Les récepteurs du glutamate de type AMPA (rAMPA) sont les acteurs principaux de la transmission synaptique excitatrice rapide. Leur abondance au niveau de la densité postsynaptique est essentielle pour l'établissement et le maintien de la fonction synaptique, et est le résultat d'un trafic hautement dynamique. De nombreuses études ont permis de caractériser les mécanismes de diffusion membranaire impliqués dans l’adressage des rAMPA jusqu’à la synapse. Le rôle majeur des protéines auxiliaires des rAMPA dans la modulation de cette étape de trafic a été démontré. Par ailleurs, il est suggéré que la localisation synaptique des rAMPA est aussi régulée lors des phases plus précoces du trafic intracellulaire, c’est-à-dire de l'appareil de Golgi vers la membrane plasmique via les vésicules post-Golgiennes. Cependant le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA n'a jamais été visualisé et reste donc encore très mal compris. En collaboration avec l'équipe de Guus Smit (Amsterdam), j’ai participé à la caractérisation d’une nouvelle protéine auxiliaire des rAMPA, appelée Shisa6. Dans le cadre de ce projet, j’ai pu étudier le rôle de cette protéine sur la diffusion membranaire des rAMPA en utilisant une technique de suivi de particule unique (Quantum dot) développée au laboratoire. Mon projet de thèse principal a consisté à étudier le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA par le développement d’une nouvelle méthode d’étude. En effet, l'échec dans la visualisation dynamique du trafic vésiculaire des récepteurs pourrait être expliqué par un faible rapport signal/bruit, conséquence d'une faible concentration vésiculaire en rAMPA combinée à un bruit de fond important dû aux marquages provenant du réticulum endoplasmique (RE) et de la membrane plasmique. Dans le but de surpasser cette difficulté, nous avons mis au point un outil ingénieux (système ARIAD) afin de bloquer les rAMPA dans le RE et contrôler, par l'ajout d'un ligand, leur sécrétion du RE jusqu'à la membrane plasmique. Grâce à cet outil, nous avons non seulement augmenté considérablement la concentration des rAMPA dans les vésicules post-Golgiennes, mais aussi éliminé le bruit de fond membranaire. Par la technique de FRAP nous avons pu éliminer le bruit de fond provenant du RE. Une telle approche, combinée à des techniques d'imagerie sur neurones vivants, nous a permis de visualiser pour la première fois le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA et de l’étudier. / AMPA-type glutamate receptors (AMPAR) are the main actors of the fast excitatory synaptic transmission. Their abundance at the postsynaptic density is essential for the establishment and maintenance of synaptic function, and is the result of a highly dynamic trafficking. Many studies have characterized the membrane diffusion mechanisms involved in the AMPAR synaptic localization, and revealed the critical role of the AMPAR auxiliary proteins in the modulation of this trafficking. Furthermore, it is suggested that AMPAR synaptic localization is also regulated during the early steps of the intracellular trafficking, from the Golgi apparatus to the plasma membrane via the post-Golgi vesicles. However, the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR has never been visualized and therefore remains poorly understood. In collaboration with the Guus Smit team (Amsterdam), I participated in the caracterization of a novel AMPAR auxiliary protein called Shisa6. As part of this project, I studied the role of this protein on the AMPAR membrane diffusion, using a method of single particle tracking (Quantum dot) developed in the laboratory. My main thesis project was to study the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR through the development of a new experimental protocol. Indeed, the failure in the dynamic visualization of the receptor vesicular trafficking could be explained by a low signal/noise ratio resulting of a poor AMPAR vesicular concentration, combined with a high background noise due to receptors localized both in the endoplasmic reticulum (ER) and at the plasma membrane. In order to overcome this difficulty, we have used an ingenious tool (ARIAD system) so as to block AMPAR into the ER and, by adding a ligand, control their trafficking from the ER to the plasma membrane. Thanks to this tool we have not only significantly increased the AMPAR concentration in the post-Golgi vesicles, but also eliminated the plasma membrane background noise. The FRAP imaging technique was used in order to remove the ER background noise. Such methodological approach combined with imaging techniques in living neurons, allowed us to clearly visualize for the first time the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR, and to study the mechanisms involved in this trafficking.

Les récepteurs AMPA (rAMPA) sont les récepteurs ionotropiques du glutamate responsables de la majeure partie des courants excitateurs rapides dans la transmission synaptique rapide. Lors de la libération de glutamate, le rAMPA passe par 3 états conformationnels majoritaires : pore fermé/agoniste non lié, pore ouvert/agoniste lié et pore fermé/agoniste lié. Le contrôle du nombre et de l’organisation dans la synapse des rAMPA, via une combinaison de diffusion latérale et d’endo/exocytose, est essentiel à la régulation de l’intensité de la transmission synaptique. Les interactions existant entre les protéines de la densité post-synaptique et les protéines partenaires des récepteurs régulent la diffusion des récepteurs, contrôlant leur nombre et leur organisation à la post-synapse. Mon travail de thèse a consisté à étudier l’impact de l’activation des rAMPA sur leur mobilité et leur organisation à la post-synapse. En effet, la fixation de glutamate sur les récepteurs ainsi que leur désensibilisation entraînent des modifications structurales majeures affectant leurs interactions avec les protéines d’échafaudage et les protéines accessoires. L’impact de telles modifications sur les propriétés de diffusion et sur l’organisation sub-synaptique de ces rAMPA était jusqu’à présent inconnu. Mes travaux démontrent une mobilisation des rAMPA synaptiques consécutivement à leur activation par le glutamate. A l’échelle moléculaire, je propose que le passage de l’état activé à l’état désensibilisé des rAMPA entraîne un changement d’affinité de ces derniers pour une de leur protéine partenaire : la Stargazin. Cette régulation glutamate dépendante de la diffusion des rAMPA participe au maintien de la fidélité de la transmission synaptique rapide. / AMPA receptors (AMPAR) are ionotropic glutamate receptors which are responsible for the vast majority of fast excitatory synaptic currents in fast transmission. Upon release of glutamate, AMPAR undergo three main conformational states: pore closed/agonist unbound, pore open/agonist bound and pore closed/agonist bound. Controlling the number of AMPAR and their organization in the synapse, through a combination of lateral diffusion and endo/exocytosis, is essential to regulate the intensity of synaptic transmission. The interactions between proteins of the post-synaptic density and accessory receptor proteins regulate the distribution of receptors, controlling their number and organization in the post-synapse. During my PhD, I studied the impact of AMPAR activation on their mobility and organization in the post-synapse. Indeed, the binding of glutamate to AMPAR and their following desensitization lead to major structural changes on the receptor which impacts on their interactions with scaffolding proteins and accessory proteins. The impact of such modifications on the lateral diffusion and sub-synaptic organization of AMPAR was not known yet. My findings show a mobilization of synaptic AMPAR following their activation by glutamate. At the molecular level, I suggest that the transition from the activated state to the desensitized state of AMPAR leads to a change in affinity of the receptor for their partner protein: Stargazin. This glutamate dependent regulation of AMPAR diffusion participates in maintaining the fidelity of fast synaptic transmission.

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes. Les granules de sécrétion (GS) contenant ces hormones sont formés au niveau du réseau trans-golgien puis migrent jusqu'à la périphérie de la cellule. Ces hormones sont libérées dans le milieu extérieur par exocytose en cas de stimulation de la cellule. Grâce à l'observation des GS situés dans la région juxta-membranaire par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente, les mouvements de ces organites ont été étudiés à l'échelle du granule unique. Une méthode d'analyse permettant la mise en évidence de comportements transitoires au sein des trajectoires tridimensionnelles des GS a été mise au point. Grâce à son application à l'étude des effets de drogues du cytosquelette et à des observations en double marquage, nous avons pu associer chaque type de mouvements décrit par les GS à un environnement particulier (GS lié à la membrane plasmique, au cytosquelette d'actine ou de microtubules). Nous avons de plus étudié le rôle du complexe protéique Rab27A/MyRIP/Myosine Va lors de la capture des GS en périphérie de la cellule et leur accrochage aux filaments d'actine.

La synapse est un assemblage macromoléculaire dynamique : les protéines synaptiques sont constamment et rapidement échangées par un mouvement diffusif entre l'assemblage synaptique et la région extrasynaptique, alors que l'assemblage reste stable. Par ailleurs, dans le compartiment présynaptique, les cycles d'endo- et d'exocytose des vésicules synaptiques imposent une réorgani- sation dynamique de la membrane plasmique. La syntaxin1A est une protéine membranaire impliquée dans l'exocytose. Quelles sont les caractéristiques de la diffusion latérale de la syntaxin et ses implications pour la transmission sy- naptique ? Nous avons étudié la diffusion latérale de la syntaxin à l'échelle de la popu- lation (méthode de retour de fluorescence après photoblanchiment, FRAP) et à l'échelle de la molécule individuelle (suivi de particule unique, SPT). Nous avons montré que la syntaxin diffuse rapidement dans la membrane plasmique et présente des périodes d'immobilisation transitoire, qui reflètent des inter- actions moléculaires impliquées dans la formation du complexe exocytotique. Enfin, nous avons construit un modèle computationnel qui réconcilie les des- criptions de la diffusion latérale de la syntaxin à l'échelle de la population et de la molécule individuelle. Ce modèle a permis de caractériser les cinétiques des interactions entre la syntaxin et ses partenaires, qui conduisent à sa stabilisa- tion à la synapse.

La spectroscopie de corrélation de fluctuation a été utilisée pour étudier la réponse optique, en solution, de molécules et de billes d'or nanométriques individuelles, fonctionnalisées ou non, en vue du développement de nouvelles sondes biochimiques. Les expériences réalisées s'appuient sur un système de microscopie confocale et/ou biphotonique optimisé pour la détection de faibles signaux. Plusieurs procédés de filtrage du signal de fluorescence et d'algorithmes de calcul de la corrélation ont permis une analyse détaillée des signaux acquis. A travers un modèle original, je montre qu'il faut tenir compte de la réponse impulsionnelle tensorielle du microscope lors de l'ajustement des courbes de corrélation de particules ayant un diagramme d'émission anisotrope. Je me suis intéressé à trois types de nanosondes différentes. J'ai montré que l'on peut caractériser efficacement des sondes calciques comme l'Oregon Green Bapta 5N par spectroscopie de corrélation de fluctuations tout en pointant les limites de la méthode. J'ai ensuite mis en évidence et caractérisé une anisotropie inattendue de l'absorption à deux photons et de l'émission de photoluminescence de nanosphères d'or. Son interprétation montre l'importance du rôle des états de surface et de celui des ligands et de leur dynamique. J'ai aussi caractérisé des nanosondes formées de particule d'or fonctionnalisées avec des chromophores. Une technique originale s'appuyant sur la nature hybride de la sonde, m'a permis de démontrer l'hétérogénéité de ces systèmes, la formation d'agrégats de fluorophores et la très forte annihilation de la fluorescence des chromophores liés aux particules d'or.

L’effet photothermique permet de détecter efficacement des nanoparticules d’or avec un microscope en champ lointain grâce à leur forte absorption de la lumière. L’absence de problème photophysique fait des nanoparticules d’or une alternative au marquage de biomolécules par des sondes fluorescentes. La méthode PhACS (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) utilise les fluctuations de signal photothermique dues au passage de nanoparticules dans le volume de détection pour étudier leur diffusion. Cette méthode permet également la mesure précise de diamètres hydrodynamiques de nanoparticules fonctionnalisées. La méthode SNaPT (Single Nano-Particle Tracking) réalise le suivi bidimensionnel de nanoparticules individuelles grâce à une localisation effectuée par triangulation. Nous avons appliqué cette méthode pour étudier la diffusion des intégrines alphaV-beta3 marquées par des nanoparticules d’or de 5 nm dans les adhérences focales, points d’ancrage entre le cytosquelette de la cellule et la matrice extracellulaire. Nous observons que ces intégrines ont tendance à former des agrégats qui alternent entre un mouvement diffusif et un mouvement confiné. Ce résultat appelle maintenant à un nouveau modèle où nous aurions une redistribution continue des intégrines au sein des adhérences focales. / Gold nanoparticles may be detected with optical far-field microscopy by use of the photothermal effect due to their strong light absorbance. With no photophysic issues, gold nanoparticles are an alternative to fluorescent probes for use in biological systems. The PhACS method (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) is used to study diffusion by measuring the autocorrelation of photothermal signal fluctuations due to nanoparticles passing through the detection volume. This method is sensitive enough to mesure the precise hydrodynamic diameter of functionalised nanoparticles. The SnaPT method (Single Nano-Particle Tracking) can track 2-dimensional motion of individual nanoparticles by pinpointing the localization with a triangulation method. The SNaPT method was used to study motion of alphaV-beta3 integrins that were bound to a 5 nm gold nanoparticle inside focal adhesion, where the cell cytoskeleton is linked to the extracullular matrix. The integrin was found to organize into clusters oscillating between the bound and diffuse states. These observations require new working models where integrins would be constantly redistributed.

La diffusion latérale des lipides et des protéines transmembranaires est essentielle pour les fonctions biologiques. Dans le contexte cellulaire, la fraction surfacique des protéines membranaires est élevée, atteignant environ de 50 à 70% selon le type de membrane. La diffusion se fait donc dans un milieu très encombré. Le but de ce travail est d'étudier in vitro l'effet de l'encombrement des protéines sur la diffusion des protéines et des lipides. Jusqu'à présent, les mesures de diffusion latérale ont généralement été réalisées à faible densité de protéines, et l'effet de l'encombrement des inclusions membranaires ou des protéines membranaires a été peu étudié expérimentalement. Nous avons utilisé une méthode de suivi de particules uniques (SPT) pour suivre les trajectoires de la pompe à protons Bactériorhodopsine (BR) et de lipides marqués avec des quantum dots au bas de vésicules unilamellaires géantes (GUVs) en fonction de la fraction de surface totale (Ф) de BR reconstituée dans la membrane constituée par ailleurs de 1,2-Dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC). / Lateral diffusion of lipids and transmembrane proteins is essential for biological functions. In the cellular context, the surface fraction of membrane proteins is high, reaching approximately 50 to 70% depending on the membrane type. Therefore, diffusion occurs in a very crowded environment. The aim of this work is to study in vitro the effect of protein crowding on their own diffusion and on those of the surrounding lipids. So far, lateral diffusion measurements generally have been carried out at low protein density, and the effect of proteins crowding has not been much studied experimentally. We used a single particle tracking (SPT) method to track the trajectories of the Bacterorhodopsin (BR) proton pump and of lipids labeled with quantum dots at the bottom of giant unilamellar vesicles (GUVs) as a function of the total surface fraction (Ф) of BR reconstituted in 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) membrane.

L’utilisation accrue des nanomatériaux manufacturés (NM) fait en sorte que les différents acteurs de réglementation se questionnent de plus en plus par rapport à leur destin et leurs impacts sur les écosystèmes et la santé humaine suite à leur rejet dans l’environnement. Le développement de techniques analytiques permettant de détecter et de caractériser les NM en matrice environnementale est impératif étant donné la nécessité d’évaluer le risque relié à ces polluants émergents. Une des approches de plus en plus favorisée est d’utiliser une technique chromatographique et un ou plusieurs détecteurs sensibles dans les buts de réduire les effets de matrice, d’identifier des nanoparticules (NP) selon leurs temps de rétention et de les quantifier à des concentrations représentatives de la réalité environnementale. Une technique analytique utilisant la chromatographie hydrodynamique (HDC) et des détecteurs en ligne ou hors ligne (détecteurs de diffusion statique ou dynamique de la lumière, spectromètre de masse par torche à plasma en mode particule unique (SP-ICPMS), l’ultracentrifugation analytique) a donc été développée. Le couplage de la colonne HDC avec ces détecteurs a permis de caractériser des NP standards et l’optimisation des conditions de séparation de ces nanoparticules de polystyrène, d’or et d’argent a permis de confirmer que les NP y sont bel et bien séparées seulement selon leur taille, tel que la théorie le prédit. De plus, l’utilisation de la colonne HDC couplée au SP-ICPMS a permis de séparer un mélange de nanoparticules d’argent (nAg) et de les détecter à des concentrations représentatives de celles rencontrées dans l’environnement, soit de l’ordre du μg L-1 au ng L-1. Par exemple, dans un échantillon d’eau usée (effluent), un mélange de nAg de 80 et de 40 nm a été séparé et les nAg ont été détectées à l’aide du SP-ICPMS connecté à la colonne HDC (temps de rétention de 25.2 et 25.6 minutes et diamètres déterminés de 71.4 nm et 52.0 nm). Finalement, pour plusieurs échantillons environnementaux auxquels aucun ajout de nanoparticules n’a été fait, les analyses HDC-SP-ICPMS effectuées ont permis de déterminer qu’ils ne contenaient initialement pas de nAg. / Due to the widespread use of engineered nanoparticles (ENP), regulatory agencies are very concerned about their fate and their impacts on the environment and on human health. The development of analytical techniques, which will allow the detection, characterization and quantification of ENP in environmental matrices, is therefore critical in order to properly evaluate the exposure associated with these emerging pollutants. One promising approach to detect and quantify the nanoparticles is to couple a chromatographic technique to a sensitive detector in order to: (i) reduce matrix effects; (ii) identify nanoparticles from their retention times and (iii) quantify the ENP at environmentally relevant concentrations. Consequently, the coupling of hydrodynamic chromatography (HDC) was performed with both on-line and off-line detectors (light scattering detectors, inductively coupled plasma mass spectrometer in its single particle mode (SP-ICPMS) and an analytical ultracentrifuge). HDC was first used for the characterization of ENP standards. Separation conditions were optimized for standard nanoparticle suspensions of polystyrene, gold and silver, which allowed us to confirm that the separation was occurring, based on hydrodynamic size, as predicted by theory. By coupling the HDC column to the ICPMS detector in its ‘‘single particle’’ mode, it was possible to separate an ENP mixture and to detect the nanoparticles at environmental concentrations, i.e., in the μg L-1 to ng L-1 range. For example, in a wastewater sample (effluent wastewater), a mixture of two silver nanoparticles (nAg) of 40 and 80 nm were separated and the nAg were detected by SP-ICPMS at retention times of 25.2 and 25.6 minutes. Diameters of 71.4 nm and 52.0 nm were found. HDC-SP-ICPMS analysis carried out on different non-spiked wastewater samples allowed us to conclude that nAg was below the detection limit of 0.1 µg L-1.

Il est bien admis que la compréhension de la structuration moléculaire à l’intérieur des cellules neuronales est essentielle pour appréhender le fonctionnement du cerveau. Pour cette raison, l’étude de l’organisation des molécules clés neuronales et synaptiques contribue grandement à comprendre le mystère du cerveau. AMPA sont des récepteurs ionotropiques du glutamate jouent le rôle central dans la plasticité synaptique et la transmission synaptique basale dans le système nerveux central. Distribution des récepteurs AMPA sur la membrane neuronale est remarquablement hétérogène. Ils sont organisés en agrégats fonctionnels distincts, appelés nanodomaines. Des travaux antérieurs ont montré que Neuroligin, la molécule d’adhésion post-synaptique, ancres récepteurs AMPA par PSD95 dans la membrane post-synaptique et constitue en même temps un complexe d’adhésion trans-synaptique avec présynaptique Neurexin, impliqué dans le recrutement de machines de libération vésiculaire sur le site présynaptique. De cette façon, NRLG fonctionnellement organise synapses par la poste de recrutement de molécules présynaptiques essentielles pour réponse synaptique. Ici, nous avons étudié l’effet de la modulation de NRLG1 (modification du niveau d’expression ou de l’activité) sur le dynamique et nano-organisation des récepteurs AMPA au niveau des synapses individuelles. Notre hypothèse est que le complexe NRX-NRG pourrait être impliquée dans la localisation précise des récepteurs post-synaptiques et son apposition avec zone active présynaptique, jouant ainsi le rôle important dans la transduction du signal approprié. Taille de la densité post-synaptique (PSD) est de l’ordre de 500 nm, alors que diamètre moyen des nanodomaines AMPAR 100 nm. Une telle petite dimension nécessitait l’application de techniques de microscopie de super-résolution, dont la résolution de l’ordre de 20-40 nm est presque un ordre de grandeur mieux que microscopie fluorescence limitée par la diffraction. Nanoscopie fluorescence permettent visualiser des cellules jusqu’au niveau presque moléculaire. Pour atteindre mes objectifs, j’ai mis en place différents nanoscopies de localisation d’une seule molécule, qui s’appuient sur séparés dans l’espace et le temps de détection de population choisi de sondes de fluorescence. Il a été proposé que le trafic membranaire des récepteurs de neurotransmetteurs peut contribuer à la modulation de l’efficacité synaptique. J’ai sondé propriétés diffusionnelles des récepteurs AMPA avec suivi de particules unique, qui a été pendant longtemps appliqué pour sonder l’hétérogénéité de la membrane cellulaire. Localisation relative des biomolécules à la base de la compréhension de leur relation fonctionnelle. Il est bien admis que la juxtaposition de deux objets, ainsi que leur colocalisation, peuvent témoigner de leur association. Avec les récents développements dans l’acquisition multi couleur de la molécule unique et images de super-résolution à base d’ensemble, il est maintenant possible d’explorer la colocalisation à l’échelle nanométrique entre biomolécules dans des cellules vivantes et fixe. Malgré l’ la popularité et l’application très répandue, il n’existe que quelques paradigmes d’analyse quantitative pour la colocalisation des images multicolores super-résolution. Ici, avec l’aide de paradigmes conventionnels de mesure de la colocalisation et statistiques multivariées, nous analysons et présentons en isolement l’échelle du détail et proximité des macromolécules au sein de zones fonctionnelles de synapses. En outre, nous utilisons ces paradigmes pour évaluer marqueurs fluorescents impliqués dans la production de routine de la molécule unique fondée images super-résolution. Nous étendons notre analyse élucider en profondeur le co-agrégation des molécules clés synaptiques, PSD95 et récepteurs AMPA, qui sont impliqués dans l’organisation synaptique et transmission basale. / The brain is made of complex networks of interconnected neuronal cells. All our mental activities are underlain by electrochemical signals passing through dedicated neuronal circuits. Climbing further up on the complexity ladder, information processing by neurons is performed by multiple molecules assembling and interacting together. It is well accepted that the understanding of the molecular structuring inside neuronal cells is essential to apprehend functioning of the brain. For this reason, study of the organization of the key neuronal and synaptic molecules greatly contributes to understand the mystery of the brain. AMPA receptors (AMPARs) are ionotropic glutamate receptors that play a central role in synaptic plasticity and basal synaptic transmission in the central nervous system. The distribution of AMPARs on the neuronal membrane is remarkably heterogeneous. They are organized in distinct functional aggregates, called nanodomains. Previous work demonstrate that the postsynaptic adhesion molecule Neuroligin (NRLG) anchors AMPARs through PSD-95 in the postsynaptic membrane while simultaneously forming a trans-synaptic adhesion complex with presynaptic Neurexin (NRX), and recruiting vesicular release machinery at the presynaptic site. In this way, NRLG functionally organizes synapses by recruiting post and pre-synaptic molecules essential for regulation of synaptic responses. Here we studied the effect of NRLG modulation (modification of expression level or activity) on AMPAR nano-dynamics and nano-organization at individual synapses. Our hypothesis is that the NRX-NRLG complex could be involved in the precise localization of postsynaptic receptors and their apposition with the neurotransmitter release sites in the presynaptic active zone, thus playing important role in proper signal transduction. The size of the postsynaptic density (PSD) is in the order of 500 nm, whereas the average diameter of AMPAR nanodomains 100 nm. Such small dimension necessitated the application of super-resolution microscopy techniques, whose resolution in the range of 20-40 nm is almost an order of magnitude better than diffraction limited fluorescence microscopy. Probe-based far-field fluorescence nanoscopies allow visualizing cells down to almost molecular level. To achieve my goals, I implemented different single-molecule localization nanoscopies which rely on the detection of selected populations of fluorescence probes that are separated in space and time. It was proposed that membrane trafficking of neurotransmitter receptors may contribute to modulation of synaptic efficacy. I have probed diffusional properties of AMPARs with single particle tracking, which has long been applied to probe heterogeneity of the cell membrane. Relative localization of biomolecules provides the basis for understanding their functional relationship. It is well accepted that the juxtaposition of two objects, as well as their colocalization, may give evidence of their association. With the recent developments in multi-color acquisition of single molecule and ensemble based super resolution images, it is now possible to explore the colocalization at the nanoscale between biomolecules in live and fixed cells. Despite the popularity and wide spread application of super resolution imaging, there exist only a few quantitative analysis paradigms for the colocalization of multicolor super-resolution images. Here, with the aid of conventional colocalization measurement paradigms and multivariate statistics, we analyze and report in detail the scale segregation and proximity of macromolecules within functional zones of synapses. Furthermore, we use these paradigms to evaluate fluorescent tags involved in the routine generation of single molecule based super-resolution images. We extend our analysis to elucidate in depth the co-aggregation and clustering of two key synaptic molecules, PSD95 and AMPARs, which are involved in basal synaptic organization and transmission.

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