Background: Migraine is a common disease with a global prevalence of about 15%. Migraine is divided into two main types; migraine with aura or migraine without aura. Migraine symptoms include moderate or severe unilateral pulsating pain exacerbated by physical activity, nausea and vomiting as well as light and sound sensitivity. Headaches lasting ≥ 15 days per month of which ≥ 8 of the days are migraine are defined as chronic migraine. Episodic migraine is defined as less than 15 headache days per month. The full reasons for how and why migraine arises are not yet fully understood. The main hypothesis is that migraine is due to a hypersensitivity in the brain that involves activating and sensitizing the trigeminovascular system. Calcitonine-related peptide (CGRP) has been shown to be an important neurotransmitter in the pathophysiology of migraine that mediates pain through vasodilation of intracranial vessels and an increased sensitivity of A-δ fibers. New drugs in the form of monoclonal antibodies directed against CGRP or the CGRP receptor have been developed to try to stop the CGRP signaling. Currently, there are four approved drugs: galcanezumab, fermanezumab and eptinezumab, which are three monoclonal antibodies directed against CGRP and erenumab which is a monoclonal antibody directed against the CGRP receptor. Purpose: The purpose of this literature study was to investigate how effective treatment with the monoclonal antibodies erenumab, fremanezumab, galcanezumab and eptinezumab directed against CGRP or the CGRP receptor is as prophylaxis against episodic and chronic migraine versus placebo. Method: A literature study was performed by reviewing articles retrieved from the Pubmed database. A free text search was done in Pubmed with the keywords "fremanezumab" OR "eptinezumab" OR "galcanezumab" OR "erenumab". The studies should be randomized, double-blind and placebo-controlled with the aim of investigating the efficacy and tolerability of treatment with erenumab, fremanezumab, galcanezumab or erenumab. A total of eight studies were selected for review. Results: Two studies reviewed erenumab, three studies reviewed fremanezumab, two studies reviewed galcanezumab and one study reviewed eptinezumab. The results showed that all four substances significantly reduced the number of migraine days per month compared to placebo with a mean change of −2.1. Number needed to treat (NNT) to produce ≥ 50 % reduction in migraine frequency varied between 4 – 33 in the eight studies. Conclusion: The results of the eight studies showed that treatment with erenumab, fremanezumab, galcanezumab or eptinezumab in patients with chronic and episodic migraine significantly reduce the number of migraine days per month compared to placebo. The treatments have been well tolerated and there have been relatively few side effects that have been comparable to placebo. However, more long-term studies need to be done to detect any long-term side effects.

Title: Raman optical activity and conformational flexibility of peptides in solution Author: Jana Hrudíková Department: Institute of Physics of Charles University Supervisor: Doc. RNDr. Vladimír Baumruk, DrSc. Supervisor's e-mail address: baumruk@karlov.mff.cuni.cz Abstract: Molecular flexibility can significantly modify Raman and ROA spectral intensities, band positions and the ROA signs. Taking into account dynamic aspects of behavior of studied molecules in solution via conformational averaging therefore seems to be crucial for spectral interpretation. The first of studied models, histidine, plays an important role in metallo-enzymatic reactions and peptide folding, due to its imidazole ring. ROA spectra of His at different pH, His complexed with Cu2+ and dipeptides His- Gly and Gly-His were recorded on the spectrometer built at the Institute of Physics of the Charles University as a first step of the subsequent study. The second studied system, a cyclic hexapeptide c-(Phe-D-Pro-Gly-Arg-Gly-Asp), serves as a convenient model for β- hairpin and anti-parallel β-sheet. It was previously studied by means of VCD and IR. From molecular dynamics simulations 10 peptide geometries were selected for spectral modeling. The Raman and ROA spectra were calculated ab initio. For a model fragment Phe-D-Pro, which...

This work focuses on anorexigenic neuropeptides, cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) and prolactin-releasing peptide (PrRP), which decrease food intake and body weight. CART peptide is an anorexigenic neuropeptide and, despite many efforts, its receptor has not yet been identified. We found CART peptide specific binding sites in pheochromocytoma PC12 cells. Cells differentiated to neurons increased significantly the number of binding sites. On the other hand, after differentiation to chromaffin cells the number of binding sites was so low that it was impossible to determine their density. To clarify the importance of each of the three disulfide bridges in the CART molecule, analogs with one or two disulfide bridges were synthetized. The biological activity was maintained in analog with two disulfide bridges in positions 74-94 and 88-101. Moreover, we demonstrated the stimulation of JNK and subsequently c-Jun activation in PC12 cells. Neuropeptide PrRP belongs to the RF-amide peptide family and has anorexigenic properties. PrPR has a high affinity to GPR10 and neuropeptide FF (NPFF2) receptor. In our laboratory lipidized analogs of PrRP were synthesized, which are able to decrease food intake after peripheral administration and may cross the blood-brain barrier. We tested biological...

This work focuses on anorexigenic neuropeptides, cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) and prolactin-releasing peptide (PrRP), which decrease food intake and body weight. CART peptide is an anorexigenic neuropeptide and, despite many efforts, its receptor has not yet been identified. We found CART peptide specific binding sites in pheochromocytoma PC12 cells. Cells differentiated to neurons increased significantly the number of binding sites. On the other hand, after differentiation to chromaffin cells the number of binding sites was so low that it was impossible to determine their density. To clarify the importance of each of the three disulfide bridges in the CART molecule, analogs with one or two disulfide bridges were synthetized. The biological activity was maintained in analog with two disulfide bridges in positions 74-94 and 88-101. Moreover, we demonstrated the stimulation of JNK and subsequently c-Jun activation in PC12 cells. Neuropeptide PrRP belongs to the RF-amide peptide family and has anorexigenic properties. PrPR has a high affinity to GPR10 and neuropeptide FF (NPFF2) receptor. In our laboratory lipidized analogs of PrRP were synthesized, which are able to decrease food intake after peripheral administration and may cross the blood-brain barrier. We tested biological...

Die sichere Diagnose der Lyme-Borreliose und der Nachweis des verursachenden Spirochäten Borrelia burgdorferi bei Mensch und Tier sind problematisch. In Nordamerika ist B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.) die einzige pathogene Spezies, während in Europa und Asien mit B. garinii und B. afzelii mindestens zwei weitere pathogene Arten vorkommen. B. valaisiana, B. spielmanii und B. lusitaniae werden ebenfalls als Verursacher der Lyme-Borreliose diskutiert. Der indirekte Erregernachweis durch Detektion von Antikörpern mittels Antigen aus Borrelienlysat im Zweistufentest (ELISA und Western-Blot) gilt seit langem trotz der anspruchsvollen Interpretationskriterien als Methode der Wahl. Ein hochspezifischer ELISA mit dem synthetischen C6 Peptid als Antigenkomponente ergänzt erst seit wenigen Jahren die Diagnostik. Das C6-Peptid basiert auf der invariablen Region 6, welche eine konstante Region des ansonsten hochvariablen Borrelien-Oberflächenproteins VlsE darstellt. Nur metabolisch aktive Borrelien exprimieren VlsE/C6 Epitope im Säugetierwirt. Studien zeigten, dass C6-Antikörper mehrere Monate nach einer potenziell erfolgreichen antibiotischen Therapie deutlich messbar und langfristig absinken. In Deutschland sind ein C6-Schnelltest (4Dx®SNAP®, IDEXX Inc., USA) und ELISA (Quant C6®, IDEXX Inc., USA) für die Serodiagnostik bei Hunden erhältlich. Über die Anwendbarkeit des C6-Peptids für die kanine Borreliosediagnostik in Deutschland liegen wenige Daten vor, aber zunehmend wird der Ersatz des Zweistufentests durch das C6-Peptid diskutiert. In dieser Arbeit sollte zunächst festgestellt werden, ob potenzielle kanine Infektionen in der Routinediagnostik mit dem C6-Peptid ebenso sensitiv detektiert werden können wie mit dem Zweistufentest und ob C6-positive Hunde nach einer Antibiose mit dem deutlichen Sinken der C6 Antikörperspiegel als Zeichen eines potenziellen Therapieerfolges reagieren. Dafür wurden 510 Sera von Hunden aus verschiedenen deutschen Tierarztpraxen untersucht, wobei neben der serologischen Untersuchung eine Analyse der Vorberichte erfolgte. Eine dort angegebene, bestehende Infektion konnte in 93,3 % der Fälle serologisch nicht bestätigt werden und nur bei 3,3 % der Hunde wurden infektionsspezifische Antikörper ermittelt. Der Zweistufentest und der C6 Schnelltest wiesen hier eine vollständige Übereinstimmung auf. Unabhängig vom Vorliegen klinischer Anzeichen wurden für diese Studie C6-positive Hunde mit Antibiotika behandelt. Vier bis 18 Monaten nach der Therapie wurde von insgesamt 27 Hunden eine zweite Blutprobe untersucht. Die C6 Antikörperspiegel waren bei acht Hunden im ELISA um mindestens 50 % gesunken. Für deutliche Effekte musste aber ein ausreichend hoher initialer C6-Antikörperspiegel vorliegen. Da in Europa mindestens drei pathogene Borrelienarten vorkommen, wurde in einem murinen Infektionsmodell analysiert, ob speziesspezifische C6-Peptide von B. burgdorferi s.s., B. garinii und zwei Varianten von B. afzelii sicher Antikörper detektieren, die durch definierte experimentelle Monoinfektionen mit B. burgdorferi s.s. N40, B. garinii PBi, B. afzelii Slovakia, B. afzelii PKo, B. valaisiana, B. spielmanii oder B. lusitaniae induziert wurden. Um die erfolgreiche Infektion zu belegen, wurden murine Gewebe zur Borrelienisolation in Kulturmedien inkubiert und zusätzlich eine qPCR zum Nachweis von ospA durchgeführt. Eine PCR zur Detektion von essenziellen Plasmiden ergab, dass die B.-lusitaniae- und B.-valaisiana-Isolate nicht infektiös waren. Eine Infektion konnte durch Gewebekultur und qPCR dagegen bei mit B.-burgdorferi-s.s.-, B- garinii-, B.-afzelii- und B. spielmanii-inokulierten Mäusen belegt werden. Die Ergebnisse des C6-Peptid-ELISAs wurden mit dem des Zweistufentests als Goldstandard verglichen und die Sensitivitäten der C6-Peptide ermittelt. Diese betrug bei C6-Peptiden von B. burgdorferi s.s. und B. garinii je 100 % für B.¬burgdorferi¬s.s.¬N40, B. garinii-PBi- oder B.-afzelii-PKo-spezifische C6-Antikörper. Dagegen konnten C6-Peptide basierend auf B. afzelii nur B.-afzelii-PKo-spezifische Antikörper zu 100 % erfassen. Antikörper gegen B. afzelii Slovakia wurden von jedem C6-Peptid schlechter erfasst als Antikörper gegen B. afzelii PKo, was das Vorkommen stamm- oder isolatspezifischer C6-Antikörperfraktionen nahelegt. Die Untersuchung der 27 C6-positiven Hundesera aus der serologischen Studie ergab zudem, dass der Großteil der Sera ausschließlich gegenüber B.-burgdorferi-C6 und B.-garinii-C6 deutlich messbar reagierte. Die Eignung des C6-Peptids in praxi als ein schneller, hochspezifischer Infektionsmarker für den serologischen Nachweis bei Hunden aus Deutschland kann bestätigt werden. Allerdings kann der alleinige Nachweis von C6-Antikörpern weder einen detaillierten Vorbericht, noch den Zweistufentest auf Lysatantigen-Basis ersetzen. Seine Eignung als Marker für einen potenziellen Therapieerfolg ist nur unter definierten Bedingungen gegeben. Die divergenten Sensitivitäten verschiedener C6 Peptidsequenzen gegenüber Antikörpern von in Europa vorkommenden Borrelien-Arten und Isolaten machen deutlich, dass zukünftig weiterer, intensiver Forschungsbedarf bezüglich der Etablierung von ausreichend sensitiven C6-Testsystemen für europäische Bedürfnisse notwendig ist.

Rapporten syftar till att ge en overskådlig bild av den aktuella peptidbaseradelläkemedelsmarknaden. Från en i rapporten definierad marknad har primärdata kring etablerade företag på marknaden, samt peptidbaserade läkemedel till försäjning på marknaden, sammanställts. Rapporten finner att onkologiska- och metaboliska sjukdomar är överrepresenterade i statistiken, vilket även stöds av rapporter från tredje part. Utforskandet av samarbeten mellan företag och akademi, företag och företag, och andra samarbetsformer presenteras också. En tydlig trend i dessa undersökningar tyder på att kontraktsbaserade samarbeten mellan organisationer, där forskning och produktion görs av ett externt företag som ett annat företag använder sig av, är på uppgång. Detta sänker kostnader för framställningen av nya läkemedel, och effektiviserar denna process. Trender inom forskningen talar också för att folkhälsosjukdomar i västvärlden ar trendsättande för läkemedelsföretagens inriktningar. Rapporten baseras på primärt insamlad statistik som verifieras genom rapporter från tredje part, fallstudier för att exemplifiera generaliseringar gjorda av andra källor, samt reflektioner kring vad denna information utrönar i för slutsats.

A investigação dos mecanismos de interação dos vírus com as células do hospedeiro trazem informações relevantes para a identificação de alvos no desenvolvimento de drogas para impedir a penetração e/ou desenvolvimento dos vírus. Peptídeos desenhados a partir de proteínas virais foram desenvolvidos e testados quanto as suas capacidades de inibir o processo de fusão do vírus com a célula do hospedeiro. Alguns se encontram em fase de avaliação clínica. Anticorpos contra a proteína p24 do HIV-1 foram detectados no soro de pacientes HIV-positivos, e estes reconhecem pequenas seqüências peptídicas desta proteína. Neste trabalho foi analisada a interação entre uma seqüência peptídica correspondente aos aminoácidos 196-224 (AAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIA) da proteína p24, denominado p24- 1, com sistemas biomiméticos. Os sistemas utilizados foram filmes de Langmuir (monocamadas) de dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e vesículas multilamelares (MLVs) de DPPC. O p24-1 encontra-se desorganizado em solução aquosa, mas com a interação com as MLVs de DPPC teve induzido uma conformação hélice ?, de acordo com o espectro de dicroísmo circular (CD). Esta característica foi confirmada pela predição de hélice a seguida por uma estrutura não ordenada contendo 11 resíduos do p24-1. As isotermas de pressão e potencial de superfície das monocamadas de DPPC foram afetadas com a presença de 0,05% mo1 de p24-1, com uma expansão de aproximadamente 5%. Para concentrações acima de 0,5% mo1 de p24-1 a expansão foi de 20%, com saturação do efeito da concentração. O efeito de expansão foi acompanhado por uma alteração na morfologia das monocamadas, estudados com microscopia no ângulo de Brewster (BAM). A incorporação do p24-1 impede a formação de grandes domínios de DPPC. O efeito cooperativo causado na monocamada de fosfolipídios pelo p24-1 sugere que esse tem um potencial na atividade antiviral por participar da expansão da membrana da célula hospedeira. / The investigation of the interaction mechanisms between the viruses and the host cells brings relevant information for the identification of targets on the development of drugs to prevent the penetration and/or development of the viruses. Peptides designed from viral proteins have been developed and tested on its capacities of inhibiting the merging process of the virus with the host cell. Some of them are in clinical evaluation. Antibodies against the protein p24 of the HIV-1 have been detected in the serum of HIV-positive patients, and they are able to recognize short peptide sequences of this protein. In this work, it was analyzed the interaction between a peptide sequence corresponding to amino acids 196-224 (AAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIA) of the protein p24, called p24- 1, and biomimetic systems. The systems used were Langmuir films (monolayers) of dipalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC) and dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG) and multilamelar vesicles (MLVs) of DPPC. p24-1 is found disorganized in watery solution, but with the interaction with the MLVs of DPPC it had induced a conformation ?-helix, according to the circular dichoism spectra (CD). This characteristic was confirmed by the prediction of ?-helix followed by an unordered structure with 11 residues of p24-1. The isotherms of pressure and potential of surface of the DPPC monolayers were affected by the presence of 0,05% mo1 of p24-1, with an expansion of approximately 5%. For concentrations above 0,5% mol of p24-1 the expansion was 20%, with saturation of the concentration effect. The expansion effect was followed by a morphologic alteration of the monolayers, studied with microscopy of the Brewster angle (BAM). The incorporation of p24-1 prevents the formation of large domains of DPPC. The cooperative effect caused in the phospholipid monolayer by p24-1 suggests that this peptide has a potential in the antiviral activity, once its participates on the expansion of the host cell membrane.

Hintergrund: RGD-Peptide hemmen kompetitiv die Adhäsionsmoleküle von Linsenepithelzellen (LEC). Ziel unserer Untersuchungen war es herauszufinden, ob diese Peptide in der Lage sind, auch nach Kurzzeitinkubation eine suffiziente Inhibition der Adhäsion bzw. eine Ablösung adhärenter Zellen und damit eine ausreichende Prävention des Nachstars zu bewirken. Außerdem wurde überprüft, ob das von uns verwendete RGD-Peptid eine Toxizität für die Hornhaut aufweist. Material und Methoden: Kulturen boviner und humaner LEC, boviner Hornhautendothelzellen, humane und bovine Linsenkapselexzidate und humane explantierte Hornhäute wurden verwendet. Wir untersuchten die Inhibition der Adhäsion und die Ablösung konfluenter LEC-Layer mittels des zyklischen RGD-Peptids cRGDDFV (Inkubationszeiten von 1 Stunde bzw. 5-7 Tagen und Konzentrationen von 10-4 M, 10-3 M und 2x10-3 M wurden angewandt). Ergebnisse: Wir fanden nach nur einstündiger Inkubation in der Kulturschale eine Adhäsionsinhibition von 48% für bovine LEC und von 100% für humane LEC. Die Differenz zwischen Kontrollpeptid und cRGDDFV war statistisch signifikant (p / Purpose: RGD-peptides competitively inihibit adhesion molecules of the lens epithelial cells (LEC). The purpose of our study was to investigate whether this peptide could be able to inhibit adhesion sufficiently after short term incubation resp. to detach adherent cells and so to prevent posterior capsule opacification (PCO). Also there was proofed if there is any toxicity for the cornea. Methods: Cultures of bovine and human LEC, bovine cornea endothelial cells, humane and bovine fragments of the lens capsule and explanted humane corneas were used. The inhibition of adhesion and the detachment of confluent LEC-layer by the cyclic RGD-peptide cRGDDFV were studied (incubation time was 1 hour resp. 5-7 days and concentrations of 10-4, 10-3 M and 2x10-3 M were used). Results: After one hour incubation time in a culture dish inhibition of adhesion was 48% for bovine LEC resp. 100% for humane LEC. There was a statistically significant difference between the control-peptide-group and cRGDDFV (p

Die meisten Lebewesen nutzen zur Abwehr von pathogenen Mikroorganismen u.a. ein weites Spektrum von antimikrobiellen, oft kationischen Peptiden. Etliche dieser natürlichen und künstlichen Peptide sind in der Lage, Bakterienprodukte wie das Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien zu binden. LPS ist als potenter Stimulator des Immunsystems ein bedeutender Faktor bei der Entstehung von Infektion und Entzündung. LPS-bindende kationische Peptide, zu denen auch von der LPS-Bindungssequenz des Limulus-anti-LPS-Faktors (LALF) abgeleiteten Ringpeptide gehören, wirken synergistisch zu den klassischen Antibiotika, ohne jedoch wie diese zu einer vermehrten LPS-Freisetzung zu führen. LALF-Peptide zeigten in bisher veröffentlichten Versuchen vielversprechende Ergebnisse bei der Bindung von LPS und in murinen Sepsismodellen. In der vorliegenden Arbeit wird in Versuchen mit humanen Monozyten und murinen Makrophagen gezeigt, dass neuartige LALF-Peptide eine durch LPS induzierte Ausschüttung des Zytokins TNF-alpha und des vasoaktiv wirksamen Stickstoffoxids wirkungsvoll unterdrücken können. Ferner wird in LPS-Bindungsassays nachgewiesen, dass dies durch eine Blockierung der LPS-Erkennung durch das LPS bindende Protein (LPB) verursacht wird. Die Verwendung von D-Aminosäuren verspricht dabei in ersten in vitro Experimenten eine Optimierung der Peptid-Eigenschaften. Die Entschlüsselung der Wirkmechanismen dieser neuartigen Peptide könnte Auswirkungen auf die Entwicklung neuer therapeutischer Interventionsstrategien bei Infektion und Sepsis haben. / In host defense against pathogenic microorganisms most organisms employ a broad spectrum of antimicrobial, often cationic peptides. Several of these natural or synthetic peptides are able to bind bacterial products like Lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria. As a potential stimulator of the immune system LPS is an important pathogenetic factor for infection and inflammation. Cationic LPS-binding peptides like cyclic peptides corresponding to the LPS-binding domain of the Limulus-anti-LPS-factor (LALF) have been shown to act synergistic to classic antibiotics. An advantage of these compounds, however, may be their lack of induction of LPS release. In previous studies LALF-peptides have shown promising results for binding LPS, and in murine sepsis models. Here we show in experiments with human monocytes and murine macrophages that novel LALF-derived peptides are able to effectively block the LPS-induces release of the cytokine TNF-alpha and of the vasoactive nitric oxide. In addition it is shown here by employing an LPS-binding assay that this activity is caused by inhibition of LPS-recognition brought about by the LPS binding protein (LBP). In first in vitro experiments the use of D-amino acids looks promising as they improve peptide quality. To further elucidate the mode of action of these novel peptides could lead to the development of new therapeutic strategies against infection and sepsis.

Hepcidin-25, ein 2000 entdecktes Peptidhormon, das eine Schlüsselrolle im Eisenstoffwechsel spielt, hat das Verständnis von Eisenerkrankungen revolutioniert. In dieser Studie wurde LC gekoppelt mit einem Triple-Quadrupol MS in einer schnellen und robusten Methode zur Quantifizierung von Hepcidin-25 in menschlichem Serum verwendet, welche letztlich in Routine-Laboratorien genutzt werden soll. Zu diesem Zweck wurden zwei Probenvorbereitungsstrategien und zwei komplementäre LC Bedingungen untersucht, wobei eine saure mobile Phase (0,1% TFA) mit einem neuartigen Ansatz unter der Verwendung einer basischen mobilen Phase (0,1% NH3) verglichen wurde. In einem laborinternen Vergleich beider LC-MS/MS Methoden wurde Hepcidin-25 in humanen Proben unter Verwendung der gleichen Kalibrierstandards quantifiziert und eine sehr gute Korrelation der Ergebnisse ermittelt. Hierbei wurde die Analysestrategie mit saurer mobiler Phase als hochsensitiv (LOQ von 0,5 μg/L) und präzise (CV <15%) befunden und als Kandidat einer Referenzmethoden für die Hepcidin-25 Quantifizierung in realen Proben empfohlen. Einer der neuartigen Aspekte der Methodik war die Verwendung von Amino- und Fluor-silanisierten Autosampler-Fläschchen, um die Adsorption des 25 Reste umfassenden Peptids anOberflächen zu reduzieren. Darüber hinaus wurde diese LC-MS/MS-Methode in einer internationalen Ringversuchsstudie eingesetzt, bei der ein sekundäres Referenzmaterial als Kalibrierstandard verwendet wurde, und gemäß des International Consortium for Harmonization of Clinical Laboratory Results (ICHCLR) als optimal bewertet. In dieser Arbeit wurde die Bildung von Hepcidin-Komplexen mit Kupfer(II) untersucht. Die erste Umkehrphasen-chromatographische Trennung von Hepcidin-25/Cu(II) und Hepcidin-25 (Kupfer "frei") wurde unter Verwendung von mobilen Phasen mit 0,1% NH3 erreicht. LC-MS/MS und FTICR-MS wurden für die Charakterisierung der gebildeten Hepcidin-25-Cu(II)-Spezies bei pH-Werten von 11 bzw. 7,4 verwendet. / Hepcidin-25, a key iron-regulatory peptide hormone discovered in 2000, has revolutionized the understanding of iron-related pathology. This study applied LC-MS/MS, using the triple quadrupole mass spectrometer, in a rapid and robust analytical strategy for the quantification of hepcidin-25 in human serum, to be implemented in routine laboratories. For this purpose, two sample preparation strategies and two complementary LC conditions were investigated, where the use of acidic mobile phases (0.1% TFA) was compared with a novel approach involving solvents at high pH (0.1% NH3). The application of these LC-MS/MS methods to human samples in an intra-laboratory comparison, using the same hepcidin-25 calibrators, yielded a very good correlation of the results. The LC-MS/MS employing trifluoroacetic acid-based mobile phases was selected as a highly sensitive (LOQ of 0.5 µg/L) and precise (CV<15%) method and was recommended as a reference method candidate for hepcidin-25 quantification in real samples. One of the novel aspects of the methodology was the use of amino- and fluoro-silanized autosampler vials to reduce the interaction of the 25-residue peptide to laboratory glassware surfaces. Moreover, this LC-MS/MS method was used for an international round robin study, applying a secondary reference material as a calibrator and its performance was found to be in the optimal range as defined by the International Consortium for Harmonization of Clinical Laboratory Results (ICHCLR). In this work, the formation of hepcidin-25 complexes with copper(II) was investigated. The first reversed-phase chromatographic separation of hepcidin-25/Cu2+ and hepcidin-25 (copper “free”) was achieved by applying mobile phases containing 0.1% NH3. LC-MS/MS and FTICR-MS were applied for the characterization of the formed hepcidin-25-Cu(II) species at pH values of 11 and 7.4 respectively. A new species corresponding to hepcidin-25 complexed with two copper ions was identified at high pH.