Este trabalho teve como objetivo avaliar a infectividade de estirpes fracas do Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) em plantas de melancia (Citrullus lanatus), em função da origem da estirpe fraca, da concentração e da espécie doadora do inóculo e da idade da planta-teste de melancia, inoculada mecanicamente. Também foi avaliado o efeito protetor dessas estirpes em plantas de melancia em casa de vegetação e em campo. A seleção de estirpes fracas do PRSV-W foi feita a partir de bolhas de folhas de melancia infectadas naturalmente em campo. A infectividade da estirpe fraca selecionada foi comparada com a das estirpes fracas PRSV-W-1 e PRSV-W-2, previamente selecionadas de bolhas de folhas de abobrinha de moita (Cucurbita pepo) 'Caserta' com mosaico. Como controle foi utilizada uma estirpe severa do vírus obtida de abobrinha de moita (PRSV-W-C). A avaliação do efeito da concentração e da espécie da planta fonte do inóculo na infectividade de plantas de melancia foi feita com extratos de 4, 8, 12 e 16 discos de folhas de abobrinha de moita e de melancia, infectadas separadamente com as estirpes fracas e severa, e diluídos em 2 mL de tampão fosfato. O efeito da idade da planta-teste de melancia na infectividade das estirpes fracas foi estudado comparando-se plantas inoculadas em quatro estádios de desenvolvimento, a partir do estádio cotiledonar, com inóculos das diferentes estirpes do PRSV-W extraídos de 12 discos foliares/2 mL de tampão. O efeito protetor da estirpe fraca obtida de bolhas de folhas de melancia com mosaico foi avaliado em plantas premunizadas e desafiadas com a estirpe PRSV-W-C, em casa de vegetação e em campo. Plantas de melancia premunizadas com as estirpes fracas PRSV-W-1 e PRSV-W-2 e plantas não protegidas também foram avaliadas no teste em campo. Foram avaliadas a proteção, com base nos sintomas, a produção e o conteúdo de açúcares (grau brix) dos frutos colhidos das plantas premunizadas e não premunizadas. Uma estirpe fraca do vírus, denominada PRSV-W-3, foi selecionada de bolhas de folhas de melancia com mosaico. Em todos os testes de infectividade em plantas de melancia, independente da concentração e da planta fonte do inóculo e do estádio de desenvolvimento da planta-teste inoculada, a estirpe fraca PRSV-W-3 apresentou taxas de infectividade semelhantes as das estirpes PRSV-W-1 e PRSV-W-2, chegando a 100% em alguns casos. A infectividade da estirpe severa PRSV-W-C foi de 100% em todos os testes. Aparentemente, a infectividade das três estirpes fracas foi mais diretamente afetada pela intensidade de fricção das folhas no momento da inoculação mecânica do que pelas variáveis estudadas. A estirpe fraca PRSV-W-3 protegeu as plantas de melancia contra a infecção e/ou manifestação da estirpe PRSV-W-C em casa de vegetação. Em campo, todas as plantas de melancia premunizadas com as três estirpes fracas também ficaram protegidas contra a estirpe severa utilizada no desafio. A produção das plantas premunizadas não diferiu estatisticamente entre si, nem mesmo daquelas inicialmente sadias infectadas em campo. O conteúdo de açúcares e a aparência da polpa dos frutos também foram semelhantes em todos os tratamentos. / The purpose of this work was to evaluate the infectivity of three mild strains of Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) on watermelon (Citrullus lanatus). The effect of the origin of the mild strain, the concentration of the inoculum, the species of the source of the inoculum and the age of the test-plant on the infectivity of mechanically inoculated watermelon were also evaluated. The protective effect of these mild strains on preimmunized watermelon plants was evaluated under greenhouse and field conditions. Mild strains were selected from blisters formed on mosaic leaves of naturally infected watermelon plants. The infectivity of the selected mild strain was compared with that of mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2, which were previously obtained from blisters formed on mosaic leaves of zucchini squash (Cucurbita pepo cv. Caserta). A severe strain isolated from zucchini squash (PRSV-W-C) was used as control. The effect of the concentration and the species source of inoculum of the mild strains on the infectivity of watermelon plants was studied with inoculum extracted from 4, 8, 12 and 16 leaf discs of zucchini squash and watermelon plants, separately infected with the mild and severe strains, diluted in 2 mL of phosphate buffer. Four stages of development of watermelon plants, starting at the cotyledonal stage, were tested for the infectivity with the mild strains. Inocula were prepared with extracts of 12 leaf discs diluted in 2 mL of phosphate buffer. The protective effect of the mild strain selected from blisters on mosaic leaves of watermelon plants was evaluated on preimmunized plants challenge inoculated with severe strain PRSV-W-C, under greenhouse and field conditions. Watermelon plants preimmunized with mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2 and unprotected plants were also included in the field trial. Protection was evaluated based on plant simptons, yield and sugar content in the fruits. One mild strain, named PRSV-W-3, was obtained from blisters on mosaic leaves of watermelon plants. The rate of infection of watermelon plants with mild strain PRSV-W-3 was similar to that with mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2 in all infectivity tests, independently of the concentration of the inoculum, species source of the inoculum and stage of development of the inoculated test-plant, reaching 100% in some cases. Rate of infectivity with severe strain PRSV-W-C was always 100%. Apparently, the infectivity of the mild strains on watermelon was more directly related with the intensity of the abrasion produced by mechanical inoculation than with the above studied variables. The selected mild strain PRSV-W-3 protected watermelon plants against superinfection with the severe strain in the greenhouse tests. Protection was also effective under field conditions. Yield of plants preimmunized with all three mild strains and unprotected plants were statistically similar. The sugar content and the quality of the pulp of the fruits were similar for all treatments.

Entre as cucurbitáceas cultivadas no Brasil, a abobrinha de moita (Cucurbita pepo L.) apresenta grande importância econômica, notadamente no Estado de São Paulo, a maior área de plantio. No Brasil, já foram encontrados nove vírus capazes de infectar esta espécie. Os mais freqüentes e responsáveis por prejuízos significativos à produção da abobrinha de moita são os do mosaico do mamoeiro – estirpe melancia (Papaya ringspot virus - type W – PRSV-W) e do mosaico amarelo da abobrinha (Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV), devido principalmente à sua alta sensibilidade. A premunização das plantas com estirpes fracas vem sendo investigada há mais de 10 anos no Brasil e surge como uma alternativa interessante para controle destas viroses. A premunização de abobrinha de moita só foi estudada até o momento em plantas da variedade Caserta. O presente trabalho teve o objetivo de dar continuidade a estes estudos avaliando o efeito de estirpes premunizantes PRSV-W-1 e ZYMV-M na produção quantitativa e qualitativa de quatro variedades comerciais de C. pepo: Samira, Novita Plus, AF-2847 e Yasmin. Os resultados obtidos em experimentos conduzidos em estufa plástica mostraram que as plantas destas variedades infectadas com a estirpe fraca ZYMV-M, não exibiram sintomas foliares acentuados e não apresentaram alterações na produção quantitativa e qualitativa de frutos, quando comparada com a produção das plantas sadias. No entanto, as plantas dessas mesmas variedades infectadas com a estirpe PRSV-W-1, só ou em mistura com a estirpe ZYMV-M, exibiram sintomas acentuados de mosaico foliar e alteração significativa na qualidade dos frutos, caracterizada pelo escurecimento da casca. Não houve alteração significativa na quantidade de frutos produzidos por essas plantas e no peso médio dos frutos. Quando plantas dessas variedades foram infectadas somente com a estirpe fraca PRSV-W-1 e conduzidas paralelamente em condições de campo e estufa plástica, constatou-se intensificação dos sintomas nos frutos e nas folhas das plantas infectadas conduzidas principalmente em estufa, porém a produção quantitativa mais uma vez não foi alterada. A variedade Samira mostrou-se a mais sensível ao PRSV-W-1 em ambas as condições. Os resultados sugerem que fatores ambientais, além da interação da estirpe fraca com a variedade de abobrinha, parecem interferir na expressão de sintomas nos frutos das plantas infectadas com a estirpe PRSV-W-1. Também foi objeto de estudo desse trabalho a identificação da melhor hospedeira, entre algumas cucurbitáceas, para a multiplicação e manutenção das duas estirpes fracas, e a avaliação da eficiência dos afídeos Myzus nicotianae e M. persicae na transmissão da estirpe ZYMV-M. Os resultados mostraram que a estirpe ZYMV-M parece atingir as maiores concentrações em C. pepo cv. Caserta e em C. melo cv. Casca-de-Carvalho. Para a estirpe PRSV-W- 1, as melhores hospedeiras foram C. pepo cv. Caserta, seguida de C. lanatus cv. Crimson Sweet e C. sativus cv. Safira. M. nicotianae e M. persicae transmitiram a estirpe fraca ZYMV-M para 11,7% e 0% das plantas de abobrinha de moita cv. Caserta, respectivamente. Enquanto a estirpe severa foi transmitida para 47,0% e 80% das plantas teste, respectivamente. / Zucchini squash (Cucurbita pepo L.) is widely cultivated in Brazil, especially in the State of São Paulo, which is the major producer. Nine viruses capable to infect this species have already been described in Brazil. The most frequent and responsible for significant yield losses are the potyviruses Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), for which zucchini squash is highly susceptible and intolerant. Preimmunization with mild strains of both viruses have been investigated in Brazil for the last 10 years and appears as and interesting option for the control of these viruses. As preimmunization have been evaluated only for zucchini squash cv. Caserta, the purpose of the present work was to investigate the effect of the mild strains PRSV-W-1 and ZYMV-M on the quantitative and qualitative yield of four other commercial zucchini squash varieties: Samira, Novita Plus, AF-2847 e Yasmin. The results of an experiment carried out under plastic-house showed that mild strain ZYMV-M induced mild symptoms on the leaves of the plants of all varieties, but did not affect the yield of marketable fruits, as compared to those from the respective healthy controls. On the other hand, plants from all varieties exhibited accentuated mosaic and leaf malformation when infected with mild strain PRSV-W-1, alone or in mixture with ZYMV-M. The amount of fruits harvested (number and average weight) from these plants was similar to that from the respective healthy controls. However, the quality of the fruits was severely affected, since the mild strain PRSV-W-1 induced alteration on the texture and color of the skin. When plants infected only with mild strain PRSV-W-1 were grown simultaneously under field and plastic-house conditions, it was noticed that leaf and fruit symptoms were more intense on those maintained in the plastic-house. Once more the quantitative fruit yield was not affected by this mild strain. Zucchini squash cv. Samira was the most sensitive to PRSV-W-1 under both conditions. Together theses results suggest that environmental variables, besides the interaction between the variety and the mild strain, might influence the expression of symptoms shown by plants infected with PRSV-W-1. In addition to this, the present work also tried to identify the most appropriate host, among some cucurbit species/varieties, for multiplication of both mild strains, and the efficiency of two species of aphids (Myzus nicotianae and M. persicae) on the transmission of the mild strain ZYMV-M. The mild strain ZYMV-M attained the highest concentration in C. pepo cv. Caserta and Cucumis melo cv. Casca-de-Carvalho. The most appropriate hosts for multiplication of mild strain PRSV-W-1 were C. pepo cv. Caserta followed by Citrullus lanatus cv. Crimson Sweet and C. sativus cv. Safira. M. nicotianae and M. persicae transmitted the mild strain ZYMV-M to 11.7% and 0% of the test-plants of zucchini squash cv. Caserta. The transmission of the severe strain of ZYMV by both species of aphids occurred for 47% and 80% of the test-plants, respectively.

Resumo: O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein. / Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: José Osmar Gaspar / Banca: João Roberto Spotti Lopes / Banca: Addolorata Colariccio / Doutor

Ces dernières années, les facteurs du complexe d'initiation de la traduction eucaryote ont été identifiés comme des déterminants essentiels dans la sensibilité des plantes aux virus à ARN, y compris les potyvirus, genre le plus important à la fois de par leur nombre et leur importance économique chez des espèces légumières, fruitières et de grandes cultures.En particulier, les allèles récessifs mo11 et mo12 du gène mo1 précédemment identifié comme codant pour le facteur d'initiation de la traduction eIF4E, sont actuellement utilisés pour protéger les cultures de laitue contre le potyvirus de la mosaïque de la laitue (LMV).Partant des résultats obtenus au laboratoire démontrant que les déterminants du LMV impliqués dans le contournement de la résistance mo1 comprennent non seulement le domaine codant pour la VPg mais aussi, en amont, l'extrémité carboxy-terminale de celui codant pour la CI, mon travail de thèse a consisté à (1) confirmer que le LMV code pour deux facteurs de virulence, la CI et la VPg (2) identifier par mutagenèse dirigée et aléatoire des acides aminés clés de la CI impliqués dans le contournement de la résistance contrôlée par eIF4E (3) entamer une caractérisation fonctionnelle des interactions impliquant les trois partenaires eIF4E, CI et VPg.Les résultats obtenus ont montré que l'échange de la VPg d'un isolat virulent (LMV-E) dans un non virulent (LMV-0) est suffisant pour restituer la compatibilité complète avec les variétés de laitue portant l'allèle mo11, mais pas mo12, alors que la région codant pour la portion C-terminale de la CI et la 6K2, suffit pour contourner les deux allèles de mo1. Le mutant ponctuel dans la CI (LMV-0-S621T) obtenu par mutagenèse dirigée est capable de contourner la résistance conférée par mo12 et partiellement celle conférée par mo11 tandis que le mutant réciproque (LMV-E-T621S) perd sa capacité à contourner les deux allèles de résistance. Il s'agit donc là du premier exemple d'un gène de CI de potyvirus, agissant comme un déterminant de contournement de la résistance récessive contrôlée par eIF4E. En effet, la VPg des potyvirus a été identifiée jusque là comme l'unique facteur de virulence vis-à-vis de eIF4E. Il semble donc que le LMV puisse utiliser deux facteurs viraux (CI et VPg) pour le contournement des allèles de résistance mo1.Cette propriété, associée au fait que des isolats de LMV d'origine sauvage ou ornementale soient capables d'évoluer vers le contournement pourraient donc présenter un risque pour la durabilité des résistances mo1. Des travaux préliminaires ont été menés lors de cette thèse afin de mieux comprendre le rôle exact des mutations des facteurs de virulence dans le processus évolutif d'adaptation du LMV aux pressions imposées par les allèles mo1.Enfin, l'implication de la CI dans le contournement de la résistance mo1 laisse supposer que cette protéine pourrait elle aussi interagir (comme la VPg), directement ou non, avec eIF4E. Nous avons montré pour la première fois in vitro et in vivo l'interaction entre la région C-terminale de la CI et la protéine eIF4E de laitue. De plus, la mutation en position 621 de la CI ayant un rôle clé dans le contournement de la résistance mo1 ne semble pas affecter ces interactions in vitro

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-29Bitstream added on 2014-06-13T19:24:02Z : No. of bitstreams: 1 frangioni_dss_dr_botfca.pdf: 2302780 bytes, checksum: a3bab8cdfaa8a760d70900c13de09d8d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... / The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2907131 bytes, checksum: 7c8c658c01f5e065741077a77ef12f4d (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The genomes of most plant viruses code for only 4-10 proteins which are required to complete the infection cycle, including the stages of viral genome replication, cell-to-cell movement and systemic spread. For a successful infection, these viral proteins must interact with host factors, modulating metabolic pathways and coordinating a complex network of biochemical and molecular interactions in the pathogen s favor. A subtractive library constructed from susceptible tomato plants infected by the plant potyvirus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) identified several genes which are putatively involved in the initial steps of the viral infection process, including those that code for the Translationally Controlled Tumor Protein (TCTP) and the tomato homologue of the Saccharomyces cerevisae Gal83 (Sl-Gal83), a protein of the SNF1 complex. TCTP is a highly conserved protein in eukaryotes, and is involved in several fundamental cellular processes such as cell growth, cell cycle progression, programmed cell death and protection against different types of stresses. SNF1 plays an important role in transcriptional activation and expression of genes involved in the cellular response to different stresses, such as nutrient limitation, high salinity, heat shock and virus infection. The objectives of this work were to study the roles of TCTP and Sl-Gal83 during PepYMV infection in susceptible hosts. Transgenic tomatoes (cv. 'Moneymaker') silenced for these genes were generated and were mechanically inoculated with PepYMV. ELISA and qRT-PCR were performed to verify the phenotype resulting from Sl-Gal83 and TCTP silencing. The results showed that non-transformed plants were infected, while all ten silenced plants remained symptomless, were ELISA negative and had reduced viral load. The subcellular localization of TCTP in healthy and PepYMVinfected plants was analyzed by confocal microscopy using a TCTP-YFP fusion. In healthy plants the subcellular localization of TCTP is cytoplasmatic, as described for other organisms. Forty-eight hours after PepYMV infection, TCTP is relocated to the nucleus. To determine which PepYMV protein(s) promotes nuclear targeting of TCTP, each viral protein (P1, HC-Pro, P3, PIPO, P3N-PIPO, CI, 6K2, NIa, NIb and CP) was coexpressed individually with pYFP-TCTP. Results showed that TCTP accumulates predominantly in the nucleus when co-infiltrated with CI and NIa, and is distributed equally in the nucleus and cytoplasm when co-infiltrated with P1, PIPO, P3N-PIPO, 6K2 and NIb. In plants co-infiltrated with HC-Pro, P3 and CP, TCTP remained in the cytoplasm. In order to identify and characterize additional viral and host factors involved in the TCTP-mediated network of plant-potyvirus interactions, TCTP was cloned as a TAP (tandem affinity purification) tag fusion.Protein complexes were purified using TAP, and its constituents were analyzed by mass spectrometry. However,it was not possible to identify the proteins. The probable limiting factor for a more efficient detection was the low concentration of protein eluted. Thus, it is necessary to optimize the protocol of extraction/elution to obtain a higher concentration of proteins complexed with nTAPi- TCTP. Together, the results of this work indicate that both TCTP and Sl-Gal83 play critical roles in the tomato-PepYMV interaction, being necessary for the establishment of a systemic infection. Further studies should be conducted to improve our understanding of the nature and mechanisms of the interactions between TCTP, Sl-Gal83 and PepYMV. / O genoma da maioria dos vírus que infectam plantas codifica apenas 4-10 proteínas, que são necessárias para completar o ciclo de infecção, incluindo as etapas de replicação do genoma viral, movimento célula-a-célula e movimento sistêmico. Para uma infecção bem sucedida, as proteínas virais devem interagir com fatores do hospedeiro, modulando processos metabólicos e coordenando uma rede complexa de interações bioquímicas e moleculares a favor do patógeno. Uma biblioteca subtrativa foi construída a partir de plantas de tomateiro suscetíveis infectadas pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Foram identificados vários genes potencialmente envolvidos nas etapas iniciais do processo de infecção viral. Dentre os genes identificados encontram-se os genes que codificam as proteínas Translationally controlled tumor protein (TCTP) e o homólogo de tomate de Saccharomyces cerevisae Gal83 (Sl-Gal83), uma proteína do complexo Sucrose non-fermenting-1 (SNF1). TCTP é uma proteína altamente conservada em eucariotos, e está envolvida em vários processos celulares básicos, como crescimento celular, progressão do ciclo celular, morte celular programada e proteção contra diversos tipos de estresses. SNF1 desempenha um papel importante na ativação da transcrição e expressão de genes envolvidos na resposta celular aos diferentes tipos de estresses, tais como limitação de nutrientes, salinidade elevada, choque térmico e infecção viral. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel das proteínas TCTP e Sl-Gal83 durante o processo de infecção pelo PepYMV em hospedeiros suscetíveis. Plantas transgênicas de tomate cv. Moneymaker silenciadas para estes genes foram produzidas e inoculadas mecanicamente com o PepYMV. O estabelecimento da infecção viral foi avaliado por ELISA e qRT-PCR. Plantas não-transformadas foram infectadas, enquanto as plantas silenciadas permaneceram assintomáticas. Nas plantas silenciadas o ELISA apresentou resultado negativo e a carga viral foi reduzida. A localização subcelular de TCTP em plantas sadias e infectadas pelo PepYMV foi analisada por microscopia confocal utilizando-se uma fusão YFP-TCTP. Em plantas sadias a localização subcelular de TCTP é citoplasmática, conforme descrito para outros organismos. Quarenta e oito horas após a infecção pelo PepYMV, TCTP foi redirecionada para o núcleo. Para determinar qual é a proteína viral que direciona a relocalização de TCTP para o núcleo, cada uma das proteínas virais (P1, HC-Pro, P3, PIPO, P3N-PIPO, CI, 6K2, NIa, NIb e CP) foi coinfiltrada individualmente com pYFP-TCTP. Os resultados mostraram que TCTP acumula predominantemente no núcleo quando co-infiltrada com CI e NIa, e está igualmente distribuída no núcleo e citoplasma, quando co-infiltrada com P1, PIPO, P3NPIPO, 6K2 e NIb. Em plantas co-infiltradas com HC-Pro, P3 e CP, TCTP permaneceu no citoplasma. Para identificar possíveis proteínas virais e/ou do hospedeiro que interagem com TCTP foi realizado um ensaio de purificação por afinidade em tandem. A análise por SDS-PAGE de extratos protéicos de plantas expressando nTAPi-TCTP mostrou duas bandas entre 40 e 50 kDa presentes no extrato purificado. Os fragmentos foram analisados por espectrometria de massa, porém não foi possível identificar as proteínas. Provavelmente o limitante para uma detecção mais eficiente foi a baixa concentração de proteínas eluídas. Com isso, torna-se necessário a otimização do protocolo de extração/eluição para a obtenção de uma maior concentração de proteínas complexadas com nTAPi-TCTP. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que tanto TCTP quanto Sl-Gal83 possuem papéis fundamentais na interação PepYMV-tomate, sendo necessárias para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. Estudos adicionais devem ser realizados para melhor compreensão da natureza e dos mecanismos das interações entre TCTP, Sl-Gal83 e o PepYMV.

Entre as cucurbitáceas cultivadas no Brasil, a abobrinha de moita (Cucurbita pepo L.) apresenta grande importância econômica, notadamente no Estado de São Paulo, a maior área de plantio. No Brasil, já foram encontrados nove vírus capazes de infectar esta espécie. Os mais freqüentes e responsáveis por prejuízos significativos à produção da abobrinha de moita são os do mosaico do mamoeiro – estirpe melancia (Papaya ringspot virus - type W – PRSV-W) e do mosaico amarelo da abobrinha (Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV), devido principalmente à sua alta sensibilidade. A premunização das plantas com estirpes fracas vem sendo investigada há mais de 10 anos no Brasil e surge como uma alternativa interessante para controle destas viroses. A premunização de abobrinha de moita só foi estudada até o momento em plantas da variedade Caserta. O presente trabalho teve o objetivo de dar continuidade a estes estudos avaliando o efeito de estirpes premunizantes PRSV-W-1 e ZYMV-M na produção quantitativa e qualitativa de quatro variedades comerciais de C. pepo: Samira, Novita Plus, AF-2847 e Yasmin. Os resultados obtidos em experimentos conduzidos em estufa plástica mostraram que as plantas destas variedades infectadas com a estirpe fraca ZYMV-M, não exibiram sintomas foliares acentuados e não apresentaram alterações na produção quantitativa e qualitativa de frutos, quando comparada com a produção das plantas sadias. No entanto, as plantas dessas mesmas variedades infectadas com a estirpe PRSV-W-1, só ou em mistura com a estirpe ZYMV-M, exibiram sintomas acentuados de mosaico foliar e alteração significativa na qualidade dos frutos, caracterizada pelo escurecimento da casca. Não houve alteração significativa na quantidade de frutos produzidos por essas plantas e no peso médio dos frutos. Quando plantas dessas variedades foram infectadas somente com a estirpe fraca PRSV-W-1 e conduzidas paralelamente em condições de campo e estufa plástica, constatou-se intensificação dos sintomas nos frutos e nas folhas das plantas infectadas conduzidas principalmente em estufa, porém a produção quantitativa mais uma vez não foi alterada. A variedade Samira mostrou-se a mais sensível ao PRSV-W-1 em ambas as condições. Os resultados sugerem que fatores ambientais, além da interação da estirpe fraca com a variedade de abobrinha, parecem interferir na expressão de sintomas nos frutos das plantas infectadas com a estirpe PRSV-W-1. Também foi objeto de estudo desse trabalho a identificação da melhor hospedeira, entre algumas cucurbitáceas, para a multiplicação e manutenção das duas estirpes fracas, e a avaliação da eficiência dos afídeos Myzus nicotianae e M. persicae na transmissão da estirpe ZYMV-M. Os resultados mostraram que a estirpe ZYMV-M parece atingir as maiores concentrações em C. pepo cv. Caserta e em C. melo cv. Casca-de-Carvalho. Para a estirpe PRSV-W- 1, as melhores hospedeiras foram C. pepo cv. Caserta, seguida de C. lanatus cv. Crimson Sweet e C. sativus cv. Safira. M. nicotianae e M. persicae transmitiram a estirpe fraca ZYMV-M para 11,7% e 0% das plantas de abobrinha de moita cv. Caserta, respectivamente. Enquanto a estirpe severa foi transmitida para 47,0% e 80% das plantas teste, respectivamente. / Zucchini squash (Cucurbita pepo L.) is widely cultivated in Brazil, especially in the State of São Paulo, which is the major producer. Nine viruses capable to infect this species have already been described in Brazil. The most frequent and responsible for significant yield losses are the potyviruses Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), for which zucchini squash is highly susceptible and intolerant. Preimmunization with mild strains of both viruses have been investigated in Brazil for the last 10 years and appears as and interesting option for the control of these viruses. As preimmunization have been evaluated only for zucchini squash cv. Caserta, the purpose of the present work was to investigate the effect of the mild strains PRSV-W-1 and ZYMV-M on the quantitative and qualitative yield of four other commercial zucchini squash varieties: Samira, Novita Plus, AF-2847 e Yasmin. The results of an experiment carried out under plastic-house showed that mild strain ZYMV-M induced mild symptoms on the leaves of the plants of all varieties, but did not affect the yield of marketable fruits, as compared to those from the respective healthy controls. On the other hand, plants from all varieties exhibited accentuated mosaic and leaf malformation when infected with mild strain PRSV-W-1, alone or in mixture with ZYMV-M. The amount of fruits harvested (number and average weight) from these plants was similar to that from the respective healthy controls. However, the quality of the fruits was severely affected, since the mild strain PRSV-W-1 induced alteration on the texture and color of the skin. When plants infected only with mild strain PRSV-W-1 were grown simultaneously under field and plastic-house conditions, it was noticed that leaf and fruit symptoms were more intense on those maintained in the plastic-house. Once more the quantitative fruit yield was not affected by this mild strain. Zucchini squash cv. Samira was the most sensitive to PRSV-W-1 under both conditions. Together theses results suggest that environmental variables, besides the interaction between the variety and the mild strain, might influence the expression of symptoms shown by plants infected with PRSV-W-1. In addition to this, the present work also tried to identify the most appropriate host, among some cucurbit species/varieties, for multiplication of both mild strains, and the efficiency of two species of aphids (Myzus nicotianae and M. persicae) on the transmission of the mild strain ZYMV-M. The mild strain ZYMV-M attained the highest concentration in C. pepo cv. Caserta and Cucumis melo cv. Casca-de-Carvalho. The most appropriate hosts for multiplication of mild strain PRSV-W-1 were C. pepo cv. Caserta followed by Citrullus lanatus cv. Crimson Sweet and C. sativus cv. Safira. M. nicotianae and M. persicae transmitted the mild strain ZYMV-M to 11.7% and 0% of the test-plants of zucchini squash cv. Caserta. The transmission of the severe strain of ZYMV by both species of aphids occurred for 47% and 80% of the test-plants, respectively.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a infectividade de estirpes fracas do Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) em plantas de melancia (Citrullus lanatus), em função da origem da estirpe fraca, da concentração e da espécie doadora do inóculo e da idade da planta-teste de melancia, inoculada mecanicamente. Também foi avaliado o efeito protetor dessas estirpes em plantas de melancia em casa de vegetação e em campo. A seleção de estirpes fracas do PRSV-W foi feita a partir de bolhas de folhas de melancia infectadas naturalmente em campo. A infectividade da estirpe fraca selecionada foi comparada com a das estirpes fracas PRSV-W-1 e PRSV-W-2, previamente selecionadas de bolhas de folhas de abobrinha de moita (Cucurbita pepo) 'Caserta' com mosaico. Como controle foi utilizada uma estirpe severa do vírus obtida de abobrinha de moita (PRSV-W-C). A avaliação do efeito da concentração e da espécie da planta fonte do inóculo na infectividade de plantas de melancia foi feita com extratos de 4, 8, 12 e 16 discos de folhas de abobrinha de moita e de melancia, infectadas separadamente com as estirpes fracas e severa, e diluídos em 2 mL de tampão fosfato. O efeito da idade da planta-teste de melancia na infectividade das estirpes fracas foi estudado comparando-se plantas inoculadas em quatro estádios de desenvolvimento, a partir do estádio cotiledonar, com inóculos das diferentes estirpes do PRSV-W extraídos de 12 discos foliares/2 mL de tampão. O efeito protetor da estirpe fraca obtida de bolhas de folhas de melancia com mosaico foi avaliado em plantas premunizadas e desafiadas com a estirpe PRSV-W-C, em casa de vegetação e em campo. Plantas de melancia premunizadas com as estirpes fracas PRSV-W-1 e PRSV-W-2 e plantas não protegidas também foram avaliadas no teste em campo. Foram avaliadas a proteção, com base nos sintomas, a produção e o conteúdo de açúcares (grau brix) dos frutos colhidos das plantas premunizadas e não premunizadas. Uma estirpe fraca do vírus, denominada PRSV-W-3, foi selecionada de bolhas de folhas de melancia com mosaico. Em todos os testes de infectividade em plantas de melancia, independente da concentração e da planta fonte do inóculo e do estádio de desenvolvimento da planta-teste inoculada, a estirpe fraca PRSV-W-3 apresentou taxas de infectividade semelhantes as das estirpes PRSV-W-1 e PRSV-W-2, chegando a 100% em alguns casos. A infectividade da estirpe severa PRSV-W-C foi de 100% em todos os testes. Aparentemente, a infectividade das três estirpes fracas foi mais diretamente afetada pela intensidade de fricção das folhas no momento da inoculação mecânica do que pelas variáveis estudadas. A estirpe fraca PRSV-W-3 protegeu as plantas de melancia contra a infecção e/ou manifestação da estirpe PRSV-W-C em casa de vegetação. Em campo, todas as plantas de melancia premunizadas com as três estirpes fracas também ficaram protegidas contra a estirpe severa utilizada no desafio. A produção das plantas premunizadas não diferiu estatisticamente entre si, nem mesmo daquelas inicialmente sadias infectadas em campo. O conteúdo de açúcares e a aparência da polpa dos frutos também foram semelhantes em todos os tratamentos. / The purpose of this work was to evaluate the infectivity of three mild strains of Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) on watermelon (Citrullus lanatus). The effect of the origin of the mild strain, the concentration of the inoculum, the species of the source of the inoculum and the age of the test-plant on the infectivity of mechanically inoculated watermelon were also evaluated. The protective effect of these mild strains on preimmunized watermelon plants was evaluated under greenhouse and field conditions. Mild strains were selected from blisters formed on mosaic leaves of naturally infected watermelon plants. The infectivity of the selected mild strain was compared with that of mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2, which were previously obtained from blisters formed on mosaic leaves of zucchini squash (Cucurbita pepo cv. Caserta). A severe strain isolated from zucchini squash (PRSV-W-C) was used as control. The effect of the concentration and the species source of inoculum of the mild strains on the infectivity of watermelon plants was studied with inoculum extracted from 4, 8, 12 and 16 leaf discs of zucchini squash and watermelon plants, separately infected with the mild and severe strains, diluted in 2 mL of phosphate buffer. Four stages of development of watermelon plants, starting at the cotyledonal stage, were tested for the infectivity with the mild strains. Inocula were prepared with extracts of 12 leaf discs diluted in 2 mL of phosphate buffer. The protective effect of the mild strain selected from blisters on mosaic leaves of watermelon plants was evaluated on preimmunized plants challenge inoculated with severe strain PRSV-W-C, under greenhouse and field conditions. Watermelon plants preimmunized with mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2 and unprotected plants were also included in the field trial. Protection was evaluated based on plant simptons, yield and sugar content in the fruits. One mild strain, named PRSV-W-3, was obtained from blisters on mosaic leaves of watermelon plants. The rate of infection of watermelon plants with mild strain PRSV-W-3 was similar to that with mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2 in all infectivity tests, independently of the concentration of the inoculum, species source of the inoculum and stage of development of the inoculated test-plant, reaching 100% in some cases. Rate of infectivity with severe strain PRSV-W-C was always 100%. Apparently, the infectivity of the mild strains on watermelon was more directly related with the intensity of the abrasion produced by mechanical inoculation than with the above studied variables. The selected mild strain PRSV-W-3 protected watermelon plants against superinfection with the severe strain in the greenhouse tests. Protection was also effective under field conditions. Yield of plants preimmunized with all three mild strains and unprotected plants were statistically similar. The sugar content and the quality of the pulp of the fruits were similar for all treatments.

Este trabalho apresenta resultados da caracterização biológica, serológica e molecular de um potyvirus que causa mosqueado foliar em maracujazeiro e infecta, experimentalmente, plantas de abobrinha-de-moita (Cucurbita pepo cv. Caserta). Esse potyvirus foi inicialmente observado em extratos de folhas de maracujazeiro e em cortes ultra finos de tecidos infectados de abobrinha-de-moita, em microscopia eletrônica. Além de partículas alongadas, observaram-se inclusões lamelares do tipo catavento, características de espécies de vírus do gênero Potyvirus. Após purificação a partir de folhas de maracujazeiro com mosqueado, as partículas desse potyvirus foram dissociadas para a caracterização dos seus principais componentes. O RNA viral apresentou peso molecular de aproximadamente 10000 pb. O peso molecular da proteína da capa protéica foi de aproximadamente 32 kDa. Antissoro policlonal produzido em coelho reagiu com o antígeno homólogo, bem como com o Passion fruit woodiness virus (PWV), em teste de PTA-ELISA, mas não reagiu com dois potyvirus que infectam cucurbitáceas, Papaya ringspot virus - type W e Zucchini yellow mosaic virus. O antissoro contra o PWV reagiu com o potyvirus do mosqueado do maracujazeiro. Quando três isolados do potyvirus do mosqueado do maracujazeiro (M1, M2 e M3) foram inoculados em 37 espécies vegetais, juntamente com dois isolados do PWV (PWV-1 e PWV-2), constatou-se que todas as espécies infectadas pelos isolados do PWV também o foram com os isolados do potyvirus do mosqueado. Estes últimos, entretanto, também foram capazes de infectar sistemicamente plantas de abobrinha-de-moita cv. Caserta e de abóbora híbrida do tipo Tetsukabuto, o que não ocorreu com os isolados do PWV. Testes de transmissão do isolado M1 do potyvirus do mosqueado, por meio mecânico e com os afídeos Myzus persicae e Aphis gossypii, de plantas de maracujazeiro, abobrinha-de-moita, feijoeiro BT 2 e crotalária, para plantas das mesmas espécies foram positivos. No entanto, observou-se que a eficiência de transmissão foi influenciada pela planta fonte de inóculo. Quando a abobrinha-de-moita foi utilizada como fonte de inóculo, a transmissão só ocorreu para plantas-teste dessa espécie, independente do processo de inoculação. Testes de proteção entre os isolados do potyvirus do mosqueado e do PWV, em plantas de Crotalaria juncea, juntamente com a análise da seqüência de nucleotídeos do gene da capa protéica e da região terminal 3' não traduzida dos isolados M2 e M3, indicaram que o potyvirus do mosqueado é uma estirpe do PWV que ocorre em São Paulo. Análises moleculares comparativas com outras espécies de Potyvirus indicaram que tanto os isolados do potyvirus do mosqueado como os isolados do PWV têm alta identidade com o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV). Esse resultado corrobora relato anterior feito no país e aponta para a necessidade de uma alteração na nomenclatura da espécie do vírus que está freqüentemente associada ao endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Brasil. / This work presents results of the biological, serological and molecular characterization of a potyvirus that causes leaf mottling on passion fruit and infects some cucurbit plants experimentally. This potyvirus was initially observed in extracts of passion fruit leaves and in ultra thin sections of infected tissue of Cucurbita pepo L. cv. Caserta, examined in the electronic microscope. Besides flexuous filamentous particles, lamellar inclusions, characteristic of species of potyvirus, were observed in infected tissue. After purification from infected passion fruit leaves, virus particles were dissociated for the molecular characterization of their main components. The viral RNA showed a molecular weight of approximately 10000 bp. The molecular weight of the coat protein was nearly 32 kDa. Policlonal antibody, produced in rabbit, reacted with the homologous antigen, as well as with Passion fruit woodiness virus (PWV), in PTA-ELISA. No reaction was observed with Papaya ringspot virus - type W and Zucchini yellow mosaic virus, two potyviruses usually found infecting plants in the Cucurbitaceae family. The antibody against PWV reacted with the passion fruit mottling potyvirus. When three isolates of the passion fruit leaf mottling potyvirus (M1, M2 and M3) and two isolates of PWV were separately inoculated in 37 vegetable species, it was verified that all the species infected with the PWV isolates were also infected with the isolates of the passion fruit leaf mottling potyvirus. Isolates M1, M2 and M3, however, were also capable to infect systemically plants of zucchini squash cv. Caserta and hybrid squash Tetsukabuto, which were not infected with the PWV isolates. Transmission tests showed that the M1 isolate of passion fruit leaf mottling potyvirus was efficiently transmitted from infected plants of passion fruit, zucchini squash, Phaseolus vulgaris cv. BT 2 and Crotalaria juncea to plants of the same species by means of mechanical inoculation. Efficient transmission was also obtained when the aphids Myzus persicae and Aphis gossypii were used as vectors. However, the transmission efficiency was influenced by the plant source of inoculum. When zucchini squash was used as a source of inoculum, the transmission only occurred for plants of the same specie, independent of the method of inoculation. Cross protection tests with isolates of the passion fruit leaf mottling potyvirus and PWV, in plants of C. juncea, together with the analysis of the nucleotide sequences of the coat protein (CP) gene and the 3' non translated region (NTR) of the isolates M2 and M3, indicated that the leaf mottling potyvirus has high identity with the PWV present in São Paulo State. As compared with other species of the genus Potyvirus, isolates of both potyviruses showed high identity with the CP gene and 3' NTR of Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV). This result corroborates previous report regarding to the identity between Brazilian PWV isolates and CABMV and it points for the need of an alteration in the nomenclature of the virus species frequently associated to passion fruit woodiness in Brazil.

Plum pox virus (PPV) es miembro del género Potyvirus, causa la enfermedad de la sharka que tiene un serio impacto agrícola y económico sobre el cultivo de frutales de hueso. Puesto que la utilización de variedades resistentes es la estrategia más duradera y definitiva en la lucha contra virosis de plantas. El objetivo general de esta tesis doctoral sería evaluar la expresión de anticuerpos recombinantes específicos de proteínas de PPV para interferir o inmunomodular la infección viral y servir así como estrategia para obtener resistencia. Para ello se ha utilizado el fragmento de anticuerpo recombinante scFv2A (del inglés "single chain Fv variable fragment) que reconoce específicamente a la proteína NIb replicasa de PPV. Esta proteína se localiza principalmente en el núcleo de células de plantas infectadas, aunque su función de replicación, presumiblemente, tiene lugar en estructuras membranosas derivadas del retículo endoplásmico (RE) en el citoplasma. Se transformaron plantas de Nicotiana benthamiana con tres versiones del fragmento recombinante scFv2A dirigidas a diferentes compartimentos celulares. Una versión citosólica (scFv2A), una versión nuclear (NLS-scFv2A) y otra dirigida a membranas del RE (6K2-scFv2A) por la cara citosólica. Se obtuvieron diversas líneas transgénicas: líneas A, líneas N y líneas K transformadas respectivamente con las construcciones scFv2A, NLS-scFv2A y 6K2-scFv2A. Se realizaron ensayos independientes de desafío, mediante inoculación mecánica con extractos de plantas infectadas con virus o bien inoculando con un clon recombinante de PPV fusionado a GFP (PPV-GFP). Tras los ensayos, se comprobó que las plantas de las diversas líneas transgénicas de N. benthamiana que expresaban los fragmentos scFv2A, 6K2scFv2A o NLSscFv2A presentaban diferentes grados de protección frente a la infección por PPV. Además, se determinó que varias de las líneas transgénicas, tanto líneas A como K y N, presentaban porcentajes de infección significativamente m / Gil Capitán, MT. (2010). Inmunomodulación de la infección de Plum pox virus mediante la expresión estable y transitoria de anticuerpos recombinantes contra la NIb replicasa viral en plantas de Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34204 / Palancia