Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.

No description available.

L’adhérence, l’activation et l’agrégation des plaquettes sanguines sont essentielles à l’hémostase mais peuvent également conduire à la thrombose artérielle sur plaque d’athérosclérose, aujourd’hui première cause de mortalité dans le monde. Les anti-thrombotiques actuels, dirigés contre l’activation et l’agrégation plaquettaires, ont une efficacité reconnue mais ont pour inconvénient d’augmenter le risque de saignement. L’objectif de cette thèse a été d’explorer de nouvelles stratégies réduisant la thrombose tout en préservant l’hémostase. L’utilisation de souris modifiées génétiquement a mis en évidence que l’intégrine alpha6 beta1, impliquée dans l’adhérence des plaquettes aux laminines, joue un rôle critique en thrombose expérimentale mais pas en hémostase. De plus, nous avons montré dans un système de perfusion de sang qu’une protéine préférentiellement exprimée dans les plaques d’athérosclérose, la ténascine-C, permet l’adhérence et l’activation des plaquettes. En revanche, la beta-arrestine-1, une protéine de signalisation, ne contribue que modestement aux fonctions plaquettaires et à la thrombose. En conclusion, ce travail a permis de dégager deux nouvelles pistes anti-thrombotiques potentiellement capables de préserver l’hémostase, basées sur le ciblage de l’intégrine alpha6 beta1 ou de l’interaction plaquette/ténascine-C. / Following vascular injury, blood platelet adhesion, activation and aggregation are essential for hemostasis but can also lead to arterial thrombosis, which is a leading cause of death worldwide. Current antithrombotic drugs impede platelet activation and aggregation, thereby considerably reducing cardiovascular mortality, but their use is linked to an increased bleeding risk. This thesis aimed to explore more selective strategies causing minimal perturbation of hemostasis. The use of genetically-modified mice has revealed an unsuspected important contribution of integrin alpha6 beta1, which mediates platelet adhesion to laminins, to experimental arterial thrombosis but not hemostasis. In addition, we showed that tenascin-C, an extracellular matrix protein overexpressed in atherosclerotic plaques, can support platelet adhesion and activation under flow. In contrast, the signaling protein beta-arrestin-1 does not play a major role in platelet function, hemostasis and thrombosis. In conclusion, this work provides two interesting candidates, namely integrin alpha6 beta1 and tenascin-C, to put into practice the concept of targeting thrombosis while minimally impairing hemostasis.

La mégacaryopoïèse représente le processus de différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en mégacaryocytes (MK). Ce processus précède la thrombopoïèse qui aboutira à la formation des plaquettes sanguines. Ces processus complexes ont lieu 1) au sein de la structure tridimensionnelle (3D) de la moelle osseuse, 2) dans les vaisseaux sinusoïdes de la moelle et 3) dans la circulation sanguine. Le but général de ce travail a été de comprendre le mécanisme de chaque étape. Le premier objectif a été d’étudier les effets d’une structure poreuse 3D mimant celle de la moelle osseuse, sur la différenciation mégacaryocytaire et la production plaquettaire in vitro. Cette étude a permis de démontrer que la synergie entre l’organisation spatiale et les signaux du microenvironnement améliore la production en MK et en plaquettes. Par la suite, nous avons souhaité caractériser in vitro et in vivo les plaquettes produites en conditions de flux. Nous avons notamment mis en évidence la capacité des plaquettes produites in vitro dans un système de microfluidique, à s’incorporer et à participer à la formation d’un thrombus in vitro et in vivo contrairement aux plaquettes obtenues en statique. Ces travaux prouvent donc l’intérêt d’une part, de mimer le microenvironnement de la moelle osseuse et d’autre part, de reproduire les forces de cisaillement du sang afin d’améliorer et d’augmenter la production de plaquettes in vitro pour de futures applications en thérapeutique. / Megakaryopoiesis is a process allowing hematopoietic stem cell (HSC) to proliferate and differentiate into megakaryocytes (MK). It is followed by thrombopoiesis allowing blood platelet production. These processes occur 1) in the bone marrow three-dimensional (3D) structure, 2) in the bone marrow sinusoid vessels and 3) in the blood flow. Our general aim was to decipher the mechanism associated to each process. The first objective was to study the effects of porous 3D structure on MK differentiation and platelet production. This study demonstrated that the synergy between spatial organization and biological cues improved MK and platelet production. We also characterized platelets produced from mature MK in flow conditions, with respect to their in vitro and in vivo properties. We highlighted the capacity of flow-derived platelets to incorporate in a thrombus in vitro and in vivo, compared to static-derived platelets. These works represent some new developments for mimicking the bone marrow structure and to reproduce blood shear forces in order to improve and increase in vitro platelet production for therapeutic use.

La numération plaquettaire est une analyse délicate et le résultat est souvent erroné notamment du fait d’une tendance à l’agrégation in vitro dans certaines espèces animales. Il a ainsi pu être démontré chez le Chat que ce phénomène peut être inhibé par l’association d’un anticoagulant avec des inhibiteurs plaquettaires : le CTAD (Citrate, Théophylline, Adénosine et Dipyridamole). Cette association permet ainsi l’obtention de numérations plaquettaires fiables sans affecter les autres populations sanguines, mais également d’effectuer des analyses d’hémostase et de biochimie. De nouveaux intervalles de référence ont dû être établis pour certaines variables hématologiques avec les analyseurs utilisés en laboratoire et dans les cliniques vétérinaires. Par ailleurs, si les effets antiagrégants du CTAD sont moins nets chez le Chien, il peut également servir d’anticoagulant « universel », permettant de réduire le nombre de prélèvements et d’améliorer ainsi le bien-être des animaux. / The platelet count is a delicate measurement, which may often be erroneous because of the tendency of platelets from some animal species to aggregate in vitro. This study demonstrated that this effect can be inhibited in cats using CTAD (Citrate, Theophylline, Adenosine and Dipyridamole) composed of an anticoagulant and platelet inhibitors. This association provides reliable platelet counts without affecting other blood populations and also allows hemostasis and biochemical analyses. New hematological reference intervals have been established for some variables with analyzers used in clinical pathology laboratories and veterinary clinics. Furthermore, if the antiplatelet clumping effects of CTAD are less marked in canine species, the CTAD can also serve as "universal" anticoagulant, reducing the number of blood samples and thus improving animal welfare.

Le traitement des patients avec une coronarographie après un SCA est l'aspirine et les thiénopyridines. La réponse aux thiénopyridines est variable, cette variabilité, multifactorielle, a des répercutions cliniques. Leur efficacité a été évaluée sur la réduction de la survenue d'évènements cliniques et peu sur le risque d'hémorragie qui est un effet indésirable majeur. Les plaquettes, jouent un rôle dans l'athérosclérose et les SCA notamment par le CD40L.J'ai étudié les facteurs plaquettaires conditionnant le risque hémorragique chez ces patients et apporté un éclairage sur des fonctions plaquettaires peu connues comme l'inflammation. Les génotypes du cytochrome P450 CYP2C19*2 et *17 ont une influence sur la réponse plaquettaire aux thiénopyridines et il existe une relation entre les complications hémorragiques et la réactivité plaquettaire.Une très faible réactivité plaquettaire (VASP<10%) est un facteur prédictif du risque hémorragique et les valeurs de VASP < 10 % sont plus fréquentes chez les patients traités par prasugrel. Nous avons ensuite ciblé un marqueur de l'état inflammatoire plaquettaire, le CD40L. Sa libération plaquettaire dépend de la voie du P2Y12, son expression, elle, dépend moins de cette voie. Une faible expression du CD40L est associée à des évènements hémorragiques chez les patients traités par thiénopyridines.Ainsi le déterminisme génétique de l'efficacité du traitement par thiénopyridines a un impact sur le risque hémorragique et d'autres paramètres plaquettaires influencent ce risque indépendamment de l'inhibition de l'agrégation plaquettaire. Le CD40L, serait un lien entre l'inflammation et l'équilibre saignement/thrombose. / Aspirin and thienopyridine are the therapy for patients with percutaneous coronary intervention after ACS. The level of platelet inhibition by thienopyridine varies between patients, this variability, multifactorial, is associated with adverse clinical outcomes. Treatment efficacy was evaluated mainly on the association between poor thienopyridine response and thrombotic events but less on the principal side effect: bleeding complications. Platelet play a key role in atherosclerosis and thrombosis, notably via CD40L.I studied platelet factors that influence the bleeding risk in these patients and brought a new highlight on platelet function less known such as inflammation.P450 cytochrome genetic variants (2C19*2 and 2C19*17) influence platelet response to thienopyridines. There is a relation between platelet reactivity and bleeding events. A very low on-treatment platelet reactivity (VASP<10 %) is a predictor of bleeding and is mainly observed with prasugrel treatment. We then focussed on a marker of platelet inflammatory status, CD40L. Its release by platelets depends on P2Y12 signalling, whereas its surface expression is less dependent on this signalling pathway. A low platelet-CD40L surface expression is associated with bleeding events in these patients We show that genetic background on thienopyridine treatment efficacy is related to bleeding risk and that other platelet parameters influence the bleeding risk independently of platelet aggregation inhibition. Thus, a molecule of inflammation, CD40L, would be a link between inflammation and bleeding/thrombosis equilibrium.

Le système de fabrication des plaquettes de silicium (wafer) est la partie la plus complexe et la plus coûteuse du processus de fabrication des semi-conducteurs et son ordonnancement pour la production a un impact significatif sur la rentabilité économique. Le système d’outils Multi-cluster pour la fabrication de plaquettes est un système de type multi-boucles, largement utilisé dans la fabrication de plaquettes de 300 mm et 450 mm. Le problème d’ordonnancement dans ce système de production présente des caractéristiques pour les modèles de flux de plaquettes compliqué, des contraintes résidentielles strictes et des conflits de ressources à gérer, ce qui rend le problème très complexe. Dans cette thèse, l'outil multi-cluster est étudié et les recherches se concentrent principalement sur les caractéristiques des contraintes sur le temps de séjour, les contraintes sur les ressources utilisés et les flux plaquettes de silicium. Plus particulièrement, cette thèse traite trois problèmes d'ordonnancement: le problème d'ordonnancement cyclique unitaire pour un flux unique de plaquettes, le problème d'ordonnancement cyclique multi-unitaires dans un modèle de flux unique de plaquettes et le problème d'ordonnancement non-cyclique. Pour résoudre ces problèmes, des modèles robustes sont développés ainsi que certains algorithmes heuristiques efficaces sont construits pour atteindre les objectifs. L'objectif principal étant d'améliorer la performance des outils multi-cluster et d'augmenter le rendement des flux des plaquettes de silicium. Des tests de simulation et des analyses sont effectuées afin d’évaluer la performance des algorithmes proposés. Les résultats montrent la stabilité et l'efficacité de ces algorithmes. / Multi-cluster tool is a highly automated and costly wafer fabrication system with multi-loop coupling structure, and scheduling of such equipment directly affects the overall efficiency of semiconductor manufacturing enterprises. Multi-cluster tools scheduling problem has the features of large scale, complex wafer flow patterns, strict residency time constraints and intense resource conflict, which are significantly different from any other manufacturing system. Since the existing literatures have proved that most of the wafer fabrication systems scheduling problems are NP-hard, it’s difficult to obtain the optimal solution by using exact algorithms. Thus, how to develop an efficient heuristic algorithm to solve the multi-cluster tools scheduling problem attracts considerable attention both in academia and in industry. After reviewing the literatures, it is found that the research on the cyclic scheduling problem of multi-cluster tools rarely takes into account the characteristics of residency constraints. The scale of the object is limited to three single cluster tools, and the proposed scheduling methods are mostly mathematical programming and simple scheduling rules. Therefore, in this thesis, the multi-cluster tool is studied and our research mainly focuses on the characteristics of residency constraints, resource constraints and wafer flow patterns. Based on the descriptions of research domains, some solid models are developed for different scheduling problems and some efficient heuristic algorithms are constructed to realize the objectives. To deal with the problem, different approaches are proposed: A non-linear mixed-integer programming model, a two-stage = approximate-optimal scheduling algorithm, and a chaos-based particle swarm optimization-tabu search hybrid heuristic algorithm. Simulation experiments and analysis demonstrate the effectiveness of these algorithms. Results show the stability and efficiency of proposed algorithms.

Les plaquettes sont la principale source de CD40L soluble (sCD40L), une molécule thrombo-inflammatoire dont les taux élevés chez les patients atteints des maladies coronariennes (CAD) prédisent des événements athérothrombotiques. Nous avons déjà démontré que le sCD40L active deux voies de signalisation dans les plaquettes, la p38 MAPK et le facteur nucléaire-κB (NF-κB), non affectées par l’activité antiplaquettaire de l'aspirine (ASA). Nous avons montré aussi que le sCD40L, en réponse à des doses sous-optimales d'agonistes plaquettaires comme la thrombine et le collagène, potentialise l'agrégation des plaquettes via le récepteur CD40 et son effecteur cible présent en aval le NF-κB. En effet, le NF-κB appartient à une famille de dimères cytoplasmiques inactivés par l'inhibiteur IκB et régulés par l’IκB kinase (IKK). Suite à des signaux immunologiques, l’IKK phosphoryle l’IκB, ce qui entraîne sa dégradation par le protéasome. Par conséquent, le NF-κB, une fois libre, se déplace vers les noyaux des cellules immunitaires où il agit sur le génome pour maintenir la survie et la prolifération cellulaires. Contrairement aux cellules immunitaires, la régulation et les fonctions de NF-κB dans les plaquettes, fragments cellulaires dépourvus de génome, sont moins bien comprises. Dans ce projet, nous proposons l'hypothèse que l’axe sCD40L/NF-κB/protéasome amorce les plaquettes en les prédisposant à une activation et une agrégation prononcées. Nos objectifs seront donc (i) d'étudier l'interaction entre le NF-κB et le protéasome en réponse au sCD40L et (ii) d'examiner les rôles de cet axe sur les fonctions plaquettaires. Pour cela, des plaquettes ont été fraîchement isolées à partir du sang des donneurs humains sains qui ne prennent pas des médicaments antiplaquettaires ou anti-inflammatoires. Ces plaquettes ont été par la suite stimulées par le sCD40L. En étudiant l'activation de NF-κB, l'analyse par Western blot a montré que le sCD40L induit la phosphorylation d’IκB et la dégradation de sa forme phosphorylée (p-IκB) dans un délai de 30 minutes, d'une manière similaire à l’action de la thrombine, l’agoniste plaquettaire le plus puissant. Le prétraitement des plaquettes avec deux classes d'inhibiteurs de NF-κB, le répresseur d’IKK (BAY 11-7082) et l’antagoniste du protéasome (MG132), a montré que l'activation du NF-κB dans les plaquettes est régulée par l’IKK et le protéasome, identiquement aux cellules nucléées. L'examen des événements de signalisation induits par le sCD40L a montré que l'inhibition du NF-κB plaquettaire n'affecte pas la phosphorylation de p38 MAPK ou le clivage protéasomique de la Taline-1 qui est impliquée dans le changement de la forme des plaquettes. Concernant les effets sur les fonctions plaquettaires, l'inhibition de NF-κB ou du protéasome n'a pas influencé l'agrégation des plaquettes induite par des doses élevées de collagène ou de thrombine. Cependant, elle a considérablement réduit l'agrégation plaquettaire suite à un amorçage avec le sCD40L, suivie d'une stimulation avec des doses sous-optimales de collagène ou de thrombine. Nous avons également constaté que le sCD40L exacerbe la rétraction des caillots fibrino-plaquettaire formés par de faibles doses de thrombine. Cet effet d'amorçage est régulé par l’axe NF-κB/protéasome. En bref, l’axe sCD40L/NF-κB/protéasome fonctionne de manière non génomique, en amorçant les plaquettes, induisant ainsi la potentialisation de l'agrégation plaquettaire et l'augmentation de la rétraction des caillots fibrino-plaquettaire. Par conséquent, le ciblage de cet axe dans les plaquettes pourrait avoir un rôle thérapeutique chez les patients atteints de CAD et dont les plaquettes ne répondent pas ou sont moins sensibles aux traitements antiplaquettaires conventionnels. / Platelets are the principal source of soluble CD40L (sCD40L), a thrombo-inflammatory molecule whose high levels in coronary artery disease (CAD) patients predict atherothrombotic events. We have previously demonstrated that sCD40L activates two signaling pathways in platelets, p38 MAPK and the nuclear factor-κB (NF-κB), both of which were unaffected by the anti-platelet activity of aspirin (ASA). We have also shown that sCD40L, in response to suboptimal doses of platelet agonists like thrombin and collagen, potentiates platelet aggregation through CD40 receptor and its downstream effector target NF-κB. Indeed, NF-κB belongs to a family of cytoplasmic dimers that are inactivated by the inhibitor IκB and regulated by IκB kinase (IKK). Following immunological signals, IKK phosphorylates IκB, driving the degradation of its phosphorylated form (p-IκB) by the proteasome. Consequently, NF-κB becomes free to translocate to the nuclei of immune cells where it acts genomically to maintain survival and proliferation. That is the case in immune cells, but in platelets which are devoid of genome, the regulation and functions of NF-κB are less understood. Herein, we hypothesized that sCD40L/NF-κB/proteasome axis primes platelets, predisposing them to pronounced activation and aggregation. We thus aimed to (i) assess the interplay between NF-κB and proteasome in response to sCD40L and (ii) investigate the roles of this axis at the level of platelet functions. For this purpose, platelets were freshly isolated from the blood of healthy human donors who are not on anti-platelet or anti-inflammatory medication and then stimulated with sCD40L. In monitoring the activation of NF-κB, western blot analysis showed that sCD40L induces the phosphorylation of IκB and the degradation of p-IκB during a 30-mins time window, in a similar fashion to the most potent platelet agonist thrombin. The pre-treatment of platelets with two classes of NF-κB inhibitors, an IKK repressor (BAY 11-7082) and a proteasome antagonist (MG132), showed that the activation of platelet NF-κB is regulated by IKK and the proteasome as in nucleated cells. The examination of the functional signaling events induced by sCD40L showed that NF-κB inhibition does not affect the phosphorylation of p38 MAPK or the proteasomal cleavage of shape change-involved Talin-1. In functional studies, NF-κB or proteasomal inhibition did not influence the aggregation of platelets induced by high doses of collagen or thrombin; however, it markedly reduced platelet aggregation primed with sCD40L followed by stimulation with sub-optimal doses of collagen or thrombin. We also found that sCD40L exacerbates the retraction of fibrin-platelet clots formed by low doses of thrombin. This priming effect was regulated by NF-κB/proteasome dyad. In brief, sCD40L/NF-κB/proteasome axis primes platelets and functions non-genomically, inducing the potentiation of platelet aggregation and augmenting the retraction of fibrin-platelet clots. Hence, targeting this axis in platelets might have a therapeutic potential in CAD patients whose platelets are not or less responsive to conventional antiplatelet therapies.

La greffe de cellules souches hématopoïétiques est parfois le seul traitement efficace contre les cancers hématologiques ainsi que plusieurs autres désordres reliés au système hématopoïétique. La greffe autologue est souvent le traitement de choix pour les patients atteints de lymphome ou de myélome. Dans ce cas, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) du patient sont récoltées et congelées. Le patient subit ensuite des traitements de chimiothérapie et/ou radiothérapie qui éliminent les cellules malignes, mais détruisent aussi son système hématopoïétique. Ce dernier sera ensuite reconstitué par la greffe de CSH. Ces traitements ont pour conséquence de plonger le patient en état d’aplasie pour une période variant de 2 à 4 semaines. La thrombocytopénie (faible taux de plaquettes) est une complication majeure nécessitant des transfusions plaquettaires répétées et associée à une augmentation de la mortalité hémorragique post-transplantation. Il serait particulièrement intéressant de développer une thérapie accélérant la reconstitution des mégacaryocytes (MK), ce qui aurait pour effet de raccourcir la période de thrombopénie et donc de diminuer les besoins transfusionnels en plaquettes et potentiellement augmenter la survie. HOXB4 est un facteur de transcription qui a déjà démontré sa capacité à expandre les CSH et les progéniteurs multipotents (CFU-GEMM) donnant naissance aux MK. Il est donc un bon candidat pour l’expansion des progéniteurs MK. Comme la protéine HoxB4 a par contre une courte demi-vie (~1.1h), des protéines HoxB4 de deuxième génération avec une plus grande stabilité intracellulaire ont été créées (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) et 1427 (HoxB4Y28A)). Nous avons donc étudié la capacité d’HoxB4 sauvage et de deuxième génération à expandre les CSH, ainsi que les MK donnant naissance aux plaquettes. La surexpression rétrovirale de ces protéines HoxB4Y23A et HoxB4Y28A conduit à une expansion des progéniteurs MK murins in vitro supérieure à HoxB4-wt, 1423 et au contrôle GFP. La reconstitution plaquettaire in vivo dans un modèle murin a ensuite été évaluée par des transplantations primaires et secondaires. Les résultats révèlent que la surexpression rétrovirale des différents HoxB4 n’apporte pas de bénéfice significatif à la reconstitution plaquettaire des souris. Lorsque cultivées dans un milieu favorisant la différenciation mégacaryocytaire, le traitement de cellules CD34+ dérivées du sang de cordon ombilical avec les protéines recombinantes TATHoxB4WT ou de seconde génération n’a pas augmenté la production plaquettaire. Par contre, de manière intéressante, les cellules CD34+ provenant de sang mobilisé de patients atteints de myélome et mises en culture dans un milieu favorisant l’expansion des CSH ont montré des différences significatives dans la différenciation des progéniteurs MK en présence de la protéine recombinante TATHoxB4. La protéine HOXB4 possède donc un avenir prometteur quant à une amélioration de l’état thrombocytopénique chez les patients. / Haematopoietic stem cell (HSC) transplantation is the most efficient treatment against a number of cancers or other disorders of the hematologic system. Prior to HSC transplantation, patients are exposed to high doses of radiotherapy and/or chemotherapy to eliminate malignant cells. However, these treatments result in a state of aplasia, particularly in thrombocytopenia, which is characterised by very low blood platelet counts. Platelets produced by megakaryocytes (MK) are essential components of the blood system and play a critical role in the prevention of bleeding. Thus a low platelet blood level is a major complication and contributes significantly to transplant related mortality. At present, regular infusion of platelets isolated from healthy donors is the treatment of choice for thrombocytopenia. However, this is cumbersome for patients as well as donors and, in many instances results in platelet refractoriness due to the generation of auto-antibodies against disparate HLA molecules expressed on donor platelets. Therefore, the development of strategies to accelerate MK production and thus platelet reconstitution post HSC transplant would represent a major advance. It has already been shown that HoxB4 expands HSC and multipotent progenitors (CFU-GEMM) that give rise to megakaryocytes (MK). Thus HoxB4 is a great candidate for in vitro MK progenitor expansion. However, the short half-life of HoxB4 protein prompted us to generate a second generation of HoxB4 proteins with greater intracellular stability. We therefore studied the capacity of wild type (WT) and HoxB4 with 3 substitutions (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) and 1427 (HoxB4Y28A) resulting in a longer protein half-life to expand HSC as well as MK progenitors. Retroviral-mediated expression of HoxB4Y23A and HoxB4Y28A proteins showed a greater expansion of murine MK progenitors, in comparison with HoxB4WT or HoxB4L7A proteins or GFP control. We also evaluated the ability of HSC expressing second generation HoxB4 to generate platelets in a murine model. Our results show that retroviral-mediated transduction of second generation HoxB4 in murine HSC does not provide a significant advantage over HoxB4WT in platelet reconstitution in mice. Interestingly, treatment of CD34+ cells derived from cord blood showed only marginal effect of HoxB4WT or second generation HoxB4 soluble recombinant proteins when cultured under conditions optimized for megakaryocyte differentiation. Unexpectedly, CD34+ cells derived from mobilized peripheral blood of myeloma patients showed a significant increase in MK progenitor differentiation in the presence of TAT-HoxB4WT when cultured in expansion medium for HSC. Thus, HoxB4 holds promise in autologous HSC transplantation for the treatment of thrombocytopenic patients.

Les plaquettes sanguines sont les principaux acteurs de l’hémostase primaire et de la thrombose, deux éléments majeurs de la physiopathologie vasculaire. Plusieurs médicaments régulent les fonctions plaquettaires mais peu de tests sont validés pour suivre leur efficacité en fonction de l’évolution clinique des patients. Mon doctorat a eu pour but de développer de nouvelles approches d’évaluation de la fonction plaquettaire. Deux essais cliniques réalisés sur des patients atteints de syndrome coronarien stable ont constitué la première partie de mon doctorat. La première étude met en évidence la nécessité d'une standardisation des tests biologiques pour la détection de patients répondant moins au clopidogrel, un inhibiteur du récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y12. L’étude suivante montre le potentiel thérapeutique, chez ces patients, de l’inhibition conjointe de P2Y12 et du second récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y1, sur la fonction plaquettaire. De plus, le suivi en temps réel par vidéomiscroscopie a permis de distinguer des effets précoces et tardifs des antiplaquettaires sur la formation du thrombus en chambre de perfusion. La seconde partie de mon doctorat concerne les microdomaines membranaires de type « lipid rafts » qui tiennent une place fondamentale dans les fonctions cellulaires et plaquettaires. Ainsi plusieurs récepteurs dépendent de ces microdomaines, régulant la fonction plaquettaire et les effets des médicaments antiplaquettaires. Cependant, les techniques d’étude de ces microdomaines sont complexes et peu adaptées aux études cliniques. Profitant de nouvelles sondes fluorescentes sensibles au niveau d’ordre liquide membranaire (OLM), nous avons développé une méthode de mesure de l’OLM par cytométrie de flux spectrale. Grâce à cette approche, nous avons montré que l’activation plaquettaire diminue l’OLM alors qu’il est augmenté chez des patients traités par un inhibiteur de la synthèse du cholestérol ou par le clopidogrel. Nous avons également mis en évidence, en condition de forces de cisaillement élevées correspondant à celles retrouvées au niveau de sténoses artérielles, une sous-population plaquettaire présentant un OLM plus bas. Le passage dans le domaine clinique de ces approches fondamentales qui privilégient l’étude dynamique des plaquettes pourrait permettre d’améliorer le diagnostique et le suivi de traitement de pathologies cardiovasculaires. / Blood platelets play a central role in primary hemostasis and thrombosis, two major elements of vascular physiopathology. Although a number of drugs regulate platelet functions, there are no validated tests that monitor their efficacy on the basis of the patients' clinical course. This doctorate, therefore, aims to develop novel approaches to evaluate platelet function. The first part of my work consisted of two clinical trials involving patients with stable coronary syndrome. The first study demonstrated the need for standardized biological tests to screen for patients who respond less well to clopidogrel, an ADP P2Y12 receptor antagonist. The second study showed the therapeutic potential of the joint inhibition of P2Y12 and P2Y1 receptors on platelet adhesion, activation, and aggregation for these patients. Furthermore, a video microscopy model using perfusion chambers made it possible to monitor the course of thrombosis in real time, and enabled us to dissociate the early and late effects of the antiplatelet drugs. Lipid raft membrane microdomains play a pivotal role in many cell functions. At the platelet level, many receptors depend on these microdomains and thus modulate the function as well as the drug sensitivity of platelets. However, current techniques for the study of these microdomains are complex and limit their clinical applications. By taking advantage of new fluorescent probes that are sensitive to the level of the membrane order, we developed a method of measuring the membrane order using spectral flow cytometry. Through this approach we showed that platelet activation reduced the lipid order of the membranes, whereas it was increased in patients treated with a cholesterol synthesis inhibitor or clopidogrel. It was also possible for us to demonstrate the appearance, under shear stress similar to that of stenotic arteries, of a platelet sub-population with a very low membrane order. These approaches which privilege the dynamic study of thrombi and platelets could be applied to the clinical practice and thus widen the fields of clinical studies.