El factor de transcripción DBP1 de Nicotiana tabacum, es el primer miembro de una nueva familia de reguladores transcripcionales que poseen, además de capacidad de unión al ADN, actividad proteín-fosfatasa de tipo 2C. En este trabajo hemos abordado la caracterización funcional del factor regulador DBP1, determinando que su capacidad de unión al ADN reside en el motivo DNC, el cual se localiza en la región N-terminal de la proteína y está conservado entre las proteínas DBP de diferentes plantas mono y dicotiledóneas. Así mismo hemos llevado a cabo una búsqueda de factores proteicos que interaccionan con DBP1. Así, la isoforma G de la proteína 14-3-3 se presenta como el primer interactor de DBP1, comprometiendo en dicha interacción una zona del dominio N-terminal adyacente al motivo DNC. Mediante expresión transitoria en N. benthamiana hemos podido comprobar que la isoforma G de la 14-3-3 es capaz de promover la exclusión nuclear de DBP1, modificando la distribución núcleo-citoplasma que presenta en condiciones basales y participando así de manera indirecta en la regulación de genes diana de DBP1 como CEVI1. De los cuatro homólogos estructurales de DBP1 identificados en A. thaliana, AtDBP1 es el representante estructuralmente más semejante a DBP1 de tabaco. AtDBP1 mantiene la capacidad de unirse al ADN así como la actividad fosfatasa 2C característica de esta familia, y es capaz de interaccionar a través de su región N-terminal con la proteína GRF6, homóloga a la 14-3-3 G de tabaco. Con el objetivo de identificar dianas de AtDBP1 tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional para así averiguar los procesos biológicos en los que están implicados estos factores, se ha realizado un análisis proteómico comparativo entre plantas Col-0 y mutantes atdbp1 que ha puesto de manifiesto una baja acumulación de una de las isoformas del factor de inicio de la traducción 4E, eIF(iso)4E, en el mutante atdbp1. / Castelló Llopis, MJ. (2008). Identificación y caracterización de la familia de factores DBP, nuevos reguladores de la expresión génica en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6363 / Palancia

Tesis por compendio / [ES] Los virus de plantas poseen la capacidad de parasitar células vegetales y poner a su disposición la maquinaria celular de la planta para la síntesis de sus propias proteínas. Aprovechando esta capacidad, la ingeniería genética ha dirigido muchos de sus esfuerzos en la modificación del genoma viral para utilizar los virus de plantas como vectores de expresión de proteínas de interés humano. Los potyvirus son un grupo de virus de plantas ampliamente estudiado y utilizado en biotecnología. Su genoma está formado por un RNA de cadena sencilla que codifica, principalmente, una poliproteína que se procesa para dar aproximadamente 10 proteínas maduras. En diferentes posiciones intercistrónicas se pueden insertar cDNAs que codifican proteínas de interés, las cuales se producen junto al resto de productos de la poliproteína. Si además estos cDNAs se flanquean por secuencias que codifican los sitios de procesamiento específicos de las proteasas virales, las proteínas heterólogas se liberan eficientemente de la poliproteína viral. Así, la inserción de un cDNA correspondiente al factor de transcripción Rosea1 de la ruta de las antocianinas en distintos potyvirus resulta en la biosíntesis de estos compuestos en las células vegetales infectadas. Las antocianinas son compuestos flavonoides coloreados que se pueden observar a simple vista, por lo que la expresión de Rosea1 es una herramienta biotecnológica muy útil para seguir la infección de virus de plantas. En esta Tesis se han investigado diferentes aplicaciones biotecnológicas basadas en la expresión del factor de transcripción Rosea1 y la consecuente acumulación de antocianinas en el contexto de la biología de los potyvirus. Primero, se construyó un clon del virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) etiquetado con Rosea1 (ZYMV-Ros1). El ZYMV es capaz de replicarse a nivel local pero no de moverse a larga distancia en plantas de Nicotiana benthamiana. Un análisis de la infección por ZYMV-Ros1 en una serie de plantas transgénicas de N. benthamiana silenciadas en distintas RNasas de tipo Dicer (DCL) permitió profundizar en el conocimiento de los mecanismos defensivos de la planta frente a este virus. Los resultados indicaron que DCL4 está implicada en restringir el movimiento sistémico del virus, ya que en plantas con este gen silenciado el virus es capaz de moverse a larga distancia. Además, las antocianinas tienen un gran interés nutricional, farmacéutico e incluso industrial, por su gran actividad antioxidante. Un clon viral derivado del virus Y de la patata (PVY) que expresaba Rosea1 (PVY-Ros1) indujo la acumulación de más antocianinas que las que contienen frutas y verduras que son fuente rica de estos valiosos antioxidantes. Este mismo clon PVY-Ros1 también se utilizó para estudiar la transmisión del virus mediante áfidos vectores, observándose como estos provocan frecuentemente el inicio de la infección en el tejido vascular. Este mismo clon viral permitió mostrar visualmente el efecto antiviral que tienen las nanopartículas de plata en plantas. Por último, en esta Tesis se combinó el factor de transcripción Rosea1 con distintas proteasas de los potyvirus para crear circuitos lógicos de regulación génica en plantas. Se observó que la fusión de distintas proteínas virales, como la proteína de inclusión nuclear b (NIb) de los potyvirus o fragmentos de ella, al extremo carboxilo terminal de Rosea1 inhibía la actividad del factor de transcripción. Sin embargo, la acumulación de antocianinas se pudo restablecer insertando sitios de reconocimiento de proteasas virales entre ambas partes y coexpresando tales proteasas. La especificidad de corte y la eficiente actividad catalítica de las proteasas de inclusión nuclear a (NIaPro) del virus del grabado del tabaco (TEV) y del virus de las venas moteadas del tabaco (TVMV) permitió construir circuitos genéticos basados en regulación postranscripcional que son capaces de realizar algunas operaciones lógicas básicas (YES, OR y AND) en tejidos vegetales. / [CA] Els virus de plantes posseeixen la capacitat de parasitar cèl·lules vegetals i posar a la seva disposició la maquinària cel·lular de la planta per a la síntesi de les seves pròpies proteïnes. Aprofitant aquesta capacitat, l'enginyeria genètica ha dirigit molts dels seus esforços a la modificació del genoma viral per utilitzar els virus de plantes com a vectors d'expressió de proteïnes d'interès humà. Els potyvirus són un grup de virus de plantes àmpliament estudiat i utilitzat en biotecnologia. El seu genoma està format per un RNA de cadena senzilla que codifica, principalment, una poliproteïna que es processa per donar aproximadament 10 proteïnes madures. En diferents posicions intercistróniques es poden inserir cDNAs que codifiquen proteïnes d'interès, les quals es produeixen alhora amb la resta de productes de la poliproteïna. Si a més aquests cDNAs es flanquegen per seqüències que codifiquen els llocs de processament específics de les proteases virals, les proteïnes heteròlogues s'alliberen eficientment de la poliproteïna viral. Així, la inserció d'un cDNA corresponent al factor de transcripció Rosea1 de la ruta de les antocianines en diferents potyvirus resulta en la biosíntesi d'aquests compostos en les cèl·lules vegetals infectades. Les antocianines són compostos flavonoides colorits que es poden observar a simple vista, de manera que l'expressió de Rosea1 és una eina biotecnològica molt útil per seguir la infecció de virus de plantes. En aquesta Tesi s'han investigat diferents aplicacions biotecnològiques basades en l'expressió del factor de transcripció Rosea1 i la conseqüent acumulació d'antocianines en el context de la biologia dels potyvirus. Primer, es va construir un clon del virus del mosaic groc del carbassó (ZYMV) etiquetat amb Rosea1 (ZYMV-Ros1). El ZYMV és capaç de replicar-se a nivell local però no de moure's a llarga distància en plantes de Nicotiana benthamiana. Un anàlisi de la infecció per ZYMV-Ros1 en una sèrie de plantes transgèniques de N. benthamiana silenciades en diferents RNases de tipus Dicer (DCL) va permetre aprofundir en el coneixement dels mecanismes defensius de la planta front aquest virus. Els resultats van indicar que DCL4 està implicada en restringir el moviment sistèmic del virus, ja que en plantes amb aquest gen silenciat el virus és capaç de moure's a llarga distància. A més, les antocianines són objecte d'un gran interès nutricional, farmacèutic i fins i tot industrial, per la seva gran activitat antioxidant. Un clon viral derivat del virus Y de la patata (PVY) que expressava Rosea1 (PVY-Ros1) va induir l'acumulació de més antocianines que les que contenen fruites i verdures que són font rica d'aquests valuosos antioxidants. Aquest mateix clon PVY-Ros1 es va utilitzar per estudiar la transmissió del virus mitjançant àfids vectors, observant com aquests provoquen freqüentment l'inici de la infecció en el teixit vascular. Aquest mateix clon viral també va permetre mostrar visualment l'efecte antiviral que tenen les nanopartícules de plata en plantes. Finalment, en aquesta Tesi es va combinar el factor de transcripció Rosea1 amb diferents proteases dels potyvirus per crear circuits lògics de regulació gènica en plantes. Es va observar que la fusió de diferents proteïnes virals, com la proteïna d'inclusió nuclear b (NIb) dels potyvirus o fragments d'ella, a l'extrem carboxil terminal de Rosea1 inhibia l'activitat del factor de transcripció. No obstant això, l'acumulació d'antocianines es va poder restablir inserint llocs de reconeixement de les proteases virals entre les dues parts i coexpressant aquestes proteases. L'especificitat de tall i l'eficient activitat catalítica de les proteases d'inclusió nuclear a (NIaPro) del virus del gravat del tabac (TEV) i del virus de les venes clapejades del tabac (TVMV) va permetre construir circuits genètics basats en regulació postranscripcional que són capaços de realitzar algunes operacions lògiques bàsiques (YES, OR i AND) en teixits vegetals. / [EN] Plant viruses have the ability to parasitize plant cells and use the plant cellular machinery for the synthesis of their own proteins. Taking advantage of this capacity, genetic engineering has focused many of its efforts in modifying the viral genome in order to use modified plant viruses as expression vectors of proteins of human interest. These proteins are stored in host plants that act as low-cost and highly secure biofactories. Potyviruses are a group of plant viruses widely studied and used in biotechnology. Their genome consist of a single-stranded RNA that mainly encodes a polyprotein that is processed in approximately 10 mature proteins. cDNAs flanked by protease specific processing sequences can be inserted in different intercistronic positions and efficiently processed by the viral proteases to produce proteins of interest together with the rest of the viral polyprotein products. Thus, the insertion of the cDNA corresponding to the transcription factor Rosea1 of the anthocyanin pathway in different potyviruses results in the biosynthesis of these compounds in infected plant cells. Anthocyanins are colored flavonoid compounds that can be observed with the naked eye, and thus, the expression of Rosea1 is a very useful biotechnological tool to follow the infection of plant viruses. In this work, we provided different biotechnological applications based on the expression of this transcription factor and the consequent accumulation of anthocyanins in the context of potyvirus biology. First, a zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, genus Potyvirus) clone tagged with Rosea1 (ZYMV-Ros1) was constructed. ZYMV is able to replicate locally but not to move long distances in Nicotiana benthamiana plants. We analyzed the infection by ZYMV-Ros1 in a series of N. benthamiana transgenic plants in which the different Dicer-like (DCL) RNases were slilenced. The results showed that DCL4 is involved in restricting the systemic movement of the virus in N. benthamiana plants. This study allowed to deepen the knowledge of the defense mechanisms of the plant against this virus. Besides their biotechnological potential as markers of biological activities, anthocyanins have great nutritional, pharmaceutical and even industrial interest due to their high antioxidant activity. We found that a potato virus Y clone (PVY; genus Potyvirus) expressing Rosea1 (PVY-Ros1) induced the accumulation of a higher amount of anthocyanins than those contained in fruits and vegetables that are a rich source of these valuable antioxidants. The PVY-Ros1 clone was also used to study the transmission of the virus by aphid vectors. We observed that aphids frequently initiate infection in vascular tissue. This viral clone also allowed to visually show the antiviral effect of silver nanoparticles in plants. Finally, in this work, the Rosea1 transcription factor was combined with different potyvirus proteases to create genetic circuits in plants. We observed that the fusion of the nuclear inclusion protein b (NIb) of potyviruses, or fragments of it, to the carboxyl terminal end of Rosea1 inhibited the activity of the transcription factor. However, the accumulation of anthocyanins could be restored by inserting viral protease recognition sites in between NIb and Rosea1 and co-expressing those proteases. The cleavage specificity and the efficient catalytic activity of nuclear inclusion a proteases (NIaPro) of tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus) and tobacco spotted vein virus (TVMV; genus Potyvirus) allowed the construction of genetic circuits based on post-transcriptional regulation that are capable of performing some basic logical operations (YES, OR and AND) in plant tissues. / This work was supported by the Spanish Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) through grants BIO2014-54269-R and AGL2013-49919-EXP, and by the Greek Ministry for Education and Religious Affairs (Program Aristeia II, 4499, ViroidmiR; ESPA 2007-2013). This research was supported by the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Spain) grants AGL2013-49919-EXP, BIO2014-54269-R, BFU2015-66894-P and BIO2017-83184-R (co-financed FEDER funds) and by the Engineering and Physical Sciences Research Council and the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (UK) grant BB/M017982/1. / Cordero Cucart, MT. (2021). Aplicaciones del factor de transcripción Rosea1 de la ruta de las antocianinas como marcador visual en virología molecular y biotecnología de plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171455 / TESIS / Compendio

[ES] Las plantas están emergiendo como una alternativa atractiva a los sistemas convencionales de producción heteróloga, como bacterias, cultivos celulares de mamíferos, levaduras u hongos, para la síntesis de productos de alto valor, como metabolitos secundarios y proteínas. La demanda de estos productos a menudo se ve limitada por la capacidad de producción y los costos asociados. Sin embargo, utilizar las plantas como plataformas de producción ofrece ventajas en términos de accesibilidad económica, sostenibilidad, escalabilidad y la ausencia de patógenos humanos y de animales, lo que las convierte en una opción cada vez más atractiva. A pesar de las limitaciones en la capacidad de carga, la expresión génica transitoria utilizando vectores virales proporciona un método eficiente y reproducible para la producción de proteínas recombinantes en plantas, a diferencia de la transformación estable, que requiere más mano de obra y tiempo. Los vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (TMV), particularmente aquellos en los que el gen de la proteína de la cubierta viral (CP) se reemplaza principalmente por el gen de interés, son clásicos en la biotecnología vegetal y se utilizan con frecuencia para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. En este trabajo, nuestro primer objetivo fue optimizar un vector de TMV para mejorar la producción. La fusión traduccional del extremo amino-terminal de la CP del TMV con la proteína recombinante de interés mostró un aumento en la acumulación de la proteína verde fluorescente, interferón alfa-2a y un nanobody contra la proteína Spike del SARS-CoV-2 en hojas de Nicotiana benthamiana. La inserción de un sitio de clivaje específico, basado en las proteasas de inclusión nuclear (NIaPro) de dos potyvirus, junto con la expresión de las proteasas correspondientes, además de la producción de la proteína recombinante madura, aumentó aún más la acumulación de las proteínas recombinantes mencionadas anteriormente. En segundo lugar, nuestro objetivo fue establecer estrategias para producir proteínas recombinantes de interés industrial y farmacéutico en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. Logramos producir grandes cantidades de una xilanasa termofílica, activa en condiciones extremas de temperatura y pH alcalino, en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La enzima que se acumuló rápidamente en los tejidos de la planta se dirigió al apoplasto, lo que facilitó enormemente la purificación y evitó cualquier efecto adverso en el crecimiento de la planta. Se demostró que esta enzima producida en planta es útil para la producción de xilooligosacáridos probióticos. También produjimos grandes cantidades de una glucosa oxidasa (GOX) modificada en hojas de N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La GOX producida en planta, que también se purificó fácilmente a partir de fluidos apoplásticos, exhibió potentes propiedades antimicrobianas contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. / [CA] Les plantes están emergint com una alternativa atractiva als sistemes convencionals de producció heteròloga, com ara bacteries, cultius cel·lulars de mamífers, llevats o fongs, per a la síntesi de productes d'alt valor, com son metabòlits secundaris i proteïnes d'interés industrial i farmacéutic. La demanda d'aquests productes sovint es veu limitada per la capacitat de producció i els costos associats. No obstant això, utilitzar les plantes com a plataformes de producció ofereix avantatges en termes d'accessibilitat econòmica, sostenibilitat, escalabilitat i l'absència de patògens humans i animals, la qual cosa les converteix en una opció cada vegada més atractiva. Malgrat les limitacions en la capacitat de càrrega, l'expressió gènica transitoria mitjançant vectors virals proporciona un mètode eficient i reproducible per a la producció de proteïnes recombinants en plantes, a diferència de la transformació estable, que requereix més mà d'obra i temps. Els vectors derivats del virus del mosaic del tabac (TMV), particularment aquells en els quals el gen de la proteïna de la coberta viral (CP) és principalment reemplaçat pel gen d'interès, són clàssics en la biotecnologia vegetal i s'utilitzen sovint per a la producció a gran escala de proteïnes recombinants. En aquest treball, el nostre primer objectiu va ser optimitzar un vector de TMV per a millorar la producció. La fusió traduccional de l'extrem amino-terminal de la CP del TMV amb la proteïna recombinant d'interès va mostrar un augment en l'acumulació de la proteïna verda fluorescent, interferó alfa-2a i un nanobody contra la proteïna Spike del SARS-CoV-2 en fulles de Nicotiana benthamiana. La inserció d'un lloc de tall específic, basat en les proteases d'inclusió nuclear (NIaPro) de dos potivirus, juntament amb l'expressió de les proteases corresponents, a més de la producció de la proteïna recombinant madura, va augmentar encara més l'acumulació de les proteïnes recombinants esmentades anteriorment. En segon lloc, el nostre objectiu va ser establir estratègies per a produir proteïnes recombinants d'interés industrial i farmacèutic en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. Vam aconseguir produir grans quantitats d'una xilanasa termofílica, activa en condicions extremes de temperatura i pH alcalí, en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. El enzim que es va acumular ràpidament en els teixits de la planta es va dirigir a l'apoplast, la qual cosa va facilitar enormement la purificació i va evitar qualsevol efecte advers en el creixement de la planta. Es va demostrar que aquesta enzima produïda en planta és útil per a la producció de xilooligosacàrids probiòtics. També vam produir grans quantitats d'una glucosa oxidasa (GOX) modificada en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. La GOX produïda en planta, que també es va purificar fàcilment a partir de fluids apoplàstics, va exhibir potents propietats antimicrobianes contra Staphylococcus aureus i Escherichia coli. / [EN] Plants are emerging as an attractive alternative to conventional heterologous production systems, including bacteria, mammalian cell cultures, yeast, or fungi, for the synthesis of high-value products, such as secondary metabolites and proteins. The demand for these products is often limited by production capacity and associated costs. However, using plants as production platforms offers advantages in terms of affordability, sustainability, scalability, and the absence of human and livestock pathogens, making them an increasingly appealing choice. Despite limitations in cargo capacity, transient gene expression using viral vectors provides an efficient and reproducible method for producing recombinant proteins in plants, unlike stable transformation, which is more labor- intensive and time-consuming. Vectors derived from tobacco mosaic virus (TMV), particularly those in which the viral coat protein (CP) gene is mostly replaced with the gene of interest, are classic in plant biotechnology and frequently use for large-scale production of recombinant proteins. In this work, we first aimed to optimize a TMV vector to improve production. Translational fusion of the amino- terminal end of TMV CP to the recombinant protein of interest led to increased accumulation of the green fluorescent protein, interferon alfa-2a and a nanobody against the Spike protein of SARS-CoV-2 in Nicotiana benthamiana leaves. Insertion of a specific cleavage site, based on the nuclear inclusion a proteases (NIaPro) form two potyviruses, along expression of the cognate proteases led to, in addition to production of the mature recombinant protein, a further increase in the accumulation of the aforementioned recombinant proteins. Second, we aimed to set up strategies to produce recombinant proteins of industrial and pharmaceutical interest in N. benthamiana using a TMV vector. We successfully produced large amounts of a thermophilic xylanase, active under extreme temperature and alkaline pH conditions, in N.benthamiana using a TMV vector. The enzyme that accumulated rapidly in plant tissues was targeted the apoplast, which enormously facilitated purification, and avoided any adverse effect on plant growth. This plant-made enzyme was shown to be useful for the production of probiotic xylooligosaccharides. We also produced large amounts of an engineered glucose oxidase (GOX) in N. benthamiana leaves using a TMV vector. The plant-made GOX that was also easily purified from apoplastic fluids exhibited potent antimicrobial properties against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. / This work was supported Generalitat Valenciana, grant INNEST/2021/7 from Agència Valenciana de la Innovació, and by grant PID2020-114691RB-I00 from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación, through the Agencia Estatal de Investigación (co-financed European Regional Development Fund), and by the Bio Based Industries Joint Undertaking, under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program (Project WOODZYMES, Grant Agreement H2020-BBI- JU-792070). M.N.-S. is the recipient of a predoctoral contract from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (PRE2018-084771). / Nicolau Sanus, M. (2023). Production of Recombinant Proteins with Pharmaceutical and Industrial Applications in Plants Using a Tobacco Mosaic Virus-Derived Vector [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/200381

Tesis por compendio / [ES] La biotecnología de plantas actual, y la llamada agricultura molecular aspiran a convertir las plantas en "biofábricas" sostenibles para producir compuestos de valor como proteínas, metabolitos o nanopartículas de interés farmacéutico o industrial. Los virus de plantas constituyen una de las principales causas de enfermedades vegetales. Son capaces de secuestrar la maquinaria celular del huésped, y de ahí surgió la idea de reconvertir los virus de plantas en herramientas para la biotecnología de plantas como vectores de expresión transitoria y andamios para nanomateriales. Los carotenoides son metabolitos relevantes debido a sus propiedades nutricionales y beneficiosas para la salud. El primer objetivo fue manipular la ruta de biosíntesis de carotenoides para producir los muy apreciados apocarotenoides de azafrán, siendo estos los productos de la escisión de carotenoides. Para ello, se diseñó un vector derivado del virus del grabado del tabaco (TEV; género Potyvirus) manipulado para expresar unas enzimas específicas, dioxigenasas de escisión de carotenoides (CCD) de Crocus sativus y Buddleja davidii. Los análisis metabólicos de los tejidos infectados demostraron que, tras sólo dos semanas, se alcanzaron cantidades notables de crocinas y picrocrocina en plantas adultas de Nicotiana benthamiana. Sólo la expresión de CsCCD2L de C. sativus dio una acumulación en hoja de 0.2% de crocinas y 0.8% de picrocrocina en peso seco. La coexpresión de CsCCD2L con otra enzima carotenogénica, como la fitoeno sintasa de Pantoea ananatis (PaCrtB), usando el mismo vector aumentó la acumulación de crocinas al 0.35%. Pese a ser cantidades inferiores a las encontradas en fuentes naturales, este sistema mediado por virus representa el primer sistema heterólogo capaz de producir crocinas. Los compuestos fenólicos son otro amplio grupo de metabolitos secundarios en plantas muy apreciados también. Los curcuminoides son polifenoles con alta actividad antioxidante que se encuentran naturalmente en el rizoma de la cúrcuma (Curcuma longa). El segundo objetivo fue establecer un sistema para la producción heteróloga de curcuminoides utilizando vectores virales. Para ello, se desarrolló un sistema viral doble, basado en TEV y en el virus X de la patata (PVX; género Potexvirus), capaz de coexpresar diferentes enzimas biosintéticas en las mismas células. Este sistema se usó para expresar la dicétido-CoA sintasa 1 (DCS1) y la curcumina sintasa 3 (CURS3) de C. longa en plantas de N. benthamiana. El análisis metabólico confirmó la producción exitosa de curcuminoides usando dos vectores virales. Posteriormente se analizó la coexpresión de DCS1 y CURS3 usando un solo vector viral derivado de TEV, obteniendo una producción más eficiente, aumentando al doble la acumulación de curcumina. Tras un análisis temporal usando el vector TEVΔN-DCS1-CURS3, se vio que a los 11 días se lograba una acumulación máxima de 22 ± 4 µg/g peso seco. Las nanopartículas virales (VNP) también han atraído la atención en biotecnología por su uso potencial como componentes básicos para nuevos materiales en nanotecnología y medicina. Los nanoanticuerpos son los dominios variables de los anticuerpos de camélidos de sólo cadena pesada (VHH) que han ganado interés como moléculas terapéuticas por su estructura simple, tamaño pequeño y alta especificidad. El último objetivo de este trabajo fue producir VNPs decoradas con un nanoanticuerpo codificadas genéticamente. El virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV; género Potyvirus) y TEV se utilizaron como andamios para producir VNPs decoradas con un nanoanticuerpo contra la proteína verde fluorescente en plantas de calabacín y N. benthamiana, respectivamente. Confirmándose el ensamblaje y unión de ambas VNPs contra GFP. En conjunto, el trabajo presentado en esta tesis contribuye al concepto de que los virus de plantas, convenientemente manipulados, pueden convertirse en poderosas herramientas en biotecnología vegetal y agricultura molecular. / [CA] La biotecnologia de plantes actual i la anomenada agricultura molecular aspiren a convertir les plantes en "biofàbriques" sostenibles per a produir compostos de valor com a proteïnes, metabòlits o nanopartícules d'interès farmacèutic o industrial. Els virus de plantes constitueixen una de les principals causes de malalties vegetals. Son capaços de segrestar la maquinària cel·lular de l'hoste, i d'ací va sorgir la idea de reconvertir els virus en eines per la biotecnologia de plantes com a vectors d'expressió transitòria i bastides per a nanomaterials. Els carotenoides són metabòlits rellevants a causa de les seues propietats nutricionals i beneficioses per a la salut. El primer objectiu va ser manipular la ruta de biosíntesi de carotenoides per a produir els valuosos apocarotenoides de safrà, sent aquests els productes de l'escissió de carotenoides. Per a això, es va dissenyar un vector derivat del virus del gravat del tabac (TEV; gènere Potyvirus) manipulat per a expressar uns enzims específics, dioxigenases d'escissió de carotenoides (CCD) de Crocus sativus i Buddleja davidii. Les anàlisis metabòliques dels teixits infectats van demostrar que, després de només dues setmanes, es van aconseguir quantitats notables de crocines i picrocrocina en plantes adultes de Nicotiana benthamiana. Només l'expressió de CsCCD2L de C. sativus va donar com a resultat una acumulació en fulla de 0.2% de crocines i 0.8% de picrocrocina en pes sec. La coexpressió de CsCCD2L amb un altre enzim carotenogènic, com la fitoé sintasa de Pantoea ananatis (PaCrtB), usant el mateix vector viral va augmentar l'acumulació de crocines al 0.35%. Malgrat ser quantitats inferiors a les trobades en fonts naturals, aquest sistema mediat per virus representa el primer sistema heteròleg capaç de produir crocines. Els compostos fenòlics són un altre ampli grup de metabòlits secundaris en plantes, també molt valuosos. Els curcuminoides són polifenols amb alta activitat antioxidant que es troben naturalment en el rizoma de la cúrcuma (Curcuma longa). El segon objectiu va ser establir un sistema per a la producció heteròloga de curcuminoides utilitzant vectors virals. Per a això, es va desenvolupar un sistema viral doble, basat en TEV i en el virus X de la creïlla (PVX; gènere Potexvirus, família Alphaflexiviridae), capaç de coexpressar diferents enzims biosintètics en les mateixes cèl·lules. Aquest sistema es va usar per a expressar la dicétid-CoA sintasa 1 (DCS1) i la curcumina sintasa 3 (CURS3) de C. longa en plantes de N. benthamiana. L'anàlisi metabòlica va confirmar la producció reeixida de curcuminoides. Posteriorment es va analitzar la coexpresió de DCS1 i CURS3 usant un sol vector viral derivat de TEV, obtenint una producció més eficient, augmentant al doble l'acumulació de curcumina. Una anàlisi temporal usant el vector TEVΔN-DCS1-CURS3 va mostrar que als 11 dies s'aconseguia una acumulació màxima de 22 ± 4 µg/g pes sec. Les nanopartícules virals (VNP) també han atret l'atenció en biotecnologia pel seu ús potencial com a components bàsics per a nous materials en nanotecnologia i medicina. Els nanoanticossos són els dominis variables dels anticossos de camèlids de només cadena pesada (VHH) que han guanyat interès com a molècules terapèutiques per la seua estructura simple, grandària xicoteta i alta especificitat. L'últim objectiu d'aquest treball va ser produir VNPs decorades amb un nanoanticos codificades genèticament. El virus del mosaic groc de la carabasseta (ZYMV; gènere Potyvirus) i TEV es van utilitzar com a bastides per a produir VNPs decorades amb un nanocos contra la proteïna verda fluorescent en plantes de carabasseta i N. benthamiana, respectivamente. Confirmant-se l'assemblatge i unió de les VNPs contra GFP. En conjunt, el treball presentat en aquesta tesi contribueix al concepte que els virus de plantes, convenientment manipulats, poden convertir-se en poderoses eines en biotecnologia vegetal i agricultura molecular. / [EN] Modern plant biotechnology and molecular farming aim to convert plants into sustainable 'biofactories' to produce valuable compounds as proteins, metabolites or nanoparticles of pharmaceutical or industrial interest. Plant viruses, constitute a major cause of plant diseases inducing devastating crop losses. Based on their ability to hijack the host cell machinery, it arose the idea of repurposing plant viruses from foes to friends into tools for plant biotechnology as transient expression vectors and scaffolds for nanomaterials. Carotenoids are relevant metabolites based on their nutritional and health-promoting properties. The first goal of this work was to manipulate the carotenoid biosynthesis pathway to produce highly appreciated saffron apocarotenoids. For this purpose, a vector derived from Tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus, family Potyviridae) was engineered to express specific carotenoid cleavage dioxygenase (CCD) enzymes from Crocus sativus and Buddleja davidii. Metabolic analyses of infected tissues demonstrated that, after only two weeks, remarkable amounts of crocins and picrocrocin in adult Nicotiana benthamiana plants were reached. The sole virus-driven expression of C. sativus CsCCD2L resulted in an accumulation of 0.2% of crocins and 0.8% of picrocrocin in leaf dry weight (DW). Co-expression of CsCCD2L with another carotenogenic enzyme, such as Pantoea ananatis phytoene synthase (PaCrtB), using the same viral vector increased crocin accumulation to 0.35%. Although these amounts are still far from those accumulating in natural sources, such as saffron stigma, this virus-driven system represents the first heterologous system able to produce crocins. Phenolic compounds represent another broad group of plant secondary metabolites highly appreciated for their health promoting properties. Curcuminoids are polyphenols with high antioxidant activity that are naturally found in turmeric (Curcuma longa) rhizome. The second goal of this work was to establish a system for the heterologous production of curcuminoids using viral vectors. To this aim, a double-virus vector system, based on TEV and Potato virus X (PVX; genus Potexvirus, family Alphaflexiviridae), able to co-express different biosynthetic enzymes in the same cells was developed. This system was used to express C. longa diketide-CoA synthase 1 (DCS1) and curcumin synthase 3 (CURS3) in N. benthamiana plants. Metabolic analysis confirmed the successful production of curcuminoids. Curcumin quantification indicated that sequential inoculation of both viral vectors was more efficient than co-inoculation. Co-expression of DCS1 and CURS3 was next analysed using a single viral vector derived from TEV (TEVΔN-DCS1-CURS3). This resulted in a more efficient approach as it led to a 2-fold increase in curcumin accumulation (11.7 ± 1.5 µg/g DW). A time-course analysis using the TEVΔN-DCS1-CURS3 vector showed that a maximum accumulation of 22 ± 4 µg/g DW was achieved at 11 days post-inoculation. Viral nanoparticles (VNPs) have also attracted attention in biotechnology for their potential use as building blocks for novel materials in nanotechnology and medicine. Nanobodies are the variable domains of heavy-chain (VHH) camelid antibodies that have sparked interest as therapeutic molecules due to their simple structure, small size and high specificity. The last goal of this work was to produce genetically encoded VNPs decorated with a nanobody. Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; genus Potyvirus, family Potyviridae) and TEV were used as scaffolds to produce VNPs decorated with a nanobody against the green fluorescent protein in zucchini (Cucurbita pepo) and N. benthamiana plants, respectively. Assembly and binding functionality of both VNPs against GFP was confirmed. Altogether, the work presented in this thesis contribute to the concept that plant viruses, conveniently manipulated, can turn into powerful tools in plant biotechnology and molecular farming. / This work was supported by grants BIO2016-77000-R, PID2020-114691RB-I00 and BIO2017-83184-R from the Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (co-financed European Union FEDER funds). M.M. was the recipient of a predoctoral fellowship from the Spanish Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (FPU16/05294). / Martí Botella, MC. (2022). Plant-Based Production of Metabolites and Nanoparticles Using Potyvirus Vectors [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/187155 / TESIS / Compendio

A vinca (Catharanthus roseus) é uma planta perene, arbustiva, pertencente à família Apocinaceae, cujas folhas e raízes possuem propriedades medicinais. A presença de sintoma de mosaico e deformação foliar em plantas dessa espécie, associados com a presença de partículas alongadas e flexuosas, característica de vírus pertencentes ao gênero Potyvirus, conduziu a estudos complementares para a identificação e caracterização desse vírus. No estudo da gama parcial de hospedeiras foram testadas 28 espécies, envolvendo oito famílias botânicas. Catharanthus roseus e Nicotiana benthamiana apresentaram sintomas de mosaico foliar e Chenopodium amaranticolor e C. quinoa apresentaram lesões locais cloróticas nas folhas inoculadas. A transmissão do vírus com afídeos foi avaliada com as espécies Aphis gossypii, Myzus nicotianae e Toxoptera citricidus. Apenas Aphis gossypii e Myzus nicotianae transmitiram o vírus. O antissoro policlonal produzido contra este potyvirus reagiu com o vírus homólogo e com o Passionfruit woodiness virus (PWV) e Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), mas não com o Lettuce mosaic virus (LMV), Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W), Potato virus Y (PVY) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). O peso molecular da proteína capsidial (CP) foi de aproximadamente 34 kDa. A reação de PCR realizada com os oligonucleotídeos universais de potyvirus e oligonucleotídeos específicos posteriomente confeccionados amplificaram três fragmentos de aproximadamente 0,8, 1,0 e 1,4 Kb, os quais após o seqüênciamento geraram um fragmento de 1654 nucleotídeos (nt) da região 3' terminal do genoma, que inclui parte do gene da replicase viral (Nib), a região codificadora completa do gene da proteína capsidial (CP), seguida de 286 nt da região 3' não traduzida (3'NTR). A identidade da seqüência de nucleotídeos do gene da CP variou de 67,0 a 76,0%, quando comparada com as de outros membros da família Potyviridae. A maior identidade foi com o Omphalodes virus Y (76,0%). A identidade dos aminoácidos deduzidos da proteína capsidial variou de 62,0 a 71,0%, sendo a maior com East Asian Passiflora virus (71%). Para a região não traduzida (3'NTR) a identidade variou de 16,8 a 28,6%. Em conjunto esses dados indicam que este vírus é uma nova espécie dentro do gênero Potyvirus, para o qual se propõe o nome de Vírus do mosaico do Catharanthus (Catharanthus mosaic virus - CatMV). / Catharanthus roseus is known as the common periwinkle or Madagascar periwinkle. It is a perennial, evergreen herb in the family Apocynaceae, which was originally native to the island of Madagascar, although both name and classification are contradictory in some literature. The plants grow up to 80 cm high; have glossy, dark green leaves and bloom during summer. The flowers range from white to hot pink to purple. The species has historically been used in popular medicine to treat a wide assortment of human diseases, as it contains more than 150 useful alkaloids. Plants of C. roseus exhibiting mosaic symptoms followed by malformation of the leaf blades and flower variegation were collected from a garden at the University of São Paulo, School of Agriculture (Piracicaba, State of São Paulo, Brazil). Preliminary electron microscopy exams of negatively stained leaf sap revealed that the symptoms were associated with potyvirus-like particles. The objective of the present work was to obtain further biological, immunological and molecular data to better characterize this species of the genus Potyvirus, family Potyviridae. Of 28 plant species from eight botanical families inoculated mechanically with this potyvirus, only C. roseus and Nicotiana benthamiana developed systemic mosaic, whereas Chenopodium amaranticolor and C. quinoa exhibited only chlorotic local lesions. The virus was transmitted by Aphis gossypii and Myzus nicotianae, but not by Toxoptera citricidus. Polyclonal antiserum raised against this potyvirus reacted with the homologous virus, Passion fruit woodiness virus (PWV) and Cowpea aphid borne mosaic virus (CABMV) in PTA-ELISA. The molecular mass of the coat protein (CP) was approximately 34 kDa. RT-PCR from viral RNA amplified a fragment of approximately 1654 nucleotides (nt) at the 3'-terminal of the viral genome, containing portion of the replicase gene (Nib), the entire CP gene and the 3' untranslated region (3'UTR) (286 nt). When the nucleotide sequence of the CP gene was compared with other members of the Potyviridae family, identities varied from 67.0 to 76.0%. The highest identity was with Omphalodes virus Y. Identity of the deduced amino acid of the CP varied from 62.0 to 71.0%, with the highest for East Asian Passiflora virus. For the 3' UTR, identities varied from 16.8 to 28.6%. The name Catharanthus mosaic virus (CatMV) is proposed for this new potyvirus.

Les résistances génétiques permettent une lutte efficace contre les maladies des plantes cultivées mais sont limitées par les capacités d'évolution des bioagresseurs ciblés. Chez le piment, le fonds génétique peut améliorer la durabilité de la résistance au PVY conférée par le gène majeur pvr23. L'objectif de ma thèse était de caractériser les facteurs génétiques de l'hôte conditionnant la durabilité du gène majeur en répondant aux questions suivantes : (i) Quels sont leurs actions sur l'évolution des populations virales ? (ii) Correspondent-ils aux QTL (quantitative trait loci) de résistance partielle ? (iii) Sont-ils répandus au sein des ressources génétiques du piment ? Différentes expérimentations incluant des tests de résistances, d'évolution expérimentale et de compétition entre différents variants viraux, ont montré que les facteurs du fonds génétique augmentant la durabilité de pvr23 agissaient en : (i) diminuant la concentration virale dans la plante, (ii) en réduisant les probabilités de mutations du PVY vers le contournement du gène pvr23 et (iii) en ralentissant la sélection des variants viraux contournants. La détection de QTL et la cartographie des facteurs génétiques affectant la fréquence de contournement de pvr23 (QTL de durabilité) a mis en évidence quatre régions du génome du piment qui, par des effets additifs ou épistatiques, expliquent 70% de la variabilité phénotypique observée. La cartographie comparée montre que trois des quatre QTL de durabilité co-localisent avec des QTL affectant la résistance partielle, suggérant que les QTL de résistance partielle ont un effet pléiotropique sur la durabilité d'un gène majeur de résistance. L'étude d'une collection de 20 accessions de piment, porteuses de pvr23 ou pvr24(allèle très proche de pvr23) dans des fonds génétiques variés, a montré que les fonds génétiques favorables à la durabilité de ces allèles de résistance sont fréquents dans les ressources génétiques du piment. Ces résultats mettent en évidence que la durabilité d'un gène majeur de résistance peut-être fortement augmentée lorsqu'il est associé à des facteurs génétiques réduisant la multiplication du pathogène. De plus, la fréquence de contournement du gène majeur s'est révélée être un caractère très héritable (h²=0.87) et la détection de QTL affectant ce caractère est possible. La sélection directe pour de tels QTL est donc envisageable et ouvre de nouvelles perspectives pour préserver la durabilité des gènes majeurs de résistance utilisés en sélection variétale.

Prior to the commencement of this project, few plant viruses had been identified from Vietnam despite virus-like symptoms being commonly observed on many crops and weeds. In limited surveys in the late 1990's, preliminary evidence was obtained indicating that potyviruses and geminiviruses were causing significant diseases. As a result, this study was aimed at developing generic PCR-based methods for the rapid detection of viruses belonging to viruses in the families Potyviridae and Geminiviridae in plant samples collected from Vietnam, and to characterise the viruses at the molecular level. Novel degenerate PCR primers were developed for the identification of begomoviruses. Using these primers, 17 begomoviruses species infecting seven crop and nine weed species in Vietnam were identified and characterised. Sequence analyses showed that ten of the viruses (six monopartite and four bipartite) were new species. Of the seven previously characterized begomoviruses, five were identified in Vietnam for the first time. Additionally, eight DNA-ß and three nanovirus-like DNA-1 molecules were also found associated with the monopartite viruses. Five of the DNA-β molecules were putatively novel. Two novel bipartite begomoviruses, named Corchorus yellow vein virus (CoYVV) and Corchorus golden mosaic virus (CoGMV), were isolated from jute plants. Analysis of these viruses showed that they were more similar to New World begomoviruses than to viruses from the Old World. This was based on the absence of an AV2 open reading frame, the presence of an N-terminal PWRLMAGT motif in the coat protein and phylogenetic analysis of the DNA A and DNA B nucleotide and deduced amino acid sequences. This is the first known occurrence of Old World viruses bearing features of New World viruses, and their presence in Vietnam suggests the presence of a &quotNew World" virus in the Old World prior to Gondwana separation. Other interesting features relating to begomoviruses identified in Vietnam were; (i) the detection of several recombination events, particularly between the newly identified Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), and the previously characterised, Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), (ii) the identification of new natural hosts of Sida leaf curl virus (SiLCV), Papaya leaf curl China virus (PaLCuCNV) and Alternanthera yellow vein virus (AlYVV), (iii) the first report of variation in the geminivirus stem-loop nonanucleotide sequence (CoGMV sequence was TATTATTAC rather than TAATATTAC) and (iv) the first report of different stem sequences in the stem-loop structure of two genomic components from a bipartite begomovirus, Kudzu mosaic virus (KuMV). The sequence and phylogenetic analyses of the begomoviruses and begomovirus-associated DNAs identified in this study suggested that South East Asia, and Vietnam in particular, may be a centre of begomovirus diversity. Two pairs of degenerate primers, designed in the CI gene (CIFor/CIRev) and HC-Pro gene (HPFo/HPRev), were developed for the detection of viruses in the genus Potyvirus. Using these primers, three novel potyviruses from Vietnam were detected, namely Telosma mosaic virus (TelMV) infecting telosma (Telosma cordata), Peace lily mosaic virus (PeLMV) infecting peace lily (Spathiphyllum patinii) and Wild tomato mosaic virus (WTMV) infecting wild tomato (Solanum torvum). The fragments amplified by the two sets of primers enabled additional PCR and complete genomic sequencing of these three viruses and a Banana bract mosaic virus (BBrMV) isolate from the Philippines. All four viruses shared genomic features typical of potyviruses. Sequence comparisons and phylogenetic analyses indicated that WTMV was most closely related to Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) and Pepper veinal mottle virus (PVMV) while PeLMV, TelMV were related to different extents with members of the BCMV subgroup. The incidence of potyviruses infecting plants in Vietnam was investigated using the potyvirus-specific primers. Fifty two virus isolates from 13 distinct potyvirus species infecting a broad range of crops were identified in Vietnam by PCR and sequence analysis of the 3' region of the genome. The viruses were Bean common mosaic virus (BCMV), Potato virus Y (PVY), Sugarcane mosaic virus (SCMV), Sorghum mosaic virus (SrMV), Chilli veinal mottle virus (ChiVMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Leek yellow stripe virus (LYMV), Shallot yellow stripe virus (SYSV), Onion yellow dwarf virus (OYDV), Turnip mosaic virus (TuMV), Dasheen mosaic virus (DsMV), Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) and a novel potyvirus infecting chilli, which was tentatively named Chilli ringspot virus (ChiRSV). With the exception of BCMV and PVY, this is first report of these viruses in Vietnam. Further, rabbit bell (Crotalaria anagyroides) and typhonia (Typhonium trilobatum) were identified as new natural hosts of the Peanut stunt virus (PStV) strain of BCMV and of DsMV, respectively. Sequence and phylogenetic analyses, based on the nucleotide sequence of the entire CP-coding region of all 52 virus isolates, revealed considerable variability in BCMV, SCMV, PVY, ZYMV and DsMV. The phylogenetic analyses also suggested the possible presence of ancestral groups of BCMV, SCMV and ZYMV in Vietnam.

A vinca (Catharanthus roseus) é uma planta perene, arbustiva, pertencente à família Apocinaceae, cujas folhas e raízes possuem propriedades medicinais. A presença de sintoma de mosaico e deformação foliar em plantas dessa espécie, associados com a presença de partículas alongadas e flexuosas, característica de vírus pertencentes ao gênero Potyvirus, conduziu a estudos complementares para a identificação e caracterização desse vírus. No estudo da gama parcial de hospedeiras foram testadas 28 espécies, envolvendo oito famílias botânicas. Catharanthus roseus e Nicotiana benthamiana apresentaram sintomas de mosaico foliar e Chenopodium amaranticolor e C. quinoa apresentaram lesões locais cloróticas nas folhas inoculadas. A transmissão do vírus com afídeos foi avaliada com as espécies Aphis gossypii, Myzus nicotianae e Toxoptera citricidus. Apenas Aphis gossypii e Myzus nicotianae transmitiram o vírus. O antissoro policlonal produzido contra este potyvirus reagiu com o vírus homólogo e com o Passionfruit woodiness virus (PWV) e Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), mas não com o Lettuce mosaic virus (LMV), Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W), Potato virus Y (PVY) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). O peso molecular da proteína capsidial (CP) foi de aproximadamente 34 kDa. A reação de PCR realizada com os oligonucleotídeos universais de potyvirus e oligonucleotídeos específicos posteriomente confeccionados amplificaram três fragmentos de aproximadamente 0,8, 1,0 e 1,4 Kb, os quais após o seqüênciamento geraram um fragmento de 1654 nucleotídeos (nt) da região 3' terminal do genoma, que inclui parte do gene da replicase viral (Nib), a região codificadora completa do gene da proteína capsidial (CP), seguida de 286 nt da região 3' não traduzida (3'NTR). A identidade da seqüência de nucleotídeos do gene da CP variou de 67,0 a 76,0%, quando comparada com as de outros membros da família Potyviridae. A maior identidade foi com o Omphalodes virus Y (76,0%). A identidade dos aminoácidos deduzidos da proteína capsidial variou de 62,0 a 71,0%, sendo a maior com East Asian Passiflora virus (71%). Para a região não traduzida (3'NTR) a identidade variou de 16,8 a 28,6%. Em conjunto esses dados indicam que este vírus é uma nova espécie dentro do gênero Potyvirus, para o qual se propõe o nome de Vírus do mosaico do Catharanthus (Catharanthus mosaic virus - CatMV). / Catharanthus roseus is known as the common periwinkle or Madagascar periwinkle. It is a perennial, evergreen herb in the family Apocynaceae, which was originally native to the island of Madagascar, although both name and classification are contradictory in some literature. The plants grow up to 80 cm high; have glossy, dark green leaves and bloom during summer. The flowers range from white to hot pink to purple. The species has historically been used in popular medicine to treat a wide assortment of human diseases, as it contains more than 150 useful alkaloids. Plants of C. roseus exhibiting mosaic symptoms followed by malformation of the leaf blades and flower variegation were collected from a garden at the University of São Paulo, School of Agriculture (Piracicaba, State of São Paulo, Brazil). Preliminary electron microscopy exams of negatively stained leaf sap revealed that the symptoms were associated with potyvirus-like particles. The objective of the present work was to obtain further biological, immunological and molecular data to better characterize this species of the genus Potyvirus, family Potyviridae. Of 28 plant species from eight botanical families inoculated mechanically with this potyvirus, only C. roseus and Nicotiana benthamiana developed systemic mosaic, whereas Chenopodium amaranticolor and C. quinoa exhibited only chlorotic local lesions. The virus was transmitted by Aphis gossypii and Myzus nicotianae, but not by Toxoptera citricidus. Polyclonal antiserum raised against this potyvirus reacted with the homologous virus, Passion fruit woodiness virus (PWV) and Cowpea aphid borne mosaic virus (CABMV) in PTA-ELISA. The molecular mass of the coat protein (CP) was approximately 34 kDa. RT-PCR from viral RNA amplified a fragment of approximately 1654 nucleotides (nt) at the 3'-terminal of the viral genome, containing portion of the replicase gene (Nib), the entire CP gene and the 3' untranslated region (3'UTR) (286 nt). When the nucleotide sequence of the CP gene was compared with other members of the Potyviridae family, identities varied from 67.0 to 76.0%. The highest identity was with Omphalodes virus Y. Identity of the deduced amino acid of the CP varied from 62.0 to 71.0%, with the highest for East Asian Passiflora virus. For the 3' UTR, identities varied from 16.8 to 28.6%. The name Catharanthus mosaic virus (CatMV) is proposed for this new potyvirus.

Tesis por compendio / [ES] La evolución experimental nos permite comprobar postulados teóricos y realizar observaciones que ayuden a incrementar nuestro conocimiento sobre la evolución. Este trabajo tiene como objetivo estudiar la evolución de los virus utilizando enfoques experimentales. Los virus muestran una alta capacidad de evolución, lo que los convierte en modelos perfectos para abordar cuestiones evolutivas con bastante rapidez. Los procesos subyacentes a la evolución y adaptación de los patógenos se rigen por muchos factores: desde la naturaleza intrínseca del virus hasta componentes ambientales que afectan al hospedador, al patógeno y la interacción entre ambos. En esta tesis utilizamos un patosistema formado por una planta y un potyvirus (virus de (+)ssRNA) para explorar cómo diferentes factores bióticos y abióticos modulan la evolución del virus. Primero, exploramos los efectos biológicos de las mutaciones en una proteína del potyvirus, la cual es un componente esencial del complejo de replicación viral. Revelamos las limitaciones evolutivas que operan sobre esta proteína, y que son consecuencia de un equilibrio evolutiva entre la acumulación dentro del huésped y la gravedad de los síntomas. En segundo lugar, examinamos los efectos de la estructura genética de la población del huésped sobre la evolución del virus: evolucionamos virus en poblaciones genéticamente homogéneas de plantas con diferentes susceptibilidades a la infección y en una población heterogénea. Con este trabajo ilustramos cómo la diversidad genética de huéspedes en un ecosistema afecta la adaptación del virus, ya que los virus se especializaron más rápidamente en poblaciones homogéneas pero fueron más patógenos en poblaciones heterogéneas. Finalmente, estudiamos el impacto del ambiente sobre la interacción virus-planta. Para esta parte, primero revisamos los posibles efectos beneficiosos de la infección por virus en ciertos entornos hostiles para la planta. Posteriormente estudiamos el efecto de la sequía, una condición ambiental con una incidencia cada vez mayor y que se sabe afecta la fisiología del huésped. Por lo tanto, evolucionamos un virus en huéspedes bajo condiciones de sequía o de riego abundante. Los virus adaptados en condiciones de sequía conferían una mayor tolerancia a la sequía a la planta huésped a través de alteraciones específicas en la expresión génica del huésped y la señalización hormonal. En general, esta tesis contribuye al aumento del conocimiento en biología evolutiva de los virus de ARN de plantas. / [CA] L'evolució experimental ens permet comprovar postulats teòrics i realitzar observacions que ajuden a incrementar el nostre coneixement sobre l'evolució. Aquest treball té com a objectiu estudiar l'evolució dels virus utilitzant enfocaments experimentals. Els virus mostren una alta capacitat d'evolució, la qual cosa els converteix en models perfectes per a abordar qüestions evolutives amb bastant rapidesa. Els processos subjacents a l'evolució i adaptació dels patògens es regeixen per molts factors: des de la naturalesa intrínseca del virus fins a components ambientals que afecten l'hoste, al patogen i la interacció entre tots dos. En aquesta tesi utilitzem un patosistema format per una planta i un potyvirus (virus de (+)ssRNA) per a explorar com diferents factors biòtics i abiòtics modulen l'evolució del virus. Primer, explorem els efectes biològics de les mutacions en una proteïna del potyvirus, la qual és un component essencial del complex de replicació viral. Revelem les limitacions evolutives que operen sobre aquesta proteïna, i que són conseqüència d'un equilibri evolutiva entre l'acumulació dins de l'hoste i la gravetat dels símptomes. En segon lloc, examinem els efectes de l'estructura genètica de la població de l'hoste sobre l'evolució del virus: evolucionem virus en poblacions genèticament homogènies de plantes amb diferents susceptibilitats a la infecció i en una població heterogènia. Amb aquest treball il·lustrem com la diversitat genètica d'hostes en un ecosistema afecta l'adaptació del virus, ja que els virus es van especialitzar més ràpidament en poblacions homogènies però van ser més patògens en poblacions heterogènies. Finalment, estudiem l'impacte de l'ambient sobre la interacció virus-planta. Per a aquesta part, primer revisem els possibles efectes beneficiosos de la infecció per virus en uns certs entorns hostils per a la planta. Posteriorment estudiem l'efecte de la sequera, una condició ambiental amb una incidència cada vegada major i que se sap afecta la fisiologia de l'hoste. Per tant, evolucionem un virus en hostes sota condicions de sequera o de reg abundant. Els virus adaptats en condicions de sequera conferien una major tolerància a la sequera a la planta hoste a través d'alteracions específiques en l'expressió gènica de l'hoste i la senyalització hormonal. En general, aquesta tesi contribueix a l'augment del coneixement en biologia evolutiva dels virus d'ARN de plantes. / [EN] Experimental evolution allows us to test theoretical postulates and make observations that help increase our knowledge about Evolution. This work aims to use experimental approaches to study the evolution of viruses. Viruses have a high degree of evolvability, which makes them perfect subjects to address evolutionary questions quite rapidly. The underlying processes of pathogen evolution are governed by many factors. These factors can be affecting the virus adaptation at different levels: from the intrinsic virus nature to environmental factors affecting the host, the pathogen and the interaction between both. In this thesis, we used a pathosystem formed by a plant and a potyvirus (+ssRNA virus). Using this pathosystem we have explored how different factors modulate the virus evolution. First, we explored the biological effects of mutations in a potyvirus protein that is an essential component of the virus replication complex. We unveiled the evolutionary constraints on this viral protein, with an evolutionary tradeoff between within-host accumulation and severity of symptoms. Second, we examined the effects of the host population genetic structure on virus evolution: we evolved viruses in homogeneous populations of plants with different viral susceptibilities and in a heterogeneous population. With this work we illustrated how the genetic diversity of hosts in an ecosystem affects virus adaptation, as viruses specialized faster in homogeneous populations but were more pathogenic in heterogeneous ones. Finally, we studied the impact of the environment. For this part we first reviewed the possible beneficial effects of virus infection under certain environments. Afterwards we studied the effect of drought, an environmental condition with a predicted increased incidence and known to affect the host physiology. Therefore, we evolved a virus in host under either well-watered or drought conditions. The viruses adapted under drought conditions conferred an increased drought tolerance to the host plant through specific alterations in host gene expression and hormonal signaling. Overall, this thesis contributed to the increase in knowledge in evolutionary biology of plant RNA viruses. / González Miguélez, R. (2021). Virus Adaptation at Different Levels: Study on the Evolutionary Effects of Mutations, Host Population Genetic Structure and Environmental Factors in Potyviruses [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/178154 / TESIS / Compendio

Les plantes sont des organismes immobiles qui doivent répondre et s’adapter à des contraintes abiotiques et biotiques. Parmi les stress biotiques, les maladies virales, établies ou émergentes, peuvent être responsables de pertes de rendement majeures aux conséquences économiques importantes. Face aux phytovirus la lutte génétique constitue le moyen de lutte le plus efficace, le plus respectueux de l’environnement et du consommateur. Comprendre l’interaction entre les plantes et les virus reste indispensable pour rechercher de nouvelles sources de résistances. Ce travail de thèse s’intéresse à l’étude du pathosystème naturel Arabidopis thaliana/Turnip mosaic virus (TuMV). Les essais ont été menés majoritairement en conditions extérieures permettant une analyse de l’interaction dans un environnement multistress. La réponse d’A. thaliana a été explorée par l’étude de traits liés à la maladie et par la variation en métabolites primaires et secondaires. Ce travail a permis i) de caractériser de façon fine la réponse d’A. thaliana au TuMV en conditionsmultistress en exploitant la diversité naturelle d’une population mondiale et française ii) de déterminer l’architecture génétique de cette interaction par des approches de génétique d’association et de QTL mapping. Plusieurs nouveaux loci potentiellement impliqués dans la réponse ont été identifiés iii) de montrer l’intérêt du phénotypage métabolique pour discriminer les accessions en fonction de leur sensibilité au TuMV. La multidisciplinarité des approches constitue la richesse de ce travail de thèse qui contribue à une meilleure caractérisation et compréhension de la réponse des plantes lors d’une infection virale. / Plants are immobile organisms which have to adapt to abiotic and biotic constraints. Among bioticstress, established or emerging viral diseases, may be responsible for major yield losses withsignificant consequences. Genetic control is the most effective, environmentally and consumerfriendlyway to control viral infections. Understanding plant/virus interactions remains essential tosearch for new sources of resistance. This work, focuses on the study of the natural pathosystemArabidopsis thaliana/Turnip mosaic virus (TuMV). Most of the trials were conducted in commongarden conditions allowing the analysis of the interaction in a multistress environment. A. thaliana’sresponse was explored through the study of disease-related traits and the variations in primary andsecondary metabolites. This work allows i) the fine characterization of A. thaliana’s response toTuMV in multistress conditions through the exploration of the natural diversity of a world and Frenchpopulation ii) to determine the genetic architecture of this interaction by genome wide associationsand QTL mapping. Several new loci potentially involved in the response have been identified iii) tohighlight the interest of metabolic phenotyping to discriminate accessions according to theirsusceptibility to TuMV. The multidisciplinary approaches contribute to a better characterization andunderstanding of plant-virus interaction.