The phosphatidylinositol signaling pathway utilizes inositol-containing second messengers to mediate signaling events. The enzymes that metabolize phosphoinositides can in some cases serve to terminate the signaling actions of phosphoinositides. The inositol polyphosphate 5-phosphatases (5PTases) comprise a large protein family that hydrolyzes 5-phosphates from a variety of inositol phosphate and phosphoinositide substrates. I have examined the substrate specificity of the At5PTase11 protein from the model plant, Arabidopsis thaliana. The At5PTase11 gene (At1g47510) encodes an active 5PTase enzyme that can dephosphorylate the phosphoinositide substrates phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2], phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], and phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P3]. In addition, the At5PTase11 gene is regulated by abscisic acid, jasmonic acid, and auxin, suggesting a role for phosphoinositide action in these signal transduction pathways. To further delineate the function of At5PTase11 in Arabidopsis thaliana, two independent T-DNA insertion mutant lines were isolated (At5ptase11-1 and At5ptase11-2). Analysis of At5ptase11 mutant lines revealed that At5ptase11 mutant seeds germinate slower compared to wild-type seeds. Moreover, At5ptase11 mutant seedlings demonstrated less hypocotyl growth when grown in the dark. These results indicate that At5PTase11 is required for the early stages of seed germination and seedling growth. Since there are 15 predicted 5PTases in Arabidopsis thaliana, a group of 5PTases have been analyzed to identify the 5PTases with similar substrate selectivity. At5PTase1 (At1g34120), At5PTase2 (At4g18010) and At5PTase3 (At1g71710) have been found to hydrolyze all four potential substrates, inositol 1,4,5-trisphosphate [Ins(1,4,5)P3], inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate [Ins(1,3,4,5)P4], PtdIns(4,5)P2, and PtdIns(3,4,5)P3. At5PTase7 (At2g32010) hydrolyzed PtdIns(4,5)P2, and PtdIns(3,4,5)P3 which is similar to the substrate selectivity of At5PTase11. In addition, At5PTase4 (At3g63240), and At5PTase9 (At2g01900) hydrolyzed only PtdIns(4,5)P2. These results indicate that there are different groups of Arabidopsis thaliana 5PTases based on the substrate selectivity. These results suggest that Arabidopsis thaliana 5PTases with similar substrate selectivity may have overlapping functions. In summary, the findings that At5PTase11 is a phospholipid-specific 5PTase and At5PTase11 functions in the early stages of seed germination and seedling growth indicate that 5PTases play important roles in plant growth and development. / Ph. D.

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Les canaux potassiques (Kv) dépendants du voltage sont des protéines transmembranaires qui permettent le flux passif d’ions potassium à travers une membrane plasmique lorsque celle-ci est dépolarisée. Ils sont constitués de quatre domaines périphériques sensibles au voltage et un domaine central, un pore, qui délimite un chemin hydrophile pour le passage d’ions. Les domaines sensibles à la tension (VSD) et le pore sont couplés, ce qui signifie que l’activation des VSD déclenche l’ouverture du pore, et qu’un pore ouvert favorise l’activation des VSD. Le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) est un lipide mineur du feuillet interne de la membrane plasmique. Ce lipide fortement chargé négativement module le fonctionnement de plusieurs canaux ioniques, y compris les membres de la famille Kv. En particulier, l’application de ce lipide à Kv1.2 et Kv7.1, deux canaux homologues, augmente leur courant ionique. Cependant, alors que Kv1.2 est capable de s’ouvrir en l’absence de PIP2, dans le cas de Kv7.1, ce lipide est absolument nécessaire pour l’ouverture du canal. En outre, dans Kv1.2, PIP2 induit une perte de fonction, qui est manifesté par un mouvement retardé des VSD. Jusqu’à présent, les mécanismes sous-jacents à de telles modulations des canaux Kv par PIP2 restent inconnus. Dans ce travail, nous tentons de faire la lumière sur ces mécanismes en utilisant des simulations de dynamique moléculaire (DM) combinées avec une approche expérimentale, entreprise par nos collaborateurs. En utilisant des simulations de DM sans contrainte, nous avons identifié les sites potentiels de liaison du PIP2 au Kv1.2. Dans l’un de ces sites, PIP2 interagit avec le canal de sorte à former des ponts salins dépendants de l’état du canal, soit avec le VSD soit avec le pore. Sur la base de ces résultats, nous proposons un modèle pour rationaliser les données expérimentales connues. En outre, nous avons cherché à évaluer quantitativement la perte de fonction induite par la présence de PIP2 au voisinage du VSD du Kv1.2. En particulier, nous avons calculé l’énergie libre des deux premières transitions le long de l’activation du VSD en présence et en l’absence de ce lipide. Nous avons constaté que PIP2 affecte à la fois la stabilité relative des états du VSD et les barrières d’énergie libre qui les séparent. Enfin, nous avons étudié les interactions entre PIP2 et un autre membre de la famille Kv, le canal Kv7.1 cardiaque. Dans le site de liaison de PIP2 que nous avons identifié pour ce canal, l’interaction entre les résidus positifs de Kv7.1 et le lipide sont dépendants de l’état du VSD, comme dans le cas de Kv1.2. On montre que cette interaction est importante pour le couplage entre les VSD et le pore, couplage qui est par ailleurs affaibli à cause de la répulsion électrostatique entre quelques résidus positifs. Ces résultats et prédictions ont été vérifiés par les données expérimentales obtenues par nos collaborateurs / Voltage-gated potassium (Kv) channels are transmembrane proteins that enable the passive flow of potassium ions across a plasma membrane when the latter is depolarized. They consist of four peripheral voltage sensor domains, responding to the applied voltage, and a central pore domain that encompasses a hydrophilic path for passing ions. The voltage sensors and the pore are coupled, meaning that the activation of the voltage sensors triggers the pore opening, and the open pore promotes the activation of the voltage sensors. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) is a minor lipid of the inner plasma membrane leaflet. This highly negatively charged lipid was shown to modulate the functioning of several ion channels including members of the Kv family. In particular, application of this lipid to Kv1.2 and Kv7.1, two homologous channels, enhances their ionic current. However, while Kv1.2 is able to open without PIP2, in the case of Kv7.1, this lipid is absolutely required for opening. Additionally, in Kv1.2, PIP2 induces a loss of functioning, which is manifested by delayed motions of the voltage sensors. So far, the mechanism underlying the Kv channels modulation by PIP2 remains unknown. In the present manuscript, we attempt to shed light on this mechanism using molecular dynamics (MD) simulations combined with experiments, which was undertaken by our collaborators. Using unconstrained MD simulations, we have identified potential PIP2 binding sites in Kv1.2. In one of these sites, PIP2 interacts with the channel in a state-dependent manner forming salt bridges either with the voltage sensor or with the pore. Based on these findings, we propose a model rationalizing the known experimental data. Further, we aimed to estimate the loss of functioning effect induced by PIP2 on the Kv1.2 voltage sensors. In particular, we have calculated the free energy of the first two transitions along the activation path in the presence and absence of this lipid. We found that PIP2 affects both the relative stability of the voltage sensor states and the free energy barriers separating them. Finally, we studied the interactions between PIP2 and another member of the Kv family, the cardiac channel Kv7.1. In the PIP2 binding site that we have identified for this channel, the interaction between positive residues of Kv7.1 and the lipid was state-dependent, as in the case of Kv1.2. This state-dependent interaction, however, is prominent for coupling between the voltage sensors and the pore, which is otherwise weakened due to electrostatic repulsion of some positive residues. These findings are in a good agreement with the experimental data obtained by our collaborators

Die dynamische Verknüpfung zwischen Plasmamembran und dem unterliegenden Zytoskelett der Zelle ist fundamental für zelluläre Prozesse wie Zellmorphogenese, Zellmotilität und Zelladhäsion. Ezrin als Bestandteil der ERM (Ezrin, Radixin, Moesin) Proteinfamilie verbindet L-α-Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) der Plasmamembran mit filamentösem Aktin (F-Aktin) des Zytoskeletts. Die Ezrinbindung an F-Aktin wird reguliert über den Aktivierungsgrad des Proteins, welcher von der N-terminalen PIP2 Bindung und der Phosphorylierung des Threoninrests 567 abhängt. Aufgrund der Bindung an PIP2 und der Phosphorylierung wechselt Ezrin von einer inaktiven, N- und C-terminal assoziierten Konformation in einen aktivierten, geöffneten Zustand, welcher die C-terminale F-Aktinbindung ermöglicht. Ziel dieser Arbeit war es Aspekte der Verknüpfung zwischen Plasmamembran und Zytoskelett zu untersuchen. Basierend auf Bindung von Ezrin an PIP2-haltige artifizielle Lipidmembranen und der anschließenden F-Aktinbindung, wurden Bindungseigenschaften, die Organisation des F-Aktinnetzwerkes und die durch das Aktinnetzwerk beeinflusste Lipidmembranmechanik untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde der molekulare Aktivierungsprozess von Ezrin anhand der Charakterisierung von Bindungsaffinitäten und der Organisation von Ezrin an Lipidmembranen untersucht. Aufgrund einer reduzierten Proteinhöhe und FRET (FÖRSTER-Resonanzenergietransfer)-Effizienz im Fall der vollständigen Aktivierung (PIP2-Bindung und Phosphorylierung) wurde postuliert, dass Ezrin eine weniger dicht gepackte, geöffnete Konformation gebunden an Lipidmembranen ausbildet. Dies ermöglicht dem Protein C-terminal F-Aktin zu binden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Aktinnetzwerke an festkörperunterstützten Lipidmembranen (SLBs) immobilisiert und über Ezrin an PIP2- oder elektrostatisch an 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (DOEPC)-haltige SLBs gebunden. Die Netzwerkorganisation wurde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht und unter Berücksichtigung der Immobilisierungsstrategie in Hinblick auf den Einfluss der Anzahl an Verknüpfungspunkten und aktinbindender Proteine (Fascin und α-Actinin) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Immobilisierungsstrategien zu Aktinnetzwerken mit ähnlichen Eigenschaften führten, bezugnehmend auf Maschengröße und Filamentsegmentlänge. Die Aktinnetzwerkdichte konnte direkt über die Anzahl an Verknüpfungspunkten und aktinbindende Proteine (ABPs) reguliert werden, dies demonstriert die physiologische Relevanz der Ergebnisse. Es ist bekannt, dass die Aktindichte in Zellen über PIP2- und ABP-Konzentration gesteuert wird. Im dritten Teil der Arbeit wurde das etablierte Modelsystem auf poröse Substrate übertragen. Unter Kenntnis der vorangegangenen Teile der Arbeit wurde der Einfluss des F-Aktinnetzwerkes auf die Lipidmembranmechanik untersucht. Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie wurden Indentationsexperimente an porenüberspannenden Lipidmembranen (PSLBs) durchführt, welche zeigten, dass ein aufliegendes F-Aktinnetzwerk die PSLBs versteift. Dies ließ sich auf die reduzierte laterale Mobilität der Lipide innerhalb der PSLBs aufgrund des Aktinnetzwerkes zurückführen, vergleichbar mit dem Picket-Fence-Modell der Plasmamembran bei welchem die Mobilität der Lipide und (Membran-)Proteine, aufgrund der Kompartimentierung der Membran durch das Aktin-Zytoskelett, eingeschränkt ist.

Le gène OCRL1, responsable du syndrome de Lowe de transmission récessive liée à l'X, code pour une PIP2 5-phosphatase associée à l'appareil de Golgi. 107 mutations du gène OCRL1 ont été identifiées chez 146 familles de syndrome de Lowe et 6 mutations ont été identifiées chez 23 patients atteints de maladie de Dent sans mutation du gène CLCN5. L'haplotypage de 18 familles a mis en évidence 3 cas de mosaïcisme germinal et somatique. L'activité PIP2 5-phosphatase fibroblastique des patients est très abaissée par rapport à des fibroblastes normaux. L'analyse par Western blot de la protéine OCRL1 montre une diminution variable de la quantité protéique et pas forcément corrélée à l'activité résiduelle de la protéine. L'analyse des transcrits d'OCRL1 montre qu'il existe une variabilité quantitative chez les patients mais également chez les témoins. Les premières études cliniques chez 55 patients atteints de syndrome de Lowe ne montrent pas de corrélation génotype-phénotype évidente.

The TRPA1 channel is a universal, nociception-mediating cellular sensor activated by various environmental irritants, potentially harmful physical modalities and endogenous mediators of pathophysiological processes. The polymodality of TRPA1 channel allows the activation stimuli to further enhance or suppress each other's effect. While this modulation effect has its physiological importance in promoting the protective cellular and behavioral mechanisms, it may result into the unpleasant pain-related effects accompanying the chronical pain caused by aberrant TRPA1 channel activity. In order to effectively and selectively target the synergic properties of TRPA1 modulators, while preserving the sensitivity to the environmental threads, the knowledge of the mechanisms of polymodal regulation at the molecular level are required. This doctoral thesis aims at the elucidation of three main mechanisms of TRPA1 regulation: 1) the regulation via intracellular signaling cascades and phosphorylation, 2) the interaction with membrane phospholipids and 3) the temperature-driven gating. The results presented in the thesis show that the effects of the inflammatory mediator bradykinin are decreased by the low-frequency high-induction electromagnetic field used in magnetotherapy. We have identified a residue S602...

Inwardly rectifying potassium (Kir) channels establish and regulate the resting membrane potential of excitable cells in the heart, brain and other peripheral tissues. Phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate (PIP2) is a key direct activator of ion channels, including Kir channels. Gasotransmitters, such as carbon monoxide (CO), have been reported to regulate the activity of Kir channels by altering channel-PIP2 interactions. We tested, in a model system, the effects and mechanism of action of another important gasotransmitter, hydrogen sulfide (H2S) thought to play a key role in cellular responses under ischemic conditions. Direct administration of sodium hydrogen sulfide (NaHS), as an exogenous H2S source, and expression of cystathionine γ-lyase (CSE), a key enzyme that produces endogenous H2S in specific brain tissues, resulted in comparable current inhibition of several Kir2 and Kir3 channels. A “tag switch” assay provided biochemical evidence for sulfhydration of Kir3.2 channels. The extent of H2S regulation depended on the strength of channel-PIP2 interactions: H2S regulation was attenuated when strengthening channel-PIP2 interactions and was increased when channel-PIP2 interactions were weakened by depleting PIP2 levels via different manipulations. These H2S effects took place through specific cytoplasmic cysteine residues in Kir3.2 channels, where atomic resolution structures with PIP2 gives us insight as to how they may alter channel-PIP2 interactions. Mutation of these residues abolished H2S inhibition, and reintroduction of specific cysteine residues into the background of the mutant lacking cytoplasmic cysteine residues, rescued H2S inhibition. Molecular dynamics simulation experiments provided mechanistic insights as to how sulfhydration of specific cysteine residues could lead to changes in channel-PIP2 interactions and channel gating.

Les protéines ERMs (Ezrine, radixine et moésine) jouent un rôle central in cellulo, dans de nombreux processus cellulaires tels que les infections, la migration et la division cellulaire. Parmi celles-ci, la moésine est plus particulièrement impliquée dans la formation de la synapse immunologique, l’infection virale et bactérienne, et les métastases cancéreuses. D’un point de vue structural, les ERM peuvent être en conformation inactive (replies sur elles-mêmes) ou actives (ouvertes), ce qui permet leur interaction a la fois avec les constituants du cytosquelette (actine et tubuline) via leur domaine C-terminal et la membrane plasmique via leur domaine FERM. La liaison a la membrane plasmique se fait principalement et spécifiquement via un lipide de la famille des phosphoinositides, le phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2). De plus, les protéines peuvent être phosphorylées, ce qui contribue à leur ouverture structurale. Cependant, le rôle de la phosphorylation sur les interactions ERM/membrane et ERM/cytosquelette, bien que beaucoup étudié in cellulo, est peu compris au niveau moléculaire.Le but de cette thèse est précisément d’étudier, au niveau moléculaire et à l’aide de systèmes biomimétiques, les interactions entre des protéines recombinantes et des membranes biomimétiques contenant du PIP2. Pour cela, nous avons mis au point des membranes lipidiques sous forme de vésicules unilamellaires (petites ou larges) et de bicouches lipidiques supportées, qui permettent de caractériser les interactions entre protéines et membranes par des techniques biophysiques complémentaires, notamment la cosédimentation quantitative, la microscopie et spectroscopie de fluorescence, et la microbalance à cristal de quartz. Dans une première partie, nous avons étudié le rôle de la double phosphorylation de la moésine (réalisée par mutation sur site spécifique) sur les interactions moésine/membrane biomimétique, en comparaison de la protéine sauvage, les protéines recombinantes et les mutants ayant été produites et purifiées au laboratoire.Nos résultats mettent en évidence une interaction spécifique et coopérative pour le double mutant phosphomimétique alors que cette interaction est simple dans le cas de la protéine sauvage. Dans une seconde partie, nous avons employé les bicouches lipidiques supportées contenant le PIP2 pour étudier les mécanismes molécules d’adsorption de la protéine virale Gag et de ses mutants. Les méthodologies développées dans ce travail de thèse ouvrent des perspectives en biophysique moléculaires car elles sont facilement transposables à l’étude d’autres protéines sur des membranes lipidiques modèles contenant des phosphoinositides.Mots clés: Ezrine-Radixine-Moésine, phosphoinositides, PIP2, interactions protéine-lipide, membrane lipidique biomimétique, protéine virale Gag, cytosquelette. / ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins play a central role in cellulo in a large number of physiological and pathological processes, including cell infection, migration and cell division. Among the ERMs, moesin is particularly involved in the formation of the immunological synapse, viral and bacterial infection, and cancer metastasis. From a structural point of view, ERMs can be in inactive (closed) conformation or active (open), which enable them to interact on one side with the cytoskeleton (actin and tubulin) via their C-terminal domain and on the other side with the plasma membrane via their FERM domain. Binding to the plasma membrane is mediated via a specific lipid of the phosphoinositide family, the phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate (PIP2). In addition, ERM can be phosphorylated, which contribute to their structural opening. To date, the role of the phosphorylation in ERM/membrane and ERM/cytoskeleton interactions, although widely studied in cellulo, remains poorly understood at the molecular level.The aim of this PhD thesis is precisely to study, at the molecular level and using biomimetic systems, interactions between recombinant proteins and biomimetic membranes containing PIP2. To this end, we have engineered lipid membranes in the form of large and small unilamellar vesicles and supported lipid bilayers. These biomimetic membranes are used to characterize interactions between proteins and membranes by complementary biophysical techniques, notably quantitative cosedimentation, fluorescence microscopy and spectroscopy, and quartz crystal microbalance with dissipation monitoring. In a first part, we studied the role of double phosphorylation on moesin, achieved via a site-specific mutation on threonine residues, on moesin/biomimetic membrane interactions, in comparison to the wild type protein. The recombinant proteins and mutants were produced in our laboratory.Our results show that there is a specific and cooperative interaction for the double phosphomimetic mutant while interactions is 1:1 in the case of the wild type protein. In a second part, we used supported lipid bilayers containing PIP2 to study the molecular adsorption mechanism of the viral protein Gag and of its mutants. The methodologies that were developed in this work open perspectives in molecular biophysics since they are easily adaptable to other proteins on model lipid membranes containing phosphoinositidesKeywords: Ezrin-Radixin-Moesin, phosphoinositides, PIP2, protein/lipid interactions, biomimetic lipid membrane, Gag viral protein, cytoskeleton.

The membrane phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) is an important signaling molecule as substrate for the phospholipase C (PLC)-catalyzed formation of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) and diacylglycerol, and by directly regulating e.g. ion-channels, the cytoskeleton and vesicle trafficking in various types of cells. The present studies provide insights into the regulation of PLC activity and the plasma membrane concentration of PIP2 in individual insulin-secreting cells. Real-time monitoring of plasma membrane PIP2 was performed with evanescent wave microscopy and the PIP2/IP3-binding pleckstrin-homology-domain from PLC-δ1 fused to GFP. It was demonstrated that membrane depolarization and voltage-dependent Ca2+ influx are sufficient to activate PLC. Rise of the glucose concentration triggered Ca2+-dependent activation of PLC. Simultaneous measurements of the cytoplasmic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) demonstrated that oscillations of [Ca2+]i resulting from periodic influx induced cyclic activation of PLC. Activation of muscarinic receptors caused a biphasic PLC response with an initial peak enhanced by positive feedback by Ca2+ mobilized from intracellular stores, followed by sustained activity depending on store-operated Ca2+-entry. Activation of PLC by Ca2+ mobilized from intracellular stores was part of the Ca2+-induced Ca2+ release mechanism by which glucagon stimulates primary mouse pancreatic β-cells. Experiments in permeabilized cells demonstrated rapid turnover of PIP2 with t1/2 ~ 16s. ATP stimulated concentration-dependent synthesis of plasma membrane PIP2, counteracted by the ADP analogue ADPβS. RT-PCR analysis identified transcripts of 10 different phosphoinositide-kinases. The ATP-stimulated PIP2 formation was mediated by type II and III PI4-kinases as well as by PIP5-kinase Iβ. It is concluded that the PIP2 concentration in the plasma membrane is regulated by the ATP/ADP ratio and that its hydrolysis by PLC is tightly controlled by [Ca2+]i in insulin-secreting cells.

La membrane plasmique de la cellule est composée de lipides et interagit notamment avec le squelette de la cellule (le cytosquelette), par l'intermédiaire de protéines d'ancrages et de lipides clefs qui jouent un rôle spécifique dans certains types d'interactions. Parmi les protéines intervenant dans l'ancrage direct de la membrane plasmique au cytosquelette, des protéines de la famille des ERM (Ezrine, Radixine, Moésine) peuvent interagir spécifiquement avec un lipide, le phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2), d'une part et avec l'actine du cytosquelette d'autre part. Dans le but de comprendre les interactions entre membrane plasmique et cytosquelette, nous avons réalisé des expériences in vitro sur des systèmes comportant un nombre minimal de constituants : des vésicules géantes (GUV) contenant du PIP2, de l'ezrine recombinante et de l'actine purifiée. Nous avons mis en évidence que la liaison au PIP2 induit des changements conformationnels de l'ezrine. L'ezrine est alors capable d'interagir avec les filaments d'actine. Nous avons caractérisé quantitativement l'incorporation de PIP2 dans la membrane de vésicule géantes, et montré que l'interaction de l'ezrine avec les vésicule géante contenant du PIP2, induit un partitionnement du lipide dans la bicouche lipidique et conduit à la formation d'agrégats de PIP2 et d'ezrine sur la membrane. La connaissance des effets de l'ezrine sur les membranes contenant du PIP2 et la connaissance des différents mécanismes se produisant lors des interactions permettra de définir plus précisément le rôle de l'ezrine in cellulo.