Universiẗat, Diss., 2003--Köln.

Les stratégies de conception architecturale en éclairage naturel peuvent améliorer la qualité et l'habitabilité des espaces intérieurs en augmentant leur relation avec l'extérieur et, dans le cas du Nunavik, le territoire. La photobiologie privilégie également la lumière du jour comme source lumineuse dans les espaces intérieurs pour sa capacité à synchroniser les rythmes biologiques de l’horloge circadienne. Pourtant, ces stratégies demeurent un défi au Nunavik en raison de son climat subarctique, de sa photopériode et géométrie solaire particulières. Cette recherche a pour objectif de développer des représentations de la lumière du jour dans l'architecture du Nunavik, afin d’informer son intégration dans de futurs projets d'architecture. Elle adresse les représentations spatiales d'information quantitative en tant qu'outil approprié pour l'évaluation d'ambiances lumineuses. Celles-ci suggèrent un meilleur dialogue entre architectes et autres intervenants de l'industrie du bâtiment par la communication des qualités spatiales de différents environnements architecturaux. La lumière est représentée pour les parties photopique (vision diurne) et mélanopique (rythmes biologiques) du spectre électromagnétique, mesurées respectivement en lux et Equivalent Melanopic Lux (EML). Un outil numérique basé sur des micro-ordinateurs Raspberry Pi est développé pour des relevés photographiques automatisés à faible coût. Le module caméra associé (RPiCM) permet d’acquérir des images à grande gamme dynamique (HDR), qui mesurent précisément la luminance (cd/m2) pour rendre compte de la perception humaine en relation au chromatisme et à l'intensité lumineuse. Des cartes de dominance photopique/mélanopique sont développées pour identifier les surfaces et composantes architecturales qui contribuent à ces intervalles respectifs. Les patterns lumineux de différents paysages et intérieurs sont évalués par cette variable photobiologique (c’est-à-dire, qui impacte les rythmes biologiques), puis exprimés dans un graphique afin de valider leur potentiel circadien ainsi que les relations intérieur-extérieur. Ultimement, les représentations spatiales informent les initiatives conceptuelles des architectes, et servent d'outil de communication avec d’autres intervenants du bâtiment. / Architectural daylighting design strategies can improve the quality and inhabitability of indoor spaces by increasing their connection with the exterior and, in the case of Nunavik, the land. Photobiology also favours daylight as a light source in indoor spaces for its ability to synchronize the biological rhythms through the circadian clock daily entrainment. Yet, these strategies remain a challenge in Nunavik due to its subarctic climate, photoperiod and solar geometry. The objective of this research is to develop representations of daylight in Nunavik's architecture so as to inform its integration into future architectural projects. It addresses spatial representations of quantitative information as an appropriate tool for assessing light ambiences, suggesting a better dialogue between architects and other stakeholders in the building industry by communicating the spatial qualities of different architectural environments. Light is represented for the photopic (daytime vision) and melanopic (biological clock) portions of the electromagnetic spectrum, measured respectively in lux and equivalent melanopic lux (EML). A digital tool based on Raspberry Pi microcomputers is developed for low-cost automated photographic surveys. The associated camera module (RPiCM) generates High Dynamic Range (HDR) images, which accurately measure luminance (cd/m2) to render human perception in relation to light intensity and chromaticity. Photopic/melanopic dominance maps are developed to identify the surfaces and architectural components that contribute to these respective intervals. Lighting patterns of different landscapes and indoor scenes are evaluated using this photobiological variable, and then expressed in a graphical display so as to validate their circadian potential, and express interior-exterior relations. Ultimately, spatial representations inform architects’ design initiatives, and serve as a communication tool with other building stakeholders.

The short answer to the title question is: "a lot". It was transient absorption spectroscopy on geminate recombination in myoglobin that led Hans Frauenfelder to constructing his picture of protein's hierarchical energy landscape [1]. And even before that (in 1973), Joseph Lakowicz and Gregorio Weber at UIUC used quenching of tryptophan fluorescence by oxygen diffusing to solvent-inaccessible protein regions to conclude that "proteins, in general, undergo rapid structural fluctuations on the nanosecond time scale " [2]. The not-so-short answer is that the present text is written at a point where, after a decade of applying transient absorption spectroscopy to understand light induced electron transfer in a variety of enzymes, I am about to change the angle of attack and ask how these techniques and enzymes could be of help to solve some problems that are addressed in the IBS environment, namely protein dynamics, both structural and functional. It is for this reason that the answer will have to be delayed to the third and final part of this opus, "future", that deals with the perspectives. Meanwhile, the first part, "past", will be dedicated to showing on the example of the "paradigm" enzyme -DNA photolyase (the yellow egg hereunder)-, what transient absorption spectroscopy is capable of and the middle part, "present" dresses a short review into various experimental approaches currently used to obtain insight into protein dynamics. In the final section, I will delineate ways how optical spectroscopy could interact with projects existing or emerging in the protein dynamics community at IBS and thus contribute elements of an answer to the title question.

Einleitung: Fibroblasten bilden essentielle Komponenten des Bindegewebes und reagieren auf Bestrahlung mit langwelligem Licht. In der Zellkultur lässt sich durch Lichtsignale eine gerichtete Migration (= Phototaxis) induzieren. Da die Migration von Fibroblasten eine zentrale Rolle für die Wundheilung und Regeneration des Bindegewebes spielt, hat die Phototherapie mit langwelligem, nicht-thermischem Licht besondere klinische Bedeutung erlangt. Eindeutige Vorgaben für phototherapeutische Anwendungsparameter existieren bisher jedoch nicht. Fragestellung: Frühere Versuchsanordnungen zur vitalmikroskopischen Untersuchung der Phototaxis von 3T3-Fibroblasten arbeiteten in geschlossenen Kulturflaschen mit Latex- Kügelchen als Lichtquellen, die von externen Strahlungsquellen aktiviert wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer faseroptischen Anordnung mit freier Positionierbarkeit in der offenen Kulturschale. Die primäre Fragestellung war die Eignung der Methode zur Erstellung eines Aktionsspektrums für Phototaxis photoresponsiver, adhärent wachsender Zellen. Material und Methoden: Die Versuche wurden mit NIH-3T3-Zellen der Schweizer Maus durchgeführt. Um die Ergebnisse nicht durch Fremd-Chromophore zu verfälschen, wurden native Zellen ohne Färbemethoden vitalmikroskopisch untersucht. Eine speziell entwickelte Faseroptik und LED-Lichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen ermöglichten die direkte Einbringung und Positionierung der Lichtsignale auf dem Boden der Kulturschale. Ein wissenschaftliches Bildbearbeitungsprogramm wurde durch ein Plug-In so modifiziert, dass die Bewegungs- und Zeitparameter halbautomatisch erfasst werden konnten. Ergebnisse: Bei 18 von 44 Langzeitversuchen konnte eindeutiges phototaktisches Verhalten mit Zellkontakt zur Lichtquelle induziert werden. In 16 Fällen kam es zur migratorischen Annäherung und in 10 Fällen zu keiner Reaktion bzw. einer diskret negativen Phototaxis. Das positive phototaktische Verhalten der beiden reagierenden Gruppen war hochsignifikant, der zweiseitige p-Wert des Binomialtests beträgt 0,000388. Bei 77,3 % der Versuche konnte positive Phototaxis demonstriert werden. Schlussfolgerungen: Das neu entwickelte Verfahren eignet sich zur Untersuchung einer Phototaxis und kann damit prinzipiell zur Erstellung von phototaktischen Aktionsspektren eingesetzt werden. Im Vergleich zu bisherigen Methoden können die Bestrahlungsstärken direkt am Lichtwellenleiter gemessen und unerwünschte Fremdkörper-induzierte Wechselwirkungen eliminiert werden. Durch die freie Positionierbarkeit der Lichtquelle in der Kulturschale können die zu beobachtenden Zellen beliebig ausgewählt werden. / Background: Fibroblasts are essential constituents of connective tissue and react upon irradiation with long-wavelength light. In cell culture, directed migration (= phototaxis) can be induced by light stimuli. Fibroblast migration and activity play a central role for wound healing and connective tissue regeneration. In consequence, phototherapy with non-thermal, long wavelength light obtained increasing clinical importance. However, accepted guidelines for phototherapeutical treatment parameters are still lacking. Objective: Existing assays for microscopic observation of phototactic reaction of 3T3- fibroblasts in a live cell chamber use closed cell culture flasks with small light-scattering latex particles attached to the surface of the flask bottom prior to cell seeding, which can be illuminated by an external light source. The present work describes the development of a fiberoptic assembly providing free positioning of the light source in an open culture dish. The primary objective is the eligibility of this method for determination of a phototactic action spectrum for photoresponsive adherent cell species. Materials and Methods: Experiments were conducted using Swiss mouse NIH-3T3-cells. Native cells without staining were used for elimination of potential dye-induced cell-light interferences. A light microscope with field illumination shutter simulation and live cell chamber was used in combination with a specially devised LED-light-fed fiberoptic assembly providing different wavelengths, which could be directly positioned on the inner bottom of the culture dish. A scientific image processing application was modified by a special plug-in for semi-automatic acquisition of cellular locomotion parameters and temporal data token. Results: A total of 44 experiments were conducted. 18 essays resulted in full phototactic reaction characterized by pseudopodium contact with the fiberoptic aperture, another 16 essays showed migratory approximation without direct contact with the light source. 10 essays displayed no reaction or discrete negative phototaxis. The positive phototaxis of the two responding groups was highly significant in the two-sided binomial test (p = 0.000388). For 77.3 % of the experiments positive phototaxis could be demonstrated. Conclusions: The newly developed assay is appropriate for the induction of phototactic behaviour and can be utilized for the determination of phototactic action spectra. In contrast to existing methods the irradiances can be measured directly at the aperture of the optical fiber and biasing foreign object-induced effects can be eliminated. Due to arbitrary positioning of the light source the cells can be chosen freely for examination.

Einleitung: Fibroblasten bilden essentielle Komponenten des Bindegewebes und reagieren auf Bestrahlung mit langwelligem Licht. In der Zellkultur lässt sich durch Lichtsignale eine gerichtete Migration (= Phototaxis) induzieren. Da die Migration von Fibroblasten eine zentrale Rolle für die Wundheilung und Regeneration des Bindegewebes spielt, hat die Phototherapie mit langwelligem, nicht-thermischem Licht besondere klinische Bedeutung erlangt. Eindeutige Vorgaben für phototherapeutische Anwendungsparameter existieren bisher jedoch nicht. Fragestellung: Frühere Versuchsanordnungen zur vitalmikroskopischen Untersuchung der Phototaxis von 3T3-Fibroblasten arbeiteten in geschlossenen Kulturflaschen mit Latex- Kügelchen als Lichtquellen, die von externen Strahlungsquellen aktiviert wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer faseroptischen Anordnung mit freier Positionierbarkeit in der offenen Kulturschale. Die primäre Fragestellung war die Eignung der Methode zur Erstellung eines Aktionsspektrums für Phototaxis photoresponsiver, adhärent wachsender Zellen. Material und Methoden: Die Versuche wurden mit NIH-3T3-Zellen der Schweizer Maus durchgeführt. Um die Ergebnisse nicht durch Fremd-Chromophore zu verfälschen, wurden native Zellen ohne Färbemethoden vitalmikroskopisch untersucht. Eine speziell entwickelte Faseroptik und LED-Lichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen ermöglichten die direkte Einbringung und Positionierung der Lichtsignale auf dem Boden der Kulturschale. Ein wissenschaftliches Bildbearbeitungsprogramm wurde durch ein Plug-In so modifiziert, dass die Bewegungs- und Zeitparameter halbautomatisch erfasst werden konnten. Ergebnisse: Bei 18 von 44 Langzeitversuchen konnte eindeutiges phototaktisches Verhalten mit Zellkontakt zur Lichtquelle induziert werden. In 16 Fällen kam es zur migratorischen Annäherung und in 10 Fällen zu keiner Reaktion bzw. einer diskret negativen Phototaxis. Das positive phototaktische Verhalten der beiden reagierenden Gruppen war hochsignifikant, der zweiseitige p-Wert des Binomialtests beträgt 0,000388. Bei 77,3 % der Versuche konnte positive Phototaxis demonstriert werden. Schlussfolgerungen: Das neu entwickelte Verfahren eignet sich zur Untersuchung einer Phototaxis und kann damit prinzipiell zur Erstellung von phototaktischen Aktionsspektren eingesetzt werden. Im Vergleich zu bisherigen Methoden können die Bestrahlungsstärken direkt am Lichtwellenleiter gemessen und unerwünschte Fremdkörper-induzierte Wechselwirkungen eliminiert werden. Durch die freie Positionierbarkeit der Lichtquelle in der Kulturschale können die zu beobachtenden Zellen beliebig ausgewählt werden.:INHALTSVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII TABELLENVERZEICHNIS IX ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X 1. EINLEITUNG 1 2. DEFINITIONEN UND STAND DER FORSCHUNG 5 2.1 LICHT 5 2.1.1 Sonnenlicht 5 2.1.2 Licht in der Physik 5 2.1.3 Licht in der Biologie 6 2.1.3.1 Taxis 7 2.1.4 Licht in der Medizin 8 2.1.4.1 Historischer Überblick 8 2.2 PHOTOBIOLOGIE VON ROT UND NAHINFRAROT 10 2.2.1 Photochemische Grundlagen 10 2.2.2 Haut 11 2.2.2.1 Aufbau und Funktion 11 2.2.2.2 Optische Eigenschaften 12 2.2.3 Fibroblasten 13 2.2.4 Zellmigration 15 2.2.5 Mitochondrien 16 2.3 PHOTOTAXIS BEI 3T3-FIBROBLASTEN 17 3. FRAGESTELLUNG 23 4. MATERIAL UND METHODEN 25 4.1 GERÄTE, LABORMATERIALIEN UND SOFTWARE 25 4.2 ZELLMATERIAL UND KULTURBEDINGUNGEN 25 4.3 ZELLPRÄPARATION 27 4.4 VERSUCHSAUFBAU 27 4.5 SHUTTER-SIMULATION DER OBJEKTBELEUCHTUNG 32 4.6 ZUFUHR VON DESTILLIERTEM WASSER 33 4.7 VERSUCHSABLAUF 33 4.8 VERMESSUNG DES BEWEGUNGSVERHALTENS 35 4.9 STATISTISCHE BERECHNUNG 36 5. ERGEBNISSE 37 5.1 AUSWAHLKRITERIEN FÜR GÜLTIGE VERSUCHE 37 5.2 GRUPPENEINTEILUNG DER GÜLTIGEN VERSUCHE 38 5.2.1 Die Gruppe "Touchdown" (TD) 38 5.2.2 Die Gruppe "Annäherung/Closer" (CL) 39 5.2.3 Die Gruppe "still/entf./no reaction" (NO) 39 5.2.4 Zusammenfassung des Gruppenverhaltens 40 5.3 GRAFISCHE DARSTELLUNGEN DER AUSGEWERTETEN VERSUCHE 41 5.4 PRIMÄRE FRAGESTELLUNG: PHOTOTAKTISCHE REAKTION 49 5.5 FRAGESTELLUNG 2: EINFLUSS DER MIGRATIONSMODALITÄT 49 5.6 EINFLUSS VON WELLENLÄNGE UND LICHTMODULATION 51 5.6.1 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 51 5.6.2 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 52 5.7 FRAGESTELLUNG 5: ROLLE DER AUSGANGSPOSITION 53 5.8 LOKOMOTORISCHE PARAMETER 54 5.8.1 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 54 5.8.2 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 56 5.9 FRAGESTELLUNG 8: EINFLUSS DER VITALITÄT 57 5.9.1 Definition der mittleren Vitalität vitmean 57 5.9.2 Definition der relativen Vitalität vitrel 57 5.9.3 Die relative Vitalität vitrel der Zellen FBc, FB1 und FB2 58 5.9.4 Die mittlere Vitalität vitmean in den Versuchsgruppen 59 5.9.5 Die relative Vitalität vitrel des zentralen Fibroblasten 60 5.10 ATYPISCHES ZELLVERHALTEN 61 5.10.1 Atypisches Verhalten in Versuchen mit normalen 3T3-Zellen 61 5.10.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 61 5.10.1.3 "Überfall" eines Fibroblasten 63 5.10.1.2 Zentraler Fibroblast migriert unter den Lichtwellenleiter 64 5.10.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 66 6. DISKUSSION 68 6.1 ERGEBNISSE 68 6.1.1 Primäre Fragestellung: Phototaktische Reaktion 68 6.1.2 Fragestellung 2: Einfluss der Migrationsmodalität 70 6.1.3 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 71 6.1.4 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 74 6.1.5 Fragestellung 5: Rolle der Ausgangsposition 78 6.1.6 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 79 6.1.6.1 Differenz Startposition - Minimalposition zum LWL 79 6.1.6.2 Insgesamt zurückgelegte Wegstrecke 80 6.1.7 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 80 6.1.8 Fragestellung 8: Einfluss der Vitalität 81 6.1.9 Atypisches Zellverhalten 83 6.1.9.1 Versuche mit 3T3-Zellen 83 6.1.9.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 83 6.1.9.1.2 "Überfall" eines Fibroblasten 84 6.1.9.1.3 Phototaxis bei hyperosmotischem Stress 85 6.1.9.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 86 6.1.10 Zusätzliche Fragestellungen 87 6.1.10.1 Wie lange ist die maximale Versuchsdauer im offenen System 88 6.1.10.2 Spielt der Aspekt der potentiellen Verkeimung eine relevante Rolle? 88 6.1.10.3 Spielt die Dimension der Lichtquelle eine objektivierbare Rolle 88 6.1.10.4 Kann die Bestrahlungsstärke gemessen anstatt geschätzt werden 89 6.1.10.5 Können Rückschlüsse auf das "Auge der Zelle" gezogen werden? 90 6.2 SCHLUSSFOLGERUNG 93 6.3 AUSBLICK 94 7. ZUSAMMENFASSUNG 96 7.1 SUMMARY 97 8. LITERATURVERZEICHNIS 98 9. ANLAGEN 117 9.1 LABORGERÄTE UND MATERIALIEN 117 9.1.1 Mikroskope 117 9.1.2 Software: 117 9.1.3 Geräte: 118 9.1.4 Verbrauchsmaterialien 118 9.1.5 Medien, Puffer, Lösungen 119 9.2 EIGENE GERÄTSCHAFTEN 120 9.2.1 Frequenzgenerator 120 9.2.2 Halbleiter-Lichtquellen 121 9.2.2.1 Modulierbare Lichtquelle 121 9.2.2.2 Kohärente Lichtquelle 122 9.2.2.3 Photon Micro-Light LED-Lichtquellen mit Pulsmodus f = 1Hz 124 9.2.2.4 Bestrahlungsstärken der verwendeten Lichtquellen 124 9.2.3 Systemträger 125 9.2.4 LWL und Optokoppler 126 9.2.5 Modifizierte Microsoft-Maus 126 9.2.6 Eigene Software 127 10. DANKSAGUNG 128 11. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 130 / Background: Fibroblasts are essential constituents of connective tissue and react upon irradiation with long-wavelength light. In cell culture, directed migration (= phototaxis) can be induced by light stimuli. Fibroblast migration and activity play a central role for wound healing and connective tissue regeneration. In consequence, phototherapy with non-thermal, long wavelength light obtained increasing clinical importance. However, accepted guidelines for phototherapeutical treatment parameters are still lacking. Objective: Existing assays for microscopic observation of phototactic reaction of 3T3- fibroblasts in a live cell chamber use closed cell culture flasks with small light-scattering latex particles attached to the surface of the flask bottom prior to cell seeding, which can be illuminated by an external light source. The present work describes the development of a fiberoptic assembly providing free positioning of the light source in an open culture dish. The primary objective is the eligibility of this method for determination of a phototactic action spectrum for photoresponsive adherent cell species. Materials and Methods: Experiments were conducted using Swiss mouse NIH-3T3-cells. Native cells without staining were used for elimination of potential dye-induced cell-light interferences. A light microscope with field illumination shutter simulation and live cell chamber was used in combination with a specially devised LED-light-fed fiberoptic assembly providing different wavelengths, which could be directly positioned on the inner bottom of the culture dish. A scientific image processing application was modified by a special plug-in for semi-automatic acquisition of cellular locomotion parameters and temporal data token. Results: A total of 44 experiments were conducted. 18 essays resulted in full phototactic reaction characterized by pseudopodium contact with the fiberoptic aperture, another 16 essays showed migratory approximation without direct contact with the light source. 10 essays displayed no reaction or discrete negative phototaxis. The positive phototaxis of the two responding groups was highly significant in the two-sided binomial test (p = 0.000388). For 77.3 % of the experiments positive phototaxis could be demonstrated. Conclusions: The newly developed assay is appropriate for the induction of phototactic behaviour and can be utilized for the determination of phototactic action spectra. In contrast to existing methods the irradiances can be measured directly at the aperture of the optical fiber and biasing foreign object-induced effects can be eliminated. Due to arbitrary positioning of the light source the cells can be chosen freely for examination.:INHALTSVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII TABELLENVERZEICHNIS IX ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X 1. EINLEITUNG 1 2. DEFINITIONEN UND STAND DER FORSCHUNG 5 2.1 LICHT 5 2.1.1 Sonnenlicht 5 2.1.2 Licht in der Physik 5 2.1.3 Licht in der Biologie 6 2.1.3.1 Taxis 7 2.1.4 Licht in der Medizin 8 2.1.4.1 Historischer Überblick 8 2.2 PHOTOBIOLOGIE VON ROT UND NAHINFRAROT 10 2.2.1 Photochemische Grundlagen 10 2.2.2 Haut 11 2.2.2.1 Aufbau und Funktion 11 2.2.2.2 Optische Eigenschaften 12 2.2.3 Fibroblasten 13 2.2.4 Zellmigration 15 2.2.5 Mitochondrien 16 2.3 PHOTOTAXIS BEI 3T3-FIBROBLASTEN 17 3. FRAGESTELLUNG 23 4. MATERIAL UND METHODEN 25 4.1 GERÄTE, LABORMATERIALIEN UND SOFTWARE 25 4.2 ZELLMATERIAL UND KULTURBEDINGUNGEN 25 4.3 ZELLPRÄPARATION 27 4.4 VERSUCHSAUFBAU 27 4.5 SHUTTER-SIMULATION DER OBJEKTBELEUCHTUNG 32 4.6 ZUFUHR VON DESTILLIERTEM WASSER 33 4.7 VERSUCHSABLAUF 33 4.8 VERMESSUNG DES BEWEGUNGSVERHALTENS 35 4.9 STATISTISCHE BERECHNUNG 36 5. ERGEBNISSE 37 5.1 AUSWAHLKRITERIEN FÜR GÜLTIGE VERSUCHE 37 5.2 GRUPPENEINTEILUNG DER GÜLTIGEN VERSUCHE 38 5.2.1 Die Gruppe "Touchdown" (TD) 38 5.2.2 Die Gruppe "Annäherung/Closer" (CL) 39 5.2.3 Die Gruppe "still/entf./no reaction" (NO) 39 5.2.4 Zusammenfassung des Gruppenverhaltens 40 5.3 GRAFISCHE DARSTELLUNGEN DER AUSGEWERTETEN VERSUCHE 41 5.4 PRIMÄRE FRAGESTELLUNG: PHOTOTAKTISCHE REAKTION 49 5.5 FRAGESTELLUNG 2: EINFLUSS DER MIGRATIONSMODALITÄT 49 5.6 EINFLUSS VON WELLENLÄNGE UND LICHTMODULATION 51 5.6.1 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 51 5.6.2 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 52 5.7 FRAGESTELLUNG 5: ROLLE DER AUSGANGSPOSITION 53 5.8 LOKOMOTORISCHE PARAMETER 54 5.8.1 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 54 5.8.2 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 56 5.9 FRAGESTELLUNG 8: EINFLUSS DER VITALITÄT 57 5.9.1 Definition der mittleren Vitalität vitmean 57 5.9.2 Definition der relativen Vitalität vitrel 57 5.9.3 Die relative Vitalität vitrel der Zellen FBc, FB1 und FB2 58 5.9.4 Die mittlere Vitalität vitmean in den Versuchsgruppen 59 5.9.5 Die relative Vitalität vitrel des zentralen Fibroblasten 60 5.10 ATYPISCHES ZELLVERHALTEN 61 5.10.1 Atypisches Verhalten in Versuchen mit normalen 3T3-Zellen 61 5.10.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 61 5.10.1.3 "Überfall" eines Fibroblasten 63 5.10.1.2 Zentraler Fibroblast migriert unter den Lichtwellenleiter 64 5.10.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 66 6. DISKUSSION 68 6.1 ERGEBNISSE 68 6.1.1 Primäre Fragestellung: Phototaktische Reaktion 68 6.1.2 Fragestellung 2: Einfluss der Migrationsmodalität 70 6.1.3 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 71 6.1.4 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 74 6.1.5 Fragestellung 5: Rolle der Ausgangsposition 78 6.1.6 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 79 6.1.6.1 Differenz Startposition - Minimalposition zum LWL 79 6.1.6.2 Insgesamt zurückgelegte Wegstrecke 80 6.1.7 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 80 6.1.8 Fragestellung 8: Einfluss der Vitalität 81 6.1.9 Atypisches Zellverhalten 83 6.1.9.1 Versuche mit 3T3-Zellen 83 6.1.9.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 83 6.1.9.1.2 "Überfall" eines Fibroblasten 84 6.1.9.1.3 Phototaxis bei hyperosmotischem Stress 85 6.1.9.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 86 6.1.10 Zusätzliche Fragestellungen 87 6.1.10.1 Wie lange ist die maximale Versuchsdauer im offenen System 88 6.1.10.2 Spielt der Aspekt der potentiellen Verkeimung eine relevante Rolle? 88 6.1.10.3 Spielt die Dimension der Lichtquelle eine objektivierbare Rolle 88 6.1.10.4 Kann die Bestrahlungsstärke gemessen anstatt geschätzt werden 89 6.1.10.5 Können Rückschlüsse auf das "Auge der Zelle" gezogen werden? 90 6.2 SCHLUSSFOLGERUNG 93 6.3 AUSBLICK 94 7. ZUSAMMENFASSUNG 96 7.1 SUMMARY 97 8. LITERATURVERZEICHNIS 98 9. ANLAGEN 117 9.1 LABORGERÄTE UND MATERIALIEN 117 9.1.1 Mikroskope 117 9.1.2 Software: 117 9.1.3 Geräte: 118 9.1.4 Verbrauchsmaterialien 118 9.1.5 Medien, Puffer, Lösungen 119 9.2 EIGENE GERÄTSCHAFTEN 120 9.2.1 Frequenzgenerator 120 9.2.2 Halbleiter-Lichtquellen 121 9.2.2.1 Modulierbare Lichtquelle 121 9.2.2.2 Kohärente Lichtquelle 122 9.2.2.3 Photon Micro-Light LED-Lichtquellen mit Pulsmodus f = 1Hz 124 9.2.2.4 Bestrahlungsstärken der verwendeten Lichtquellen 124 9.2.3 Systemträger 125 9.2.4 LWL und Optokoppler 126 9.2.5 Modifizierte Microsoft-Maus 126 9.2.6 Eigene Software 127 10. DANKSAGUNG 128 11. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 130

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus einzelligen Grünalgen, die in der Optogenetik verwendet werden. Photonabsorption führt zur Isomerisierung des Retinal-Kofaktors, was eine Reihe von Reaktionen auslöst, die als Photozyklus bezeichnet werden und die Bildung des leitenden Zustands umfassen. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus-Mechanismus ausgewählter ChRs mittels FTIR (Fourier Transform Infrarot)- und UV-Vis-Spektroskopie, sowie Retinalextraktion und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analyse untersucht. Photorezeptoren sind dafür optimiert, Lichtenergie zu nutzen, um Konformationsänderungen des Proteins hervorzurufen. Dafür wird ein Teil der Lichtenergie durch eine transiente Verdrillung des Chromophors gespeichert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Transfer der gespeicherten Energie zum Protein in ReaChR stark vom Protonierungszustand von Glu163 beeinflusst wird; er wird durch eine erhöhte Rigidität des aktiven Zentrums bei protoniertem Glu163 verlangsamt. In Chrimson hingegen relaxiert der Chromophor nach Photoisomerisierung, was auf einen verdrillten Chromophor im Dunkelzustand hinweist, was vermutlich für die bathochrome Verschiebung von Bedeutung ist. Zusätzlich zur Chromophorgeometrie beeinflusst der Protonierungszustand von Glu163 in ReaChR und dem homologen Glu165 in Chrimson die Stereoselektivität der Photoreaktion. Ein weiterer Faktor der Stereoselektivität ist Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2), welches im Photozyklus deprotoniert. Die Bildung des leitenden Zustands in C1C2 und ReaChR geht mit einem Wassereinstrom ins Protein einher, welcher den Transport größerer Kationen erleichtert. Die Deprotonierung von Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) verändert die Ionenselektivität des Kanals, wie aus elektrophysiologischen Messungen bekannt ist. In Chrimson ist das Ausmaß des Wassereinstroms deutlich reduziert, was – in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Experimenten – den Transport von Protonen begünstigt. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels found in single-cell algae and used in optogenetics. Photon absorption leads to isomerization of the retinal cofactor, initiating a number of reactions that are referred to as photocycle and involve formation of the ion-conducting state. In this thesis, the photocycle mechanism of selected ChRs was investigated using FTIR (Fourier Transform Infrared) and UV-Vis spectroscopy, as well as retinal extraction and subsequent HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis. Photoreceptors are optimized to use photon energy to drive conformational changes of the protein. Therefore, a fraction of the photon energy is stored by a transient distortion of the chromophore. In this thesis, it is shown that in ReaChR the transfer of the stored energy to the protein is largely affected by the protonation state of Glu163, being decelerated by protonated Glu163 due to an enhanced rigidity of the active site. In contrast, the chromophore in Chrimson relaxes upon photoisomerization, hinting at a distorted retinal geometry in the dark state, which is probably essential for its unprecedented bathochromic absorption. In addition to the chromophore geometry, the protonation state of Glu163 in ReaChR and the homologue Glu165 in Chrimson affects the stereoselectivity of the photoreaction. Another factor for stereoselectivity is Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2) which deprotonates in the photocycle. Formation of the ion-conducting state in C1C2 and ReaChR involves water influx into the protein, facilitating transport of larger cations. Deprotonation of Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) alters the ion selectivity of the channel as known from electrophysiological experiments. In Chrimson, the extent of water influx is drastically reduced which favors the conductance of protons in agreement with electrophysiological characterization.

De nombreuses recherches démontrent qu'un contact visuel avec la nature et l'accès à la lumière du jour dans le milieu scolaire favorise le bien-être et la réussite éducative des élèves. Au moment où la majorité des bâtiments du milieu scolaire québécois doivent être rénovés, il existe peu de méthodes d'évaluation et de visualisation permettant aux architectes d'identifier les enjeux et opportunités des écoles québécoises en termes d'éclairage naturel et de lien visuel avec l'extérieur. L'objectif de cette recherche consiste à évaluer et représenter l'éclairage centré sur l'humain et les vues sur l'extérieur dans le milieu scolaire, afin d'informer le processus de requalification des écoles primaires québécoises. Elle aborde l'analyse d'espaces intérieurs dans trois écoles de Québec par une approche d'évaluation post-occupationnelle (EPO), soit le relevé environnemental. Cette méthode permet de quantifier la connexion visuelle avec l'extérieur en termes d'angles de vue (°), et l'éclairage centré sur l'humain en termes de température de couleur (K), ainsi que d'éclairement photopique (Lux) et mélanopique (Equivalent melanopic lux - EML). La recherche développe également des méthodes de représentation permettant de spatialiser les données quantitatives recueillies lors des relevés sur des plans et coupes architecturaux, ainsi que des photographies panoramiques. Ces spatialisations permettent d'étudier le lien entre la position et le champ visuel des occupants en relation aux caractéristiques architecturales d'un espace scolaire qui modifient les relations intérieures extérieures. L'analyse simultanée de plusieurs représentations illustre la manière dont les obstructions naturelles, la configuration des fenêtres et la matérialité des salles de classe modifient l'éclairage centré sur l'humain et les possibilités de vues extérieures. Ultimement, les visualisations spatiales développées dans cette recherche informent la manière dont diverses stratégies d'éclairage naturel et de connexion visuelle avec la nature contribuent au bien-être des occupants, permettant le transfert des connaissances générées par les EPO vers la conception architecturale. / Numerous studies have shown that a visual contact with nature and daylighting in the school environment promotes children's well-being and academic achievement. At a time when most Quebec school buildings require major renovation, there exist few evaluation and visualization methods that allow architects to identify the challenges and opportunities of Quebec schools in terms of daylighting and visual connection with the exterior. The objective of this research is to evaluate and represent human-centric lighting and views in the school environment, to inform the requalification process of Quebec primary schools. It addresses the analysis of interior spaces in three Quebec City schools through a post-occupancy evaluation (POE) approach, namely the environmental survey. This method quantifies the visual connection with the exterior in terms of viewing angles (°), and human-centric lighting in terms of colour temperature (K), as well as photopic (Lux) and melanopic illuminance (Equivalent melanopic lux - EML). The research also develops representation methods to spatialize the quantitative data collected during the surveys on architectural plans and sections, as well as panoramic photographs. These spatializations make it possible to study the link between the position and the visual field of the occupants in relation to the architectural characteristics of a school space that modify the interior-exterior relations. Simultaneous analysis of several representations illustrates how natural obstructions, window configurations and the materiality of classrooms alter human-centric illumination and opportunities for outdoor views. Ultimately, the spatial visualizations developed in this research inform how various daylighting strategies and visual connections to nature contribute to occupant well-being, and enables the transfer of knowledge generated by POE to architectural design.

Comme presque tous les êtres vivants, les insectes et autres arthropodes terrestres évoluent dans des environnements dynamiques et hétérogènes relativement à de multiples facteurs abiotiques incluant le rayonnement ultraviolet (UV). L’absorption de ces photons peut affecter le fitness des individus à travers différents types d’effets physiologiques et comportementaux. Certaines stratégies de lutte intégrée manipulent l’exposition au rayonnement UV en contexte agricole de façon à prendre avantage de son aspect attractif pour de nombreux ravageurs et de leur susceptibilité aux photodommages qu’il induit. Considérant le manque de connaissances sur les conséquences potentielles de telles approches sur les ennemis naturels, j’ai étudié dans cette thèse l’influence du rayonnement UV au fil du cycle de vie de deux espèces de guêpes parasitoïdes d’œufs, Telenomus podisi Ashmead, 1893 et Trissolcus utahensis Ashmead, 1893 (Hymenoptera : Scelionidae), et d’une de leurs punaises hôtes, Podisus maculiventris (Say, 1832) (Hemiptera : Pentatomidae), une espèce prédatrice qui pond des œufs de différents niveaux de pigmentation photoprotectrice. De façon à examiner divers paramètres d’histoire de vie de ces associations hôtes-parasitoïdes ainsi que certains des comportements liés à la recherche et à l’exploitation d’hôtes chez les parasitoïdes, j’ai réalisé une série d’expériences sous exposition naturelle et artificielle au rayonnement UV à l’aide de matériaux transmettant ou absorbant ces photons. Je démontre qu’une exposition réaliste au rayonnement UV peut entraîner des conséquences négatives sur le fitness des punaises et de leurs parasitoïdes d’œufs, et ce qu’ils y soient exposés durant leur développement ou comme adultes. L’exposition soutenue à un rayonnement UV-A de faible intensité a réduit la survie et la longévité des parasitoïdes adultes, tandis que chez les punaises, elle a induit des effets reportés négatifs sur la survie des nymphes jusqu’au stade adulte. Les conséquences immédiates et ultérieures de l’exposition des œufs de P. maculiventris au rayonnement UV ont été atténuées avec l’augmentation de leur niveau de pigmentation, et ce tant pour l’hôte que son parasitoïde. Au niveau comportemental, j’ai décrit comment les microhabitats exposés au rayonnement UV attirent les femelles parasitoïdes tout en réduisant leur activité locomotrice. Néanmoins, un taux de parasitisme élevé a été observé à diverses intensités d’exposition au rayonnement UV sur des plants de soya en cages de terrain, révélant que l’atténuation de ces signaux ne réduit pas nécessairement la performance de mes parasitoïdes. Dans l’ensemble, ces différentes études expérimentales ont révélé des effets similaires du rayonnement UV chez les trois espèces testées. Elles fournissent d’importantes réponses quant aux interactions complexes entre des insectes bénéfiques et un facteur abiotique associé aux changements climatiques et qui agit simultanément comme source de stress et d’information relativement à l’environnement. / Like most living things, insects and other terrestrial arthropods navigate environments that are dynamic and heterogenous with regards to various abiotic factors including ultraviolet (UV) radiation. Absorbing those photons can affect arthropod fitness via different types of physiological and behavioural effects. Some integrated pest management strategies manipulate UV exposure in agricultural settings to take advantage of its attractiveness to pests and of their susceptibility to UV damage. Considering the lack of knowledge on how such techniques could affect natural enemies, I studied the influence of UV radiation throughout the lifecycles of two egg parasitoid species, Telenomus podisi Ashmead, 1893 and Trissolcus utahensis Ashmead, 1893 (Hymenoptera: Scelionidae), and one of their potential stink bug hosts, Podisus maculiventris (Say, 1832) (Hemiptera: Pentatomidae), a predatory species that lays eggs of different photoprotective qualities. To examine various life history parameters in these host-parasitoid associations as well as some of the parasitoids’ host location and exploitation behaviours, I conducted a series of experiments under natural and artificial UV exposure, using UV-transmitting and UV-absorbing materials. I showed that realistic doses of UV radiation can have negative consequences for the fitness of stink bugs and their egg parasitoids, whether they were exposed during their development or their adult stage. Long-term exposure to mild UV-A intensities reduced parasitoid emergence and longevity, while inducing negative carryover effects on stink bug nymph survival to adulthood. Immediate or delayed consequences of exposing P. maculiventris eggs to UV radiation lessened with increasing egg pigmentation levels, both for the hosts and their parasitoids. As for behavioural responses to UV radiation, UV-exposed microhabitats were attractive to foraging female parasitoids but also reduced their walking activity. Nonetheless, high parasitism rates were observed under different intensities of UV exposure on soybean plants in field cages, revealing that UV attenuation does not necessarily impede these parasitoids’ performance. Together, these different experimental studies revealed similar effects of UV radiation on the three species tested. They provide important insight on the complex interactions between beneficial insects and an abiotic factor that is involved in climate change and that can act both as an environmental hazard and a visual cue.

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