Plutella xylostella, commonly known as diamondback moth, causes great damages in collard greens and broccolis crops of Itabaiana municipality in Sergipe State-BR. Alternative control techniques are being researcher s goals because the intensive use of chemicals has enhancing resistance problems, intoxication of workers, beside the pollution of environment and residues in the products, making difficult their commercialization. Entomogenous fungi have been used widespread in biological control of agriculture pests and have a remarkable role among micro-organisms as an alternative method to control the moth. This work aims to evaluate the pathogenicity of ten isolates of Beauveria and Paecilomyces, from different research institutions, on diamondback moth and also to identify and quantify extra cell enzyme patterns made by the mentioned fungi. The rearing of the moths will be at lab conditions starting from young crawlers and pupae picked up in field crops of collard and broccolis. The enzyme activities will be evaluated in extra cell fluids filtrated from entomogenous fungi reared in aqueous medium. The results obtained from the bioassays will give contribution in the identification of the most efficient genera or isolates to be used in IPM of diamondback moth. Moreover, it is expected that the relationship pathogenicity x enzyme activity be one other tool to characterizing these micro-organisms. / A traça-das-crucíferas tem causado grandes danos a produtores de couve e brócolis do município de Itabaiana-SE. O uso indiscriminado de agrotóxicos para o controle desta praga tem causado problemas quanto à resistência a determinados ingredientes ativos, além de comprometer a saúde dos aplicadores e o consumo dos produtos pela veiculação de resíduos desses produtos. Os fungos entomopatogênicos são uma alternativa de controle para a traça. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade de fungos entomopatogênicos sobre a traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), observando sua interação com a quantificação e tipos de enzimas proteases produzidas pelos isolados. Foi realizado no Laboratório de Controle Biológico da Embrapa Tabuleiros Costeiros usando 9 isolados de Beauveria bassiana e 1 isolado de Paecilomyces fumosoroseus, provenientes de diferentes instituições para o controle da traça-das-crucíferas. Foi realizado um bioensaio, com os 10 isolados em uma mesma concentração (1x108 conídios/ml). Folhas de couve foram banhadas com a solução de conídios dos fungos e oferecidas como alimentação as lagartas. Análises da atividade enzimática de duas proteases degradadoras de cutícula, Pr1 e Pr2, enzimas relacionadas diretamente com o processo de infecção do inseto pelo patógeno foram realizadas no Laboratório de Enzimologia da Universidade Federal de Sergipe. Os isolados 447© e 1213 apresentaram as maiores médias de mortalidade, sendo o 447© o mais virulento. Não foi confirmada uma correlação entre patogenicidade e atividadade enzimática para os isolados de fungos entomopatogênicos estudados. Este resultado não contradiz a influencia da atividade enzimática no processo de infecção e patogenicidade destes microrganismos, porém, confirma o quanto é complexo o estudo desta relação na interação patógeno hospedeiro. Os períodos de avaliação de 96 e 144 horas apresentaram os maiores valores de atividade para as duas enzimas avaliadas, coincidindo com o período de maior número de lagartas mortas.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao adriane g gamboa.pdf: 1009208 bytes, checksum: bb95e46e7798790f86bb339947708a21 (MD5) Previous issue date: 2010-03-25 / In this work papain inhibitor from A. pavonina was immobilized by covalent bond in polyaniline (PANI) modified with glutaraldehyde (PANIG) for be used as stationary phase for affinity chromatography and then applied in the purification of cysteine proteases bromelain and ficin. The extraction and purification of inhibitors protease from A. pavonina resulted in a yield of 3.9% in the last step of purification. Gel filtration chromatography performed in Sephadex G-75 resin as a purification step resulted in three protein peaks (F1, F2 and F3), but only F1 was used in the experiments of immobilization because of higher specific activity. Immobilization was performed using PANIG. To optimize the immobilization conditions the amount of PANIG in the reaction (5, 10 and 15mg), time (30, 60 and 90 min) and pH (5.0 to 8.0) were varied. The best conditions for immobilization of A. pavonina inhibitor, according to tests performed were 5mg PANIG, reaction time of 30min and pH 7.0. PANIG-I was used as bio-affinity stationary phase for separation of bromelain and ficin. Electrophoresis (SDS-PAGE) performed after the separation process revealed the presence of a single band for both bromelain and ficina, with 28 and 25 kDa, respectively. In this process, ficin was purified 2,60 fold and bromelain 0,89 fold, showing that the use of inhibitors of A. pavonina immobilized in PANIG were efficient in the purification of cysteine proteases. / No presente trabalho um inibidor de papaína extraído de sementes de A. pavonina foi imobilizado por ligação covalente em polianilina (PANI) modificada com glutaraldeído (PANIG), visando a aplicação desse material como fase estacionária para cromatografia de afinidade e sua aplicação na purificação das proteases cisteínicas bromelaína e ficina. A extração e purificação dos inibidores de A. pavonina resultou num rendimento de 3,9% no último passo de purificação. A cromatografia de gel filtração em resina Sephadex G-75 como passo para purificação dos inibidores resultou em três picos protéicos (F1, F2 e F3) dos quais F1 foi utilizado nos experimentos de imobilização por ter apresentado atividade específica mais alta. A imobilização foi feita utilizando-se PANIG. Para otimização das condições de imobilização foram variados na reação a quantidade de PANIG (5, 10 e 15mg), tempo (30, 60 e 90 min) e pH (5,0 a 8,0). As melhores condições para imobilização dos inibidores de A. pavonina, de acordo com os ensaios realizados, foram 5mg de PANIG, tempo de reação de 30min e pH 7,0. PANIG-I foi utilizada como fase estacionária de bioafinidade para separação de bromelaína e ficina. Eletroforese (SDS-PAGE) após o processo de separação revelou a presença de uma única banda, tanto para bromelaína como para ficina, de 28 e 25 kDa, respectivamente. Nesse processo, a ficina foi purificada 2,60 vezes e a bromelaína 0,89 vezes, mostrando que o uso dos inibidores de A. pavonina imobilizados em PANIG foram eficientes na purificação de proteases cisteínicas

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As proteases de lÃtex tÃm atraÃdo atenÃÃo devido à habilidade de exibir atividades semelhantes à trombina e à plasmina. Neste estudo, as proteÃnas do lÃtex das plantas Calotropis procera (CpPL), Cryptostegia grandiflora (CgPL) e Plumeria rubra (PrPL) foram avaliadas em termos destas atividades. Para tanto, as amostras foram investigadas quanto as suas atividades fibrinogenolÃticas e fibrinolÃticas, em plasma humano e por incubaÃÃo com fibrinogÃnio humano atravÃs da medida do tempo de coagulaÃÃo, ensaios eletroforÃticos, espectrofotomÃtricos, ou de difusÃo em gel de agarose. O efeito de CpPL in vivo, sobre o tempo de coagulaÃÃo no plasma de camundongos saudÃveis ou sÃpticos, que foram experimentalmente infectados com a bactÃria Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, tambÃm foi estudado. Grupos de cinco camundongos foram tratados com CpPL (30 mg/Kg), S. enterica (107 UFC/mL) ou CpPL 24 h antes da inoculaÃÃo bacteriana. Depois do sacrifÃcio dos animais, as amostras de sangue foram examinadas quanto ao tempo de coagulaÃÃo, conteÃdo de plaquetas e perfil protÃico. As fraÃÃes protÃicas de C. procera exibindo atividade proteolÃtica foram capazes de hidrolisar o fibrinogÃnio de forma similar à trombina, enquanto que as fraÃÃes protÃicas de Cr. grandiflora exibindo atividade proteolÃtica foram capazes de hidrolisar o fibrinogÃnio de forma similar à plasmina. As amostras exibiram atividade fibrinogenolÃtica de forma dose e tempo dependente, mas nÃo foram capazes de dissolver totalmente o coÃgulo de fibrina. As atividades fibrinogenolÃticas foram eliminadas pela inibiÃÃo das proteases dos lÃtices com E-64, um inibidor de protease cisteÃnica. Pepstatina, PMSF e EDTA nÃo se mostraram inibitÃrios. O tempo de formaÃÃo do coÃgulo no plasma de camundongos sÃpticos e o conteÃdo de plaquetas foram consistentemente reduzidos quando comparados aos animais saudÃveis. CpPL exibiu efeitos antagonistas. Foi capaz de reverter, estatisticamente, o efeito da sepse no tempo de formaÃÃo do coÃgulo associado à preservaÃÃo do conteÃdo de plaquetas. Contudo, CpPL exibiu efeito oposto em camundongos nÃo sÃpticos, induzindo rÃpida formaÃÃo do coÃgulo, comparado aos animais saudÃveis, porÃm sem alterar o conteÃdo de plaquetas. Os resultados relatados neste trabalho confirmam a atividade fibrinogenolÃtica associada a proteases cisteÃnicas de lÃtex e mostram uma efeito protetor in vivo muito intrigante de CpPL no conteÃdo de plaquetas em animais sÃpticos, com aparentes efeitos benÃficos contra a coagulaÃÃo intravascular disseminada, um evento crucial associado à sepse letal. Este efeito, porÃm, nÃo foi observado quando CpPL foi dado aos animais saudÃveis. / Latex proteases have grown in attention because of their ability to exhibit both thrombin and plasmin-like effects. In this study, the plant latex proteins Calotropis procera (CpLP), Cryptostegia grandiflora (CgLP) and Plumeria rubra (PrLP) were investigated in terms of these activities. For both samples were investigated for their fibrinogenolytic and fibrinolytic activity in human plasma and by incubation with human fibrinogen by measuring the clotting time, electrophoretic or spectrophotometric assays and diffusion in agarose gel. In vivo effect of CpLP on clot formation of plasma of healthy and septic mice that have been experimentally infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium was also studied. Groups of five mice were treated with CpLP (30 mg/Kg), S. enterica (107 CFU/mL) or CpLP 24 h prior bacteria. After sacrificing animals, blood samples were examined for coagulation time, platelet content and protein profile. The protein fractions of C. procera exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to thrombin, while the protein fractions of Cr. grandiflora exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to plasmin. The samples exhibited fibrinogenolytic activity in a dose and time manner, but were not able to dissolve the fibrin clot. Procoagulant activity was eliminated by inhibition of latex proteases with cysteine proteinase inhibitor E-64. Pepstatin, PMSF and EDTA were not inhibitory. Time of clot formation of plasma in septic mice and platelet content were consistently reduced as compared to healthy animals. CpLP exhibited antagonistic effects. It statistically reversed the effects of sepsis on clot-time formation associated to preservation on platelet content. However, CpLP exhibited opposite effect on non-septic mice, inducing faster clot formation, compared to healthy animals but without changing platelet content. Results reported in this work confirm fibrinogenolytic activity associated to cysteine proteases of latex and show a very intriguing in vivo protective activity of CpLP on platelet content on septic animals with apparent benefit effect against disseminated vascular coagulation, a pivotal event associated to lethal sepsis. This effect was however not observed when CpLP was given to healthy animals.

Na propriedade rural, onde o leite cru refrigerado fica armazenado até a captação pelo caminhão tanque em coleta a granel, o mesmo é mantido a temperatura de refrigeração entre 1 a 4ºC por longos períodos (até 96 horas), os microrganismos psicrotróficos encontram condições favoráveis para sua multiplicação, produzindo enzimas proteolíticas e lipolíticas termotolerantes, podendo provocar alterações indesejáveis no leite e nos seus derivados. Quando estes microrganismos estão presentes em elevadas populações, pode ser indicativo de baixa qualidade do leite e insatisfatória condições sanitárias para o processamento. Devido a necessidade da melhora da qualidade dos produtos lácteos, objetivou-se a execução desta pesquisa realizando levantamentos sobre o cumprimento dos padrões microbiológicos exigidos pela atual legislação brasileira IN 62 (BRASIL, 2011), pesquisas sobre os microrganismos psicrotróficos, Pseudomonas spp. e produção de enzimas proteolítica e lipolítica por Pseudomonas spp. As coletas foram realizadas em 10 propriedades do Estado de São Paulo na Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR Limeira - SP, sendo, 5 propriedades com ordenha manual e 5 propriedades com ordenha mecânica, nos períodos de chuva e seca e em vários pontos durante a obtenção do leite cru refrigerado e também do leite com intervalo de 24 horas até a captação deste leite pelo caminhão. As médias das populações dos microrganismos mesófilos na ordenha manual, foi diferente estatisticamente significativo no leite recém ordenhado (1,52×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (2,67×107 UFC.mL-1) no período chuvoso, e na ordenha mecânica, o encontrado foi uma diferença estatisticamente significativa no leite recém ordenhado (3,87×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (9,82×108 UFC.mL-1) também no período chuvoso. Nas populações dos microrganismos psicrotróficos, suas médias diferiram estatisticamente na ordenha manual no período da chuva no leite recém ordenhado (1,48×104 UFC.mL-1) para o leite com 48 horas de armazenamento (1,49×105 UFC.mL-1) e na ordenha mecânica, o leite recém ordenhado (8,74×103 UFC.mL-1), com 24 horas de armazenamento (4,33×104 UFC.mL-1) não diferiram entre si e foram diferentes estatisticamente do leite com 48 horas de armazenamento (3,46×105 UFC.mL-1) apresentaram valor elevado, principalmente quando o leite cru refrigerado permanece por longos períodos de armazenamento na propriedade rural, que pode ser um sério fator de comprometimento pela produção de lipases ou proteases principalmente pelas Pseudomonas spp. onde em todos os pontos amostrados foram isolados este microrganismo produzindo enzimas (lipase e/ou protease). A maior porcentagem de atividade lipolítica foi verificada no período seco, já a maior porcentagem de atividade proteolítica foi verificada no período chuvoso. Contudo, deve-se intensificar as medidas de autocontrole para minimizar os efeitos dos microrganismos mesófilos e psicrotróficos sobre a qualidade do leite cru refrigerado e, consequentemente, de seus derivados. / On the farm, where the cold raw milk is stored until the tank truck collects it in bulk, it is kept at refrigeration temperature between 1 and 4°C for extended periods (96 hours), the psychrotrophic microorganisms find favorable conditions for their multiplication, producing proteolytic and lipolytic thermotolerant enzymes, it may cause undesirable changes in milk and its derivatives. When these microorganisms are present in a large population, it can be an indicative of low quality milk and unsatisfactory sanitary conditions for its processing. Due to the need of improving the quality of dairy products, this research was carried out with surveys about fullfilment of microbiological standards required by current Brazilian law IN 62 (BRAZIL, 2011), researches on psychrotrophic microorganisms, Pseudomonas spp. and production of proteolytic and lipolytic enzymes by Pseudomonas spp. Samples were collected in 10 farms in the state of São Paulo in the Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR in Limeira - SP, 5 farms with manual milking and 5 farms with mechanical milking; during the rainy and dry periods and in several points during the obtaining of refrigerated raw milk and also milk with a 24-hour-interval before the collection of this milk by the truck. The averages of the mesophilic population in the manual milking were different, statistically significant between the newly expressed milk (1,52×106 UFC.mL-1) and 24 hour-storage milk (2,67×107 UFC.mL-1) in the rainy season, and during mechanical milking, what was found was a statistically significant difference between the newly expressed milk (3,87×106 UFC.mL-1) and 24-hour-storage milk (9,82×108 UFC.mL-1, also in the rainy season. In the populations of psychrotropic microorganisms, the averages statistically differed in manual milking during the period of rain between the newly expressed milk (1,48×104 UFC.mL-1) and 48-hour-storage milk (1,49×105 UFC.mL-1); and during the mechanical milking, newly expressed milk (8,74×103 UFC.mL-1) and 24-hour-storage (4,33×104 UFC.mL-1); were not different and were statistically different from 48-hour-storage milk (3,46×105 UFC.mL-1), they present high value, especially when refrigerated raw milk remains for long storage periods on the farm, which can be a serious impairment factor for the production of lipases and proteases mainly by Pseudomonas spp. where in all the sampling sites these microorganisms were isolated producing enzymes (lipase and/or protease). The highest percentage of lipolytic activity was observed in the dry season; the highest percentage of proteolytic activity was observed during the rainy season. However, the self-control measurementsshould be intensified to minimize the effects of mesophilic and psychrotrophic microorganisms on the quality of refrigerated raw milk and, consequently, its derivatives.

Este trabalho relata o isolamento e caracterização bioquímica parcial de componentes do veneno de Tityus serrulatus (VTs) com ação sobre o sistema complemento (SC). O procedimento de purificação envolveu uma cromatografia de troca iônica do VTs em CM-celulose-52, em pH 7,8 e doze frações foram obtidas, denominadas de I a XIII. A fração I, que apresenta atividade sobre o SC sérico, foi filtrada em Sephacryl S-200 e dez subfrações foram obtidas e denominadas I-1 a I-10. A subfração I-1 foi recromatografada em uma coluna de DEAE-Sepharose, em pH 7,8. Cinco subfrações foram obtidas (DE-1 a DE-5) e as subfrações DE-2, DE-3 e DE-4 incubadas com soro humano normal (SHN) induziram redução da atividade lítica da via clássica/lectina (VC/L) de forma concentração-dependente. A subfração DE-2 apresentou uma banda eletroforética única no gel de eletroforese de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), com peso molecular (PM) de aproximadamente 247.000 na ausência de b-mercaptoetanol e seis bandas na presença de b-mercaptoetanol. O procedimento de purificação dos componentes ativos da subfração I-4 envolveu basicamente uma cromatografia de troca iônica em Mono-Q, em pH 7,1. Sete subfrações (MQ-1 a MQ-7) foram obtidas neste passo cromatográfico. As proteínas MQ-5 e MQ-7 da subfração I-4 induziram redução da atividade hemolítica das VC/L e via alternativa (VA). Com o objetivo de investigar o mecanismo de ação sobre o SC, SHN foi incubado com a subfração I-4 ou seus componentes (MQ-5 e MQ-7). A imunoeletroforese mostrou a clivagem do fator B e de C3 por estas proteínas, similar ao induzido pela incubação de SHN com zimosan, o que confirma a hipótese de que MQ-5 e MQ-7 induzem a ativação do SC. A capacidade de gerar fatores quimiotáticos no soro foi investigada. Nas condições experimentais, a incubação de SHN com a subfração I-4, proteínas MQ-5 e MQ-7 induziu a migração de neutrófilos similar a induzida pela incubação de soro com zimosan, demonstrando que estas proteínas induzem clivagem de C3 e C5, gerando os fragmentos ativos de C3a e C5a. As proteínas MQ-5 e MQ-7 não foram capazes de lisar eritrócitos de coelho e carneiro. MQ-5 e MQ-7 não induziram redução da atividade hemolítica da VC/L após o aquecimento a 100ºC, portanto a ação destas proteínas não é conseqüência da presença de produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS). As proteínas MQ-5 e MQ-7 apresentaram atividade fibrinogenolítica e caseinolítica e são metaloproteases, já que a atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10-fenantrolina. Ambas proteínas apresentaram uma banda eletroforética única por SDS-PAGE, com um PM aproximado de 24.500 na ausência de b-mercaptoetanol, 33.100 na presença de b-mercaptoetanol e um ponto isoelétrico de 4,2. A seqüência N-terminal (Degradação de Edman) e a seqüência de peptídeos trípticos (Espectrometria de massa ESI-MS/MS) de MQ-5 e MQ-7 foram determinadas. Ambas proteínas apresentaram seqüência similar de aminoácidos. Em resumo, este trabalho mostrou que o VTs contém proteases (MQ-5 e MQ-7, metaloproteases) que são capazes de ativar o SC e podem ser importantes no processo inflamatório que ocorre em conseqüência do envenenamento. Além disso, estas proteínas podem ser usadas para depledar o SC em modelos experimentais de doenças em que este sistema está envolvido. / This work reports the isolation and partial biochemical characterization of components from Tityus serrulatus venom (TsV) with action on the complement system (CS). The purification procedure involved an ion-exchange chromatography of TsV on CM-celullose-52, at pH 7.8, twelve fractions were obtained and named I to XIII. Fraction I, showing activity on the serum CS, was filtered on Sephacryl S200 and ten subfractions were obtained and denominated I-1 to I-10. The subfraction I-1 was rechromatographed on a column of DEAE-sepharose, at pH 7.8. Five subfractions were obtained (DE-1 to DE-5) and subfractions DE-2, DE-3 and DE-4 incubated with NHS induced a concentration-dependent reduction in lytic activity of CP/L. Subfraction DE-2 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with a molecular weight (MW) of approximately 247,000 in the absence of -mercaptoethanol and six bands in the presence of -mercaptoethanol. The purification procedure of the active compounds of subfraction I-4 involved basically an ion-exchange chromatography on Mono-Q, at pH 7.1. Seven subfractions (MQ-1 to MQ-7) were obtained in this chromatography step. We found that proteins MQ-5 and MQ-7 of subfraction I-4 induced reduction in hemolytic activity for CP/L and AP. In order to investigate the mechanism of action on the CS, NHS was incubated with subfraction I-4 or its components (MQ-5 and MQ-7). The immunoelectrophoresis showed cleavage of factor B and C3 by these proteins, similar to that induced by incubation of NHS with zymosan, which corroborated the hypothesis that MQ-5 and MQ-7 induce activation of the CS. Their capacitiy to elicit serum-induced chemotaxis was then investigated. Under our assay conditions, incubation of NHS with subfraction I-4, protein MQ-5 and MQ-7 induced neutrophil migration similar to that induced by incubation of serum with zymosan, showing that the proteins induce cleavage of C3 and C5, thereby generating the active fragments C3a and C5a. Proteins MQ-5 and MQ-7 alone were unable to lyse rabbit or sheep erythrocytes. MQ-5 and MQ-7 did not induce reduction in hemolytic activity for CP/L after being heated to 100ºC, therefore the action of these proteins is not a consequence of the presence of bacterial products, such as lipopolyssaccharides (LPS). Proteins MQ-5 and MQ-7 showed fibrinogenolytic and caseinolytic activities and they probably are metalloproteases, since its fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenantroline. Both MQ-5 and MQ-7 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with an approximate MW of 24,500 in the absence of -mercaptoethanol, 33,100 in the presence of -mercaptoethanol and an isoelectric point of 5.9. The N-terminal sequence (Edman Degradation) and the sequence of tryptic peptides (Mass spectrometry- ESI-MS/MS) from MQ-5 e MQ-7 were determined. The proteins MQ-5 e MQ-7 showed similar sequence of aminoacids. In summary, this work showed that the TsV venom contains proteases (MQ-5 and MQ-7, metalloproteases) which are able to activate the CS, and may therefore be important in the context of the inflammatory process occurring in consequence of envenomation. In addition these proteins may be used to deplete complement in experimental models of diseases involving participation of this system.

Importantes estudos voltados para a análise das secreções de anfíbios fundamentam-se na grande quantidade de componentes biologicamente ativos presentes nas mesmas, tais como aminas biogênicas, esteróides, aminopolissacarídeos, glicosídeos, inibidores de proteases e diversos outros compostos, responsáveis pela complexa sintomatologia observada no envenenamento. O gênero Bufo apresenta diversas moléculas em suas excreções que podem ser divididas em categorias como aminas biogênicas, bufadienolídeos (bufogeninas), esteróides (bufotoxinas), alcalóides, peptídeos e proteínas. Marongio (2006) verificou que o veneno do sapo Bufo paracnemis, hoje classificado como Rhinella schneideri, apresenta componente ativo sobre a via clássica do sistema complemento (SC), necessitando de melhores estudos e caracterização. Os objetivos deste trabalho foram, portanto, o isolamento e caracterização química do componente do veneno de Rhinella schneideri responsável pelos efeitos observados sobre o sistema complemento. Para a purificação, o veneno foi inicialmente submetido a uma cromatografia catiônica (CM-Celulose-52), obtendo-se 7 frações denominadas C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. A fração C1 foi cromatografada em resina aniônica (DEAE-SepharoseTM), resultando em 4 subfrações denominadas D1, D2, D3, e D4. A subfração D3 apresentou atividade sobre o sistema complemento e foi submetida a uma Gel Filtração (SephacrylTMS-200), fornecendo 5 subfrações denominadas S1, S2, S3, S4, e S5. As subfrações S2 e S5 induziram redução da atividade hemolítica das vias clássica/lectinas. Ambas apresentaram resultados positivos nos ensaios de migração de neutrófilos e imunoeletroforese bidimensional. No ensaio de capacidade geradora de SC5b-9, a subfração S2 apresentou maior significância frente as demais subfrações utilizadas. Visando esclarecer o mecanismo de ação das subfrações ativas sobre o sistema complemento, testes de determinação da atividade proteolítica ou inibitória de proteases (tripsina, quimotripsina e elastase) foram realizados. No entanto, nas concentrações utilizadas, as amostras não mostraram atividade proteolítica ou inibitória de protease. Os compostos isolados foram também submetidos ao sequenciamento amino-terminal inicial. Foi possível a identificação dos primeiros 15 aminoácidos da banda protéica majoritária do gel de poliacrilamida e 10 e 5 aminoácidos das subfrações S2 e S5, respectivamente. No entanto, os resultados de sequenciamento N-terminal apresentaram baixa confiabilidade, devido à baixa quantidade de material utilizada. Neste trabalho foram isolados e caracterizados dois compostos capazes de induzir a ativação do sistema complemento. Esta ação foi evidenciada, após exposição do soro humano normal às subfrações, por induzirem à formação do complexo SC5b-9 e aumentarem a migração de neutrófilos, provavelmente por induzirem a formação de fatores quimiotáticos. Este estudo permitiu avaliar melhor alguns componentes presentes na complexa mistura que é o veneno de Rhinella schneideri, que, no futuro, poderão se tornar ferramentas farmacológicas importantes para o estudo de diversas patologias relacionadas ao sistema complemento. / Important studies focused on amphibians secretions analysis are based on large amount of biologically active components present in them, such as biogenic amines, steroids, polysaccharide amine, glycosides, protease inhibitors and several other compounds, responsible for complex symptomatology observed in the envenomation by Bufo paracnemis. The genus Bufo presents several molecules in their excretions that can be divided into categories such as biogenic amines, bufadienolides (Bufogenin), steroids (Bufotoxins), alkaloids, peptides and proteins. Marongio (2006) found in one of his studies the toad poison of Bufo paracnemis, now classified as Rhinella schneideri, has an active component of the classical pathway of the complement system (SC), which needs further studies and characterization. The purification process of this study was accomplished through cation chromatography (CM-Cellulose-52), and seven fractions were obtained, called C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. The fraction C1 was chromatographed on anion-exchange resin (DEAE- SepharoseTM) resulting in 4 subfractions referred to as D1, D2, D3, and D4. The subfraction D3 showed activity on complement system and was subjected to gel filtration (SephacrylTMS-200) giving 5 subfractions termed S1, S2, S3, S4, and S5. The subfractions S2 and S5 induced reduction of the hemolytic activity of the classical/lectin pathway. Both showed positive results in the assays of migration of neutrophils and bidimensional immunoelectrophoresis. In the assay of generating capacity of SC5b-9, the subfraction S2 presented greater significance when compared to the other used subfractions. Aiming to clarify the action mechanism of the active subfractions on the complement system, tests of determination of the proteolytic or inhibitory activity of proteases (trypsin, chymotrypsin and elastase) had been done. However, in the used concentrations, the samples had not shown proteolytic or inhibitory activity of protease. The isolated compounds also had been submitted to the initial amino-terminal sequence. The identification of the first 15 aminoacids of the major proteinic band of the polyacrylamide gel and 10 and 5 aminoacids of the subfractions S2 and S5 was possible, respectively. However, the sequence of N-terminal results had presented low trustworthiness, due to the low amount of used material. In this work, were isolated and characterized two capable compounds to induce the activation of the complement system. This action was evidenced, after exposition of the normal human serum to the subfractions, for inducing to the formation of the SC5b-9 complex and will increase the migration of neutrophils, probably because they can induce the formation of chemotactic factors. This study allowed a better evaluation of some components present in the complex mixture which is the poison of Rhinella schneideri, that, in the future, important pharmacological tools for the study of diverse pathologies related the complement system.

Leptospiras são bactérias espiroquetas altamente móveis dotadas de estratégias que possibilitam grande eficiência nos processos de invasão e disseminação no hospedeiro. Nosso grupo demonstrou previamente que leptospiras patogênicas secretam proteases capazes de clivar e inativar moléculas-chave do sistema complemento humano, o que confere a essas bactérias a capacidade de driblar os mecanismos de defesa do sistema imune inato. Dada a rápida disseminação das leptospiras durante o processo de infecção, aventou-se a hipótese de que essas proteases secretadas pudessem alvejar uma gama maior de moléculas do hospedeiro. No presente estudo, a atividade proteolítica de proteínas secretadas por leptospiras sobre um painel de moléculas da matriz extracelular e do plasma foi avaliada. O sobrenadante de cultura da estirpe virulenta L. interrogans sorovar Kennewicki Fromm degradou fibrinogênio humano, fibronectina plasmática, colágeno Tipo I, e as proteoglicanas decorina, biglicam e lumicam. A atividade proteolítica foi inibida por 1,10-fenantrolina, sugerindo o envolvimento de metaloproteases. Laminina, matrigel, plasminogênio e trombina não foram clivados por proteases presentes nos sobrenadantes. Ainda, os dados indicam que a produção de proteases deve ser um determinante de virulência importante, uma vez que os sobrenadantes de estirpes saprófitas ou patogênicas atenuadas em cultura não apresentaram atividade proteolítica sobre componentes da matriz ou do plasma. A análise dos genomas de leptospiras disponíveis nos levou à identificação de quatro termolisinas, metaloproteases presentes apenas nas espécies patogênicas. Uma delas, codificada pele LIC13322, foi produzida na forma recombinante e apresentou atividade proteolítica sobre fibrinogênio, biglicam e decorina. Em paralelo, foram também realizadas análises comparativas dos exoproteomas das estirpes Fromm e Patoc I. Algumas metaloproteases que podem estar envolvidas na degradação de moléculas do hospedeiro foram identificadas. A capacidade de clivar moléculas do tecido conjuntivo e proteínas da cascata de coagulação pode certamente contribuir para a invasão e a destruição tecidual observadas durante a infecção por Leptospira. / Leptospires are highly motile spirochetes equipped with strategies for efficient invasion and dissemination within the host. Our group previously demonstrated that pathogenic leptospires secrete proteases capable of cleaving and inactivating key molecules of the human complement system, allowing these bacteria to circumvent host´s innate immune defense mechanisms. Given the successful dissemination of leptospires during infection, we wondered if such proteases would target a broader range of host molecules. In the present study, the proteolytic activity of secreted leptospiral proteases against a panel of extracellular matrix and plasma proteins was assessed. The culture supernatant of the virulent L. interrogans serovar Kennewicki strain Fromm degraded human fibrinogen, plasma fibronectin, collagen Type 1, and the proteoglycans decorin, biglycan, and lumican. Proteolytic activity was inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the participation of metalloproteases. Laminin, matrigel, plasminogen and thrombin were not cleaved by proteases present in the supernatants. Moreover, production of proteases might be an important virulence determinant since culture-attenuated or saprophytic Leptospira did not display proteolytic acticity against ECM or plasma components. A search against Leptospira genomes allowed identification of four thermolysins, which are metalloproteases found exclusively in pathogenic species. One of them, encoded by LIC13322, was produced in the recombinant form and displayed proteolytic activity against fibrinogen, biglycan and decorin. Comparative exoproteomic analyses using Fromm and Patoc I strains were also performed and allowed identification of a few metalloproteases that could be involved in the degradation of host components. The ability to cleave connective tissue molecules and coagulation cascade proteins may certainly contribute to invasion and tissue destruction observed upon infection with Leptospira.

Dermatófitos são fungos filamentosos que infectam substratos queratinizados como pele, unha e cabelo em busca de nutrientes para se desenvolverem e permanecerem no hospedeiro. Pertencem aos gêneros Epidermophyton, Microsporum ou Trichophyton, os quais, dependendo de seu habitat natural, são classificados em espécies geofílicas, zoofílicas ou antropofílicas. O uso indiscriminado de antifúngicos levou à seleção de cepas resistentes, e o comportamento invasivo desses patógenos em pacientes imunodeprimidos aumentou nos últimos anos, dificultando o tratamento das dermatofitoses. Há, portanto, a necessidade de estudos para um melhor entendimento da biologia dos dermatófitos devido as suas importâncias médica e/ou veterinária e o escasso conhecimento da interação destes patógenos com os hospedeiros. No presente trabalho, analisamos oito espécies de dermatófitos: Arthroderma benhamiae, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton equinum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans e Trichophyton verrucosum. Análises de genômica comparativa e de expressão de genes potencialmente envolvidos na degradação de queratina foram realizadas. Além disso, efetuamos o sequenciamento genômico em larga escala de uma das linhagens. A estrutura dos genes sub3, sub5 e sub7, que codificam serina endopeptidases com atividade queratinolítica, mep3 e mep4, que codificam proteínas pertencentes ao grupo das metaloendopeptidases, dppV, lap1 e lap2, que codificam exopeptidases, foi analisada por meio de ferramentas computacionais. Essas análises revelaram que os genes que codificam proteases possuem alto grau de conservação em suas estruturas, que é menor quando comparadas apenas suas regiões não codificadoras. As análises permitiram também a identificação em regiões promotoras de consensos específicos a gêneros de dermatófitos. Observamos que o acúmulo de transcritos destes genes, avaliados durante o cultivo em queratina, mimetizando o processo infeccioso, não está correlacionado à similaridade das sequências gênicas entre as espécies. Não encontramos correlação entre o nicho preferencial dos dermatófitos e suas sequências gênicas ou níveis transcricionais. Observamos que, na grande maioria das vezes, genes que codificam endo e exopeptidases, possuem acúmulo de transcritos em períodos iniciais de degradação de queratina. Nossos resultados sugerem que diferenças pontuais na sequencia gênica, diferenças em regiões promotoras ou, até mesmo, expressão variável destes genes que codificam um conjunto proteico com funções sinérgicas e provavelmente compensatórias, contribuam para os diferentes graus de reações inflamatórias no hospedeiro, bem como para a especificidade patógeno-hospedeiro. / Dermatophytes are filamentous fungi that infect keratinized substrates such as skin, nail and hair, searching for nutrients for their development and permanence in the host. They belong to the genera Epidermophyton, Microsporum or Trichophyton, and, depending on their natural habitat, are classified into geophilics, zoophilics or anthropophilics species. The indiscriminate use of antifungals has led to the selection of resistant strains, and the invasive behaviour of these pathogens in immunocompromised patients increased in the last years, hampering the treatment of the dermatophytoses. Therefore, there is a need of studies for a better understanding of the biology of the dermatophytes due to their medical and/or veterinary importance and the scarce knowledge about the interaction of these pathogens with their hosts. In this work, we analyzed eight species of dermatophytes: Arthroderma benhamiae, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton equinum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, and Trichophyton verrucosum. Comparative genomics and gene expression analyses of genes potentially involved in keratin degradation were performed. Moreover, we performed a large-scale genome sequencing of one of the strains. The structure of the genes sub3, sub5, and sub7, which encode serine endopeptidases with keratinolytic activity, mep3, and mep4, which encode proteins belonging to the group of the metalloendopeptidases, dppV, lap1, and lap2, encoding exopeptidases, were analyzed by computational tools. These analyses revealed that the genes encoding proteases possesses high degree of conservation in their structures, which are lower when their non-coding regions are compared. The analyses also allowed the identification of consensus in promoter regions, specific of dermatophytes genera. We observed that the transcripts accumulation of these genes, evaluated during the cultivation in keratin, mimicking the infection process, is not correlated to the gene sequence similarities among the species. We have not found any correlation between the preferential niche of dermatophytes and their gene sequences or transcription levels. Most of the times, we observed that genes encoding endo and exopeptidases accumulated transcripts at the beginning of keratin degradation. Our results suggest that specific differences in the genic sequencing, differences in promoter regions, or even variable expression of these genes encoding a set of proteins with synergic and probably compensatory functions, contribute to different levels of inflammatory reactions in the host, as well as to the host-pathogen specificity.

Orientador: Luciana Francisco Fleuri / Resumo: Resíduos e subprodutos agroindustriais são extensivamente estudados a fim de se reaproveitar seu potencial biológico e agregar valor. A fermentação em estado sólido (FES) é uma das formas de utilizar estes resíduos e subprodutos para obtenção de enzimas, como as proteases. Este trabalho objetivou estudar a produção de proteases fúngicas por FES utilizando farelo de soja e farinhas de banana, caracterizar bioquimicamente as proteases mais promissoras e, por fim, aplicar na hidrólise da farinha de grilo (Gryllus assimilis), avaliando os produtos de hidrólise. O estudo da composição do meio de cultivo foi conduzido através de um delineamento experimental, o planejamento de misturas, para definir a proporção ótima de parte sólida dos substratos de fermentação. Posteriormente, realizou-se a cinética de produção de protease por FES, a caracterização bioquímica das proteases mais promissoras quanto ao pH e temperatura ótimos de atuação, bem como a influência de íons metálicos e L-cisteína em diferentes concentrações. Por meio de relargagem (salting-out), fez-se a purificação parcial das enzimas, seguida de diálise e liofilização, para então serem aplicadas na hidrólise da farinha de grilo. O fator de hidrólise, a atividade antioxidante e o perfil eletroforético dos produtos de hidrólise foram avaliados. O planejamento de misturas resultou em duas proporções com altas atividades proteolíticas, 50 % de farelo de soja (FS) e 50 % de farinha de casca de banana madura (FCBM) e um terço d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Agro-industrial waste and by-products are extensively studied aiming to add value and explore their full biological potential. Solid state fermentation (SSF) is a technique that use agro-industrial waste and by-products and may be used to obtain enzymes, such as proteases. This study aimed to produce fungal proteases by SSF using soybean bran and banana flours as substrate, characterize biochemically and apply most promising proteases to hydrolysis of cricket flour (Gryllus assimilis), and evaluate the hydrolysis products. The composition of the culture medium was evaluated through an experimental design to define the optimal proportion of solid part of the fermentation substrates. Subsequently, the protease production kinetics were performed by SSF, the most promising proteases were characterized biochemically according to the optimal pH and temperature, as well as according to the influence of metal ions and L-cysteine ​​in different concentrations. Proteases were partially purified by salting-out, followed by dialysis and lyophilization and applied in hydrolysis of the cricket flour. The hydrolysis factor, the antioxidant activity and the electrophoretic profile of the hydrolysis products were evaluated. The mixture design resulted in two combinations with high proteolytic activities, 50% soybean bran (SB) and 50% ripe banana peel flour (RBPF) and one third of each component (soybean bran, ripe banana peel flour and green banana flour) for the microorganisms Trichoderma ko... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Naegleria fowleri, a free-living ameba, is the causative agent of Primary Amebic Meningoencephalitis. Highly-pathogenic mouse-passaged amebae (Mp) and weakly-pathogenic axenically-grown (Ax) N. fowleri were examined for peptidase activity. Zymography and azocasein peptidase activity assays demonstrated that Mp and Ax N. fowleri exhibited a similar peptidase pattern. Prominent for whole cell lysates, membranes and conditioned medium from Mp and Ax amebae were the presence of an activity band of approximately 58kDa and 100 kDa bands susceptible to the action of cysteine and metallopeptidase inhibitors, respectively. Further roles of the peptidases during the invasion process were examined by in vitro invasion assays in the presence of inhibitors and Cysteine and metallopeptidase inhibitors were found to greatly reduce invasion through the ECM. This study establishes a functional linkage of the expressed peptidases to the invasion process, and these peptidases may serve as a candidate target for therapeutic management of N. fowleri infection.