Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A diferenciação da oligodendroglia depende de alterações coordenadas no citoesqueleto e na sua relação com a membrana plasmática, um componente importante para a formação da bainha de mielina. A 23 nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) está relacionada com a organização do citoesqueleto, sendo uma proteína ancoradoura de microtúbulos na membrana plasmática. In vitro, a CNPase compõe, com a F-actina e os microtúbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoproteína associada a mielina (MAG), também é importante para a formação dos véus de membrana e está associada a CNPase e a tubulina. Além disso, as três proteínas podem ser reguladas pela via de sinalização do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulação da diferenciação oligodendroglial, culturas de hemisférios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as células das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos véus de membrana quando comparadas às culturas controle. O tratamento com SQ também causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a redução no tamanho dos prolongamentos e nos véus de membrana. Com 24 h, as células tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, já as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram redução no véu de membrana. Observamos também alterações na distribuição da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentração próxima ao núcleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padrão puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentração próximo ao núcleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ também reduziu a distribuição da MAG nos véus de membrana. A mesma redução foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforçam a participação da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formação dos prolongamentos, suas ramificações e ainda a formação dos véus de membrana, com prováveis consequências na formação e manutenção da bainha de mielina. / Oligodendroglial differentiation depends on coordinated changes in the cytoskeleton and on its relationship with the plasmatic membrane, a critical site regarding the formation of the myelin sheath. 23cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase (CNPase) is related to cytoskeleton modulation, anchoring microtubules to the plasmatic membrane. In vitro, CNPase composes, together with F-actin and microtubules, the vein-like structures or radial components in myelin sheath. Myelin associated glycoprotein (MAG) is important to membrane vellum formation and is associated with CNPase and tubulin. Besides, the AMPc/PKA pathway can regulate these three proteins. In order to evaluate the effects of the cAMP/PKA pathway modulation on oligodendroglial differentiation, cultures of cerebral hemispheres were treated for 30 min or 24 h with the adenylyl cyclase inhibitor SQ22536 SQ [1 lM] or with its activator forskolin [10 lM], or with the PKA inhibitor H-89 [1 lM]. Oligodendroglia was identified using anti-CNPase antibody as also by morphology. At 30 min, the cells treated with forskolin showed bigger processes and a shorter membrane vellum when compared to control cultures, the treatment with SQ caused an increase in the processes length, the H-89 treatment reduced the processes length and the membrane vellum. At 24 h, cultures treated with forskolin showed few processes when compared to control cultures. Cultures treated with SQ showed an increase in the processes length and after H89 treatment oligodendroglial cells presented a reduction in the membrane vellum. We also observed alterations in the distribution of CNPase, tubulin and MAG, the first showed an increase in the distribution closest to nucleus in both periods of H-89 treatment, the same pattern occurred for tubulin. The CNPase acquired a punctiform pattern after 24 hours of treatment with both inhibitors. The MAG also showed an increase closest to nucleus after 30 minutes of treatment with forskolin and SQ. The SQ treatment also caused a reduction in the protein distribution to membrane vellum. The same reduction is observed after 24 hours of treatment with H-89.These findings reinforce a role for AMPc/PKA pathway in oligodendroglial differentiation including the processes extension and arborization as also the formation of membranar vellum, with possible consequences in the formation and maintenance of myelin sheath.

Estudos anteriores de nosso laboratório demonstraram que a estimulação aguda dos receptores 2-adrenérgicos (2-AR) atenua a perda de massa muscular induzida pela desnervação motora (DEN) por meio de uma via dependente de AMPc/PKA. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ativação crônica destes receptores ainda são pouco conhecidos. Por outro lado, a ativação desta via de sinalização também está envolvida no controle da estabilidade dos receptores nicotínicos (AChR) na junção neuromuscular (JNM), sugerindo que a densidade dos AChR possa estar sob controle neuro-humoral. Desta forma, aventou-se a possibilidade de que além dos efeitos protetores na massa muscular, a ativação dos receptores 2-AR pudesse mediar a estabilização dos AChR na placa motora. Para testar essa hipótese, camundongos foram submetidos à DEN através da secção do nervo ciático, um protocolo clássico de indução de atrofia muscular e desestabilização dos AChR, e tratados com salina ou clembuterol (CB), um 2-agonista seletivo, por até 14 dias. Após 3 dias de DEN, observou-se redução da massa muscular e aumento do conteúdo proteico e expressão do RNAm de genes relacionados à ativação do sistema Ubiquitina-Proteassoma (atrogina-1 e MuRF1) e do sistema autofágico/lisossomal (catepsina L e LC3). A DEN também promoveu aumento no turnover dos AChR, no número de vesículas endocíticas e na expressão do RNAm para a subunidade 1 dos AChR. Após 7 dias, a DEN reduziu a expressão dos genes relacionados à atrofia e aumentou a atividade da via do AMPc/PKA independentemente do tratamento com CB. Na tentativa de elucidar os sinais extracelulares que produziam esta resposta adaptativa, foi demonstrado que neurônios catecolaminérgicos trafegam ao longo do nervo ciático e sua ablação pela DEN reduziu o conteúdo de noradrenalina muscular. Baseados nestes resultados, foi postulado a existência de uma hipersenbilidade às catecolaminas em músculos desnervados cronicamente. O tratamento com CB por 3 dias aboliu o aumento da expressão dos atrogenes induzido pela DEN e este efeito foi associado ao maior conteúdo de AMPc e de substratos fosforilados pela PKA. Além disso, o CB diminuiu a hiperexpressão do RNAm para catepsina L e LC3 induzida pela DEN de 7 dias. Embora o CB não tenha alterado a meia-vida dos AChR em músculos inervados e desnervados, houve um total bloqueio do aumento do número de vesículas endocíticas contendo o AChR em músculos desnervados e tratados com CB. Corroborando estes dados, o CB aumentou a incorporação de AChR novos nas JNM e este efeito foi também associado à maior expressão do RNAm para a subunidade 1-AChR em músculos desnervados. Esta ação do CB no turnover dos AChR parece ser direta uma vez que neuroniôs catecolaminérgicos presentes no nervo ciático ativam receptores 2-ARe a produção de AMPc especificamente na JNM. Em estudos in vitro, foi demonstrado que a estimulação colinérgica produzida pelo carbacol (10-4M) diminuiu a velocidade de síntese de proteínas, aumentou a proteólise total e a atividade do sistema proteolítico Ca2+-dependente em músculos soleus de ratos por meio da ativação dos receptores nicotínicos. Este efeito catabólico do carbacol foi completamente bloqueado pela adição de CB (10-4M) ao meio de incubação. Os dados obtidos no presente estudo permitem sugerir que a estimulação crônica dos 2-AR no músculo esquelético induz um efeito anti-catabólico pela supressão dos sistemas proteolíticos proteassomal e lisossomal, provavelmente através da via de sinalização do AMPc/PKA. A inibição destes sistemas pode estar relacionada ao aumento do turnover dos AChR, uma vez que a velocidade de incorporação destes receptores na JNM foi aumentada pelo CB. Além disso, os achados que mostram a associação entre neurônios noradrenérgicos e colinérgicos no nervo ciático, que conjuntamente inervam as JNM, e a co-localização de receptores 2-AR e AChR na sinapse permitem sugerir a existência de uma interação funcional entre o sistema colinérgico e adrenérgico na manutenção da massa muscular e da placa motora. / Previous studies from our laboratory have shown that the acute stimulation of 2-adrenergic receptor (2-AR) attenuates the muscle loss induced by motor denervation (DEN) through a cAMP/PKA dependent pathway. However, the molecular mechanisms involved in the chronic activation of these receptors are poorly understood. Furthermore, the activation of this signaling pathway is also involved in controlling the stability of nicotinic receptors (AChR) at the neuromuscular junction (NMJ), suggesting that the density of AChR may be under neurohumoral control. Thus, we postulated that besides the protective effects on muscle mass the activation of 2-AR receptors could mediate the stabilization of AChR in the motor plate. To test this hypothesis, mice were submitted to DEN through of the sciatic nerve section, a classical protocol of induction muscle atrophy and destabilization of AChR, and were treated with saline or clenbuterol (CB), a selective 2-agonist for 14 days. DEN decreased the muscle mass and increased the protein content and mRNA expression of genes related to the activation of the ubiquitin-proteasome system (atrogin-1 and MuRF1) and autophagic/lysosomal system (cathepsin L and LC3). DEN also promoted an increase in the turnover of AChR, number of endocytic vesicles and the expression of mRNA for the 1 subunit of AChR. Interestingly, chronic DEN induced down-regulation of atrophy related-genes, and increased the activity of cAMP/PKA pathway independently of CB treatment. In an attempt to elucidate the extracellular signals that produced this adaptive response, it was demonstrated that catecholaminergic neurons travels along the sciatic nerve and its ablation by DEN reduces muscle norepinephrine content. Based on these results, it was postulated the existence of a muscle adrenergic hypersensitivity to circulating catecholamines induced by chronic DEN. CB treatment for 3 days completely abolished the higher expression of atrogenes and this effect was associated with increased Camp content and PKA phosphorylated substrates. Furthermore, CB decreased the DEN-induced hyperexpression of cathepsin L and LC3 mRNA at 7 days. Although CB has not altered the half-life of AChR in innervated and denervated muscles, it produced a total blockage of the increased number of endocytic vesicles containing the AChR in denervated muscles. Consistently, CB increased the incorporation of new AChR and this effect was associated with an increased expression of the 1-subunit AChR mRNA in denervated muscles. This action of CB on AChR turnover appears to be direct, since catecholaminergic neurons are present in the sciatic nerve stimulating 2-AR and cAMP production specifically in the NMJ. Furthermore, in vitro studies demonstrated that cholinergic stimulation produced by carbachol (10-4M) decreased the rate of protein synthesis and increased the proteolytic activity of Ca2+-dependent system in rat soleus muscle through activation of nicotinic receptors. This catabolic effect of carbachol was completely blocked by the addition of CB (10-4M) to the incubation medium. These data suggest that chronic stimulation of 2-AR in skeletal muscle induces an anti-catabolic effect by suppressing proteasomal and lysosomal proteolytic systems, probably through the cAMP/PKA signaling. The inhibition of these systems seems to be related to the increased AChR incorporation into NMJ induced by CB treatment. Moreover, the association between noradrenergic and cholinergic neurons in the sciatic nerve, both of which innervate the motor endplates, and the co-localization of AChR and 2-ARat the synapse suggest the existence of a functional interaction between cholinergic and adrenergic systems in the maintenance of muscle mass and motor endplate.

La nicotianamine est une molécule naturelle qui joue un rôle essentiel dans la régulation des concentrations en métaux de transition dans les plantes. Sa structure comprend trois acides carboxyliques et trois fonctions amines. L'objectif du travail présenté dans ce manuscrit est d'établir un protocole permettant de reproduire les propriétés de chélation de cette molécule grâce à des calculs de chimie quantique. L'intérêt est d'appliquer ce protocole à des analogues synthétiques de la nicotianamine, afin de prédire leurs propriétés.Le protocole que nous avons mis au point s'articule autour de quatre axes : le calcul des pKa, l'étude des propriétés de chélation, le calcul de tenseur g de résonance paramagnétique électronique et l'analyse des propriétés vibrationnelles. Ces différents points ont nécessité le développement de méthodes de calcul et d'outils innovants. Les calculs de chimie quantique qui ont été effectués sont basés sur la théorie de la fonctionnelle de la densité. On a utilisé des fonctionnelles hybrides, associées à un modèle de solvant implicite ou semi-explicite qui permet de prendre en compte l'effet du milieu.Nous avons proposé une méthode graphique originale adaptée à la nicotianamine permettant le calcul de ses six pKa ainsi que celui des pka des complexes formés avec les métaux de transition. Cette méthode conduit à une bonne précision sur les calcul de pKa dans l'intervalle de pH physiologique. Ces pKa renseignent sur le comportement de la nicotianamine dans différents milieux végétaux. Nous avons aussi envisagé plusieurs protocoles pour l'étude des propriétés de chélation de la nicotianamine.Pour compléter l'étude des complexes de la nicotianamine, nous avons paramétré une méthode simple et rapide de calcul du tenseur g de systèmes moléculaires contenant du cuivre paramagnétique. Enfin, nous avons développé un programme graphique permettant l'analyse des modes de vibration infrarouges de systèmes moléculaires comme les complexes métal-nicotianamine étudiés. / Nicotianamine is a triamino acid that plays an essential role in regulation and transportation of transition metals in plants by a chelation process. Functional analogues of this molecule have already been synthesised that we hope to use for selective soil decontamination thanks to their property changes with respect to nicotianamine. Therefore, the aim of the present work is to find a predictive protocol for the chelating properties of these analogues, using the know example of nicotianamine. We worked out a predictive protocol focusing on the four following points : pKas, chelation, EPR tensors and vibrational properties. It uses quantum chemistry methods such as hybrid DFT functionals and implicit solvent models.The pKa calculations for nicotianamine and metal-nicotianamine complexes were performed using a novel graphical method well suited to these systems. The pKas are useful to understand the effect of the various plants pHs on the complexes. Then we computed the chelation constants and the structures of metal-nicotianamine complexes. As a complement to the study of these complexes, we set up protocols to calculate the EPR tensors of the copper-nicotianamine complex and to analyse the infra-red vibrations of the complexes, using respectively a parametrised method and a local code.

Au cours du développement, les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) voyagent sur de longues distances pour établir des connexions avec leurs cellules cibles. La navigation des cônes de croissance est guidée par différentes molécules chimiotropiques présentes dans leur environnement. Les endocannabinoïdes (eCB) sont d’importants neuromodulateurs qui régulent de manière rétrograde la fonction de nombreuses synapses du cerveau. Ils agissent principalement par le biais de leurs récepteurs liés à une protéine Gi/o CB1 (CB1R) et CB2 (CB2R). La présence des eCBs durant le stade fœtal et la période postnatale suggère leur implication dans des événements régulant le développement du système nerveux. Cette thèse confirme l’expression des récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2 ainsi que l’enzyme dégradant les eCBs lors du développement embryonnaire et perinatal des CGRs et de la voie rétinothalamique in vivo. La manipulation pharmacologique de l’activité de CB1R et CB2R réorganise la morphologie du cône de croissance des CGRs et des neurones corticaux in vitro. De plus, la stimulation locale avec un agoniste de CB1R ou de CB2R modifie le comportement du cône de croissance entraînant sa répulsion. CB1R et CB2R modulent par le biais de la voie de signalisation AMPc/PKA, la mobilisation de DCC à la membrane plasmique. Par ailleurs, les résultats de cette recherche démontrent également l’implication de CB1R et CB2R dans la ségrégation des projections ipsi- et controlatérales et le développement de la voie rétinothalamique. / Following differentiation, retinal ganglion cell (RGC) axons, tipped at their distal end by the growth cone (GC), navigate through relatively long distances in a highly directed manner in order to establish functional synapses with thalamic and superior colliculus (SC) neurons. This is achieved with the help of extracellular guidance molecules which steer RGC axon growth by regulating GC morphology by means of attractive and/or repulsive mechanisms. In the adult brain, endocannabinoids (eCBs) exert an important neuromodulatory function by acting as retrograde messengers to regulate the function of many synapses. Endocannabinoids act mainly via their Gi/o protein coupled receptors CB1 (CB1R) and CB2 (CB2R). Due to their presence at the fetal and early postnatal periods, it has been proposed that eCBs and their receptors might be involved in several developmental events, such as cell proliferation and migration, axon guidance and synaptogenesis. We observed that during early postnatal development, components of the eCB system are expressed along the visual pathway (the optic chiasm, the lateral geniculate nucleus and the SC). To assess the implication of the eCB system, in vitro, embryonic retinal explant and primary neuron cultures were treated with pharmacological agonists and inverse agonists of CB1R and CB2R. These experiments demonstrated that these cannabinoid receptors modify the GC’s morphology. Most importantly, CB1R and CB2R act through the cAMP/PKA pathway to modulate the presence of DCC at the plasma membrane. In vivo, CB1R and CB2R play a major role and the absence of either one of them induces a decrease in eye-specific segregation of retinal projections. These results show an implication of CB1R and CB2R during RGC growth and retinothalamic development.

La production endogène de glucose est une fonction cruciale au maintien de l’homéostasie glucidique dont les 2 dernières étapes sont la production de glucose par la glucose-6-phosphatase (G6Pase) et la sortie du glucose hors de la cellule par le transporteur facilité GLUT2. Les mécanismes dépendants de mouvements membranaires régulant ces deux étapes ont été étudiés. La régulation de la G6Pase par l’AMPc dépend de mouvements membranaires. Cependant les mécanismes moléculaires de cette régulation restaient à caractériser. Nous avons étudié l’hypothèse d’une phosphorylation directe des sous-unités de la G6Pase par la PKA. La PKA est capable d’induire l’activité G6Pase. Cependant, aucune phosphorylation des sous-unités G6Pase n’a pu être mise en évidence par phosphorylation in vitro, mutations dirigées de sites potentiels de phosphorylation ou analyse par spectrométrie de masse. En absence de Glut2, le glucose produit de novo sort des hépatocytes par une voie dépendante de mouvements membranaires, dont le mécanisme moléculaire n’est pas caractérisé. Cette voie vésiculaire n’est pas impliquée dans la sortie du glucose glycogénolytique. À l’inverse, 50% du glucose néoglucogénique sort des hépatocytes par une voie vésiculaire, probablement dépendante de la cavéoline-1. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons montré que la G6Pase se déplace dans la cellule vers la membrane plasmique et co-localise avec une partie de la cavéoline1 cellulaire. Les vésicules composées de cavéoline-1 et contenant la G6Pase pourrait donc constituer un lien entre le réticulum endoplasmique, lieu de production du glucose et la membrane plasmique, lieu de libération du glucose / Endogenous glucose production is a crucial function to maintain glucose homeostasis whose last two steps are glucose production by glucose-6-phosphatase (G6Pase) and glucose output by GLUT2. Regulations of both steps depend on membrane movements. In this work, we characterized the mechanisms of these regulations. Regulation of G6Pase by cAMP depends on membrane movements; however the molecular mechanisms of this regulation still have to be characterized. We hypothesized that PKA directly phosphorylated G6Pase subunits. We showed that PKA was able to enhance G6Pase activity. However, no phosphorylation of G6Pase subunits was evidenced by in vitro phosphorylation, directed mutagenesis of potentiel phosphorylation sites or mass spectrometry. In the absence of Glut2, the gluconeogenic glucose produced by hepatocytes is released through a pathway depending on membrane movements, which has not been characterised yet. This vesicular pathway was not involved in the output of glycogenolytic glucose. However, half of gluconeogenic glucose was released through a vesicular pathway, probably depending on caveolin-1. By confocal microscopy, we showed that G6Pase moved in cells and co-localized in part with cellular caveolin-1. Caveolin-1 vesicles containing G6Pase could thus constitute a link between the endoplasmic reticulum, site of glucose production, and the plasma membrane, site of glucose output

Les surrénales sont des glandes endocrines permettant la réponse au stress de l’organisme. Alors que la medulla produit des catécholamines, la corticosurrénale sécrète des minéralocorticoïdes au niveau de la zone glomérulée, et des glucocorticoïdes grâce aux cellules de la zone fasciculée. Ces hormones sont notamment impliquées dans l’homéostasie hydrominérale, la réponse immunitaire et la maturation pulmonaire au cours de la vie fœtale. Les insuffisances surrénaliennes peuvent donc être très délétère en absence de traitement. Pour maintenir l’intégrité tissulaire au cours de la vie et pour mieux répondre aux variations des besoins de l’organisme, le cortex surrénalien est en renouvellement cellulaire constant. Des expériences de lignage ont mis en évidence que ce renouvellement repose sur le recrutement de cellules progénitrices capsulaires et situées dans la partie externe du cortex. Lorsqu’ils sont mobilisés, ces progéniteurs se différencient en cellules de la zone glomérulée, qui vont alors migrer de façon centripète le long du cortex et se différencier en cellules de la zone fasciculée après une conversion de lignage, au cours de leur migration. Cette conversion de lignage est orchestrée via un équilibre entre l’activation des voies Wnt/β-caténine, imposant une identité glomérulée, et PKA, permettant une différenciation fasciculée. Les facteurs épigénétiques jouent de nombreux rôles essentiels, du développement embryonnaire jusqu’à la tumorigenèse, en passant par l’homéostasie des tissus. Nous avons montré que la méthyltransférase EZH2 était le facteur épigénétique le plus surexprimé dans les carcinomes corticosurrénaliens et que cette surexpression était associée à l’agressivité de ces cancers. EZH2 est la sous-unité catalytique du complexe multi-protéique PRC2 qui permet, entre autres, la répression de la transcription de ses gènes cibles en posant la marque H3K27me3. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les potentiels rôles physiologiques de EZH2 dans la surrénale, qui n’avaient jusque là, jamais été recherchés.En développant un modèle murin d’invalidation génétique de Ezh2 dans le cortex surrénalien, dès l’émergence de l’ébauche surrénalienne au cours du développement embryonnaire, nous avons pu mettre en évidence une hypoplasie corticosurrénalienne, résultant d’une forte atrophie de la zone fasciculée, et associé à une insuffisance primaire en glucocorticoïdes. Nos analyses nous ont permis de démontrer le rôle original et inattendu de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA, en réprimant l’expression d’inhibiteurs de cette voie comme les phosphodiestérases (PDE) et la sous-unité régulatrice Prkar1b. EZH2 régule ainsi la zonation fonctionnelle du cortex surrénalien via son activité histone méthyltransférase. A l’inverse, on n’observe pas d’altération marquée de la voie Wnt/β-caténine, suggérant que Ezh2 n’est pas essentiel au contrôle de cette voie dans la surrénale. Nous avons également pu mettre en évidence une dédifférenciation de cellules corticales qui retrouvent, suite à la perte de Ezh2, une identité progénitrice en exprimant des marqueurs adréno-gonadique tels que Gata4 et Wt1. Cette dédifférenciation est un phénomène naturel que l’on retrouve avec le vieillissement et qui pourrait être associée avec la diminution progressive de l’expression de Ezh2 dans les cellules stéroïdogènes. L’ensemble de ces résultats, met en évidence une nouvelle fonction de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA et de l’homéostasie de la glande surrénale. / Adrenals are endocrine glands allowing the stress response of the organism. While the medulla produces catecholamines, the adrenal cortex secretes mineralocorticoids in the glomerular zone, and glucocorticoids through cells in the fasciculated zone. These hormones are notably involved in hydromineral homeostasis, the immune response and pulmonary maturation during fetal life. Adrenal insufficiency can therefore be very deleterious in the absence of treatment. To maintain tissue integrity over the course of life and to better respond to the changing needs of the body, the adrenal cortex is in constant cell renewal. Lineage experiments have shown that this renewal is based on the recruitment of capsular progenitor cells and progenitors located in the outer part of the cortex. When mobilized, these progenitors differentiate into cells of the glomerular zone, which then migrate centripetally along the cortex and differentiate into cells of the fasciculated zone after lineage conversion, during their migration. This lineage conversion is orchestrated via a balance between the activation of the Wnt/β-catenin pathway, imposing a glomerular identity, and PKA pathway, allowing fasciculated differentiation. Epigenetic factors play many important roles, from embryonic development to tumorigenesis, passing by tissue homeostasis. We have shown that methyltransferase EZH2 is the most overexpressed epigenetic factor in adrenocortical carcinomas and this overexpression is associated with cancer agressivity. EZH2 is the catalytic subunit of the multiprotein complex PRC2 that allow, among others things, the repression of the transcription of its target genes by posing the mark H3K27me3. The aim of my thesis was to indentify the putative physiological roles of EZH2 in the adrenal, never investigated yet.By developing a murine model of genetic invalidation of Ezh2 in the adrenal cortex, from the emergence of the adrenal anlagen during embryonic development, we have been able to demonstrate adrenocortical hypoplasia, resulting from a strong atrophy of the zona fasciculata, and associated with primary glucocorticoid insufficiency. Our analyses allowed us to demonstate the original and unexpected role of EZH2 in the controle of the PKA pathway, by repressing expression of this pathway inhibitors such as phosphodiesterases (PDE) and regulatory subunit Prkar1b. EZH2 thus regulate functionel zonation of adrenal cortex via its histone methyltransferase activity. On the contrary, we don’t observe marked alteration of the Wnt/β-catenin pathway, suggesting EZH2 is not essential for the control of this pathway in the adrenal. We could also show a dedifferenciation of cortical cells which, after the loss of Ezh2, exhibit progenitors identity by expressing adreno-gonadal marks as Gata4 and Wt1. This dedifferenciation is a natural phenomenon that appear with ageing and could be associated with processive decrease of Ezh2 expression in steroidogenic cells. All of these results, highlights a new function of Ezh2 in the control of the PKA signaling pathway and in the homeostasis of the adrenal gland.

As cisteíno-proteases da família da papaína desempenham funções essenciais em processos biológicos, entre eles o desenvolvimento e crescimento do organismo, vias de sinalização celular e apoptose, invasão de parasitas em células hospedeiras. Assim, trata-se de uma classe de proteínas de grande interesse para as indústrias farmacêuticas, sendo utilizada como alvo para o tratamento de doenças como o câncer e metástases, osteoporose. Disfunções relacionadas ao sistema imune, doenças parasitárias como malária, leishmaniose, doença do sono e doença de Chagas. Esta última é uma enfermidade considerada negligenciada pelas grandes indústrias farmacêuticas, sem nenhum tratamento eficaz e seguro disponível, que gera um problema econômico de mais de sete bilhões de dólares anuais devido à perda de mão de obra e gastos com tratamento para amenizar os efeitos da doença. A cisteíno protease cruzaína de Trypanosoma cruzi, causador da Doença de Chagas, desponta como um alvo validado na busca de novos fármacos contra essa enfermidade. Essa enzima apresenta um par de aspartatos que interagem entre si, para os quais foi predito um pKa de 7, sendo possível a forma desprotonada desse par em condições biológicas. Neste caso, pode levar à exposição de uma nova cavidade por meio do movimento da alça entre os resíduos 57-62, segundo as simulações de dinâmica molecular desse trabalho, que se trata de uma possível candidata a ponto de seletividade de inibidores de cisteínoproteases de parasitos em relação às suas ortólogas em Homo sapiens que não possuem o par de aspartatos. Em pH ácido, foi mostrado por meio de análise de componentes principais de simulações de dinâmica molecular que as cisteíno protease apresentam uma restrição gradual na amostragem conformacional do sítio ativo quando complexadas com as formas não covalente e covalente de inibidores derivados de dipeptidil nitrilas. Isso sugere que esse sistema segue o modelo de seleção conformacional para flexibilidade de proteína. Notou-se também que o perfil de restrição de ligantes que inibem na faixa de nmol.L-1 difere daqueles a µmol.L-1 , o que possibilitou a construção de uma árvore de decisão para identificar os complexos que apresentam afinidade a nmol.L-1 . / The papain-like cysteine proteases are essentials for biological process, performing important roles on the parasite development, growth and also in the parasite invasion process on the host cell, in cellular signaling pathways and apoptosis, among others. Thus, the pharmaceutical industry widely uses this class of protein as target for the development of new drugs, against cancer and metastasis, osteoporosis and immune system disorders, resulting in many approved drugs. Additionally, these enzymes are validated target against parasitic diseases as leishmaniose, malaria and African and American trypanosomiasis. The last one, also known as Chagas\' disease, is neglected disease for which, further a century form this discovery, there is no effective and safe chemotherapy and is responsible for an economic loss of around seven billion dollars in the world per year due to the health care and lost productivity from infected people. Faced with this situation, the Cruzain, a cysteine protease from the Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas\' disease, is emerging as interesting and validated target to the search for new drugs against this sickness. This enzyme has a pair of interactiong Asp for which was predicted a pKa of 7, by computational methods. By this way, this pair under neutral to alkaline pH adopts the deprotonated form, which exposed a new cavity through a movement of loop of residues 57-62, as we showed here by molecular dynamics simulations. This cavity emerges as a possible selectivity point of the cruzain inhibitors, once Homo sapiens enzynes does not present the aspartic acid - aspartate pair. In condition of acidic pH, principal component analysis of molecular dynamics simulations showed a gradual reduction of the conformational space covered by the active site of cruzain, cathepsin K and cathepsin L in it free form and complexed with dipeptidyl nitrilelike molecules in it noncovalent e covalent forms. This suggests these systems follows the conformational selection model of protein flexibility. Furthermore, we observed the ligands that inhibits the protein at nmol.L-1 induces the protein flexibility in a similar way, while the µmol.L-1 ones leads to another pattern. That made possible the construction of a decision tree which is able to identify nmol.L-1 from µmol.L-1 complexes.

Membranas e organelas constituem estruturas presentes nas células dos organismos. Estas estruturas representam interfaces entre eletrólitos. Uma tentativa de descrever, interpretar e compreender a distribuição iônica nas vizinhanças destas estruturas é feita neste trabalho com a análise de resultados de experimentos obtidos na investigação de alguns sistemas: 1) Sistemas constituídos por micelas de SDS. Medidas do pH nas vizinhanças de superfícies das micelas por sondas derivadas do ácido salicílico mostra variações do pH em termos da concentração de SDS e da concentração de sal adicionado. O objetivo dos experimentos é inferir o comportamento do pH nas vizinhanças de membranas biológicas que, por dissociação de alguns fosfolipídios, podem apresentar segmentos da membrana com carga na superfície. 2) A natureza \"zwitteriônica\" das membranas biológicas motivou o estudo da \"ligação iônica\" em micelas \"zwitteriônicas\", imersas em soluções com eletrólito, em concentrações variadas de sais de Cl- e Br- com os cátions monovalentes, Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+ e tetrametil amônio (TMA+) e bivalentes Mg2+ e Ca2+. Os experimentos consistiram em determinar a concentração de haletos próximos a micela. A técnica de captura química mostra que há um grau de seletividade que não é determinado apenas pela carga iônica. 3) Resultados preliminares do grau de dissociação no interior de vesiculas de, cloreto de dimetildioctadecil amônio, DODAC, indicam que 8% dos monômeros estão dissociados em vesículas com o diâmetro médio em torno de 150 e 300 nm. As leis fundamentais usadas para compreender os resultados estão aliadas a hipótese de que os sistemas estudados estão em equilibrio termodinâmico, que a interação eletrostática é predominante e ao potencial eletrostático é conferido o papel do potencial da força média que atua nos íons. A simplificação adicional consistindo em admitir que os íons se comportam como cargas puntiformes no que se refere à interação eletrostática conduz o modelo teórico à equação de Poisson-Boltzmann que, linearizada, resulta na equação de Debye-Hückel. Hipóteses adicionais se fazem necessárias para formular o modelo como um problema matemático com condições de contorno. Para cada situação as hipóteses adicionais são discutidas. Sistemas hipotéticos são analizados com o intuito de comparar os resultados provenientes da equação de Poisson-Boltzmann e da equação de Debye-Hückel. A análise teórica dos sistemas conduz a resultados em acordo com os valores medidos. Entre as conclusões obtidas, neste trabalho, são mencionados: 1- As sondas derivadas do ácido salicílico mantêm os grupos dissociáveis próximos a superfície, a distância é da ordem de 0,1 nm, mesmo para sondas que apresentam cadeia longa entre o grupo nitrogênio e o grupo dissociável. 2- A especificidade iônica é bem descrita utilizando, além da carga elétrica, a massa do íon. Os íons na superfície de uma micela zwitteriônica têm liberdade translacional e portanto superfícies zwitteriônicas em solução de eletrólito apresentam condutividade elétrica na superfície. 3- As concentrações iônicas no interior de vesículas são uniformes em praticamente toda a região interna, apresentando variações apenas nas vizinhanças da superfície interna carregada eletricamente. / Membranes and organelles are structures present in biological systems. Such structures are interfaces between electrolytes. Addressing to the description, interpretation and comprehension of the ionic distribution around the structures an attempt is done is this work analyzing experimental results from the investigation of the following systems: 1) SDS micelles. \"pH\" measurements in the micellar surface neighborhood using salicylic acid probes show the pH values dependence with the SDS and added salt concentrations. The experiments aimed to infer the pH behavior in biological membranes where same phospholipids may dissociate and portions of the surface can acquire electrical charges. 2) The zwitterionic nature of biological membranes leads to the investigation of ion binding in zwitterionic micelles in electrolyte solutions with varied concentrations of Cl- or Br<SUP- salts with the cations Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+ e tetramethylammonium (TMA+) and the bivalent cations Mg2+ e Ca2+. Halide concentration in the micellar vicinity was measured. Chemical trapping method shows there is a selectivity degree that does not depend only on the ionic charge. 3) Preliminary results in the determination of the inner dissociation degree of dioctadecyldimethylammonium chloride vesicles, DODAC, show that about 8% of the vesicle constituent monomers are dissociated in vesicles with 150 and 300 nm mean diameter. The theoretical description is based upon the thermodynamics equilibrium hypothesis about the systems and that the electrostatic interaction is the stronger interaction and also it is attributed to the mean electrostatic potential the role of the mean force potential acting on the ionic species. A further simplification in considering the ions as point charges with respect to the electrostatic interactions leads the model to the Poisson-Boltzmann equation and under linearization results in the Debye-Hückel alternative description. Additional hypothesis are necessary in order to have the model as a mathematical problem with boundary conditions and are discussed for each system. Hypothetical systems are analysed aiming the comparison between Poisson-Boltzmann and Debye- Hückel descriptions. Some conclusions derived in the analysis are: 1- The salicylic acid probes have the dissociable groups always near (~0,1nm) the micellar surface, even to the probes that have a long chain between the nitrogen group and the dissociable group. 2- In a zwitterionic micelle the ions on the surface have translational freedom and this is way the zwitterionic membranes in electrolyte solutions are conducting surfaces. 3- The ionic concentrations in the vesicle interior have uniformly value almost everywhere showing variations only in the vicinity of the electrically charged interior surface. The theoretical study of the three systems considered gives results in accord with experimental data.

As cisteíno-proteases da família da papaína desempenham funções essenciais em processos biológicos, entre eles o desenvolvimento e crescimento do organismo, vias de sinalização celular e apoptose, invasão de parasitas em células hospedeiras. Assim, trata-se de uma classe de proteínas de grande interesse para as indústrias farmacêuticas, sendo utilizada como alvo para o tratamento de doenças como o câncer e metástases, osteoporose. Disfunções relacionadas ao sistema imune, doenças parasitárias como malária, leishmaniose, doença do sono e doença de Chagas. Esta última é uma enfermidade considerada negligenciada pelas grandes indústrias farmacêuticas, sem nenhum tratamento eficaz e seguro disponível, que gera um problema econômico de mais de sete bilhões de dólares anuais devido à perda de mão de obra e gastos com tratamento para amenizar os efeitos da doença. A cisteíno protease cruzaína de Trypanosoma cruzi, causador da Doença de Chagas, desponta como um alvo validado na busca de novos fármacos contra essa enfermidade. Essa enzima apresenta um par de aspartatos que interagem entre si, para os quais foi predito um pKa de 7, sendo possível a forma desprotonada desse par em condições biológicas. Neste caso, pode levar à exposição de uma nova cavidade por meio do movimento da alça entre os resíduos 57-62, segundo as simulações de dinâmica molecular desse trabalho, que se trata de uma possível candidata a ponto de seletividade de inibidores de cisteínoproteases de parasitos em relação às suas ortólogas em Homo sapiens que não possuem o par de aspartatos. Em pH ácido, foi mostrado por meio de análise de componentes principais de simulações de dinâmica molecular que as cisteíno protease apresentam uma restrição gradual na amostragem conformacional do sítio ativo quando complexadas com as formas não covalente e covalente de inibidores derivados de dipeptidil nitrilas. Isso sugere que esse sistema segue o modelo de seleção conformacional para flexibilidade de proteína. Notou-se também que o perfil de restrição de ligantes que inibem na faixa de nmol.L-1 difere daqueles a µmol.L-1 , o que possibilitou a construção de uma árvore de decisão para identificar os complexos que apresentam afinidade a nmol.L-1 . / The papain-like cysteine proteases are essentials for biological process, performing important roles on the parasite development, growth and also in the parasite invasion process on the host cell, in cellular signaling pathways and apoptosis, among others. Thus, the pharmaceutical industry widely uses this class of protein as target for the development of new drugs, against cancer and metastasis, osteoporosis and immune system disorders, resulting in many approved drugs. Additionally, these enzymes are validated target against parasitic diseases as leishmaniose, malaria and African and American trypanosomiasis. The last one, also known as Chagas\' disease, is neglected disease for which, further a century form this discovery, there is no effective and safe chemotherapy and is responsible for an economic loss of around seven billion dollars in the world per year due to the health care and lost productivity from infected people. Faced with this situation, the Cruzain, a cysteine protease from the Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas\' disease, is emerging as interesting and validated target to the search for new drugs against this sickness. This enzyme has a pair of interactiong Asp for which was predicted a pKa of 7, by computational methods. By this way, this pair under neutral to alkaline pH adopts the deprotonated form, which exposed a new cavity through a movement of loop of residues 57-62, as we showed here by molecular dynamics simulations. This cavity emerges as a possible selectivity point of the cruzain inhibitors, once Homo sapiens enzynes does not present the aspartic acid - aspartate pair. In condition of acidic pH, principal component analysis of molecular dynamics simulations showed a gradual reduction of the conformational space covered by the active site of cruzain, cathepsin K and cathepsin L in it free form and complexed with dipeptidyl nitrilelike molecules in it noncovalent e covalent forms. This suggests these systems follows the conformational selection model of protein flexibility. Furthermore, we observed the ligands that inhibits the protein at nmol.L-1 induces the protein flexibility in a similar way, while the µmol.L-1 ones leads to another pattern. That made possible the construction of a decision tree which is able to identify nmol.L-1 from µmol.L-1 complexes.

Vários estudos clínicos demonstram que existem fatores adicionais ao efeito reforçador primário das drogas que determinam por que alguns indivíduos permanecem usuários ocasionais, enquanto outros progridem para a farmacodependência. Evidências clínicas apontam o estresse como uma variável importante na iniciação, manutenção e recaída ao uso da cocaína ou morfina. Em roedores, a cocaína induz a sensibilização comportamental que se caracteriza pelo aumento progressivo da atividade motora no decorrer do seu uso prolongado. Esse fenômeno é um dos eventos que emergem no decurso temporal das adaptações que levam à farmacodependência. Recentemente foi sugerido que a sensibilização é a gênese do uso compulsivo de drogas. Muitos estudos revelam que o estresse induz a sensibilização comportamental cruzada com os psicostimulantes. O objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilização cruzada entre o estresse e a cocaína, bem como os mecanismos neurais subjacentes. Para tanto foram avaliados as concentrações plasmáticas da corticosterona, a atividade locomotora basal e a induzida por cocaína, e a atividade da PKA nos animais expostos aos estresses agudo ou crônico, previsível ou imprevisível. A exposição ao estresse crônico previsível (EP) aumentou a atividade locomotora basal e a induzida por cocaína. A exposição ao EP aumentou as concentrações basais da corticosterona mas não alterou a atividade da PKA no núcleo acumbens e no corpo estriado. Assim, podemos concluir que a exposição a EP induziu sensibilização comportamental cruzada à cocaína, sendo que esse efeito não se correlacionou com as alterações na atividade da PKA. / A potential etiologic factor in substance abuse is stress, and it is possible that chronic exposure to stressful life’s events is related to the development of drug dependence and relapse. Behavioral sensitization is defined as an augmentation of a response to a drug during repeated drug exposure. Behavioral sensitization has been shown to occur to the locomotor and reinforcing effects of cocaine, amphetamine and other drugs of abuse. It has been suggested that sensitization is the genesis of compulsive drug use. Converging evidence suggests that exposure to stress induces behavioral sensitization to psychostimulant drugs. The present study investigates behavioral and molecular aspects of the cross-sensitization between stress and cocaine. We evaluated the basal and cocaine-induced locomotor activity, corticosterone plasma levels and protein kinase cAMP-dependent (PKA) activity in animals exposed to acute or chronic predictable and unpredictable stress. Increased basal and cocaine-induced locomotor activity was observed in animals exposed to chronic predictable stress. Chronic predictable stress increased basal corticosterone levels but did not change protein kinase A activity in both accumbens and striatum. In conclusion, predictable stress produced sensitization to locomotor effects of cocaine but this effect did not correlate with changes in PKA activity.