo na fração celulose (CEL) em frutos com DAP pode indicar modificação na parede celular, ao nível celulose-hemicelulose. A produção de etileno não acompanhou as modificações na parede celular, sugerindo que alterações na estrutura da parede podem ter ocorrido durante o crescimento do fruto. Frutos com DAP apresentaram níveis de auxina (AIA) 6 vezes menor do que frutos sem DAP, no dia 0, sem diferença durante o armazenamento. Possivelmente os níveis de AIA nos frutos com DAP estavam reduzidos quando o fruto ainda estava ligado à planta. O distúrbio possivelmente está relacionado à alteração na parede celular e níveis de AIA. Desta forma, uma alteração hormonal durante o desenvolvimento do fruto anterior à colheita -, associada à sensibilidade do fruto à essa sinalização hormonal, levaria à mudanças na parede celular, o que determinaria a ocorrência do distúrbio do amolecimento precoce. / The occurrence of green skin and soft pulp in Golden papaya fruit during certain seasons has been reported by orchards in northern Espírito Santo State, Brazil. It is not possible solely by skin color and pulp firmness analysis to distinguish early softening disorder fruits (DAP), at the time of harvest, from those without the disorder. The aim of this work was to study the physiological and biochemical ripening aspects that might help to understand the early softening disorder. Fruits were harvested on the most common seasons (mid-summer to mid-autumn) in maturity stage 1 and evaluated for 10 days. Fruits were stored at 10°C, and submitted to softening index (IA). The symptoms of early softening disorder were clearly observed on the 4th day after storage. However, the firmness decrease in DAP fruits happened between the 2nd and 8th day at 10°C, with a decrease of 71% of initial firmness, presenting an atypical behavior for fruits stored under refrigeration. There was no difference between fruits with DAP and without DAP for soluble solids, titratable acidity and ascorbic acid content. Besides that, there was no difference between fruits with DAP and without DAP for respiration rate and ethylene production under refrigerated storage, which suggests that the disorder occurrence is not related to an increase in ethylene in the postharvest period. The results indicate a strong association between early softening disorder and changes in the cell wall composition. The cell wall polymers fractionation show that the yield of water soluble polymers (FSA) and NaOH soluble polymers (FSH) was higher in fruits with DAP than on fruits without DAP during the entire storage period. The smallest level of the imidazole soluble fraction (FSI) in DAP fruit, on day 0, may be related to a higher activity of pectinmethylesterase. The decrease in cellulose-rich polysaccharides (CEL) in the DAP fruit suggest modifications in the cellulose-hemicellulose domain. Ethylene production did not follow cell wall modification, suggesting that changes in the cell wall structure could be happening during fruit growth. DAP fruit presented an AIA level 6 times smaller than fruit without DAP, in day 0, without storage differences. Possibly, AIA levels in DAP fruit were reduced while fruits were still connected to the plant. The disorder may be related to cell wall changes and to AIA level. Should a hormonal change occur during fruit development i. e. prior to harvesting -- and still depending on fruit sensibility to hormonal signaling, cell wall changes could have different intensities, which determine if the fruit will or not have the flesh early softening observed after harvest.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6077.pdf: 10672804 bytes, checksum: 8a7ba5e1820e96664e3cbb7f872f6f3e (MD5) Previous issue date: 2013-10-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Over the recent years, the incidence of human fungal infections has shown a significant increase. Aspergillus fumigatus is a filamentous fungus opportunistic pathogen responsible for many human respiratory diseases, including invasive pulmonary aspergillosis, which is the most serious form of infection . Studies show that A. fumigatus virulence has a multifactorial process associated with its structure, capacity for growth, adaptation to stress conditions, evasion mechanisms of the immune system and ability to cause harm to the host. CWI (via cell wall integrity ) is a signaling cascade activated in yeast cells under conditions of cell wall stress and plays a role in the adaptation of various fungal pathogens in the human host . In many fungi , CWI is triggered by activation of protein kinase C ( PKC ) and that this pathway is associated with the transcription of genes related to maintaining the integrity of the cell wall and its redevelopment. In this work, a mutant Gly579Arg (G579R) was constructed by transformation mediated by inserting a gene replacement cassette comprising a G2044C transversion located in the cysteine-rich domain controller C1B pkcA of A. fumigatus. From the phenotypic analysis of the mutant strain was observed in the involvement of pkcAG579R CWI since the mutant showed high sensitivity to agents such as CR (congo red) and CFW (calcofluor white) . Furthermore, pkcA is also involved in tolerance to oxidative stress caused by paraquat and menadione. Additionally it was found to increase the sensitivity of the mutant pkcAG579R temperature variations as well as the inhibitor of Hsp90 radicicol. Como CWI is related to the transcriptional activation of biosynthetic genes and rugged cell wall (such as glucan synthase, glucanosil chitin synthases and transferases) the abundance of major genes coding for these enzymes was analyzed by RT-PCR in real time. Based on the tests can be α -1 ,3 glucan synthase ( agsA-C ) dependent signaling mediated PkcA for correct expression. Furthermore, genes such as β-1,3 glucan synthase (fksA) glucanosyltransferase (gelA-C) and some chitin synthases (chsB-E-C) appear not to be dependent function and CWI PkcA . These data demonstrated the role of pkcA signaling cascade in the maintenance of cell wall and thermotolerance in A. fumigatus. This work was the first in which a systematic analysis of gene pkcA was conducted in the human opportunistic fungal pathogen A. fumigatus. / Ao longo dos últimos anos, a ocorrência de infecções fúngicas humanas vem apresentando um aumento expressivo. Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso patógeno oportunista responsável por diversas doenças respiratórias humanas, incluindo aspergilose pulmonar invasiva, que é a forma de infecção mais grave. Estudos demonstram que o A. fumigatus possui um processo de virulência multifatorial associado a sua estrutura, capacidade de crescimento, adaptação em condições de estresse, mecânismos de evasão do sistema imune e capacidade de causar danos ao hospedeiro. A CWI (via de integridade da parede celular) é uma cascata de sinalização ativada nas células fúngicas sob condições de estresse de parede celular e desempenha um papel na adaptação de vários fungos patogênicos no hospedeiro humano. Em muitos fungos, CWI é desencadeada através da ativação da proteína quinase C (PKC) sendo que esta via está associada à transcrição de genes relacionados com a manutenção da integridade da parede celular e sua remodelação. Neste trabalho o mutante Gly579Arg (G579R) foi construído através da transformação mediada pela inserção de um cassete de substituição gênica que compreende uma transversão G2044C localizado no domínio regulador rico em cisteína C1B da pkcA de A. fumigatus. A partir da análise fenotípica desse mutante foi possível observar o envolvimento de pkcAG579R na CWI uma vez que a linhagem mutante mostrou alta sensibilidade a agentes como o CR (congo red) e CFW (calcofluor white). Além disso, pkcA está envolvido também na tolerância ao estresse oxidativo causado por menadiona e paraquat. Adicionalmente verificou-se o aumento da sensibilidade da linhagem mutante pkcAG579R à variações de temperatura bem como ao inibidor de Hsp90, radicicol. Como a CWI está relacionada à ativação transcricional de genes de biossíntese e reforço de parede celular (como por exemplo glucanas sintases, quitinas sintases e glucanosil transferases), a abundância dos principais genes que codificam essas enzimas foi analisada através de RTPCR em tempo real. Baseado nos testes pode-se verificar que as α-1,3 glucana sintase (agsA-C) dependem da sinalização mediada por PkcA para sua expressão. Por outro lado, genes como a β-1,3 glucana sintase (fksA), glucanosiltransferases (gelA-C) e algumas quitinas sintases (chsB-C-E) parecem não ser dependente da CWI e da função de PkcA. Esses dados demostraram parte do papel de pkcA na cascata de sinalização da manutenção da parede celular e termotolerância em A. fumigatus. Este trabalho foi o primeiro no qual uma análise sistemática do gene pkcA foi conduzida no fungo patógeno oportunista humano A. fumigatus.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseGCLA.pdf: 4953630 bytes, checksum: 13c8dd01d0df7c6da5e9a087678857f8 (MD5) Previous issue date: 2004-09-03 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work suggests the chemical characterization of the genus Paspalum and was divided in 3 steps: 1) sample preparation of plants with diluted acids; 2) biosorption studies employing Paspalum notatum root material, and 3) investigation of root cellular wall constituents. Therefore, in the first step, solutions ranging from 2 to 14 mol L-1 HNO3 were used to assisted high-pressure microwave plant samples digestion. Quantitative amounts of analytes were obtained, including Fe and Al, by using 2 mL of 2 mol L-1 HNO3 solution plus 1 mL of H2O2 30 % v v-1. Residual carbon contents were ≤ 11 %. The 1H NMR spectra indicated lower variety of nitrocompounds for samples digested with diluted acids. For the second step, sorption studies in root material leached and no-leached with 0.14 mol L-1 HNO3 solution were performed. The sorption obtained for the former was higher than for the latter material. Sorption isotherms of Al3+, Fe3+, Cu2+ and Ni2+ in H3CCOONH4 and KNO3 environments with mono and multielemental solutions were plotted and adjusted to the more representative theoretical models for the experimental results. The KNO3 monoelemental studies presented higher sorption for Fe and Cu than for H3CCOONH4 environment, probably owing to the absence of bounding ions. Sorption has reduced for all analytes in KNO3 multielemental studies, probably owing to the competition by the sorption sites. In the other hand, H3CCOONH4 multielemental studies showed an increasing of two times for Fe and Al sorption, probably due to lateral interactions between the analytes and the biosorbent surfaces, which were verified with sorption isotherm profiles. In the last step, the 1H NMR spectra and the potentiometric titration indicated that the acid rinsing changed the material. In this case, interpretation of the results obtained with potentiometric titration suggests the amine and phenol groups as likely sorption sites. The determination of Al, Fe, Cu, Ni, aminoacids and sugar in fractions obtained from the sequential extraction of the cell wall compounds, combined to Pearson s correlation coefficient studies, evidenced different distributions of the analytes at the fractions and material. Thus, the functional groups related to each metal could be estimated. / Este trabalho propõe a caracterização química do gênero Paspalum e, para tanto foi dividido em 3 etapas: 1) preparo de amostras vegetais com ácido diluídos; 2) estudos de biossorção empregando material radicular de Paspalum notatum e 3) investigação de constituintes da parede celular do material radicular. Assim, para a primeira etapa, foram empregadas soluções de HNO3 (2 a 14 mol L-1) para a digestão de amostras vegetais assistida por forno de microondas com cavidade. Foram obtidas recuperações quantitativas de analitos, incluindo Fe e Al, empregando-se 2 mL de solução de HNO3 2 mol L-1 e 1 mL de H2O2 30 % v v-1. Os teores de carbono residual obtidos foram ≤ 11 %. A análise dos espectros de 1H NMR indicou menor variedade de nitrocompostos para as amostras preparadas com ácidos diluídos. Para a segunda etapa realizaram-se estudos de sorção em material radicular de Paspalum notatum não lixiviado e lixiviado com HNO3 0,14 mol L-1. Foram obtidas sorções mais elevadas para o material previamente lixiviado. Isotermas de sorção para Al3+, Fe3+, Cu2+ e Ni2+ em meio H3CCOONH4 e KNO3, com soluções mono e multilementares, foram traçadas, sendo ajustados os modelos teóricos mais representativos dos resultados experimentais. O meio KNO3 apresentou sorção mais elevada de Fe e Cu para estudos monoelementares do que o meio H3CCOONH4, provavelmente à ausência de íons complexantes. Em estudos multielementares a sorção em meio KNO3 foi reduzida para todos os analitos, provavelmente devido à competição pelos sítios de sorção. Por outro lado, o meio H3CCOONH4 apresentou o dobro de sorção para Fe e Al, provavelmente em função de interações laterais entre os analitos e à superfície do biossorvente, fatos verificados a partir do perfil das isotermas de sorção. Na última etapa do trabalho, espectros de 1H NMR e titulação potenciométrica indicaram que a lixiviação ácida alterou o material. Neste caso, a titulação potenciométrica indicou grupamentos aminos e fenólicos como prováveis sítios de sorção. A determinação de Al, Fe, Cu, Ni, aminoácidos e açúcares nas frações obtidas a partir da extração seqüencial dos componentes da parede celular, aliada a estudos de correlação de Pearson, permitiu evidenciar diferentes distribuições dos analitos nas frações e nos materiais. Assim, os grupos funcionais relacionados a cada metal puderam ser estimados.

Na maioria das sementes a emergência da radícula caracteriza o término da germinação e marca o início do desenvolvimento da plântula. A atividade das hidrolases da parede celular durante a pré-emergência pode estar associada ao amolecimento do tecido que circunda o embrião, principalmente na região micropilar, onde ocorre a protrusão da radícula. A atividade dessas enzimas após a emergência é associada à degradação de reservas polissacarídicas da parede celular, mobilizadas para suprir a plântula de açúcares antes que se torne autotrófica. No presente trabalho foram investigadas várias hidrolases da parede celular no endosperma de Euphorbia heterophylla durante a germinação e o desenvolvimento inicial pós-germinativo da plântula. Foi também realizada a purificação parcial de endo-b-1,4-glucanases da semente dessa espécie. As atividades da xiloglucano endotransglicosilase (XET), endo-b-mananase e b-manosidase são maiores no período de pré-emergência da semente de E. heterophylla, comparando-se com o período de pós-emergência. Por outro lado, as atividades da b-galactosidase, b-glucosidase, a-xilosidase, b-xilosidase e das glucanases que hidrolisam CMC, xiloglucanos de Hymenaea courbaril ou de Copaifera langsdorffii, xilano, Avicel e liquenano são elevadas no período de pós-emergência. A atividade sobre a laminarina ocorre durante ambos os períodos, de pré- e pós-emergência da radícula. A atividade da poligalacturonase não foi detectada nessa semente. Os resultados sugerem que XET, endo-b-mananase e b-manosidase podem estar envolvidas no processo de germinação, enquanto que as demais enzimas podem estar relacionadas ao processo de mobilização de reservas da semente. Em E. heterophylla o embrião está encerrado num endosperma rico em lipídios e proteínas, cujos produtos da degradação são absorvidos pelos cotilédones que iniciam a expansão 24 horas após o início da embebição. É possível que a hidrólise da parede celular do endosperma diminua a resistência contra a expansão em área do cotilédone facilitando, ao mesmo tempo, a rápida difusão dos produtos da degradação para os cotilédones. A purificação parcial das endoglucanases foi realizada utilizando-se colunas de Sephacryl S-100-HR numa primeira etapa, resultando em 2 grupos com atividade sobre CMC denominados I e II. Em uma segunda etapa, as endoglucanases do grupo I foram sequencialmente purificadas em coluna DEAE-Sephadex e de CF11-Celulose (afinidade). Através da focalização isoelétrica em gel de poliacrilamida e técnicas de sobreposição em gel de ágar para a determinação de atividade, foram detectadas endoglucanases de pIs de aproximadamente 3,0, 3,3, 3,8, 4,4, 4,9, 5,4 e 5,7 e um outro grupo de enzimas cujos pIs variam entre 8,5 e 10,0. As enzimas de pIs 3,0, 3,3 e 3,8 hidrolisam CMC e xiloglucano de C. langsdorffii; as de pIs entre 8,5 e 10,0 hidrolisam CMC e o xiloglucano de H. courbaril, mas não hidrolisam o de C. langsdorffii; as enzimas de pIs 4,4, 4,9 e 5,7 hidrolisam somente CMC; a de pI 5,4 hidrolisa somente xiloglucano de H. courbaril. As endoglucanases do grupo II foram purificadas em coluna de CM-celulose, tendo sido detectada uma enzima de pI 3,2 que degrada CMC bem como xiloglucano de C. langsdorffii e de H. courbaril. Foi também detectada uma xiloglucanase de pI 4,2 que hidrolisa somente xiloglucano de H. courbaril e um grupo de isozimas cujos pIs variam entre 8,5 e 10,0, que hidrolisa somente CMC. As xiloglucanases têm sido investigadas em sementes cujo xiloglucano é armazenado no cotilédone. O presente trabalho é o primeiro a relatar a ocorrência de xiloglucanases em uma semente endospérmica. / In most seeds radicle protrusion characterizes the termination of germination and the beginning of seedling development. The activity of cell wall hydrolases during the pre-emergence stage may be related to the softening of the tissue which involves the embryo, notably in the micropylar region where the radicle protrusion occurs. The activity of these enzymes following radicle emergence is related to the reserve degradation which may be cell wall polysaccharides mobilized to supply the seedling with sugars before it becomes autotrophic. In the present work it was investigated several cell wall hydrolases from the endosperm of Euphorbia heterophylla during germination and initial seedling development of this species. A partial purification of endo-b-1,4-glucanase was also performed. The activities of xyloglucan endotransglycosylase (XET), endo-b-mannanase and b-manosidase in E. heterophylla seeds are higher over the pre-emergence when compared to the post-emergence period. On the other hand the activities of b-galactosidase, b-glucosidase, a-xylosidase, b-xylosidase and glucanases which hydrolise CMC, xyloglucans from Hymenaea courbaril and Copaifera langsdorffii, xylan, Avicel and liquenan are higher over the post-emergence period. Activity on laminarin occurs over both periods. Polygalacturonase activity has not been detected in this seed. These results suggest that XET, endo-b-mannanase and b-manosidase may be involved in the process of germination whereas the other enzymes may be more related to reserve mobilization. In E. heterophylla the endosperm contains high contents of lipids and proteins and the degradation products of these reserves are absorbed by the cotyledons which expansion begins 24 hours since the start of imbibition. Probably endosperm cell wall hydrolysis facilitates cotyledon expansion by lowering endosperm resistance and at the same time the diffusion of degradation products into cotyledons. Partial purification of endoglucanases was carried out on Sephacryl S-100-HR as a first step resulting 2 active fractions (I and II) on CMC. Fraction I was further purified on DEAE-Sephadex and CF11-Cellulose (affinity) columns. Polyacrylamide gel isoelectric focusing followed by gel-overlay assay technique indicated several endoglucanases with pIs around 3.0, 3.3, 3.8, 4.4, 4.9, 5.4 and 5.7 and another group between 8.5 and 10.0. The pI 3.0, 3.3 and 3.8 enzymes hydrolyse both CMC and xyloglucan from Copaifera langsdorffii; the group between 8.5 and 10.0 hydrolyse both CMC and xyloglucan from Hymenaea courbaril but not from C. langsdorffii; pIs 4.4, 4.9 and 5.7 enzymes hydrolyse only CMC; pI 5.4 enzyme hydrolyse only xyloglucan from H. courbaril. Fraction II was further purified on CM-celullose column. It was detected a pI 3.2 endoglucanase which degrades CMC and xyloglucan from both C. langsdorfii and H. courbaril, a pI 4.2 xyloglucanase which hydrolyses only xyloglucan from H. courbaril, and a group of isozymes (pI 8.5 to 10.0) which hydrolyses only CMC. Xyloglucanases have been investigated only in seeds that have stored xyloglucan in the cotyledon. The present work is the first one to report the occurrence of xyloglucanases in an endospermic seed.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:11:36Z : No. of bitstreams: 1 zaine_l_me_jabo.pdf: 606188 bytes, checksum: da0b30ee696bae955544945c1be515d9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Biorigin Sa / Vários derivados da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae conhecidamente agem sobre a imunidade, no entanto a ação, especialmente da fração beta-glucano, foi pouco demonstrada em cães. Para o estudo dos possíveis efeitos sobre a imunidade na espécie canina foram empregadas quatro dietas isonutrientes, contendo uma fonte de parede celular de levedura (PCL), duas fontes de beta-glucano (BG1 e BG2) e uma dieta controle (CT). Foram utilizados 24 cães da raça beagle, adultos, divididos em quatro grupos de seis animais. As dietas foram fornecidas por um período total de 126 dias e as avaliações incluíram hemograma e avaliações bioquímicas, dosagem de anticorpos anti-Leptospira, imunofenotipagem de linfócitos sanguíneos, avaliação da concentração de IgA em fezes, teste de hipersensibilidade cutânea tardia e dosagens de citocinas em sobrenadante de cultura celular. Os animais foram submetidos a desafio antigênico com vacina contra leptospirose no dia 42. Os dados foram avaliados pelo procedimento GLM do SAS, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey (p≤0,1). Nos exames bioquímicos houve discreta variação entre os tratamentos e ao longo dos dias. No hemograma notou-se aumento dos linfócitos para BG2. A dosagem de anticorpos anti-Leptospira, mostrou baixos títulos, não havendo boa resposta à vacinação. A imunofenotipagem revelou um aumento dos linfócitos T totais, T helper, T citotóxicos e linfócitos B no grupo BG2 e de linfócitos T citotóxicos e linfócitos B para o grupo PCL. Apesar da variação da concentração de IgA fecal ao longo dos dias, os tratamentos não influenciaram tais parâmetros. O teste de hipersensibilidade cutânea tardia mostrou um aumento na resposta à inoculação da vacina, para os grupos PCL e BG2. Na dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura celular, apenas foi observada diferença na quantificação de TNF-α,... / Some products from the cell wall of the yeast Saccharomyces cerevisiae are known to act on the immunity, however this action, especially of the beta-glucan fraction, has never been demonstrated in dogs. To study these effects on the immunity of dogs four isonutrient diets were made, containing one source of yeast cell wall (YCW), two sources of beta-glucan (BG1 and BG2) and a control diet (CT). 24 adult beagle dogs were used, divided in four groups of six animals. Diets were given for a 126 days period. Evaluations included complete blood count and biochemistry profile, quantification of antibodies against Leptospira, immunophenotyping of blood lymphocytes, IgA concentration in feces, delayed-type hypersensitivity test and quantification of cytokines in cell culture supernatant. Animals were exposed to antigen challenge, by the vaccine against leptospirosis on day 42. Data were analyzed by the GLM procedure of the SAS software and the means were compared by the Tukey test (p<0,01). Biochemistry profile showed slight differences among the groups. A increase in lymphocyte count was observed for BG2 treatment. Quantification of antibodies against Leptospira showed low titles, with poor response to vaccination. Immunophenotyping revealed an increase during the time in total T cells, helper and cytotoxic T cells, and B lymphocytes for BG2 and of cytotoxic T cells and B lymphocytes for YCW group. Despite the variation in fecal IgA concentration during the time, treatments did not influence these parameters. Delayed-type hypersensitivity test showed an increased response to the vaccine inoculation, for YCW and BG2 groups. In the quantification of cytokines in cell culture supernatant the only difference observed was in TNF-α concentration, being BG2 higher than CT. We concluded that both yeast cell wall and beta-glucan fraction act on dogs` immunity