Neben chemotherapeutischen und chirurgischen Maßnahmen ist die Bestrahlung integraler Bestandteil multimodaler Therapiekonzepte bei malignen Tumorerkrankungen. In diesem Zusammenhang spielt der Einblick in physiologische und pathophysiologische Abläufe in menschlichen Zellen und auf molekularer Ebene  eine zunehmende Rolle. Auf diese Weise werden komplexe Stoffwechselwege mit ihren unterschiedlichen Funktionen und ihren aus einzelnen Proteinen bestehenden Komponenten immer besser verstanden. Allerdings entstehen durch die Kenntnis dieser Stoffwechselwege neue Fragen, die Gegenstand medizinischer Forschung sind.  Der TGFβ-Signalweg ist ein wesentlicher intrazellulärer Signalweg, der neben zahlreichen anderen Funktionen einen Einfluss auf die Entstehung bestimmter Tumorerkrankungen hat. Eine Vielzahl an Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNP) ist bekannt sowie die Erkenntnis darüber, dass die Anwesenheit von verschiedenen Varianten eines SNP einen Einfluss auf die Zellvitalität hat je nach Behandlungsbedingung. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss von Keimbahn-Polymorphismen in Genen des TGFβ-Signalwegs und der DNA-Reparatur auf die Strahlenempfindlichkeit lymphoblastoider Zellen zu untersuchen. Hierzu wurden 54 käuflich erworbene lymphoblastoide Zellen angezüchtet. Jede dieser Zelllinien wurde sechs parallelen Behandlungsbedingungen unterworfen. Neben der unbehandelten Kontrolle und einer mit anti-TGFβ behandelten Kontrolle wurden Zellen einer alleinigen Bestrahlung mit 3 Gy ausgesetzt. Darüber hinaus wurden Zellen 16 Stunden vor der Bestrahlung mit TGFβ1 oder anti-TGFβ vorinkubiert oder unmittelbar nach der Bestrahlung mit TGFβ1 behandelt.  Nach Ablauf einer 24-stündigen Inkubationszeit erfolgte die Zellvitalitätsmessung mittels FACS (fluorescence activated cell sorting)–Analyse. Die Ergebnisse wurden mit Daten von insgesamt 1656 polymorphen Positionen (aus HapMap Datenbank) aus 21 Kandidatengenen korreliert. Auf diese Weise sollte der Einfluss dieser Polymorphismen auf die Zellvitalität ermittelt werden. Sowohl bei SMAD3 als auch bei SMAD7 fanden sich jeweils 2 SNP, die ein perfektes bzw hohes Kopplungsungleichgewicht (linkage disequilibrium) aufwiesen. Insgesamt waren zwölf Polymorphismen aus acht Genen (TGFBR1, SMAD2, SMAD3, SMAD7, BRCA2, MSH2, MSH6 und XRCC1) mit signifikanten Veränderungen der Zellvitalität assoziiert. Das Variantenallel scheint bis auf wenige Ausnahmen einen zytoprotektiven Effekt zu haben. Ausnahmen sind 3 SNP der Gene BRCA2, SMAD3 und SMAD 7, bei denen der Wildtyp mit höherer Zellvitalität einhergeht. Bei alleiniger Bestrahlung wirkten sich SNP aus SMAD3, SMAD7, MSH2 und MSH6 modulierend auf die Zytotoxizität aus, wenn auch statistisch nicht signifikant. Interessanterweise zeigten sich bei Betrachtung der Auswirkung einer Stimulation mit TGFβ1 vor und nach Bestrahlung mit 3 Gy dieselben SNP als statistisch signifikante Modellprädiktoren wie auch bei alleiniger Bestrahlung mit Ausnahme eines SNP aus SMAD3.  Bei Vorinkubation mit TGFβ1 wirkte sich die MSH2-Variante stärker aus. Hier entstand beim Wildtyp ein zusätzlich zytotoxischer Einfluss im Vergleich zur Stimulation nach Bestrahlung. Bei Inhibition durch anti-TGFβ vor der Bestrahlung zeigte noch ein SNP aus MSH6 und ein SNP aus SMAD7 einen zytoprotektiven Effekt.  Einige Ergebnisse dieser Arbeit könnten, sofern sie im Verlauf durch nachfolgende Studien bestätigt bzw. erweitert werden helfen Therapiekonzepte maligner Tumoren zu optimieren und eine individuelle Radiotherapie zu ermöglichen.

Background: A large number of human inherited and acquired diseases and phenotypes are caused by mutations in G protein-coupled receptors (GPCR). Genome-wide association studies (GWAS) have shown that variations in the ADGRD1 (GPR133) locus are linked with differences in metabolism, human height and heart frequency. ADGRD1 is a Gs protein-coupled receptor belonging to the class of adhesion GPCRs. Results: Analysis of more than 1000 sequenced human genomes revealed approximately 9000 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the human ADGRD1 as listed in public data bases. Approximately 2.4 % of these SNPs are located in exons resulting in 129 non-synonymous SNPs (nsSNPs) at 119 positions of ADGRD1. However, the functional relevance of those variants is unknown. In-depth characterization of these amino acid changes revealed several nsSNPs (A448D, Q600stop, C632fs [frame shift], A761E, N795K) causing full or partial loss of receptor function, while one nsSNP (F383S) significantly increased basal activity of ADGRD1. Conclusion: Our results show that a broad spectrum of functionally relevant ADGRD1 variants is present in the human population which may cause clinically relevant phenotypes, while being compatible with life when heterozygous.

Gegenstand der Untersuchung: Vorliegende Arbeit stellt eine molekularbiologische Studie dar, die der Frage nachging, ob der Genotyp für die NAT2 eine Rolle bei der Pathogenese des Mammakarzinoms spielt. Das Mammakarzinom hat eine erbliche Komponente. Neben hoch-penetranten genetischen Mutationen des BRCA1- und BRCA2-Gens stehen polymorphe Enzyme des Fremdstoffwechsels im Verdacht, Präkanzerogene zu aktivieren und somit das Karzinomrisiko zu erhöhen. Die NAT2 detoxifiziert aromatische Amine, wie sie z. B. im Zigarettenrauch enthalten sind und weist eine ausgesprochene bimodale Aktivitätsverteilung auf. Nach systematischer Aufklärung des genetischen Polymorphismus der NAT2 ist eine Vorhersage des Phänotyps mit hoher Sicherheit möglich. Design: Es wurde eine prospektive Fall-Kontroll-Studie an 248 Patientinnen mit Mammakarzinom und 248 Kontrollen (Patientinnen mit anderen, nicht malignen Erkrankungen und Gesunde) durchgeführt. Zusätzlich wurde eine Blutprobe entnommen, aus der DNA isoliert wurde. Damit wurden folgende Mutationen des NAT2-Gens bestimmt: G191A, C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A. Anhand dieser Mutationen erfolgte die Zuordnung zu Haplotypen. Da bekannt ist, welche mittlere Aktivität der NAT2 bei den einzelnen Genotypen zu erwarten ist, konnte mit dieser Information eine Vorhersage der Aktivität als "schnelle" und "langsame" Acetylierer vorgenommen werden. Methode: Die Genotypisierung erfolgte durch Amplifikation des NAT2 -Gens mit verschiedenen Primern in der PCR, anschließendem Verdau mit Restriktionsenzymen und Charakterisierung der Fragmente mittels Gelelektrophorese. Statistik: Mit der Berechnung von "Odds ratios" und multivariaten logistischen Regressionsanalysen zur Berücksichtigung möglicher Einflussfaktoren wurde der Zusammenhang zwischen NAT2-Genotyp bzw. daraus vorhergesagtem Phänotyp und Mammakarzinom überprüft. Ergebnisse: Es wurden acht verschiedene NAT2-Haplotypen nachgewiesen. 2 Haplotypen (*4 und *12A) kodieren für einen schnellen Acetylierer-Typ, 6 Haplotypen (5A, 5B, 5C, 6A, 7B und 14*B) für den langsamen Acetylierer-Typ. 55,6% der MC-Patientinnen und 58% der Kontrollpersonen Genotypen wiesen den langsamen Acetyliererstatus auf. Dies entspricht in etwa der von anderen Untersuchern beschriebenen Häufigkeit bei Kaukasiern. Es fand sich keine Überrepräsentierung bestimmter Genotypen oder Haplotypen in der Gesamtgruppe der Patientinnen mit Mammakarzinom im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Odds ratio betrug 1,12 (CI: 0,03 - 1,60). In einer Subgruppenanalyse fanden sich keine signifikante Unterschiede in bezug auf das mittlere Alter, das Ausmaß des Zigarettenkonsums und auch von Blutgruppenmerkmalen. Innerhalb des Patientenkollektivs wurde die Verteilung von schnellen und langsamen Acetylierern stratifiziert nach Menopausenstatus, Menstruationsdauer, TNM-Klassifikation und Grading. Bei den Patientinnen mit invasiv-lobulärer Tumorhistologie waren die schnellen Acetylierer in der Auswertung signifikant häufiger als bei invasiv-duktalem Mammakarzinom. Ein weiterer signifikanter Unterschied wird bezüglich des Hormonrezeptorstatus berichtet: Schnelle Acetylierer waren bei Patientinnen mit positivem Hormonrezeptorstatus deutlich häufiger als bei solchen mit negativem Rezeptorstatus. Bezüglich der Tumorhistologie fiel auf, dass die 33 Patientinnen mit einem invasiv-lobulären Mammakarzinom signifikant häufiger schnelle Acetylierer waren. Langsame Acetylierer wiesen dagegen häufiger einen negativen Östrogenrezeptorstatus auf. Schlussfolgerung: Dem Polymorphismus des NAT2-Genotyps als unabhängigem Risikofaktor bei der Entstehung des Mammakarzinoms kommt keine mit den bekannten Risikofaktoren vergleichbare Bedeutung zu. Die Befunde in bezug auf die Tumorhistologie und auf den Hormonrezeptorstatus weisen möglicherweise auf Besonderheiten im Pathomechanismus bei der Entstehung des Mammakarzinoms hin, der derzeit unklar ist. Sie bedürfen weiterer Abklärung. / Genetically polymorphic xenobiotic metabolizing enzymes such as the polymorphic arylamine N-acetyltransferase (NAT2) are supposed to be a host factor for cancer susceptibility. A case-control study of a total of 248 patients with breast cancer and a matched reference group of 248 unrelated subjects without cancer was performed to explore the association between NAT2 genetic polymorphism and individual susceptibility to breast cancer. A structured questionnaire was used to collect relevant information regarding all known or suspected risk factors of breast cancer. Methods: The NAT2 genotype was determined using the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The NAT2-genotype was characterized at nucleotide positions 191, 282, 341, 481, 590, 803, and 857. For evaluation of nucleotide 341, a 3’-mismatch primer was used. Homozygous wild type genotypes NAT2*4/*4 were confirmed by DNA sequencing. Results: Genotypes for rapid acetylation amounted to 44.4% among breast cancer and 41.5% among reference patients. There was no over-representation of specific NAT2-genotypes in the total of breast cancer patients compared with the reference group (odds ratio 1.12, 95%; confidence limits 0.03-1.60). Neither NAT2-status nor smoking status was independently associated with breast cancer risk. Logistic regression analysis, considering confounders such as age, body mass index (BMI), and smoking status (PJ) showed that the NAT2 rapid acetylator genotype was not associated with an increased cancer risk (odds ratio 1.05; 95%-CI: 0.67-1.67; P=0.82). Discrimination into homozygous and heterozygous carriers of allele NAT2*4 did not show any over-representation of NAT2*4/*4 genotypes among breast cancer patients (odds ratio 1.31; 95% confidence limits 0.59-2.91; p=0.50). Hence carriers of the NAT2*4/*4 genotypes, with its especially high acetylation capacity are not at significantly increased risk to breast cancer. Further stratification to different risk factors revealed a non-significant elevation in risk of breast cancer among patients with increasing cigarette smoking who represented the NAT2 rapid acetylator genotype, but lack of association to age, blood groups, menopause, period of menstruation, TNM-classification, tumor grading, and histology. However, evaluation of the role of estrogen receptor status and NAT2 showed that there was a significant association between positive receptor status and NAT2 rapid acetylator genotype (odds ratio 2.07; 95%-CI: 1.32-5.27; P=0.005). Interestingly, in patients with infiltrating lobular breast cancer (n = 33), NAT2 rapid acetylator genotypes were more frequent compared with other tumor subtypes (odds ratio 2.59; 95%-CI: 1.20-5.60; P=0.014). Logistic regression analysis, considering estrogen receptor status, and age showed that the rapid acetylator genotypes were associated with an increased cancer risk (odds ratio 2.4; 95%-CI: 1.04-5.61; P=0.04). Our findings suggest that NAT2-polymorphism is not an independent susceptibility factor for breast cancer. In particular the NAT2 slow acetylator genotype was not associated with an increased breast cancer risk. Striking results point out to a likely association between NAT2 rapid acetylator genotype and tumor histology especially infiltrating lobular breast cancer and positive hormone receptor status These findings refer to special features of pathogenesis in breast cancer requiring more and detailed clarification.

Für die Identifizierung bzw. Differenzierung von Candida- Spezies und -Stämmen sowie für die Bestimmung der genetischen und epidemiologischen Verwandtschaft von Stämmen der gleichen Spezies wurde eine PCR-Fingerprint-Technik und eine RFLP-Analyse der amplifizierten ITS-Region angewandt. Das PCR-Fingerprinting amplifiziert anonyme Sequenzen in der chromosomalen DNA, die über das gesamte Genom verteilt sind. Die ITS-Region ist Bestandteil des ribosomalen Operons, welches in ca. 50-100 Kopien/Zelle vorhanden ist. 1.a. Beide molekularbiologischen Verfahren wurden zur Unterscheidung von routinemäßig schwer differenzierbaren klinischen Candida famata und Candida guilliermondii-Isolaten genutzt. Von insgesamt 37 fraglichen Stämmen konnten 31 als C. guilliermondii und 3 als C. famata identifiziert werden, die drei verbliebenen Stämme waren mit diesen Techniken nicht identifizierbar. Mit der Biochemotypie gelang nur die Zuordnung eines der 3 C. famata-Isolate sowie von 23 der 31 C. guilliermondii-Isolate. 14 Isolate wurden mit den konventionellen Methoden gar nicht oder falsch identifiziert. 1b. Mit dem PCR-Fingerprinting wurde auch die Spezieszugehörigkeit phänotypisch veränderter Candida albicans-Isolate überprüft. Alle atypischen Stämme, bei denen solche für C.albicans charakteristischen Merkmale wie die Bildung von Chlamydosporen, die Verwertung der Aminozucker Glukosamin und N-Acetylglukosamin sowie die Assimilation von 2-Ketogluconat und Xylose nicht ausgeprägt waren, wiesen die für C. albicans typischen Fingerprintmuster auf. Unsere Studie zeigte, daß die biochemische Typisierung an Grenzen stößt, wenn typische Stoffwechselreaktionen nicht nachgewiesen werden können. 2. Bei 6 verschiedenen C. albicans-Populationen aus Angola, Madagaskar, Deutschland und Portugal wurde die Variabilität phänotypischer und genotypischer Merkmale untersucht, wobei in diese Analyse auch atypische Stämme miteinbezogen wurden. Während die phänotypischen Eigenschaften, bis auf die der atypischen Stämme, kaum variierten, wurden für die insgesamt 212 C. albicans-Isolate 87 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Genotypen nachgewiesen. Eine Analyse der Beziehungen zwischen den Fingerprint-Genotypen wurde mit der UPGMA-Distanz-Methode durchgeführt. 3. Weiterhin wurden Candida-Vaginalisolate von Patientinnen mit rezidivierenden Episoden von Candida-Vaginitis mit Stämmen verglichen, die aus anderen Körperregionen stammten bzw. bei ihren Partnern isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, daß Stammaustausche zwischen den Partnern vorkommen, ein Stamm ohne oder mit geringfügigen genotypischen Veränderungen trotz Therapie persistieren kann und daß eine Reinfektion auch durch einen neuen Stamm möglich ist. Das Problem der Erregeridentifizierung in der mykologischen Labordiagnostik ist sowohl klinisch als auch epidemiologisch relevant. Molekularbiologische Methoden sollen gut funktionierende konventionelle Methoden zur Erregeridentifizierung nicht ersetzen, können aber bei Problemfällen eine wertvolle Ergänzung für die mykologische Diagnostik vorzugsweise in fachständigen Referenzlaboratorien darstellen. / A PCR fingerprinting approach and a RFLP analysis of the amplified ITS region were used to differentiate Candida species and strains as well as to assess genetic and epidemiological relationships of strains belonging to the same species. The PCR fingerprinting amplifies anonymous DNA sequences sampled throughout the whole genome. The ITS region is part of the ribosomal operon which occurs in tandem arrays of nearly 50-100 copies in one cell. 1.a. Both methods were used to identify clinical isolates of C. famata and C. guilliermondii which were difficult to differentiate with routine methods. Out of 37 ambiguous isolates 31 could be identified as C. guilliermondii, 3 as C. famata and the other 3 were not identifiable. Biochemical typing (Api 32 C V.1) identified only 23 out of 31 C. guilliermondii and 1 out of 3 C. famata whereas 14 isolates were misidentified or not identified at all. 1.b. By using the PCR fingerprinting technique strains of C. albicans with altered phenotypes could be identified at species level. Atypical isolates which did not express those characteristics which are thought to be typical for C.albicans like the formation of clamydospores, the ability to metabolise the amino sugars glucosamine and N-acetylglucosamine as the sole carbon source or to assimilate 2-ketogluconate and xylose showed the PCR patterns typical for C.albicans. Our study revealed that biochemical and morphological methods of species identification are limited if some of the key reactions fail. 2. We investigated the variability of phenotypic and genotypic properties of 6 different C. albicans populations from different countries (Angola, Madagascar, Portugal and Germany) including atypical strains. Except for the atypical strains only very little phenotypical variation was observed. However, 87 different genotypes were found among the 212 strains. The relatedness of the fingerprint-genotypes were analysed by measuring genetic distances with the UPGMA method. 3. Vaginal isolates of Candida spp. obtained from patients with recurrent episodes of vaginitis were compared with isolates from different body locations of the women and from their male partners. It has been shown that strain exchanges between the partners occur, that the original strain with or without minor genotypic changes can persist despite of the therapy, but also that reinfection by a new strain is possible. The identification of an ethiological agent by the mycological diagnostic laboratory is of clinical and epidemiological importance. Molecular biological methods should not replace well established conventional methods but they can supplement the identification of fungal pathogens in specialised reference laboratories if diagnosis cannot be achieved easily by conventional diagnostic procedures.

Die genetischen Polymorphismen der humanen Biotransformationsenzyme Glutathion-S-Transferase Theta 1 (GSTT1-1) und Arylamin-N-Acetyltransferase 1 (NAT1) wurden zu Beginn der neunziger Jahre entdeckt. Es besteht derzeit ein großes Interesse an Untersuchungen zur Häufigkeit der Allele, zu deren phänotypischen Konsequenzen und pharmakologisch-toxikologischer Relevanz. Für die Untersuchungen in dieser Arbeit standen die Blutproben von 314 gesunden, deutschen Probanden mit bekanntem GSTT1- und/oder NAT1-Genotyp zur Verfügung. Es wurden Methoden etabliert und validiert, um im Hämolysat die Reaktionsgeschwindigkeiten bei der Umsetzung des GSTT1-1-spezifischen Substrats Dichlormethan sowie des NAT1-spezifischen Substrats p-Aminobenzoesäure mit vertretbarem Laboraufwand zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine vollständige Übereinstimmung zwischen der homozygoten GSTT1-Gendeletion und dem defizienten Phänotyp bei 19,3% der Individuen gefunden. Bei 80,7% der Probanden war durch Genotypisierung mindestens ein GSTT1*A-Allel identifiziert worden. Mit Hilfe der Phänotypisierung konnten in dieser Gruppe zwei Phänotypen, der intermediäre und der hoch aktive Phänotyp, voneinander abgegrenzt werden. Damit bestand der Vorteil der Phänotypisierung darin, eine trimodale Verteilung der GSTT1-1-Aktivität nachweisen zu können. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig in einer größeren deutschen Population gezeigt. Weiterhin wurden in dieser Arbeit untersucht, ob zwei Phosphonsäurediester des Glutathions, die sich als kompetitive bzw. nicht-kompetitive Hemmstoffe anderer GST-Isoenzyme erwiesen hatten, sowie der Arzneistoff Tactin, ein Medikament zur Behandlung des Mobus Alzheimer eine Hemmwirkung auf die GSTT1-1-vermittelte Umsetzung von Dichlormethan besitzen. Gegenwärtig sind 24 verschiedene NAT1-Allele bekannt, wobei einige davon sehr selten auftreten. In der hier verwendeten deutschen Population waren sechs NAT1-Allele identifiziert worden. In den Blutproben der 105 Probanden wurde die funktionelle Konsequenz dieser Allele bestimmt. In vorliegender Arbeit wurde erstmalig für einen homozygoten Träger des NAT1*15-Allels das Fehlen jeglicher Enzymaktivität nachgewiesen. Bezüglich der Häufigkeit der GSTT1-Gendefizienz sowie des NAT1*11-Allels wurden in vorliegender Arbeit zwischen europäischen, d.h. einander ethnisch nahestehenden Bevölkerungsgruppen statistisch signifikante Unterschiede gefunden. / The genetic polymorphisms of the glutathione S-transferase theta 1-1 (GSTT1-1) and the arylamine N-acetyltransferase 1 (NAT1) were found in the beginning of the 90's. There is a great interest in genotype-phenotype relations in individuals and in pharmacological and toxicological consequences of the polymorphisms. In this work, hemolysate of 314 healthy German volunteers was used for several genotyping and phenotyping methods. A concordance between the homozygous GSTT1 gene deletion and the enzyme deficiency in 27 of 140 individuals (19,3%)was found. In 80,7% of the volunteers a discrimination between intermediate and rapid metabolizers was possible in a German population for the first time. In addition it was proved, if the ex-vivo metabolism of dichloromethane, catalyzed by GSTT1-1, is inhibited by phosphono-analoga of glutathione or tacrine, a drug for treatment of Alzheimers' disease. The NAT1 polymorphism is characterized by several point mutations and deletions or insertions of oligonucleotides. 24 NAT1 alleles are known so far. In this work, the functional consequences of various NAT1 allele combinations in the genotypes of 105 individuals were determinated. There were found interethnic differences in the frequency of the NAT1*11 allele and the frequency of the homozygous gene deletion between the German and other Caucasien populations.

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Eine besondere Rolle im Fremdstoffmetabolismus hat die SULT1A1 beim Menschen aufgrund der hohen Expression und breiten Gewebeverteilung. Während die humane SULT1A1 in sehr vielen Geweben exprimiert wird, wurde die murine SULT1A1 vor allem in der Leber, Lunge und Colon gefunden. Neben der Gewebeverteilung spielt auch der Polymorphismus im humanen SULT1A1-Gen eine bedeutende Rolle. Der häufigste Polymorphismus in diesem Gen führt zu einer Aminosäuresubstitution von Arginin zu Histidin an Position 213. Die Genvariante mit Histidin (auch als SULT1A1*2 bezeichnet) codiert für ein Protein mit einer geringen Enzymaktivität und einer reduzierten Enzymmenge in Thrombocyten. Über den Einfluss dieser allelischen Varianten in anderen Geweben ist bislang wenig bekannt. In vorausgegangenen epidemiologischen Studien wurden mögliche Korrelationen zwischen den Genvarianten und der Krebsentstehung in verschiedenen Geweben untersucht. Diese Daten liefern jedoch widersprüchliche Ergebnisse zum Krebsrisiko. Aufgrund der strittigen epidemiologischen Daten sollten Tiermodelle generiert werden, um die häufigsten SULT1A1-Allele hinsichtlich der Empfindlichkeit gegenüber Nahrungs- und Umweltkanzerogenen zu untersuchen. Zur Erzeugung transgener (tg) Mauslinien wurde mittels Mikroinjektion der codierenden Genbereich und große flankierende Humansequenzen stromaufwärts und stromabwärts in das Mausgenom integriert. Es wurden mehrere Mauslinien hergestellt. Zwei davon, die Mauslinie 31 mit dem SULT1A1*1-Allel und die Mauslinie 28 mit dem SULT1A1*2-Allel, wurden eingehend analysiert. In beiden Linien wurde eine identische Kopienzahl des Transgens ermittelt. Proteinbiochemische Charakterisierungen zeigten eine weitgehend dem Menschen entsprechende Gewebeverteilung und zelluläre und subzelluläre Lokalisation der humanen SULT1A1 in der Linie (Li) 28. In Li 31 wurden Unterschiede zu Li 28 sowohl in der Gewebeverteilung als auch in der zellulären Lokalisation des exprimierten humanen Proteins ermittelt. Dabei war die Expression auf Proteinebene in der SULT1A1*2-tg Linie generell stärker als in der SULT1A1*1-Linie. Dieses Ergebnis war überraschend, denn in humanen Thrombocyten führt das SULT1A1*1-Allel zu einem höheren Gehalt an SULT1A1-Protein als das SULT1A1*2-Allel. Zur Analyse der unterschiedlichen Proteinexpressionen in den tg Mauslinien wurde die cDNA und der 5´-flankierende Bereich des SULT1A1-Gens sequenziert. In beiden tg Linien entsprach die Sequenz der cDNA der Referenzsequenz aus der Gendatenbank (Pubmed). In der 5´-flankierenden Region wurden bekannte Polymorphismen analysiert und unterschiedliche Haplotypen in den tg Linien an den Positionen -624 und -396 ermittelt. Dabei wurde in der Li 31 der Haplotyp detektiert, der in der Literatur mit einer höheren SULT1A1-Enzymaktivität beschrieben wird. Der mögliche Zusammenhang zwischen Transkriptionsrate und Proteinexpression wurde in RNA-Expressionsanalysen im codierenden und 5´-nicht codierenden Bereich (mit den alternativen Exons 1B und 1A) untersucht. Im codierenden Bereich und im Exon 1B konnte in den untersuchten Organen eine höhere RNA-Expression in der Li 28 im Vergleich zur Li 31 ermittelt werden. Außer in der Lunge wurde für Exon 1B eine identische RNA-Expression detektiert. RNA, die Exon 1A enthielt, wurde in allen untersuchten Organen der Li 28, aber nur in der Lunge bei der Li 31 gefunden. In beiden tg Linien konnten mit den Exon 1A-Primern jedoch auch größere PCR-Produkte ermittelt werden. Dieser Unterschied im Exon 1A und mögliche Spleißvarianten könnten damit für die unterschiedliche Proteinexpression des humanen SULT1A1-Proteins in den beiden tg Mauslinien sein. Die in dieser Arbeit generierten und charakterisierten tg Mausmodelle wurden in einer toxikologischen Studie eingesetzt. Es wurde das heterozyklische aromatische Amin 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP) verwendet. PhIP wird beim Erhitzen und Braten von Fleisch und Fisch gebildet und könnte mit der erhöhten Krebsentstehung im Colon in der westlichen Welt im Zusammenhang stehen. Mittels 32P-Postlabelling sollte der Einfluss der zusätzlichen Expression der humanen SULT-Proteine auf die PhIP-DNA-Adduktbildung analysiert werden. Dabei wurden mehr DNA-Addukte in den tg Tieren als in den Wildtyp-Mäusen ermittelt. Die Konzentration der gebildeten DNA-Addukte korrelierte mit der Expressionsstärke des humanen SULT1A1-Proteins in den tg Mäusen. An den in dieser Arbeit generierten tg Mauslinien mit den häufigsten allelischen Varianten des SULT1A1-Gens konnten Unterschiede auf RNA- und Protein-Ebene ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression der humanen SULT1A1 eine Auswirkung sowohl auf die Stärke als auch das Zielgewebe der DNA-Adduktbildung in vivo hat. / In humans, SULT1A1 and its polymorphic variants play an important role in xenobiotic metabolism and display a broad tissue distribution and high expression level. This enzyme is expressed in almost every human organ whereas in mice SULT1A1 can only be detected in liver, lung and colon. The most common polymorphism of this gene leads to an amino acid substitution from arginine to histidine at the position 213. In platelets, the allele encoding histidine (also designated as SULT1A1*2) is associated with both low activity and low thermal stability of the SULT protein. However, so far only little is known about the significance of these allelic variants in the other tissues with hSULT1A1 expression. Previous epidemiological studies have made attempts to correlate SULT1A1 allelic variants and cancer development, their data, however, have been contradictory for an appropriate cancer risk assessment. In this thesis, we addressed the effect of the hSULT1A1 genetic variability on the susceptibility to nutritional and environmental carcinogens using transgenic (tg) mouse models. We generated tg mice carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. The coding region and large flanking human sequences upstream and downstream of the hSULT1A1 gene were integrated randomly into the mouse genome by microinjection. Several tg mouse lines were generated. Two of them, line (li) 31 with the SULT1A1*1 allele and li 28 with the SULT1A1*2 allele, were analysed in detail. At first, an identical transgene copy number was detected in both lines. Furthermore, biochemical characterization of li 28 showed that the tissue distribution, the cellular and subcellular localisation of the protein were very similar to those in humans. In contrast, li 31 exhibited differences in tissue distribution and cellular localisation of the human protein compared to li 28. The protein expression level in the tg line with SULT1A1*2 (li 28) was generally higher than in SULT1A1*1 (li 31) mice. These results were surprising since the SULT1A1*1 allele in human platelets usually leads to a higher amount of SULT1A1 protein compared to the SULT1A1*2 allele. To investigate these differences, we sequenced the cDNA and 5´-flanking region of the SULT1A1 gene. In both tg mouse lines, the cDNA sequence was identical to the reference sequence from the gene databank (Pubmed). We subsequently analysed the common polymorphisms of the 5´-flanking region, and determined different haplotypes at position -624 and -396 in the tg mouse lines. According to the literature, the haplotype associated with a higher SULT1A1 enzyme activity, we detected in li 31. We analyzed the possible correlation between gene transcription and protein expression by measuring RNA expression levels of the coding and the non-coding region (with alternative exons 1B and 1A). We detected a higher RNA expression level of the coding region and exon 1B in li 28 compared to li 31, whereas RNA for exon 1A was only found in li 28 in all investigated tissues, but only in lung in li 31. Furthermore we detected with exon 1A-primers larger RNA in both lines. These differences in exon 1A expression accompanied by potential splicing variants could be responsible for the different expression and activity of the human SULT1A1 protein in both tg mouse lines. In order to validate our generated and characterized tg mouse models as toxicological in vivo models, we used them for the evaluation of the heterocyclic aromatic amine 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridine (PhIP). PhIP is typically generated during heating and roasting of meat and fish and is suggested to be associated with an increased colon cancer incidence in the western world. We measured the impact of the additionally expressed human SULT proteins on the PhIP-DNA adduct level by 32P-postlabelling. We detected significantly higher DNA adduct levels in tg compared to wildtype mice, which correlated positively with the expression pattern of the human SULT1A1 protein in the tg mice. In conclusion, in this thesis, we have successfully generated and validated the transgenic mouse lines carrying the most common allelic variants of the human SULT1A1 gene. Interestingly, these lines exhibited differences in both the SULT1A1 RNA and protein levels. Using these transgenic mouse models as in vivo toxicological tools we have shown that the expression of human SULT1A1 in mice has a decisive impact on the strength and the target tissue of DNA adducts.

The 5-HTT gene (SLC6A4) is regulated by a common polymorphism in the promoter region (5-HTTLPR), which has functional consequences. Two major alleles have been observed and shown to have differential transcriptional activity with the long (L) allele having greater gene expression than the short (S) allele. 5-HTTLPR appears to modulate depression, anxiety and personality traits such as neuroticism. Additionally, a significant influence of 5-HTTLPR genotype on amygdala reactivity in response to fearful stimuli has been reported. Moreover, 5-HTTLPR seems to impact on the role of stressful life events (SLEs) in the development of depression. An elevated risk of depression and suicidal behaviors has been found in carriers of at least one low expressing S allele who had experienced SLEs, suggesting a gene x environment interaction. However, a recent meta-analysis showed that several findings failed to replicate this finding. Since genetic polymorphisms of the dopaminergic and serotonergic neurotransmission interact at the molecular, analyses with another polymorphism of the dopaminergic system, the dopamine D4 receptor (DRD4) was included to consider these likely gene-gene interactions (epistasis). The aim of this series of studies was to investigate the role 5-HTTLPR and SLEs on the endocrine stress response in different age samples. While newborns have been examined by a heel prick, stress responses were provoked in children (8-12 yrs) and younger adults (19-31 yrs) and older adults (54-68 yrs.) with the Trier Social Stress Test (TSST). The Life History Calendar (LHC) and Life Events Questionnaire (LEQ) were used to acquire data on SLEs. While in newborns the S/S genotype showed a significantly higher acute endocrine stress response than L/L or S/L genotypes, no significant difference between genotype groups was found in children. In the younger adult sample, the genotype impacted on cortisol stress responsiveness was reversed. Adults carrying the more active L allele of the 5-HTTLPR polymorphism showed a significantly larger cortisol response to the TSST than individuals carrying at least one of the lower expressing S allele. In older adults, no significant difference between genotype groups was found. However, results point in the same direction with showing highest cortisol response in individuals with L/L genotype. These data suggest that the association between 5-HTTLPR and endocrine stress reactivity seems to alter across lifespan, more specific the effects of genotype turns around. In addition, a significant interaction effect of 5-HTTLPR and SLEs has been found in the sample of younger adults, i.e. that early SLE as well as a severe number SLEs across the entire lifespan seem to modulate the interaction between HPA axis activity and 5-HTTLPR genotype. Additionally, a DRD4 by 5-HTTLPR interaction emerged which point to independent and joint effects of these polymorphisms on stress responsivity with regard to the concept of genegene interaction.

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