Die Komposition der Skelettmuskulatur resultiert aus der fein abgestimmten Balance von Proteinauf- und Abbaumechanismen. Die Skelettmuskelatrophie kann in verschiedenen Situationen entstehen bzw. von diversen Krankheiten ausgelöst werden (Altern, Hunger, Krebs, Nervenschädigung, Kachexie) und ist meist die Folge von gesteigertem Proteinabbau, der die Proteinsynthese überwiegt. Der Muskelabbau ist physiologisch teilweise sinnvoll und dient der Notversorgung von lebenswichtigen Organen mit Lipiden, Aminosäuren und Glukose. Insgesamt ist eine funktionsfähige Muskulatur sehr wichtig, sowohl für Gesunde als auch Erkrankte, da bei Muskelatrophie auslösenden Erkrankungen das Gesamtüberleben wesentlich verringert ist und die Lebensqualität der Patienten enorm reduziert ist. Der Abbau von strukturellen Muskelproteinen wurde hauptsächlich dem Ubiquitin-Proteasom System zugeschrieben, dessen Regulation und von seinen einzelnen Enzymen muss genauestens verstanden sein, um in der Zukunft zielgerichtete Therapien entwickeln zu können. Eines der zentralen Enzyme in der Skelett- und Herzmuskelatrophie ist die E3 Ubiquitin Ligase MuRF1. In nahezu allen Modellen für Muskelatrophie wurde eine starke Zunahme der Expression von MuRF1 beschrieben. Betrachtet man die sehr zentrale Rolle von MuRF1 im UPS, dort vermittelt MuRF1 den Abbau von strukturellen Proteinen des Sarkomers, und der beobachteten starken Regulation bei diversen Atrophie-Modellen, wird klar, wie wichtig das Verständnis der transkriptionellen Regulation von MuRF1 selbst ist. In den letzten Jahren wurden bereits einige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die an der Regulation von MuRF1 bei verschiedenen Atrophie-Modellen beteiligt sind, die Studien zeigten aber auch, dass noch nicht alle Modelle erklärt werden konnten. Um die verbleibenden Wissenslücken zu füllen, wurde in dieser Studie nach neuen transkriptionellen Regulatoren von MuRF1 gesucht und deren Beteiligung an bereits bekannten Signalwegen analysiert. / Skeletal muscle mass is permanently balanced as a result of fine tuned protein synthesis and degradation mechanisms. Skeletal muscle atrophy occurs when protein degradation exceeds protein synthesis, which happens in a variety of conditions, such as aging, starvation, cancer, cachexia or denervation. Degradation of muscle mass can sometimes be useful, e.g. as source for lipids, amino acids and glucose in case of critical malnutrition as well as several other physiological conditions. But a solid composition and thereby functional maintenance of muscles is necessary for healthy individuals as well as individuals suffering from atrophy releasing diseases as to retain their mobility and to preserve full heart functions. Since degradation of structural proteins in muscle tissue has been addressed mainly to the ubiquitin-proteasome-system, the regulation of the participating components needs to be understood in detail to develop constructive treatments and therapies for atrophy prevention. One of the key enzymes in skeletal and heart muscle atrophy is the E3 ubiquitin ligase MuRF1. Its expression levels and protein content was found to be elevated in almost every know atrophy model. MuRF1 is very critical for the muscles composition and thus their functional integrity, as it marks and initiates degradation of structural and contractile proteins via the UPS. Since MuRF1 plays a prominent role in muscle atrophy, its transcriptional regulation needs to be well understood to develop effective therapies for all the different atrophy models MuRF1 has been linked to. Several transcription factors have been identified to regulate MuRF1 at different ratios and in diverse atrophy models. Importantly, they do not explain all MuRF1 inducing events observed. To fill some of the remaining knowledge gaps, the studies aims were to find new transcriptional regulators for MuRF1 and to analyze potential involvements of the obtained candidates in pathways affecting skeletal muscle atrophy.

Germ-line mutations in the breast cancer susceptibility gene BRCA1 strongly increase the risk of developing breast and ovarian cancer in women. Different hypothesis have been proposed to explain this tissue specificity. One of the most argued hypothesis is the one that proposes a link between BRCA1 and ovarian hormones' action. Much data have been published in the last years pointing to an important role of progesterone receptor (PR) in inducing normal mammary development and also breast cancer formation. This study aimed to search for a functional relationship between BRCA1 and PR in breast cancer cells. We have found that BRCA1 inhibits the transcriptional activity of PR. We have investigated in more detail the mechanism of this effect. BRCA1 and PR interact in vivo in a ligand-independent fashion. Most importantly, BRCA1 alters the ligand-independent and dependent degradation of PR protein through its ubiquitination and this might have a direct effect on the level of PR recruitment on regulated promoters. BRCA1 is recruited to the hormone-responsive regions of PR-target genes and affects the presence of histone deacetylase activity and the level of monoubiquitinated histone H2A, linking BRCA1 action with chromatin status. These findings support a connection between BRCA1, the principal tumour suppressor responsible for familial breast cancer, and the progesterone receptor transcriptional activity. This relationship can be hypothesized to be reflected in the BRCA1-related breast tumourigenesis. / Mutaciones germinales en el gen breast cancer susceptibility gene BRCA1 aumentan altamente el riesgo de padecer cáncer de mama y ovario en mujeres. Se han propuesto diferentes hipótesis para explicar esta especificidad de tejido. Una de las hipótesis más argumentadas es la que propone una relación entre BRCA1 y la acción de las hormonas ováricas. En los últimos años se han publicado numerosos datos señalando al papel esencial del receptor de progesterona (PR) en la inducción del desarrollo normal de la mama y en la formación del cáncer de mama. Este estudio pretendía buscar una relación funcional entre BRCA1 y PR en células de cáncer de mama. Hemos demostrado que BRCA1 inhibe la actividad transcripcional de PR. Hemos investigado en más detalle el mecanismo de este efecto. BRCA1 y PR interaccionan in vivo de una manera independiente de ligando. Y lo que es más, BRCA1 altera la degradación independiente y dependiente de ligando de PR a través de su ubiquitinización y esto podría tener un efecto directo en el nivel de reclutamiento de PR en promotores regulados. BRCA1 es reclutado a las regiones de respuesta a hormona de genes diana de PR y afecta la presencia de actividad histona desacetilasa y el nivel de histona H2A monoubiquitinada, estableciendo un enlace entre la acción de BRCA1 y el estado de la cromatina. Estos hallazgos apoyan una conexión entre BRCA1, el principal supresor de tumor responsable del cáncer de mama hereditario, y la actividad transcripcional del receptor de progesterona. Se puede hipotetizar que esta relación se ve reflejada en el proceso de tumorigénesis BRCA1-dependiente.

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Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind die häufigste Todesursache in Deutschland. Eine gestörte Funktion des Gefäßendothels spielt bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen eine Schlüsselrolle. Das Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung ist bei Diabetikern stark erhöht. Der Transkriptionsfaktor COUP-TFII spielt eine essentielle Rolle im Glukosemetabolismus. Gleichzeitig ist er für die Differenzierung von Endothelzellen von großer Bedeutung. Für die Differenzierung und Aufrechterhaltung des arteriellen und venösen Phänotyps von Endothelzellen sind dabei maßgeblich der NOTCH-Signalweg und insbesondere die Transkriptionsfaktoren HEY2 (arteriell) und COUP-TFII (venös) verantwortlich. Gesteigerte Glukosespiegel könnten somit Auswirkungen auf die Differenzierung von Endothelzellen haben und damit einen neuen Mechanismus für das erhöhte Risiko von Gefäßerkrankungen bei Diabetikern darstellen. Im Rahmen der Arbeit konnte die exklusive Expression von COUP-TFII im Zellkern von humanen venösen Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane arterielle Endothelzellen zeigten keine Expression von COUP-TFII. Außerdem konnte im Rahmen der Arbeit erstmals die spezifische Expression von COUP-TFII in humanen Endothelzellen der Koronararterie nachgewiesen werden. Die Untersuchung der COUP-TFII Promotoraktivität konnte das Expressionsmuster von COUP-TFII bestätigen. Der Promotor zeigte sowohl in den venösen Endothelzellen der humanen Nabelschnur als auch in den humanen Endothelzellen der Koronararterie Aktivität. Die kurzzeitige Stimulation von venösen Endothelzellen mit Glukose führte zu einem starken Anstieg der COUP-TFII Expression. Eine Translokation von COUP-TFII aus dem Zellkern in das Zytoplasma konnte nicht nachgewiesen werden. Die Langzeitstimulation führte interessanterweise zu einer Verminderung der COUP-TFII Expression und zu einer Erhöhung der Expression von E-Selektin. In beiden Fällen zeigte sich keine Beeinträchtigung der Expression durch Insulin. Die durchgeführten Untersuchungen schließen eine Beteiligung des AKT-Signalweges an der Regulation aus. Es zeigte sich jedoch, dass humane venöse Endothelzellen als Insulin-sensitives Gewebe mit funktionsfähigem AKT-Signalweg einzustufen sind. Stimulationsversuche mit L-Glukose zeigten keine Regulation der COUP-TFII Expression. Eine osmotische Wirksamkeit der hohen Glukosekonzentration auf die Expression von COUP-TFII konnte somit ausgeschlossen werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors konnte einen Glukose-sensitiven Bereich innerhalb des COUP-TFII Promotors identifizieren. Weiterhin konnte die Repression der Aktivität des COUP-TFII Promotors durch Hypoxie nachgewiesen werden. Eine der wichtigen Aufgaben von Endothelzellen ist die von der endothelialen NO-Synthase (eNOS) katalysierte Bildung von Stickstoffmonoxid (NO). NO hemmt die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin. Eine verringerte NO-Produktion hat die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion zur Folge. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Erhöhung der eNOS Expression nach Verminderung der Expression von COUP-TFII in humanen venösen Endothelzellen gezeigt werden. Diese könnte die Ursache für die Verminderung der E-Selektin Expression nach Herabregulation von COUP-TFII sein. Durch die Anwendung einer Plattenkegel-Viskometer-Apparatur konnte gezeigt werden, dass die NO-Abgabe entscheidend von den Strömungsbedingungen und Scherkräften abhängig ist. Die Stimulation arterieller Endothelzellen mit laminarer oder oszillatorischer Schubspannung führte zu einer Erhöhung der NO-Abgabe. Turbulente Schubspannung zeigte dagegen keinen Einfluss auf die NO-Abgabe. Durch Überexpression von COUP-TFII in Kombination mit laminarer Schubspannung wurde die NO-Abgabe weiter gesteigert. Die gezeigte direkte Regulation der HEY2 und COUP-TFII Promotoraktivität durch geänderte Strömungsbedingungen spielt in diesem Prozess möglicherweise eine bedeutende Rolle. Die beschriebene Regulation von COUP-TFII durch Glukose in Endothelzellen könnte eine neue Erklärung für die gesteigerte Rate an Gefäßerkrankungen von Typ2-Diabetikern darstellen. Bei der Regulation der endothelialen NO-Synthase und E-Selektin durch COUP-TFII handelt es sich möglicherweise um einen neuen, anti-adhäsiven Feedback-Mechanismus, der zur Verringerung der Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen und damit zur Gefäßprotektion beitragen könnte. Die differentielle Expression der arteriellen Markergene HEY2 und CD44 konnte in humanen venösen und arteriellen Endothelzellen gezeigt werden. Die Untersuchung der Expression von FOXC1 legt nahe, dass es sich bei diesem Transkriptionsfaktor ebenfalls um ein in Endothelzellen arteriovenös differentiell exprimiertes Gen handelt. Die differentielle Exprimierung von HEY2 in Endothelzellen konnte auf transkriptioneller Ebene zusätzlich durch ein HEY2 Promotor Funktionsassay gezeigt werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Induktion der endogenen Expression der NOTCH-Zielgene HEY1 und HEY2 in HEK 293T Zellen. In dem Zelltyp durchgeführte Reportergenassays zeigten ebenfalls eine deutliche Aktivierung des HEY2 Promotors durch die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne. Durch eine Deletionsanalyse konnte der Bereich, der für die Aktivierung verantwortlichen DNA-Sequenz-Motive stark eingegrenzt werden. Weiterhin konnte die Induktion des HEY2 Promotors durch VEGF und seine Repression durch einen γ-Sekretase Inhibitor nachgewiesen werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Verringerung der mRNA- und Protein-Expression von COUP-TFII in HEK 293T Zellen. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch ein COUP-TFII Promotor Aktivitätsassay nach Überexpression des NOTCH-Zielgens HEY2 gezeigt werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors lässt eine direkte Inhibition von COUP-TFII durch HEY2 vermuten. Die Überexpression von COUP-TFII führte zu einer starken Induktion der COUP-TFII mRNA- und Protein-Expression, jedoch weder in HEK 293T Zellen noch in Endothelzellen zu einer Änderung der HEY2 Promotoraktivität. Die Überexpression von FOXC1 und FOXC2 bewirkte eine Inhibition der HEY2 Promotoraktivität in HEK 293T Zellen. Die in der Arbeit gezeigte hohe Expression von FOXC1 in venösen Endothelzellen könnte somit in Kombination mit COUP-TFII für die komplette Repression der Aktivität des HEY2 Promotors in venösen Endothelzellen verantwortlich sein. Die durchgeführte Deletionsanalyse des HEY2 Promotors legt eine direkte Bindung von FOXC1 und FOXC2 an den HEY2 Promotor nahe. Die erzielten Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Kontext mit der Literatur für eine zelltypspezifische Regulierung/Aktivierung des NOTCH-Signalweges und lassen folgendes Modell zur Differenzierung des venösen oder arteriellen endothelialen Phänotyps vermuten: Die Determinierung des Phänotyps wird entschieden durch das Gleichgewicht der Expression der Interaktionspartner des NOTCH-Signalweges. Der VEGF Co-Rezeptor NRP1 und der VEGFR2 sind die entscheidenden Aktivatoren des NOTCH-Signalweges. Die Balance der Bindung des Repressors COUP-TFII an den NRP1 und VEGFR2 Promotor sowie des Aktivatorkomplexes NICD/RBP-JК an den NRP1 Promotor sind damit entscheidend für die Aktivität des NOTCH-Signalweges. NRP1 bindet VEGF und steigert gleichzeitig dessen Bindung an den VEGFR2. Dies führt zur Induktion von DLL4. Die Bindung von DLL4 an die NOTCH1/4 Rezeptoren führt zur Abspaltung der NOTCH intrazellulären Domäne (NICD) des Rezeptors. Die NICD wandert in den Zellkern und aktiviert dort zusammen im Komplex mit dem Transkriptionsfaktor RBP-JК die Gene HEY1, HEY2 und NRP1. Die Transkriptionsfaktoren HEY1 und HEY2 reprimieren über einen Feedback-Mechanismus direkt die Aktivität des COUP-TFII Promotors.

OBJECTIVE/ METHOD The study examined implementation challenges faced by primary health care workers within the Ekurhuleni Metropolitan Municipality in Gauteng South Africa. Data collection was based on semi-structured interviews carried out on a purposive sample (n=19) of frontline clinicians working within the district as primary health care practitioners. RESULTS Participants confirmed that work within the primary health care service disproportionately focussed on curative and rehabilitative functions of their roles with little prioritisation of preventive and promotive interventions. Primary identified reasons included, institutional culture that prioritised short-term curative approaches. Clinicians also cited a range of other organisational barriers, such as – poor strategic planning, and a lack of understanding of health promotion and illness prevention. CONCLUSIONS Although the challenges that exist in implementing primary health care are clearly understood, clinicians perceive the solutions for these as being within the control of policy makers and those with power within the organisation. / Health Studies / M.A. (Public Health)

Inherited metabolic disorders (IMD) form a diverse group of several hundred different diseases with a relatively high cumulative incidence (stated up to 1:600). They are associated with accumulation of the substrates and lack of the products in specific metabolic pathways, which is caused by deficiency of the enzyme or its activator, or dysfunction of the transport protein. However, the underlying cause is at the DNA level. The grounds for different phenotype manifestation in patients with the same genotype are often not known. During my work at the Institute of Inherited Metabolic Disorders, I designed several new methods for the research of IMD and applied them in the patients and their families. I created procedures for the isolation of lysosomal membranes that are used for the research of lysosomal storage disorders and general properties of lysosomes. Next, I introduced several novel assays for determination of the X-inactivation ratio, which led to a significant increase of informative women. Nowadays, we use these methods in heterozygous women with X-linked diseases in order to study the influence of X-inactivation on the manifestation of the diseases. The cases of a girl with mucopolysaccharidosis type II, a girl with OTC deficiency and a family with the mutation in HPRT1 gene are described...

Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind die häufigste Todesursache in Deutschland. Eine gestörte Funktion des Gefäßendothels spielt bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen eine Schlüsselrolle. Das Risiko einer kardiovaskulären Erkrankung ist bei Diabetikern stark erhöht. Der Transkriptionsfaktor COUP-TFII spielt eine essentielle Rolle im Glukosemetabolismus. Gleichzeitig ist er für die Differenzierung von Endothelzellen von großer Bedeutung. Für die Differenzierung und Aufrechterhaltung des arteriellen und venösen Phänotyps von Endothelzellen sind dabei maßgeblich der NOTCH-Signalweg und insbesondere die Transkriptionsfaktoren HEY2 (arteriell) und COUP-TFII (venös) verantwortlich. Gesteigerte Glukosespiegel könnten somit Auswirkungen auf die Differenzierung von Endothelzellen haben und damit einen neuen Mechanismus für das erhöhte Risiko von Gefäßerkrankungen bei Diabetikern darstellen. Im Rahmen der Arbeit konnte die exklusive Expression von COUP-TFII im Zellkern von humanen venösen Endothelzellen nachgewiesen werden. Humane arterielle Endothelzellen zeigten keine Expression von COUP-TFII. Außerdem konnte im Rahmen der Arbeit erstmals die spezifische Expression von COUP-TFII in humanen Endothelzellen der Koronararterie nachgewiesen werden. Die Untersuchung der COUP-TFII Promotoraktivität konnte das Expressionsmuster von COUP-TFII bestätigen. Der Promotor zeigte sowohl in den venösen Endothelzellen der humanen Nabelschnur als auch in den humanen Endothelzellen der Koronararterie Aktivität. Die kurzzeitige Stimulation von venösen Endothelzellen mit Glukose führte zu einem starken Anstieg der COUP-TFII Expression. Eine Translokation von COUP-TFII aus dem Zellkern in das Zytoplasma konnte nicht nachgewiesen werden. Die Langzeitstimulation führte interessanterweise zu einer Verminderung der COUP-TFII Expression und zu einer Erhöhung der Expression von E-Selektin. In beiden Fällen zeigte sich keine Beeinträchtigung der Expression durch Insulin. Die durchgeführten Untersuchungen schließen eine Beteiligung des AKT-Signalweges an der Regulation aus. Es zeigte sich jedoch, dass humane venöse Endothelzellen als Insulin-sensitives Gewebe mit funktionsfähigem AKT-Signalweg einzustufen sind. Stimulationsversuche mit L-Glukose zeigten keine Regulation der COUP-TFII Expression. Eine osmotische Wirksamkeit der hohen Glukosekonzentration auf die Expression von COUP-TFII konnte somit ausgeschlossen werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors konnte einen Glukose-sensitiven Bereich innerhalb des COUP-TFII Promotors identifizieren. Weiterhin konnte die Repression der Aktivität des COUP-TFII Promotors durch Hypoxie nachgewiesen werden. Eine der wichtigen Aufgaben von Endothelzellen ist die von der endothelialen NO-Synthase (eNOS) katalysierte Bildung von Stickstoffmonoxid (NO). NO hemmt die Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin. Eine verringerte NO-Produktion hat die Ausbildung einer endothelialen Dysfunktion zur Folge. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Erhöhung der eNOS Expression nach Verminderung der Expression von COUP-TFII in humanen venösen Endothelzellen gezeigt werden. Diese könnte die Ursache für die Verminderung der E-Selektin Expression nach Herabregulation von COUP-TFII sein. Durch die Anwendung einer Plattenkegel-Viskometer-Apparatur konnte gezeigt werden, dass die NO-Abgabe entscheidend von den Strömungsbedingungen und Scherkräften abhängig ist. Die Stimulation arterieller Endothelzellen mit laminarer oder oszillatorischer Schubspannung führte zu einer Erhöhung der NO-Abgabe. Turbulente Schubspannung zeigte dagegen keinen Einfluss auf die NO-Abgabe. Durch Überexpression von COUP-TFII in Kombination mit laminarer Schubspannung wurde die NO-Abgabe weiter gesteigert. Die gezeigte direkte Regulation der HEY2 und COUP-TFII Promotoraktivität durch geänderte Strömungsbedingungen spielt in diesem Prozess möglicherweise eine bedeutende Rolle. Die beschriebene Regulation von COUP-TFII durch Glukose in Endothelzellen könnte eine neue Erklärung für die gesteigerte Rate an Gefäßerkrankungen von Typ2-Diabetikern darstellen. Bei der Regulation der endothelialen NO-Synthase und E-Selektin durch COUP-TFII handelt es sich möglicherweise um einen neuen, anti-adhäsiven Feedback-Mechanismus, der zur Verringerung der Leukozyten-Adhäsion an Endothelzellen und damit zur Gefäßprotektion beitragen könnte. Die differentielle Expression der arteriellen Markergene HEY2 und CD44 konnte in humanen venösen und arteriellen Endothelzellen gezeigt werden. Die Untersuchung der Expression von FOXC1 legt nahe, dass es sich bei diesem Transkriptionsfaktor ebenfalls um ein in Endothelzellen arteriovenös differentiell exprimiertes Gen handelt. Die differentielle Exprimierung von HEY2 in Endothelzellen konnte auf transkriptioneller Ebene zusätzlich durch ein HEY2 Promotor Funktionsassay gezeigt werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Induktion der endogenen Expression der NOTCH-Zielgene HEY1 und HEY2 in HEK 293T Zellen. In dem Zelltyp durchgeführte Reportergenassays zeigten ebenfalls eine deutliche Aktivierung des HEY2 Promotors durch die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne. Durch eine Deletionsanalyse konnte der Bereich, der für die Aktivierung verantwortlichen DNA-Sequenz-Motive stark eingegrenzt werden. Weiterhin konnte die Induktion des HEY2 Promotors durch VEGF und seine Repression durch einen γ-Sekretase Inhibitor nachgewiesen werden. Die Überexpression der NOTCH1 intrazellulären Domäne führte zur Verringerung der mRNA- und Protein-Expression von COUP-TFII in HEK 293T Zellen. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch ein COUP-TFII Promotor Aktivitätsassay nach Überexpression des NOTCH-Zielgens HEY2 gezeigt werden. Die Deletionsanalyse des COUP-TFII Promotors lässt eine direkte Inhibition von COUP-TFII durch HEY2 vermuten. Die Überexpression von COUP-TFII führte zu einer starken Induktion der COUP-TFII mRNA- und Protein-Expression, jedoch weder in HEK 293T Zellen noch in Endothelzellen zu einer Änderung der HEY2 Promotoraktivität. Die Überexpression von FOXC1 und FOXC2 bewirkte eine Inhibition der HEY2 Promotoraktivität in HEK 293T Zellen. Die in der Arbeit gezeigte hohe Expression von FOXC1 in venösen Endothelzellen könnte somit in Kombination mit COUP-TFII für die komplette Repression der Aktivität des HEY2 Promotors in venösen Endothelzellen verantwortlich sein. Die durchgeführte Deletionsanalyse des HEY2 Promotors legt eine direkte Bindung von FOXC1 und FOXC2 an den HEY2 Promotor nahe. Die erzielten Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Kontext mit der Literatur für eine zelltypspezifische Regulierung/Aktivierung des NOTCH-Signalweges und lassen folgendes Modell zur Differenzierung des venösen oder arteriellen endothelialen Phänotyps vermuten: Die Determinierung des Phänotyps wird entschieden durch das Gleichgewicht der Expression der Interaktionspartner des NOTCH-Signalweges. Der VEGF Co-Rezeptor NRP1 und der VEGFR2 sind die entscheidenden Aktivatoren des NOTCH-Signalweges. Die Balance der Bindung des Repressors COUP-TFII an den NRP1 und VEGFR2 Promotor sowie des Aktivatorkomplexes NICD/RBP-JК an den NRP1 Promotor sind damit entscheidend für die Aktivität des NOTCH-Signalweges. NRP1 bindet VEGF und steigert gleichzeitig dessen Bindung an den VEGFR2. Dies führt zur Induktion von DLL4. Die Bindung von DLL4 an die NOTCH1/4 Rezeptoren führt zur Abspaltung der NOTCH intrazellulären Domäne (NICD) des Rezeptors. Die NICD wandert in den Zellkern und aktiviert dort zusammen im Komplex mit dem Transkriptionsfaktor RBP-JК die Gene HEY1, HEY2 und NRP1. Die Transkriptionsfaktoren HEY1 und HEY2 reprimieren über einen Feedback-Mechanismus direkt die Aktivität des COUP-TFII Promotors.

Inherited metabolic disorders (IMD) form a diverse group of several hundred different diseases with a relatively high cumulative incidence (stated up to 1:600). They are associated with accumulation of the substrates and lack of the products in specific metabolic pathways, which is caused by deficiency of the enzyme or its activator, or dysfunction of the transport protein. However, the underlying cause is at the DNA level. The grounds for different phenotype manifestation in patients with the same genotype are often not known. During my work at the Institute of Inherited Metabolic Disorders, I designed several new methods for the research of IMD and applied them in the patients and their families. I created procedures for the isolation of lysosomal membranes that are used for the research of lysosomal storage disorders and general properties of lysosomes. Next, I introduced several novel assays for determination of the X-inactivation ratio, which led to a significant increase of informative women. Nowadays, we use these methods in heterozygous women with X-linked diseases in order to study the influence of X-inactivation on the manifestation of the diseases. The cases of a girl with mucopolysaccharidosis type II, a girl with OTC deficiency and a family with the mutation in HPRT1 gene are described...

Les facteurs de transcription SIM1, OTP, POU3F2 et ARNT2 interagissent ensemble en orchestrant le développement complexe de l’hypothalamus, une région du cerveau contenant plusieurs petites populations circonscrites de neurones, dont le noyau paraventriculaire (PVN). Ce noyau est un important centre intégrateur et l’haploinsuffisance du facteur de transcription Sim1, essentiel au développement du PVN, mène à l’hyperphagie autant chez la souris que l’homme. Différentes souris ont été générées par génie génétique afin de nous aider à trouver d’autres gènes essentiels qui participent à cette cascade transcriptionnelle. Premièrement, la partie antérieure de l’hypothalamus a été récoltée chez des embryons (E12.5) de souris qui surexprimaient le gène Pou3f2 sous le promoteur de Otp7. L’analyse transcriptionnelle de cette partie a été comparée avec les embryons (E12.5) wt de la même portée, de sorte qu’il a été possible de constater que différents gènes ont été régulés à la hausse et d’autres à la baisse. Les gènes en question ont été choisis selon leur pertinence au développement de la région d’intérêt, l’hypothalamus, et de trois autres critères : un accroissement de plus de 1.5, une expression minimale dans l’embryon d’au moins 1000 lectures et le rang le plus haut. Cette méthode discriminatoire a permis d’identifier les gènes les plus affectés dont Lgi2, Fezf2, Sema3c, Six6, Sox14, Lmo4, Nwd2 et Nkx2.1. Les gènes régulés à la baisse étaient Six6, Sox14 et Nkx2.1, tandis que tous les autres étaient à la hausse. Afin de confirmer les résultats obtenus, une validation par hybridation in situ a été utilisée sur des tranches d’hypothalamus d’embryons E12.5. Nous avons pu confirmer la surexpression des marqueurs Lgi2, Fezf2, Sema3c, Lmo4 et de Pou3f2 dans le domaine du PVN. La diminution de l’expression des marqueurs Sox14 et Nkx2.1 a pu être détectée dans el domaine basal de l’hypothalamus, ce qui suggère que l’effet d’une surexpression de Pou3f2 dans le domaine du PVN ait un effet cellulaire non autonome. La diminution de l’expression de Six6 dans le domaine basal n’a pas pu être confirmer de façon reproductible. Deuxièmement, il semblerait qu’il y ait une redondance de rôle entre les facteurs de transcription Otp et Sim1, tous les deux agissant en amont de Pou3f2. Afin de comparer leur impact dans le programme transcriptionnel, la technologie CrisPR-cas9 a été utilisée pour faire un KO du 2e exon d’Otp. Nous avons pu confirmer notre modèle de mutation en le comparant aux autres mutants de la littérature par une réduction de l’expression d’OT, d’OTP, d’AVP et de TRH. Troisièmement, les souris hétérozygotes pour Otp et Sim1 seront croisées, de sorte d’obtenir quatre génotypes : wt, Otp+/-, Sim1+/tlz+ et Otp+/-Sim1+/tlz+. Puisqu’une redondance des rôles de Sim1 et Otp est soupçonnée, le phénotype du double mutant devrait présenter une obésité par hyperphagie plus importante que celle des souris hétérozygotes pour le gène Sim1 ou Otp. Les souris sont pesées à partir de la 5e semaine de vie jusqu’à l’âge de 6 mois à une fréquence d’une fois par semaine. L’apport calorique est également mesuré une fois par semaine sur période de 24h. La double mutation (Otp+/-Sim1+/tlz+) chez les souris mâles causait un phénotype d’obésité plus important que la singularité des mutations, mais ce n’était pas le cas chez les souris femelles. Les souris portant la mutation d’Otp étaient tout de même plus obèses que les souris sauvages pour les deux sexes. Plus de souris seront nécessaire pour déterminer si un apport calorique sans changement au niveau des dépenses énergétiques est la cause de ce gain pondéral. / The transcription factors SIM1, OTP and POU3F2 interact together to orchestrate the complex development of the hypothalamus, a region of the brain containing several small, circumscribed populations of neurons, including the paraventricular nucleus (PVN). This nucleus is an important integrating center, and the haploinsufficiency of the transcription factor Sim1, essential for the development of PVN, leads to overeating in both mice and humans. Different mice have been genetically engineered to help us find other essential genes that participate in this transcriptional cascade. Firstly, the anterior part of the hypothalamus was collected from mice embryos (E12.5) which overexpressed the Pou3f2 gene under the OTP7 promotor. The transcriptional analysis was compared to wt embryos from the same litter to see the different upregulated and downregulated genes. These genes were chosen according to their relevance to the development of the anterior hypothalamus. Three criteria were used to discriminate genes from one another: 1) an increase of more than 1.5, 2) a minimal expression in the embryo (E12.5) of at least 1000 reads and 3) the highest rank. This discriminatory method allowed us to identify the genes Lgi2, Fezf2, Sema3c, Six6, Sox14, Lmo4, Nwd2, Nkx2.1. To have a visuospatial idea of these affected genes, the validation of these results was done by in situ hybridization on E12.5 embryo hypothalamus. We have been able to see an overexpression in the PVN domain for the Lgi2, Fezf2, Sema3c, Lmo4 and Pou3f2 markers. The reduction of expression for Sox14 and Nkx2.1 markers were visible in the basal domain of the hypothalamus, which suggest a non cell autonomous effect of Pou3f2 being overexpressed. The reduction of Six6 couldn’t be consistently visible with repetition. Secondly, a redundant role of OTP and SIM1 seems to occur in the development of the hypothalamus. We created a KO line of the Otp gene by deleting the second exon with CrispR-cas9 and characterized it. We then compared it to the Sim1+/tlz+ line that we already generated in the lab. We were able to confirm our mutation model by seeing a reduction in the expression of crucial markers such as OT, OTP, AVP and TRH. Thirdly, we crossed Otp+/- with Sim1+/tlz+ mice to obtain four different genotypes: wt, Otp+/-, Sim1+/tlz+ and Otp+/- Sim1+/tlz+. Since a redundant aspect has been observed for SIM1 and OTP transcription factors, we were wondering if the obesity phenotype would be worsened by carrying both mutation or not. These mice were weighted every week from 5-week-old up to 6 months old. Food intake has also been measured since the obesity has been reported to be caused by hyperphagia in Sim1 mutant mice. The male mice carrying the double mutation (Otp+/-Sim1+/tlz+) showed a more important weight gain than only Sim1+/tlz+ or Otp+/- mutants, but it was not the case for the female mice. The mice carrying the Otp mutation still got a more important weight gain than the wt mice (females and males). More mice would be necessary to determine if this weight gain is caused by hyperphagia only or if unbalance energy cost is part of the cause.

Trippelnegativ bröstcancer (TNBC) är den mest maligna formen av bröstcancer utan någon framträdande behandlingsbar biomarkör. Således har den djupa återfallsfrekvensen och bristen på behandlingsalternativ öppnat behovet av att förstå TNBC: s etiopatogenes och molekylära mekanism. Huvudsyftet är att kartlägga det genomomfattande differentiella uttrycket av den förmodade cancergenen (en prenyleringsgen) och dess betydelse vid trippelnegativ bröstcancer. Hi-Cap (Capture Hi-C) är en teknik som genererar högupplösta promotor-förstärkare interak- tioner med nästan en-förstärkare upplösning.Vi arbetade med cancercellinjer, MDA-MB_231, med och utan den förmodade genen. Hi-C-tekniken optimerades i enlighet därmed för cancer- cellinjen för att generera en högupplöst berikad region. Resultaten kan vidare användas för att utföra biblioteksförberedelser och bioinformatikanalys. Dessa fynd kommer att ägnas åt att upptäcka nya vägar involverade i prenylering och TNBC. / Triple-negative Breast cancer (TNBC) is the most malignant form of breast cancer with no prominent treatable biomarker. The profound recurrence rate and lack of treatment options have opened the need to understand the etiopathogenesis and molecular mechanism of TNBC. The main objective of this study is to map the genome-wide differential expression of the putative cancer gene (a prenylation gene) and its importance in Triple-Negative Breast cancer. Hi-Cap (Capture Hi-C) is a technique which generates high-resolution promoter-enhancer interactions with almost single-enhancer resolution. We worked with cancer cell lines, MDA-MB_231, with and without the putative gene. The Hi-C technique was optimized accordingly for the cancer cell line to generate a high-resolution enriched region. The results can be further used to perform library prep and bioinformatics analysis. These findings will devote to discovering novel pathways involved with prenylation and TNBC.