L'inflammation allergique de la peau est un état dans lequel l'hôte réagit de manière excessive à des allergènes en induisant une inflammation de type Th2. Un certain nombre d’acteurs cellulaires et moléculaires ont été impliqués dans cette pathologie, mais la façon dont ils agissent dans le réseau inflammatoire demeure largement inconnue. Les basophiles ont été reconnus pour leurs fonctions effectrices en allergie, cependant, comment ils sont recrutés et activés, ainsi que comment ils interagissent avec d'autres cellules dans l’inflammation allergique cutanée demeurent mal caractérisés. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans le réseau inflammatoire de la peau allergique. En employant un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique, combiné à des outils génétique de souris, d’immunologie et d’approches biologiques cellulaires/moléculaires, l’étude de ma thèse a démontré que l’IL-3 joue un rôle crucial dans l’extravasation des basophiles dans la peau allergique des souris (Partie I), et que l’invalidation des basophiles chez les souris Mcpt8DTR entraîne une réduction systémique des éosinophiles et des neutrophiles (Partie II). Ces études fournissent ainsi de nouvelles connaissances sur le recrutement, l'activation et la fonction des basophiles dans l'inflammation allergique de la peau. / Allergic skin inflammation is a state in which the host overreacts to otherwise innocuous allergens by inducing T helper type 2 inflammation. A number of cellular and molecular players have been implicated in the generation of allergic skin inflammation, but how they act and crosstalk in the inflammatory network remains largely unknown. Basophils have been recognized for their effector functions in allergy, however, how they are recruited to the inflamed tissue, get activated and crosstalk with other cells in inflammatory skin remain still incompletely understood. The objective of this PhD study is to investigate the recruitment, activation and function of basophils in the inflammatory network of allergic skin. Using experimental mouse model for allergic contact dermatitis, combined with mouse genetic tools, immunology and cellular/molecular biology approaches, the study of my thesis discovered that IL-3 plays a crucial role in basophil extravasation to mouse allergic skin (Part I), and that the depletion of basophils in Mcpt8DTR mice leads to a systemic reduction of eosinophils and neutrophils (Part II). These studies provide novel insights into the recruitment, activation and function of basophils in allergic skin inflammation.

Les peptidyl-arginine désiminases (PADs) catalysent une modification post-traductionnelle, appelée désimination, qui correspond à la transformation des résidus arginine en résidus citrulline. À ce jour, leur rôle est encore mal compris, bien qu'elles aient été impliquées dans divers processus physiologiques et pathologiques. Dans l'épiderme et le follicule pileux, trois d'entre elles sont exprimées, les PAD1, 2 et 3. La désimination de la filaggrine (FLG), protéine essentielle de la différenciation épidermique, semble conduire à sa dissociation des filaments de kératines et permettre sa protéolyse totale. Les acides aminés libres ainsi générés sont nécessaires à la fonction de barrière que remplit la couche cornée, couche cellulaire la plus externe de l'épiderme. Dans le follicule pileux, la désimination de la trichohyaline (TCHH), protéine apparentée à la FLG, augmente sa solubilité et permet sa liaison covalente aux kératines par la transglutaminase 3 (TGase 3), ce qui participe à la formation de la tige pilaire. La description du rôle des PADs au cours de la différenciation des kératinocytes est cependant encore incomplète, et leurs implications dans les maladies de peau peu explorée. L'objectif de mon travail de thèse a été de mieux comprendre le rôle des PADs dans le métabolisme de la FLG et, plus généralement, dans l'homéostasie de l'épiderme et du follicule pileux. Tout d'abord, j'ai montré que la désimination de la FLG humaine par la PAD1 et/ou 3 est une étape majeure qui permet de réguler sa dégradation complète en fonction du taux d'humidité extérieure. Pour cela, j'ai utilisé comme modèle expérimental des épidermes reconstruits humains (ERHs). La diminution de l'humidité relative lors de leur production, de 95% à 30-50%, augmente la protéolyse de la FLG et la genèse des acides aminés correspondants. En parallèle, l'expression de la PAD1 et le taux de désimination de la FLG sont fortement accrus alors que ni l'expression ni l'activité des protéases impliquées dans cette protéolyse ne varient. De plus, le traitement d'ERHs pendant 24 heures avec un inhibiteur des PADs, le Cl-amidine, bloque en partie l'effet de la sécheresse sur le métabolisme de la FLG. J'ai ensuite recherché si la désimination joue un rôle plus global au cours de la différenciation des kératinocytes. J'ai traité des ERHs avec différentes concentrations de Cl-amidine pendant 48 heures et analysé l'effet du traitement sur leur morphologie. L'inhibition de la désimination est dose-dépendante et non toxique. À la plus forte concentration, le Cl-amidine entraîne un amincissement de la couche cornée, une augmentation importante du nombre de cellules transitionnelles, et l'accumulation de mitochondries et de vésicules dans le cytoplasme des kératinocytes granuleux. Ceci permet de proposer que la cornification, dernière étape de la différenciation kératinocytaire, est retardée. De plus, la protéine LC3B-II, marqueur des autophagosomes, étant plus fortement détectée dans les ERHs traités, les PAD1 et/ou 3 pourraient être impliquées dans le processus d'autophagie associé à la cornification.Enfin, j'ai participé à un nouveau projet collaboratif qui a permis de découvrir l'origine d'une maladie génétique rare, le syndrome des cheveux incoiffables. Des mutations des gènes de la TCHH, de la PAD3 ou de la TGase 3 ont été identifiées dans 11 familles et sont responsables de ce syndrome. La mutation non-sens du gène de la TCHH aboutit à la synthèse, si elle a lieu, d'une forme très courte, probablement incapable d'interagir avec les kératines. Les mutations des gènes de la PAD3 et de la TGase 3 induisent des changements structuraux et une quasi-absence de l'activité des enzymes correspondantes. De plus, les souris dont le gène de la Pad3 a été inactivé présentent des anomalies de la forme des poils. Ces résultats ont permis de comprendre la physiopathologie de cette maladie des cheveux et ont prouvé que la PAD3 est essentielle à leur morphogenèse. / Peptidylarginine deiminases (PADs) catalyze a post-translational modification, named deimination, corresponding to the transformation of arginine residues into citrulline. So far, their role is still poorly understood even if they have been associated with numerous physiological and pathological processes. In the epidermis and the hair follicle, three PADs are expressed, namely PAD1, 2 and 3. Deimination of filaggrin (FLG), a major protein of epidermal differentiation, would lead to its detachment from keratin filaments and allow its full proteolysis. The resulting free amino acids contribute to the barrier function of the cornified layer, the outmost cellular layer of the epidermis. In the hair follicle, deimination of trichohyalin (TCHH), a FLG-related protein, increases its solubility and improves its crosslinking by transglutaminase 3 (TGase 3) to keratins, contributing to the hair shaft formation. However, the function of PADs during keratinocyte differentiation is incompletely described and their involvements in skin diseases have been poorly investigated. The objective of my work was to better understand the role of PADs in the metabolism of FLG, and more generally in the epidermis and hair follicle homeostasis. First of all, I demonstrated that a major step in the metabolism of human FLG is its deimination by PAD1 and/or PAD3. This regulates its complete degradation according to the external humidity level. For this purpose, I used reconstructed human epidermis (RHEs) as an experimental model. Lowering relative humidity from 95 to 30-50% during RHE generation enhanced FLG proteolysis as well as the resulting amino acid amount. In parallel, PAD1 expression and FLG deimination were highly increased while the expression or activity of proteases known to target FLG did not vary. Moreover, treatment of RHEs during 24 hours with Cl-amidine, a PAD inhibitor, partially blocked the effect of dryness on FLG metabolism. Then, I investigated whether deimination could play a more general role during keratinocyte differentiation. I treated RHEs with various concentrations of Cl-amidine during 48 hours and I analyzed the effect of treatments on the epidermis morphology. The inhibition of deimination was dose-dependent and not cytotoxic. At the strongest concentration, Cl-amidine was shown to cause thinning of the cornified layer, to highly increase the number of transitional cells and to induce accumulation of mitochondria and vesicles in the cytoplasm of granular keratinocytes. This suggested that cornification, the ultimate stage of keratinocyte differentiation, is slowed down by Cl-amidine treatment. Besides, as the autophagosome marker LC3B-II was up-regulated in Cl-amidine treated RHEs, PAD1 and/or PAD3 could be involved in the cornification-associated process of autophagy. Finally, I participated in a new collaborative work that led to discover the cause of uncombable hair syndrome, a rare genetic disorder. Mutations of the genes encoding TCHH, PAD3 and TGase 3 were identified in 11 families and were shown to be responsible for the disease. The nonsense mutation in TCHH gene results in the synthesis, if any, of a very short protein, probably not able to interact with keratins. Mutations in PAD3 and TGase3 genes were shown to induce structural changes and almost total absence of activity of the corresponding enzymes. Moreover, examination of Pad3 deficient mice revealed alterations in the hair morphology. These results allowed a better understanding of this hair disease physiopathology and proved that PAD3 is essential for the hair shaft morphogenesis.

L’étude des réseaux protéiques perturbés au cours de l’infection par les petits virus oncogéniques amena, vers la fin des années 80, à la découverte de nombreux régulateurs clés de la division et de la survie cellulaire. Parmi ceux-ci, la protéine E4F1 fût initialement identifiée comme une cible de l’oncoprotéine virale E1A. Originellement identifié comme un facteur de transcription, E4F1 est également une ubiquitine-E3 ligase atypique pour d'autres facteurs de transcription tel que le suppresseur de tumeurs p53. Au travers de ses multiples activités, E4F1 est nécessaire à la prolifération des cellules somatiques et souches, et à la survie des cellules cancéreuses. De plus, les travaux de différents laboratoires dont le mien suggèrent qu’E4F1 se situe au carrefour de plusieurs voies de signalisation qui sont fréquemment altérées au cours de l’oncogenèse, et notamment la voie impliquant le suppresseur de tumeurs p53. Afin d’étudier les fonctions physiologiques in vivo d’E4f1, mon laboratoire d’accueil a développé plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées. La caractérisation de ces modèles a permis de mettre en évidence un rôle majeur d'E4F1 dans l'homéostasie de la peau. Plus précisément, E4F1 régule le pool de cellules souches de l'épiderme au travers de son rôle dans une voie de signalisation qui implique la protéine p53 et deux de ces régulateurs en amont: Arf et Bmi1. Cependant, il semble que les effets d'E4F1 dans le contrôle du maintien des cellules souches s'étendent au delà de son rôle sur cette voie de signalisation. En effet, j'ai récemment pu démontrer qu'E4F1, au travers de ces fonctions transcriptionnelles, régule directement l'expression d'un sous-groupe de gènes impliqués dans la régulation de l'activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH). La PDH est un complexe multimérique situé dans la mitochondrie qui catalyse la décarboxylation du pyruvate (le produit final de la glycolyse) en acétyl coenzyme A (AcCoA), liant ainsi le métabolisme du pyruvate au cycle de Krebs. J’ai pu montrer que l’inactivation d’E4f1 spécifiquement dans l'épiderme conduisait à une diminution importante de l’activité de PDH et à une reprogrammation métabolique de ces cellules. Cette reprogrammation a pour conséquence d'altérer le micro-environnement des cellules souches qui conduit à leur détachement de leur niche et aboutit in fine à une absence du renouvellement de l'épiderme. Cette partie de mes travaux a donc permis d'illustrer pour la première fois l'importance du métabolisme du pyruvate dans l'homéostasie des cellules souches de la peau. Sur la base de ces résultats, je poursuis l'analyse des fonctions d’E4f1 dans l'homéostasie de la peau en étudiant son rôle dans d'autres types cellulaires tels que les mélanocytes. / The multifunctional protein E4F1 is an essential regulator of normal skin homeostasis. During my Phd, I demonstrated that E4f1 inactivation in adult skin results in stem cell autonomous defects causing exhaustion of the epidermal stem cell (ESC) pool. At the molecular level, I identified E4F1 as a new regulator of the pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in keratinocytes, an essential mitochondrial complex that converts pyruvate into Acetyl-CoEnzyme A. Using genetically engineered mouse models, I showed that E4F1-mediated control of PDH activity is required to maintain normal skin homeostasis. Consistently, E4F1 deficiency in basal keratinocytes resulted in deregulated expression of dihydrolipoamide acetlytransferase (Dlat), a gene encoding the E2 subunit of the PDC, and impaired PDH activity. The metabolic reprogramming of E4f1 KO keratinocytes associated with the redirection of the glycolytic flux towards lactate production and increased lactate secretion in their microenvironment, leading to enhanced activity of extra-cellular-matrix remodelling proteases Finally, these defects ended in alterations of the basement membrane, ESC mislocalization and the exhaustion of the ESC pool. In the second part of my thesis, I have evaluated the role of E4F1-mediated control of the PDC in melanocytes and showed that the metabolic activities of E4F1 are important for melanocyte function. Consistently, mice with E4f1-deficient melanocytes exhibited hair graying and skin pigmentation defects. Altogether, my data demonstrate the importance of E4f1-mediated control of pyruvate metabolism for normal skin homeostasis.

Introduction : Le système nerveux autonome (SNA) est le marqueur le plus puissant du vieillissement global de l'organisme, en particulier du vieillissement vasculaire cérébral et cardiaque. Bien que la peau soit richement innervée par les nerfs autonomes et le SNA contrôle de nombreuses fonctions cutanées, la relation entre le SNA et le vieillissement cutané n'a pas été étudiée. Méthodes : Nous avons évalué le vieillissement cutané chez 209 sujets âgés (105 femmes et 104 hommes, âge moyen 77,5 ans) appartenant à la cohorte stéphanoise PROOF (PROgnostic indicator OF cardiovascular and cerebrovascular events) qui explore la fonctionnalité du SNA. Le vieillissement cutané a été mesuré par le score clinique SCINEXA (SCore for INtrinsic and EXtrinsic skin Aging), par VISIA, vidéodermatoscopie et cutométrie. L’activité du SNA a été mesurée par la variabilité de la fréquence cardiaque sur enregistrement de l’électrocardiogramme de 24 heures. Résultats : Une relation entre SNA et SCINEXA n’a pas pu être démontrée. Cependant, une relation entre l'activité du SNA et certains items du SCINEXA et certains paramètres du VISIA, de la vidéodermatoscopie et de la cutométrie a été trouvée. En particulier, l'analyse des paramètres VISIA a mis en évidence une relation entre porphyrines élevées et baisse de l’activité sympathique du SNA. Discussion et Conclusion : Quoique nous n’ayons pas trouvé de relation entre le vieillissement cutané global et la fonction du SNA, il est possible que le SNA joue un rôle sur le vieillissement intrinsèque de la peau, mais d’une manière négligeable en comparaison des facteurs externes tels que l’exposition solaire, et que cette partie du vieillissement soit difficile à mettre en évidence. De plus ayant trouvé une relation entre certains paramètres du vieillissement cutané et le SNA, notre étude encourage les futures recherches sur l’influence du SNA sur les différents composants du vieillissement cutané / Background : The autonomic nervous system (ANS) is the most powerful marker of the overall body aging, especially for what concerns the vascular aging of the heart and the brain. Although the skin is richly innervated by ANS nerves and the ANS controls many skin functions, the relation between the ANS and skin aging has not been studied. Methods : We evalusated skin aging of 209 elderly subjects (105 women and 104 men, mean age 77.5 years) belonging to the PROOF (PROgnostic indicator OF cardiovascular and cerebrovascular events) cohort of Saint-Etienne which explores the functionality of the ANS. Skin aging was measured by the clinical score SCINEXA (SCore for INtrinsic and EXtrinsic skin Aging), by VISIA, videodermoscopy and cutometry. The ANS status was measuredby the heart rate variability on a 24 hours recording of the electrocardiogram. Results : A relation between ANS and SCINEXA could not be demonstrated. However, a relation between the activity of the ANS and some items of SCINEXA and certain parameters of VISIA, videodermoscopy and cutometry was found. In particular, the analysis of VISIA parameters showed a relation between elevated porphyrins and a decreased sympathetic activity of the ANS. Discussion and conclusion : Although we did not find a relationship between overall skin aging and ANS activity, ANS might play a role in intrinsic skin aging, albeit marginally if compared to external factors such a sun exposure. Moreover, the intrinsic part of the skin aging and the ANS, our study encourages further research on the influence of the ANS on the various components of skin aging.

Le toucher est considéré comme l’un des sens primordiaux à modéliser chez un robot afin de lui permettre de générer des comportements plus souples et plus agiles comme attraper un objet, toucher (ou être touché par) une personne. Même si les capteurs tactiles actuels sont encore très limités en comparaison à la peau humaine, combinés à la vision et à la proprioception, le développement de nouveaux capteurs proches de la peau humaine pourrait démultiplier les capacités d’interactions d’un robot afin d’interagir directement avec une personne en toute sécurité et de partager avec lui son environnement physique et social. A la différence de la peau humaine, les principaux capteurs tactiles utilisés en robotique actuellement ne sont capables de détecter des variations de pression et de poids que sur de petites surfaces uniquement. De plus, ceux-ci sont souvent très rigides et n’ont pas les propriétés élastiques de déformation de la peau humaine. Les travaux de cette thèse se basent sur le développement d’une interface tactile proche d’une "peau artificielle" en terme de surface de recouvrement (qui peuvent atteindre plusieurs dizaines de centimètres carrés) et de localisation des points de contact de quelques dizaines de millinewtons. Deux aspects principaux sont développés : (i) aspect d’ingénierie comprenant le développement d’un prototype de peau artificielle conçue pour un robot humanoïde afin de lui conférer une perception tactile, et (ii) aspect cognitifs qui s’appuient sur l’intégration de multiples rétroactions sensorielles (tactile, visuelle, proprioceptive) dans le but d’avoir un robot qui puisse interagir physiquement avec des personnes.Le prototype tactile développé est basé sur la reconstruction du champ électrique à la surface d’un matériau conducteur, suivant le principe de la Tomographie par Impédance Électrique (TIE). Notre innovation principale a été d’implémenter des techniques d’apprentissage par réseau de neurones artificiels afin de reconstruire l’information sans utiliser les techniques analytiques d’inversion de matrice coûteuse en temps de calcul. De plus, nous montrons que l’utilisation de réseaux de neurones artificiels permet d’avoir un système beaucoup plus biomimétique, indispensable pour comprendre la perception du toucher chez l’être humain.Nous avons ensuite abordé le problème de l’intégration des informations tactiles et motrices. Après avoir recouvert un bras manipulateur avec la peau artificielle, nous avons fait apprendre un réseau de neurones son schéma corporel et adapter sa compliance par retour tactile. Le fonctionnement du moteur est basé sur le contrôle par admittance du bras robotique. Des expériences montrent que les réseaux de neurones peuvent contrôler l’interaction adaptative entre le bras du robot avec une personne grâce à l’estimation du couple appris selon la position où la force tactile avait été appliquée lors de la phase d’apprentissage.Enfin, nous nous sommes intéressées à la problématique de la représentation du corps au niveau neuronal, comment les êtres humains perçoivent leur propre corps à travers tous les sens (visuel, tactile et proprioceptif). Nous avons proposé un modèle biologique au niveau du cortex pariétal qui s’appuie sur l’intégration de multiples rétroactions sensorielles du corps du robot (son bras) et sur la synchronisation des rétroactions visuelles et proprioceptives. Nos résultats montrent l’apprentissage d’une image corporelle et l’espace péri-personnel avec l’émergence de neurones qui codent une information spatiale visuo-tactile relative au déplacement du bras et centrée soit sur le bras robotique soit centrée sur l’objet. / The touch perception is considered as one of the crucial senses to be recreated in a robot so that it could generate a more flexible and agile behavior. For instance, grasping an object, as well as touch or be touched by a person. Although modern touch sensors are still very limited compared to the human skin, combined with vision and proprioception, the development of new sensors similar to human skin could multiply the robot’s capacity to interact directly and safely with a person, as well as to share his or her physical and social environment.Unlike human skin, the main touch sensors used in modern robotics are only capable of detecting the pressure and weight variations on small batches of surface. Moreover, they are often quite stiff and do not have the elastic deformation capacity intrinsic to the human skin. The purpose of this thesis is to develop a touch interface close to "artificial skin" in terms of the covered area (which can reach several square decimeters) and localization of the contact points (several dozen millinewtons). Two main aspects have been developed: (i) the engineering aspect including the development of an artificial skin prototype for a humanoid robot designed to impart a tactile perception, and (ii) the cognitive aspect that is based on the integration of multiple sensory feedbacks (tactile, visual, proprioceptive) in order to conceive a robot that can physically interact with people.The developed tactile prototype is based on the reconstruction of the electric field on the surface of a conductive material, following the principle of Electrical Impedance Tomography (EIT). Our main innovation was to implement the neural network learning techniques to reconstruct the information without using the inverse matrix analytical techniques which imply time consuming computation. Moreover, we show that the application of artificial neural networks allows to obtain a much more biomimetic system, essential to understand the perception of the human touch.Then, we addressed the issue of integrating tactile and motor information. After having covered a manipulator arm with artificial skin, we have learn a neural network its body schema and enables it to adjust its compliance with tactile feedback. The functioning of the motor is based on the admittance control of the robot arm. Experiments show that neural networks can control the adaptive interaction between the robot arm and a human being by estimating the torque perceived according to the position where the touch force had been applied during the learning phase.Finally, we turned our attention to the issue of the body representation at the neuronal level, namely, how human beings perceive their own body through all their senses (visual, tactile, and proprioceptive). We have proposed a biological model in the parietal cortex, which is based on the integration of multiple sensory feedbacks from the robot’s body (its arm) and on the synchronization of visual and proprioceptive feedback. Our results show the capacity to perceive the body image with the emergence of neurons that encode a spatial visual-tactile information of the arm movement and is centered on either the robotic arm or on the object.

La pigmentation de la peau résulte en grande partie de la présence de mélanine dans l’épiderme. Ce pigment est synthétisé par les mélanocytes puis transféré aux kératinocytes pour assurer une fonction photoprotectrice. Le transfert de mélanosomes nécessite une reconnaissance cellulaire entre mélanocytes et kératinocytes. L’interaction entre lectines et glycanes joue un rôle dans cette reconnaissance et peut constituer une cible d’intérêt pour le développement de produits à activité dépigmentante. Par ailleurs, les conditions du microenvironnement cutané, telles que le taux d’oxygène, sont cruciales pour l’homéostasie tissulaire. Les objectifs de ce travail de thèse, réalisé dans le cadre du projet FUI Glycoskin I, ont été : l’étude de la reconnaissance cellulaire entre mélanocytes et kératinocytes à travers l’interaction lectine-glycane, la caractérisation des mélanosomes sécrétés par les mélanocytes et la mise au point d’une méthode d’évaluation du transfert des mélanosomes aux kératinocytes pour tester l’activité de phosphoconjugués. D’autre part, nous avons étudié l’effet du taux d’oxygène sur le processus de mélanogénèse et sur l’interaction lectine-glycane. Nos résultats ont permis d’élucider les profils glycaniques et lectiniques à la surface des mélanocytes et des kératinocytes et de sélectionner des phosphoconjugués potentiellement inhibiteurs du transfert de mélanosomes aux kératinocytes. Nous avons mis au point un modèle d’évaluation du transfert de mélanosomes aux kératinocytes afin de tester l’effet inhibiteur des phosphoconjugués. Nous avons identifié un phosphosaccharide inhibiteur de la reconnaissance entre mélanosomes et kératinocytes. Par ailleurs, ce projet constitue la première étude de la pigmentation en physioxie. Nous avons montré qu’un travail en physioxie induit des modulations des profils glycaniques et lectiniques, ainsi qu’une stimulation de la mélanogénèse. Ces résultats montrent l’importance de se placer en physioxie lors de l’étude de la mélanogénèse in vitro afin de se rapprocher au maximum des conditions physiologiques du microenvironnement cutané lors de l’évaluation de composés actifs. / Skin pigmentation is mostly due to the presence of melanin in the epidermis. This pigment is produced by melanocytes and transferred to keratinocytes, to play a photoprotective role. Melanosome transfer requires cellular recognition between melanocytes and keratinocytes. Lectin-glycan interaction plays a role in this phenomena and can be an interesting target for developing depigmenting products. Besides, the cutaneous microenvironment conditions, such as oxygen level, are crucial for tissular homeostasis. The aims of this work, as part of the Glycoskin I FUI project, were : to study cellular recognition between melanocytes and keratinocytes through lectin-glycan interaction, to characterize melanosomes released from melanocytes and to develop a method for the evaluation of melanosome transfer to keratinocytes in order to assess phosphoconjugate activity. Also, we studied the effect of oxygen level on melanogenesis and lectin-glycan interaction. Our results allowed to elucidate lectin and glycan profiles on the surface of melanocytes and keratinocytes and to select phosphoconjugates potentially able to inhibit melanosome transfer. We developed a method to assess melanosome transfer in order to test phosphoconjugates inhibiting effect. We identified one phosphosaccharide able to inhibit melanocytes-keratinocytes recognition. Furthermore, this project is the first study of pigmentation in physioxia. We showed that physioxia induces modulations of lectin and glycan profiles and stimulated melanogenesis. These results show the importance of physioxia conditions when studying melanogenesis in vitro to approach cutaneous physiological microenvironment when evaluating active compounds.

Parmi les protéoglycannes à héparane sulphate (HSPGs) des lames basales, le perlécane présente un rôle majeur dans la morphogénèse de l'épiderme mais également dans la survie et la différenciation des kératinocytes. Celui‐ci régulerait ces processus en contrôlant la biodisponibilité des facteurs de croissance. Au cours de ce travail, nous avons étudié l'expression du perlécane dans la peau humaine au cours du vieillissement intrinsèque et son implication dans les défauts de l'épiderme liés à l'âge. Une analyse immunohistologique sur une cohorte de peau normale humaine provenant de donneurs allant de 22 à 73 ans, a révélé une diminution drastique du perlécane au niveau de la jonction dermo‐épidermique et des capillaires dermiques au cours de l'âge. Des études biochimiques combinées à des analyses génomiques ont pu démontrer que la diminution de l'expression du perlécane n'était pas due à une dégradation de la protéine mais à une diminution de sa régulation transcriptionnelle par les kératinocytes. Par ailleurs, la conception et la caractérisation de modèles de peaux reconstruites in vitro combinant des cellules provenant de différents âges a permis d'établir une corrélation entre le défaut de synthèse du perlécane et l'épaisseur de l'épiderme. Nous avons montré que l'addition de perlécane natif purifié dans le milieu de culture d'un modèle contenant des kératinocytes âgés a permis de restaurer l'architecture épidermique. L'ensemble de ces résultats démontre ainsi l'importance du perlécane dans l'homéostasie cutanée. Un criblage de composés a permis la sélection de molécules candidates capables de restaurer spécifiquement l'expression du perlécane dans des cultures de kératinocytes et de cellules endothéliales microvasculaires dermiques âgés. Des tests fonctionnels sur les modèles de peaux reconstruites précédemment mis au point, ont permis de démontrer leur capacité à améliorer la morphogénèse de l'épiderme en accord avec les fonctions du perlécane d'origine épithéliale. L'ensemble de nos résultats indique qu'une diminution significative de synthèse du perlécane par les kératinocytes au cours de l'âge participe à l'affinement et aux défauts de différenciation de l'épiderme observés durant le vieillissement cutané / Among basement membrane heparan sulphate proteoglycans (HSPGs), perlecan is known to be involved in epidermal formation and renewal by regulating keratinocyte survival and differentiation. HSPGs are known to be regulators of growth-factor signalling through different mechanisms. We have investigated the expression of perlecan during skin ageing and have examined whether its expression correlates with age-dependant modifications of the epidermal compartment. The immunohistochemical analysis of perlecan in a cohort of human skin samples from donors of ages ranging from 22 to 73 years revealed a strong decrease of its expression with age in good correlation with reduction of the epidermal thickness. Genomic analyses of keratinocytes isolated from these biopsies combined with further characterization of perlecan from aged donors revealed that the observed decreased expression is most likely a consequence of a reduced synthesis rather than a protein degradation or a deficient supramolecular exposure. The design and characterization of human skin models engineered with cells from donors of various ages confirmed this hypothesis and revealed that aged keratinocytes showing deficiency in perlecan production and deposit in the basement membrane, also displayed inability to form a multilayed epidermis. Addition of purified perlecan in the culture medium of these skin equivalents enhanced the epidermal thickness and restored a well-differentiated multilayed epithelium. Biological screening of a library compounds allowed the selection of candidates able to increase the expression of epithelial and endothelial-derived perlecan with high specificity. Skin engineering models mimicking ageing human skin demonstrates the capacity of one candidate to restore the perlecan functional failure in promoting epidermal renewal and morphogenesis. Our results suggest that the presence of perlecan in the skin basement membrane appears to be crucial for the maintenance of the epidermal integrity and that its decrease with age may contribute to the epidermal thinning

Les sophorolipides, appartenant à la famille des glycolipides produits par voie microbienne à l'échelle industrielle, possèdent un groupement COOH sensible au pH qui leur confèrent des propriétés d'auto-assemblage uniques. Dans ce travail, nous avons étudié deux variantes de cette molécules, une avec une chaîne alkyle saturée (C18:0 SL) et une avec des groupes acétyles sur la partie sucrée (C18:1a SL). Le C18:0 forme des rubans chiraux à pH < 7.5 que nous avons caractérisés avec des techniques de cryo microscopie, diffusion de la lumière, des neutrons et des rayons-X et de la RMN solide. Le composé mono-insaturé C18:1cis, étudié dans la littérature, s'auto-organise en micelles et ellipsoïdes sous les mêmes conditions que le C18:0 forme des rubans. A pH basique, la charge négative sur le COOH conduit à la formation de plaquettes pour les deux SL, C18:0 et C18:1cis. La molécule acétylée, C18:1a, ressemble dans son comportement au C18:1cis et forme des ellipsoïdes dont la longueur peut être modifiée avec le pH. Finalement, nous avons étudié l'effet du C18:0 sur la prolifération de cellules fibroblastes, pour une éventuelle application dans la cicatrisation de la peau. / Sophorolipids (SL), a family of industrially-scaled bolaform microbial glycolipids, possess a pH-sensitive COOH group and are expected to exhibit a unique self-assembly behavior. In this work, we have studied 2 different types of this molecule, whose chemical structure has been modified on the alkyl chain (leading to the saturated C18:0 SL) and on the sophorose moiety (leading to the acetylated C18:1a SL). The C18:0 SL forms chiral nanofibers only at pH below 7.5 and we have characterized them with powerful techniques such as cryo-TEM, light, neutron and X-Ray scattering and solid state NMR. Interestingly, the mono-unsaturated compound (C18:1cis) self-organizes into micelles and ellipsoids under the same conditions (pH < 7.5), as reported in the literature. At basic pH, the negative charge on the COOH group drives the self-assembly towards platelet-like objects for both, C18:0 and C18:1cis SL. The acetylated compound C18:1a resembles the C18:1cis SL and forms ellipsoids, whose length can be triggered with the pH. Finally, we have investigated cell viability tests of C18:0 SL to human cells (fibroblasts) in vitro for potential wound healing applications of this biosurfactant.

Afin d'obtenir de nouveaux agents dermo-cosmétiques et thérapeutiques issus de l'utilisation traditionnelle de plantes, nous avons sélectionné cinq légumineuses au Venezuela. Trois types d'extraits ont été étudiés : aqueux, éthanolique et un dérivé protéique à partir de l'extrait aqueux. Notre objectif a été de mettre en évidence de nouvelles sources de substances actives au niveau cutané, pour le traitement de l'acné, mais aussi dans le stress oxydant et la régénération cellulaire. L'effet cytoprotecteur, la capacité de la stimulation de la croissance cellulaire, l'efficacité antioxydante vis à vis des fibroblastes dermiques 3T3, ont été analysés in vitro. L'activité antibactérienne a été évaluée envers Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus aureus, des bactéries impliquées dans le processus de l'acné. Nos résultats ont démontré que Machaerium floribundum est une plante très prometteuse, une fonction antioxydante élevée à des concentrations relativement faibles. Cette activité antioxydante est liée à la présence de tanins de type anthocyanes. Les extraits de Machaerium peuvent aussi s'inscrire dans le domaine de la régénération des tissus. Par une activité antibactérienne démontrée sur des germes impliqués dans l'acné, ils offrent une ouverture alternative pour le traitement des peaux acnéiques. / In order to obtain new dermo-cosmetic and therapeutic agents from traditional medicinal plants, highlighting new sources of active substances at the skin level, treatment of the acne, oxidative stress and cell regeneration, five Venezuelan leguminous have been selected. Three types of extracts: aqueous, ethanolic and protein derived from the aqueous extract have been studied. The cytoprotective effect, the ability of the stimulation of cell growth and antioxidant efficiency were analyzed in dermal fibroblasts 3T3 cells. Our results showed that Machaerium floribundum extracts had a very high antioxidant activity at low concentrations. This antioxidant activity is linked to the presence of condensed tannins (polymers of anthocyanins). Also a good antibacterial activity was found using Machaerium ethanolic extracts against bacteria involved in the acne process: Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus offering an alternative for acne treatment.

Contexte: Simuler le comportement du complexe peau/tissu sous-cutané (CPTSC) au cours d'une chirurgie présente de nombreuses difficultés liées principalement à sa complexité anatomique qui génère un comportement mécanique complexe. Les modèles de simulation existants sur ce sujet se présentent majoritairement sous forme d'une mono-couche homogène et isotrope de comportement élastique linéaire. Ils ne prennent jamais en considération les moyens d'union conjonctifs du CPTSC pourtant responsables de la complexité de son comportement mécanique. L'augmentation tissulaire chirurgicale et en particulier l'autogreffe adipocytaire vise à restituer un volume corporel amputé par exemple par un traumatisme ou par une chirurgie carcinologique. A l'heure actuelle, seule l'expérience du chirurgien permet de prévoir l'effet d'une chirurgie d'augmentation tissulaire dans un contexte préopératoire donné. Un outil de simulation et de prévision fiable permettrait d'améliorer l'adhésion des patients à certains protocoles de traitement lourds, d'éviter certaines impasses thérapeutiques ou pourrait servir de support pédagogique.Objectifs: Dans un but de simulation et de prévision chirurgicale, nous avons souhaité développer un modèle mécanique du complexe peau tissu sous-cutané entièrement paramétrable par certaines données morphologiques des patients et adaptable à toute les régions du corps.Patients et méthodes: Afin de confirmer l'existence d'un modèle organisationnel générique du CPTSC, nous avons fait plusieurs acquisitions en IRM 3T de l'ensemble du corps. Ces acquisitions nous ont permis de mettre en évidence une organisation générique du CPTSC qui à été la base d'un modèle géométrique générique paramétrable. Afin de reconstituer l'architecture lobulaire du tissu adipeux et afin de restituer l'effet mécanique des moyens d'unions conjonctifs du CPTSC, nous avons construit de manière procédurale, à l'aide d'une tesselation de Voronoï, l'anatomie lobulaire et les septas inter-lobulaires. Une modélisation mécanique hybride a été réalisée grâce à la plateforme SOFA afin de respecter fidèlement l'organisation complexe du tissu de soutient collagénique. Pour valider le comportement mécanique de notre modèle, nous avons transcrit puis comparer les paramètres de tests d'indentation in vivo à notre modèle générique. Concernant l'augmentation tissulaire, nous avons simulé le phénomène de peau d'orange et les effets de l'autogreffe adipocytaire au dessus et en dessous du plan de fascia superficialis. Nous avons ensuite étudié les conséquences biomécaniques des fasciotomies qui sont utilisées en pratique courante. Nous avons finalement inclus ce modèle générique dans un modèle de face généré à partir des acquisitions IRM afin de simuler une autogreffe adipocytaire au niveau de la face. Résultats: Le modèle générique, paramétré de manière spécifique, nous a permis de transcrire de manière réaliste les tests d'indentation au niveau de l'avant-bras. Les simulations d'injection de graisse autologue ont pu simuler fidèlement les constatations opératoires et nous avons par ailleurs été capable de simuler le phénomène de peau d'orange en s'appuyant sur certaines de ses hypothèses physiopathologique. La simulation des fasciotomies nous a permis d'étudier pour la première fois l'effet mécanique de cette procédure. L'inclusion du modèle procédural dans un modèle géométrique spécifique de la face, acquis à partir de nos images IRM 3T, a pu aboutir à une simulation d'une autogreffe adipocytaire dans la joue. Conclusion: Malgré la mécanique complexe des tissus mous, nous avons pu établir un modèle mécanique fiable qui peut être spécifié de manière paramétrique. Après une phase de validation clinique et certaines améliorations mécaniques, nous souhaitons mettre au point des modèles spécifiques utilisables en simulation chirurgicale. / Background: Simulate the skin / subcutaneous tissue complex behavior presents many difficulties mainly related to its anatomical complexity that generates a complex mechanical behavior. Current simulation models on this subject appear mainly in the form of a homogeneous single layer of isotropic and linear elastic behavior. They never take into account the connective means of union of the skin and subcutaneous tissue which are responsible of the complexity of the mechanical behavior. The surgical tissue augmentation procedures and in particular autologous fat grafting aims to restore corporal volumes after a trauma or a carcinologic surgery. Currently, only the experience of the surgeon can predict the effect of a surgical tissue augmentation in a given preoperative context. A simulation and reliable prediction tool would improve patient adherence to certain protocols of heavy treatment, would avoid certain therapeutic impasses or could be used as a teaching aid.Objectives: As a surgical prevision and simulation tool, we wanted to develop a mechanical model of the skin / subcutaneous complex fully configurable by certain morphological data of patients and adaptable to any parts of the body. Patients and methods: To confirm the existence of a generic organizational model of subcutaneous tissue, we made several acquisitions in 3T MRI of the whole body. These acquisitions allowed us to highlight a generic pattern of organization of subcutaneous tissue that has been the basis of a generic geometric model fully configurable. To reconstruct the lobular architecture of adipose tissue and to restore the mechanical effect of the connective means of union, we constructed in a procedural manner, using a Voronoi tessellation. Hybrid mechanical modeling was performed with the SOFA framework. To validate the mechanical behavior of our model, we parametrized our generic model and transcribed the parameters of an in vivo indentation test and compare the results. Concerning tissue augmentation procedures, we simulated the phenomenon of cellulite and the effects of autologous fat grafting above and below the plane of superficial fascia. We then studied the biomechanical consequences of fasciotomies which are used in current practice. We finally included in our generic model of a face model generated from MRI acquisitions to simulate autologous adipocyte at the level of the cheek. Results: The model, allowed us to transcribe realistically indentation tests at the level of the forearm. Autologous fat injection simulations have faithfully simulate the operative findings and we have also been able to simulate the phenomenon of cellulite relying on some of its pathophysiological hypotheses. The simulation of fasciotomies has allowed us to study for the first time, the mechanical effect of this procedure. The inclusion of procedural model in a specific geometric model of the face result in an acurate simulation cheek fat grafting. Conclusion: Despite the complex mechanics of non visceral soft tissues, we have established a reliable mechanical model that can be specified parametrically. After a phase of clinical validation and some mechanical improvements, we hope to develop specific models used in surgical simulation.