Notre équipe de recherche a récemment développé les premiers inhibiteurs d’une enzyme à DDE, la transposase MOS1, une enzyme analogue à l’intégrase du VIH-1. Ces molécules, de type bisfurylmaléimides, ont également montré une efficacité contre les activités enzymatiques de l’intégrase du VIH. En se basant sur ces résultats, nous avons entrepris la synthèse de nouveaux bisfurylmaléimides dans le but d’identifier de nouveaux inhibiteurs de l’intégrase et de proposer de nouvelles molécules dans la lutte contre le virus responsable du SIDA. L’originalité de notre démarche est l’utilisation de la transposase MOS1 comme modèle pour concevoir nos molécules. Les méthodologies utilisées pour accéder à ces molécules font essentiellement appel à la chimie catalysée par des métaux de transition mais aussi à des réactions de chimie hétérocyclique telles que des réactions de Mitsunobu, de Knoevenagel ou encore de Horner-Wadsworth-Emmons. L’ensemble des molécules synthétisées a fait l’objet d’une évaluation de leurs activités inhibitrices sur la transposase MOS1 et l’intégrase du VIH-1. Leurs propriétés antivirales contre le VIH ont également été évaluées. Parallèlement à ces travaux, nous nous sommes intéressés à la réactivité du noyau maléimide dans des réactions de couplage pallado-catalysées et plus particulièrement dans des couplages de Sonogashira. / Our research team has recently developed the first inhibitors of a DDE enzyme, MOS1 transposase, an enzyme similar to the HIV-1 integrase. These molecules, having a bisfurylmaleimide structure, also showed efficacy against enzymatic activities of HIV integrase. Based on these results, we undertook the synthesis of new bisfurylmaleimides in order to identify new integrase inhibitors and propose new molecules in the fight against the virus that causes AIDS. The originality of our approach is the use of MOS1 transposase as a model for designing our molecules. Methodologies used to access these molecules are essentially involving chemistry catalyzed by transition metals but also reactions of heterocyclic chemistry such as Mitsunobu, Knoevenagel or Horner-Wadsworth-Emmons reactions. All synthesized molecules has been evaluated for their inhibitory activities on the MOS1 transposase and HIV-1 integrase. Their antiviral properties against HIV were also evaluated. Parallel to this work, we investigated the reactivity of the maleimide core in palladium-catalyzed cross-coupling reactions especially in Sonogashira couplings.

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G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest family of membrane receptors and are involved in numerous physiological processes. Collectively, these receptors are also prominently targeted by the pharmaceutical industry due to their implications in multiple diseases and disorders. GPCR signaling is tightly regulated. Several kinases, activated downstream of the receptor, initiate negative feedback loops; and arrestins play a crucial role in these regulatory processes by desensitizing the ligand–activated receptor and promoting its endocytosis. By doing so, arrestins control the duration and the amplitude of signal transduction at the cell surface. In the last few years, several non-canonical roles have also been attributed to arrestins, such as the post-endocytic activation of several signalling pathways, or the regulation of crosstalks between GPCRs and various other signalling events. My thesis project was aimed at providing a better understanding of the non-canonical functions of arrestins. The first objective of my research work was to investigate a possible reciprocal effect of the activation of the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) on GPCR signaling. We demonstrated that stimulation of ERK1/2, either by a cell surface receptor or a constitutively active mutant, leads to a reduction in steady-state expression levels of many GPCRs at the cell surface. This receptor redistribution mechanism is dependent on beta-arrestins phosphorylation. In vitro kinase assays combined with complementation experiments in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking beta-arrestins, revealed that beta-arrestin-2 phosphorylation on Ser14 and Thr276 is essential for the ERK1/2-promoted GPCR sequestration. This ERK1/2- and arrestins mediated regulatory process was found to result in a global dampening of cell responsiveness. The second objective of my research work was to identify and develop a small organic compound that inhibits the interaction between arrestins and the adaptor protein AP-2, without interfering with the recruitment of arrestin to the receptor. This inhibitor, named Barbadin, was found to specifically block endocytic processes that are dependent on the interaction between arrestins and the appendage domain of the b-subunit of AP-2. We demonstrated its value as an analytical tool in studying the role of the arrestins in GPCR signaling, such as cAMP production and ERK1/2 activation. These results support the concept that beta-arrestin/AP-2-dependent signaling is important to both G protein-dependent and -independent pathways. The third objective of my research work was to develop a BRET-based biosensor able to detect signal-dependent PTEN conformational changes. This biosensor was validated by monitoring PTEN activation induced by targeted mutations affecting key intramolecular interactions or by modulating signalling pathways that impact PTEN function. We also demonstrated the value of this biosensor in studying PTEN/protein interactions using two known interactors that activate PTEN, beta-arrestin-2 and RhoA. Finally, we uncovered PTEN activation by several GPCRs, previously unknown as PTEN regulators. Given the central role of the tumor suppressor PTEN in oncogenesis, this biosensor could also provide a precious tool for anti-cancer drug research. To conclude, my research work highlighted non-canonical mechanisms for arrestins to activate GPCR-dependent signaling pathways, such as cAMP, ERK1/2 and PTEN, as well as negatively regulate GPCR signaling upon phosphorylation by ERK1/2. This work was made possible by the development of new tools: a beta-arrestin inhibitor named Barbadin and a PTEN BRET-based biosensor that have both shown their usefulness in studying beta-arrestin noncanonical signaling. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques. Cette famille de récepteurs constitue aussi une cible majeure dans la recherche pharmaceutique au vu de son importance dans de nombreuses pathologies. La signalisation des RCPG est étroitement régulée. Plusieurs kinases activées en aval du récepteur initient des boucles de régulation négative. Les arrestines jouent un rôle clé dans ces processus de régulation en favorisant la désensibilisation du récepteur activé par le ligand, suivie de son endocytose. Ainsi, les arrestines contrôlent la durée et l’amplitude de la transmission du signal à la surface de la cellule. Ces dernières années, plusieurs rôles non-canoniques ont été attribués aux arrestines comme l’activation de voies de signalisation post-endocytiques, ou la modulation de la régulation croisée entre les RCPG et d’autres acteurs de la signalisation cellulaire. Le premier objectif de mon travail de recherche est d’examiner l’effet réciproque de l’activation des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) sur la signalisation des RCPG. Nous avons démontré que la stimulation de ERK1/2, soit par un récepteur de surface soit par l’utilisation d’un mutant constitutivement actif, conduit à la baisse de l’expression de surface basale de nombreux RCPG. Des essais kinases in vitro, combinés à des expériences de complémentation dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), où les gènes beta-arrestine-1/2 ont été supprimés, démontrent l’importance de la phosphorylation par ERK1/2 des résidus Ser14 et Thr276 dans ce mécanisme de séquestration des RCPG. Cette régulation, contrôlée par ERK1/2 et arrestine, conduit à une baisse globale de la capacité de réponse de la cellule aux stimuli extracellulaires. Le deuxième objectif de mon travail de recherche est d’identifier et de développer une petite molécule organique qui inhibe l’interaction entre l’arrestine et la protéine adaptatrice du complexe d’endocytose AP-2, sans toutefois empêcher la formation du complexe arrestine/récepteur. Cet inhibiteur, nommé Barbadin, bloque sélectivement les processus d’internalisation dépendants de l’interaction entre arrestine- et la sous-unité beta2 de la protéine adaptatrice AP-2. Barbadin représente le premier inhibiteur des fonctions d’arrestine, et nous avons démontré son utilité comme outil analytique pour déterminer la contribution des arrestines dans l’activation de plusieurs voies de signalisation en aval des RCPG, telles que la production d’AMP cyclique (AMPc) ou l’activation des kinases ERK1/2. Nos résultats démontrent l’importance du complexe arrestine/AP-2 dans la signalisation dépendante et indépendante des protéines G. Le troisième objectif de mon travail de recherche est de développer un biosenseur BRET capable de mesurer les changements de conformation du suppresseur de tumeur PTEN. Nous avons validé ce biosenseur en mesurant l’activation de PTEN suite à des mutations ciblées déstabilisant les interactions intramoléculaires au sein de cette protéine ou en modulant différentes voies de signalisation qui affectent sa fonction. Nous avons démontré l’intérêt de ce nouvel outil dans l’étude des interactions entre PTEN et des partenaires protéiques, en utilisant deux interacteurs connus pour activer PTEN : b-arrestine-2 et RhoA. Finalement, en utilisant ce biosenseur, nous avons démontré pour la première fois la capacité de plusieurs RCPG à induire l’activation de PTEN. Étant donné le rôle central de PTEN dans le développement tumoral, ce biosenseur constitue aussi un outil précieux pour la recherche de nouveaux médicaments anticancer. Ainsi, au travers de ces trois lignes directrices, nous avons pu mettre en lumière de nouveaux rôles non-canoniques des arrestines, soit dans l’activation de voies de signalisation, (comme la production d’AMPc, l’activation de ERK1/2 ou de PTEN), soit comme régulateur négatif de la signalisation des RCPG après phosphorylation par ERK1/2. Ce travail a été rendu possible par le développement de nouveaux outils pour l’étude des RCPG : un inhibiteur de beta-arrestine, Barbadin, et un biosenseur BRET de PTEN ; tous deux ayant démontré leur utilité dans l’étude des voies de signalisation non-canoniques des arrestines.

L’ataxie spinocérébelleuse de type 3, aussi connue en tant que la maladie de Machado-Joseph (MMJ), est une maladie qui se développe lorsqu’il y a une expansion des trinucléotides CAG dans la région codante du gène ATXN3. Ce dernier code pour la protéine ATXN3, une enzyme désubiquitinante avec des fonctions essentielles dans le maintien et la stabilisation de l’homéostasie protéique, la résistance au stress, la régulation de la transcription, la réparation de l’ADN, l’organisation du cytosquelette et la régulation de la myogenèse. Les principaux symptômes associés à cette maladie sont l’ataxie (le symptôme clé), une détérioration motrice progressive, la dystonie, la spasticité et la rigidité. Du fait de l’absence de thérapie spécifique et efficace pour traiter les individus atteints de la MMJ, l’approfondissement des connaissances liées à cette maladie est nécessaire. Le but de cette thèse est de comprendre davantage les mécanismes et voies de signalisations impliqués dans la pathologie de la MMJ. Pour atteindre cet objectif, à partir de notre modèle transgénique C. elegans MMJ, deux différents criblages ont été effectués : un criblage non biaisé de 3942 composés, et un criblage de modificateurs génétiques à base d’ARN interférent (ARNi) de 387 clones de facteurs de transcription. Le premier criblage nous a permis d’identifier cinq molécules prometteuses : l’alfacalcidol, le chenodiol, le cyclophosphamide, le fenbufen et le sulfaphenazole. Elles ont permis la restauration du défaut de la motilité, la protection contre la neurodégénérescence, et une augmentation de la durée de vie réduite chez les vers mutants. Trois parmi ces molécules, le chenodiol, le fenbufen et le sulfaphenazole ont démontré une nécessité de la présence de HLH-30/TFEB, un régulateur clé de l’autophagie et de la biogenèse lysosomale, pour leurs propriétés neuroprotectrices. Concernant le deuxième criblage, il nous a permis d’identifier un nouveau gène candidat impliqué dans la MMJ, fkh-2/FOXG1. L’inactivation de ce gène a entraîné une aggravation du défaut de la motilité, de la neurodégénérescence, et de la longévité réduite. À l’inverse, sa surexpression a restauré tous ces phénotypes, suggérant ainsi un rôle neuroprotecteur pour FKH-2/FOXG1 dans la MMJ. Le modèle C. elegans de MMJ et les criblages sont des outils puissants permettant un approfondissement des connaissances quant à la pathologie de la MMJ. Pour cette thèse, par l’identification des molécules neuroprotectrices et les facteurs de transcription HLH-30/TFEB et FKH-2/FOXG1, ayant des activités neuroprotectrices dans notre modèle lorsqu’ils sont surexprimés, il a été possible à mieux comprendre la pathologie de la MMJ, ainsi que les mécanismes et les voies de signalisation qui y sont impliqués. Ces découvertes sont prometteuses à investiguer dans des organismes modèles plus avancés, des applications précliniques et également, pour le développement de nouvelles interventions thérapeutiques pour la MMJ. / Spinocerebellar ataxia type 3, also known as Machado-Joseph disease (MJD), is a polyglutamine expansion disease arising from a trinucleotide CAG repeat expansion in the coding region of ATXN3. This gene encodes ATXN3 protein, a deubiquitinating enzyme, which is involved in protein homeostasis maintenance and stabilization, stress resistance, transcription regulation, DNA repair, cytoskeleton organisation and myogenesis regulation. The main symptoms associated with this disease are ataxia (the key symptom), progressive motor deterioration, dystonia, spasticity and stiffness. Due to our incomplete understanding of mechanisms and molecular pathways related to this disease, there are no therapies that successfully treat core MJD patients. Therefore, the identification of new candidate targets related to this disease is needed. The aim of this thesis is to gain insights into the pathways and mechanisms leading to MJD. In order to achieve this goal, we performed two different screens, a blind drug screen of 3942 compounds to identify protective small molecules, and a large-scale RNA interference (RNAi) screen of 387 transcription factor genes leading to identification of modifiers involved in our transgenic C. elegans MJD model. The first screen allowed us to identify five lead compounds restoring motility, protecting against neurodegeneration, and increasing the lifespan in mutant worms. These compounds were alfacalcidol, chenodiol, cyclophosphamide, fenbufen and sulfaphenazole. We then found that three of these compounds, chenodiol, fenbufen and sulfaphenazole required HLH-30/TFEB, a key transcriptional regulator of the autophagy and the lysosomal biogenesis, to complete their neuroprotective activities. The second screen brought us to identify a news hit gene candidate involved in MJD, fkh-2/FOXG1. We showed that inactivation of this gene enhanced the motility defect, neurodegeneration and reduced longevity in our MJD model. However, in opposite, its overexpression rescued all these phenotypes, suggesting a neuroprotective role for FKH-2/FOXG1 in MJD when overexpressed. C. elegans models for MJD and the screenings are promising tools to understand the mechanisms and pathways causing neurodegeneration, leading to MJD. In this study, we identified positively acting compounds that may be promising candidates for investigation in mammalian models of MJD and preclinical applications in the treatment of this disease. Also, we gained insights into the pathways of MJD and found that HLH-30/TFEB and FKH-2/FOXG1 are both implicated in MJD and have neuroprotective activities when they are overexpressed. These promising findings may aid the development of novel therapeutic interventions for MJD.

Les nouveau-nés prématurés sont soumis à de nombreuses procédures douloureuses lors de leur hospitalisation à l’unité néonatale, où la plus fréquente est le prélèvement sanguin au talon. La douleur répétée et non traitée entraîne des conséquences à long terme pour les nouveau-nés prématurés. L’utilisation des interventions de soulagement de la douleur, tant pharmacologiques que non pharmacologiques, est limitée chez cette population. Nous avons donc vérifié la faisabilité et l’effet d’une nouvelle intervention pour le soulagement de la douleur, soit l’odeur du lait maternel. Cette étude pilote visait à évaluer la faisabilité et l’acceptabilité d’une intervention de stimulation olfactive avec du lait maternel pour diminuer la réponse à la douleur des nouveau-nés prématurés, nés entre 28 et 34 semaines de gestation, lors d’un prélèvement sanguin au talon. L’étude pilote a été menée auprès d’un groupe de 12 nouveau-nés prématurés (présence de jumeaux), 11 mères et 20 infirmières dans une unité néonatale de niveau III, soit de soins intensifs. L’odeur du lait maternel a été combinée aux soins standards au moment du prélèvement sanguin au talon et la douleur a été mesurée à l’aide du Premature Infant Pain Profile Revised. Ensuite, les mères et les infirmières ont complété des questionnaires concernant la faisabilité et l’acceptabilité de l’intervention de stimulation olfactive. Des questionnaires auto-administrés remis aux mères (n=11) et aux infirmières (n=20) après l’intervention ont permis de confirmer la faisabilité et l’acceptabilité de l’intervention qui étaient de plus de 80% pour les mères et les infirmières. Les effets observés ont indiqué que plus la compresse imbibée de lait maternel était proche du nez du nouveau-né prématuré plus il semblait y avoir un effet sur la diminution de la réponse à la douleur lors d’un prélèvement sanguin au talon ainsi qu’un retour au calme après le prélèvement plus rapide. L’odeur du lait maternel est une intervention non pharmacologique de soulagement de la douleur qui est peu coûteuse et facilement réalisable par les mères et les infirmières. Les résultats de l’étude pilote confirment la faisabilité et l’acceptabilité de l’intervention et soutiennent la méthodologie d’un essai clinique randomisé à plus large échelle. / Preterm neonates experience many painful procedures during their hospitalisation in the Neonatal Intensive Care Unit (NICU) where heel prick is the most frequent painful intervention. Repeated and untreated pain has long term consequences for preterm neonates. The use of pharmacological and non-pharmacological pain management interventions is limited for preterm neonates. Therefore, it is essential to investigate new pain management interventions such as breast milk odor. This pilot study aimed to evaluate the feasibility and acceptability of an olfactive stimulation intervention to manage procedural pain of preterm neonates, born between 28 and 34 weeks of gestation, during heel prick. A pilot study was conducted with 12 preterm neonates, 11 mothers and 20 nurses in a level III NICU. The study group was familiarised with breast milk odor for nine hours preceding blood sampling. Breast milk odor was combined with standard care during heel prick and pain was measured by the Premature Infant Pain Profile-Revised. Self-reported questionnaires administered to mothers (n = 11) and nurses (n = 20) confirmed the feasibility and acceptability of the intervention, with a proportion of over 80% for both of these items. Observed effect indicated that the closer the compress with the breast milk odor was to the preterm neonates’ nose (n=12), the shorter time to return to baseline after the painful procedure was and the lower the pain score was on the PIPP-R. Breast milk odor is a non-pharmacological pain management intervention which is non-expensive and feasible for mothers and nurses. Findings of this pilot study guide the methodology of a randomized controlled trial.

Le récepteur mélanocortine de type 4 (MC4R) est un récepteur couplé aux protéines G impliqué dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Quatre-vingt pour cent des mutants du MC4R reliés à l’obésité morbide précoce (OMP) sont retenus à l’intérieur de la cellule. Le système de contrôle de qualité (SCQ) est probablement responsable de cette rétention, par la reconnaissance d’une conformation inadéquate des mutants. Le rétablissement de l’expression à la surface cellulaire et de la fonctionnalité de ces mutants est donc d’intérêt thérapeutique. Dans cette optique, des composés lipophiles spécifiques pour le MC4R ont été sélectionnés sur la base de leur sélectivité. Nous avons démontré qu’ils agissent à titre de chaperone pharmacologique (CP) en rétablissant l’expression à la surface cellulaire et la fonctionnalité des récepteurs mutants S58C et R165W, et qu’ils favorisent leur N-glycosylation complexe (maturation). Le suivi par BRET du site d’action des CP du MC4R suggère une action en aval de l’interaction calnexine-MC4R. De manière générale, une CP peut avoir un effet différent selon le mutant traité en induisant des conformations distinctes du récepteur plus ou moins aptes à se dissocier du SCQ et à activer la voie de signalisation, et un mutant peut répondre différemment selon la CP utilisée par des différences d’affinité pour le ligand, la CP et les effecteurs. Une meilleure compréhension du mode d’action des CP pourrait aider au développement de nouvelles approches thérapeutiques non seulement pour l’OMP, mais aussi pour d’autres maladies conformationnelles causées par le mauvais repliement de protéines. / The MC4R is a G-protein coupled receptor involved in the central regulation of food intake and energy homeostasis. Eighty percent of childhood obesity-related MC4R mutants are retained intracellularly, probably via the quality control system acting on misfolded receptors. Thus, rescuing cell surface targeting and functionality of these mutant receptors could be of therapeutic value. Cell permeable MC4R selective ligands have been tested and were able to restore cell surface expression and signalling activity of S58C and R165W MC4R mutants. Those compounds, according to their mode of action, are described as pharmacological chaperones (PC). The MC4R-PCs also helps to rescue the glycosylation pattern (maturation) of the MC4R mutants. The site of action of MC4R-PCs of the MC4R mutants monitored by BRET suggests an action downstream of the calnexin-MC4R interaction, most likely at the level of the Golgi apparatus. Generally, a CP can have different effects according to the mutant by stabilizing distinct conformations of the receptor that are more or less able to exit the quality control system and to activate the signaling pathway, and a mutant can respond differently according to the CP used by its distinct affinity to the ligand, the CP itself and the effectors. A better understanding of PCs’ mode of action could help in the design of novel therapeutic approaches not only for early-onset morbid obesity (EOMO) but also for other conformational diseases resulting from protein misfolding.

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