A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

Na propriedade rural, onde o leite cru refrigerado fica armazenado até a captação pelo caminhão tanque em coleta a granel, o mesmo é mantido a temperatura de refrigeração entre 1 a 4ºC por longos períodos (até 96 horas), os microrganismos psicrotróficos encontram condições favoráveis para sua multiplicação, produzindo enzimas proteolíticas e lipolíticas termotolerantes, podendo provocar alterações indesejáveis no leite e nos seus derivados. Quando estes microrganismos estão presentes em elevadas populações, pode ser indicativo de baixa qualidade do leite e insatisfatória condições sanitárias para o processamento. Devido a necessidade da melhora da qualidade dos produtos lácteos, objetivou-se a execução desta pesquisa realizando levantamentos sobre o cumprimento dos padrões microbiológicos exigidos pela atual legislação brasileira IN 62 (BRASIL, 2011), pesquisas sobre os microrganismos psicrotróficos, Pseudomonas spp. e produção de enzimas proteolítica e lipolítica por Pseudomonas spp. As coletas foram realizadas em 10 propriedades do Estado de São Paulo na Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR Limeira - SP, sendo, 5 propriedades com ordenha manual e 5 propriedades com ordenha mecânica, nos períodos de chuva e seca e em vários pontos durante a obtenção do leite cru refrigerado e também do leite com intervalo de 24 horas até a captação deste leite pelo caminhão. As médias das populações dos microrganismos mesófilos na ordenha manual, foi diferente estatisticamente significativo no leite recém ordenhado (1,52×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (2,67×107 UFC.mL-1) no período chuvoso, e na ordenha mecânica, o encontrado foi uma diferença estatisticamente significativa no leite recém ordenhado (3,87×106 UFC.mL-1) para o leite com 24 horas de armazenamento (9,82×108 UFC.mL-1) também no período chuvoso. Nas populações dos microrganismos psicrotróficos, suas médias diferiram estatisticamente na ordenha manual no período da chuva no leite recém ordenhado (1,48×104 UFC.mL-1) para o leite com 48 horas de armazenamento (1,49×105 UFC.mL-1) e na ordenha mecânica, o leite recém ordenhado (8,74×103 UFC.mL-1), com 24 horas de armazenamento (4,33×104 UFC.mL-1) não diferiram entre si e foram diferentes estatisticamente do leite com 48 horas de armazenamento (3,46×105 UFC.mL-1) apresentaram valor elevado, principalmente quando o leite cru refrigerado permanece por longos períodos de armazenamento na propriedade rural, que pode ser um sério fator de comprometimento pela produção de lipases ou proteases principalmente pelas Pseudomonas spp. onde em todos os pontos amostrados foram isolados este microrganismo produzindo enzimas (lipase e/ou protease). A maior porcentagem de atividade lipolítica foi verificada no período seco, já a maior porcentagem de atividade proteolítica foi verificada no período chuvoso. Contudo, deve-se intensificar as medidas de autocontrole para minimizar os efeitos dos microrganismos mesófilos e psicrotróficos sobre a qualidade do leite cru refrigerado e, consequentemente, de seus derivados. / On the farm, where the cold raw milk is stored until the tank truck collects it in bulk, it is kept at refrigeration temperature between 1 and 4°C for extended periods (96 hours), the psychrotrophic microorganisms find favorable conditions for their multiplication, producing proteolytic and lipolytic thermotolerant enzymes, it may cause undesirable changes in milk and its derivatives. When these microorganisms are present in a large population, it can be an indicative of low quality milk and unsatisfactory sanitary conditions for its processing. Due to the need of improving the quality of dairy products, this research was carried out with surveys about fullfilment of microbiological standards required by current Brazilian law IN 62 (BRAZIL, 2011), researches on psychrotrophic microorganisms, Pseudomonas spp. and production of proteolytic and lipolytic enzymes by Pseudomonas spp. Samples were collected in 10 farms in the state of São Paulo in the Regional Agrícola do Escritório de Desenvolvimento Rural - EDR in Limeira - SP, 5 farms with manual milking and 5 farms with mechanical milking; during the rainy and dry periods and in several points during the obtaining of refrigerated raw milk and also milk with a 24-hour-interval before the collection of this milk by the truck. The averages of the mesophilic population in the manual milking were different, statistically significant between the newly expressed milk (1,52×106 UFC.mL-1) and 24 hour-storage milk (2,67×107 UFC.mL-1) in the rainy season, and during mechanical milking, what was found was a statistically significant difference between the newly expressed milk (3,87×106 UFC.mL-1) and 24-hour-storage milk (9,82×108 UFC.mL-1, also in the rainy season. In the populations of psychrotropic microorganisms, the averages statistically differed in manual milking during the period of rain between the newly expressed milk (1,48×104 UFC.mL-1) and 48-hour-storage milk (1,49×105 UFC.mL-1); and during the mechanical milking, newly expressed milk (8,74×103 UFC.mL-1) and 24-hour-storage (4,33×104 UFC.mL-1); were not different and were statistically different from 48-hour-storage milk (3,46×105 UFC.mL-1), they present high value, especially when refrigerated raw milk remains for long storage periods on the farm, which can be a serious impairment factor for the production of lipases and proteases mainly by Pseudomonas spp. where in all the sampling sites these microorganisms were isolated producing enzymes (lipase and/or protease). The highest percentage of lipolytic activity was observed in the dry season; the highest percentage of proteolytic activity was observed during the rainy season. However, the self-control measurementsshould be intensified to minimize the effects of mesophilic and psychrotrophic microorganisms on the quality of refrigerated raw milk and, consequently, its derivatives.

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

The use of the versatile universal adhesive systems aims to improve adhesion to dentin and simplify the bonding procedure. The association between functional monomer as 10-methacryloyloxydecyl-dihydrogen phosphate (10-MDP) and proteolytic inhibitors seems to be a promising strategy to improve the longevity of hybrid layer. Therefore, this study aimed to evaluate the performance of Adper Single Bond Universal (SU) combined with proteolytic inhibitors, especially chlorhexidine (CHX), in different dentin substrates overtime. In article 1, the interaction between CHX and E-64 with SU (in etch-and-rinse mode) was investigated in sound, artificial carious and eroded dentin over 18 months aging. It was found that carious substrate was the most affected and none of the inhibitors tested were able to maintain stability over 18 months. Furthermore, it was observed that CHX negatively impacted regardless of the substrate, leading to the hypothesis of possible competition between CHX and 10-MDP, since both involve calcium ions in their mechanism of action. For a better comprehension, article 2 purposed the evaluation of proteolytic activity and bonding to dentin tests, focusing on the performance of SU in both modes (etch-and-rinse and self-etching) compared to a conventional MDP-free 2- step adhesive system (Adper Single Bond 2), associated with CHX over 6 months aging. It was observed that proteolytic activity was evidenced when all dentin bonding systems (DBS) was used. SU in self-etching mode showed the highest values of microtensile bond strength. CHX was able to reduce proteolytic activity, regardless of DBS even in 6 months aging. Moreover, CHX did not affect negatively mechanical properties. In conclusion, CHX is capable of reduce proteolytic activity, however it did not provide long lasting up to 18 months. / A utilização dos versáteis sistemas adesivos universais tem por objetivo melhorar à adesão à dentina e simplificar o procedimento adesivo. A associação entre monômeros funcionais como o 10-Metacriloiloxidecil dihidrogênio fosfato (10-MDP) e inibidores proteolíticos tende a ser uma estratégia promissora para melhorar a longevidade da camada hibrida. Desta forma, este trabalho tem por objetivo avaliar o desempenho do Adper Single Bond Universal (SU) combinado com inibidores proteolíticos, especialmente a clorexidina (CHX), em diferentes substratos dentinários ao longo do tempo. No artigo 1, a interação entre CHX e E-64 com SU (modo convencional) foi investigada em dentina sadia, artificialmente cariada e erodida em 18 meses de envelhecimento. Foi encontrado que o substrato cariado foi o mais afetado e nenhum dos inibidores testados foram capazes de manter a estabilidade ao longo de 18 meses. Além do mais, observou-se que a CHX impactou de forma negativa independente do substrato avaliado, levando a hipótese de uma possível competição entre ela e o 10-MDP, visto que ambos envolvem íons Ca em seus mecanismos de ação. Para uma melhor compreensão, no artigo 2 foi proposto testes para avaliação de atividade proteolítica e resistência de união à dentina, com foco no desempenho do SU nos dois modos (convencional e autocondicionantes) comparado a um convencional de 2 passos livre de MDP (Adper Single Bond 2), associados com CHX em 6 meses de envelhecimento. Foi observado que a atividade proteolítica foi evidente em todos os sistemas adesivos (SA). O SU no modo autocondicionantes apresentou os maiores valores de resistência de união. A CHX foi capaz de reduzir a atividade proteolítica, independente dos SA mesmo em 6 meses de envelhecimento. Além disso, a CHX não afetou negativamente as propriedades mecânicas. A CHX é capaz de reduzir a atividade proteolítica, no entanto não perdura até 18 meses.

La formation de néo-vaisseaux sanguins est un processus impliqué dans de nombreuses pathologies, telles que le développement de carcinomes cutanés et la néo-vascularisation choroïdienne caractéristique de la forme exsudative de la dégénérescence maculaire liée à lâge (DMLA). Dans ces deux cas, lactivation du réseau vasculaire est un facteur de mauvais pronostic. Lanalogie entre ces deux pathologies est renforcée par le développement récent dapproches thérapeutiques anti-angiogènes. Ces approches ciblent principalement le VEGF et les molécules associées. Malgré lefficacité de ces molécules sur la pathologie ciblée, leur administration systémique engendre des effets secondaires non négligeables. Notre travail a pour but détudier limplication dautres acteurs moléculaires dans ces pathologies, en vue de développer des stratégies thérapeutiques alternatives ou complémentaires. Parmi les principales molécules impliquées lors de langiogenèse, les protéases et leurs inhibiteurs sont des cibles potentielles pour le développement de nouveaux traitements. Il était initialement admis que les protéases (MMPs, protéases à sérine) sont des facteurs pro-angiogènes et leurs inhibiteurs (TIMPs, PAI-1) des facteurs anti-angiogènes. Dans ce contexte, lhypothèse thérapeutique évidente était dinhiber les protéases et de protéger ou dactiver leurs inhibiteurs. Cependant, lorsque nous avons entamé ce travail, ce concept a été remis en question. En effet, un niveau élevé de PAI-1 a été détecté dans de nombreux cancers et représente un facteur de mauvais pronostic. Par ailleurs, les inhibiteurs des MMPs nont présenté aucun effet lors dessais cliniques, certains stimulant même la croissance tumorale. Il est important de noter que ces premiers inhibiteurs étaient des inhibiteurs à large spectre bloquant laction non seulement des MMPs, mais aussi des membres de familles proches. Une détection fine des rôles joués par les MMPs et linhibiteur PAI-1 sest avérée indispensable. Nous avons, dès lors, focalisé notre travail sur deux thèmes : létude de PAI-1 et létude du rôle individuel de quelques MMPs. Il a précédemment été démontré que linhibiteur PAI-1 exerce un rôle pro-angiogène lors du développement de carcinomes cutanés et de néo-vascularisation choroïdienne. PAI-1 exerce donc un effet paradoxal et complexe sur langiogenèse. Bien que le rôle de PAI-1 au cours de langiogenèse bourgeonnante était bien documenté, son implication au cours de la vasculogenèse nétait pas connue. Nos résultats démontrent que le développement des carcinomes cutanés nécessite la migration des cellules stromales adjacentes aux cellules tumorales. Par contre, la néo-vascularisation choroïdienne, également dépendante de PAI-1, requiert le recrutement des cellules issues de la moelle osseuse. Publications 1 et 2. La seconde partie de notre travail est consacrée aux métalloprotéinases matricielles. Nos résultats montrent les rôles opposés ou synergiques des MMPs. Les MMP-2 et -9 sont des protéases pro-angiogènes agissant de concert au cours de linvasion des carcinomes. A lopposé, la MMP-19 exerce une fonction anti-angiogène et nos travaux suggèrent que cette MMP contribuerait à la stabilité des vaisseaux matures et au maintien physiologique des tissus, son expression étant diminuée lors de linvasion tumorale. Publications 3, 4 et 5.

Submitted by Raniere Barreto (raniere.barros@ufvjm.edu.br) on 2018-05-10T17:58:30Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) alcides_alves_freitas.pdf: 1707403 bytes, checksum: f9233629066db73fd877b2885aa875bd (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2018-05-14T14:47:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) alcides_alves_freitas.pdf: 1707403 bytes, checksum: f9233629066db73fd877b2885aa875bd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T14:47:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) alcides_alves_freitas.pdf: 1707403 bytes, checksum: f9233629066db73fd877b2885aa875bd (MD5) Previous issue date: 2017 / O boldo da terra (Plectranthus barbatus) ? popularmente utilizado para o tratamento de dist?rbios gastrintestinais e para doen?as hep?ticas. Devido ? exist?ncia de um grande n?mero de esp?cies dispon?veis para pesquisa e estudos farmacol?gicos, o estudo dessa planta torna-se importante para o conhecimento t?cnico-cient?fico, especialmente com a finalidade do desenvolvimento de novos f?rmacos. Com isto, o objetivo desse trabalho foi detectar prote?nas ativas de Plectranthus barbatus (boldo da terra) e avaliar a atividade biol?gica em c?lulas A549 e RAW264.7. As amostras dos procedimentos de extra??o das folhas e caule do P. barbatus foram submetidas ? quantifica??o de prote?na. Foi detectado em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% prote?nas com peso molecular em torno de 30kDa e 94kDa o que ? descrito na literatura como lectinas e lipoxigenases. Os extratos foram caracterizados por cromatografia l?quida de alta efici?ncia com picos aparentes em 16 e 27 minutos. N?o foi detectada atividade de inibi??o da tripsina. Os resultados dos testes biol?gicos em cultura de c?lulas demonstraram que o extrato purificado de inibidores de protease n?o alterou a viabilidade celular de ambas as linhagens, no entanto, foi capaz de inibir a produ??o de ?xido n?trico na concentra??o de 10 ?g/ml para folha e caule e 100 ?g/ml para folha. Este trabalho demonstra pela primeira vez a extra??o de prote?nas em folhas e caule de Plectranthus barbatus e a atividade dessa mol?cula em cultura celular. Esse extrato n?o alterou a viabilidade celular de ambas as linhagens celulares, podendo ser caracterizados como n?o citot?xico nas concentra??es testadas. Conclui-se, portanto, que embora as folhas, caules e flores do Plectranthus barbatus seja utilizado amplamente pela popula??o esse trabalho demonstrou a detec??o de lectina e lipoxigenase at? agora desconhecidos nessa esp?cie em estudo. / Disserta??o (Mestrado Profissional) ? Programa de P?s-Gradua??o em Tecnologia, Sa?de e Sociedade, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2017. / The boldo da terra (Plectranthus barbatus) is popularly used for the treatment of gastrointestinal disorders and for liver diseases. Due to the existence of a large number of species available for research and pharmacological studies, the study of this plant becomes important for technical-scientific knowledge, especially for the purpose of developing new drugs. With this, the objective of this work was to detect active proteins of Plectranthus barbatus and to evaluate the biological activity in cells A549 and RAW264.7. Samples of P. barbatus leaf and stem extraction procedures were submitted to protein quantification. SDS-PAGE was detected in 12% proteins with molecular weight around 30kDa and 94kDa which is described in the literature as lectins and lipoxygenases. The extracts were characterized by high performance liquid chromatography with apparent peaks at 16 and 27 minutes. No trypsin inhibition activity was detected. The results of the biological tests in cell culture demonstrated that the purified protease inhibitor extract did not alter the cell viability of both strains, however, it was able to inhibit the production of 10 ?g / ml nitric oxide to leaf and And 100 ?g / ml for leaf. This work demonstrates for the first time the extraction of proteins in leaves and stem of Plectranthus barbatus and the activity of this molecule in cell culture. This extract did not alter the cellular viability of both cell lines and could be characterized as non-cytotoxic at the concentrations tested. It was concluded, therefore, that although the leaves, stems and flowers of Plectranthus barbatus were used extensively by the population, this work demonstrated the detection of lectin and lipoxygenase hitherto unknown in this species under study.

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_almeida_ioc_dout_2014.pdf: 10914971 bytes, checksum: 979497712c5a77cc8a8934caa85ef74e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania, protozoários veiculados por insetos flebotomíneos e responsáveis pelas leishmanioses visceral e tegumentar, se encontram amplamente distribuídos pelo mundo. O potencial adaptativo destes protozoários é um reflexo da diversidade biológica do gênero Leishmania, em especial a espécie Leishmania (Viannia) braziliensis, que se encontra em diversos biomas acometendo diferentes animais e vetores de acordo com a região que se encontra. Os estudos biológicos e de expressão gênica de fatores de virulência do parasito são importantes para auxiliar na elucidação destes mecanismos de adaptação. Portanto este trabalho tem o objetivo de avaliar variações biológicas e na expressão de genes de proteinases de L. (V.) braziliensis, cepa MCAN/BR/1998/R619 e seus clones. Inicialmente foi realizada uma análise do genoma de L. (V.) braziliensis frente aos de L. (L.) infantum, L. (L.) major e L. (L.) mexicana, com o propósito de identificar características espécie-específicas que possam contribuir para compreender as diferenças fenotípicas ou de virulência entre as espécies estudadas. Foi observado que todos os cromossomos das quatro espécies apresentam genes de proteases em diferentes quantidades; alto grau de conservação entre os alelos de proteases; e as sequências dos genes de proteases dos parasitos não apresentam similaridade entre as de genes de proteases de mamíferos. Portanto, a análise dos genomas das Leishmania spp. indica uma grande diversidade de genes da protease nestas espécies Posteriormente foram obtidos clones da cepa em estudo oriundos de um único promastigota e avaliados seu comportamento in vitro e o potencial biológico destes parasitos na infecção experimental in vitro. A cepa em estudo reúne vários clones de parasitos e estas produzem padrões distintos de infecção in vitro de macrófagos de camundongos BALB/c; com produção de citocinas no sobrenadante de forma heterogênea. Algumas são menos indutoras de IL-1\03B2 e IL-6, e as citocinas TNF-\03B1 e IL-12p70, bem como o óxido nítrico, são induzidas de forma equilibrada pelos clones estudados. Uma análise de agrupamento permitiu a classificação de dois grupos distintos dos clones obtidos neste estudo. O conjunto de dados que mais influenciou para a definição destes grupos foi os relativos à infecção em macrófagos peritoneais murinos. Isto ressalta a possibilidade de haver outros marcadores, não contemplados neste estudo, que influenciam no sucesso da adaptação da cepa em estudo ao hospedeiro vertebrado. Também foi observado que os clones da cepa expressam diferentemente os genes das quatro classes de proteinases. Os amastigotas expressam mais proteinases que os promastigotas. Entre os promastigotas há maior expressão de aspártico e metaloproteinase enquanto que os amastigotas expressam mais metalo e serino proteinases. A diversidade da espécie vista entre isolados pôde ser comprovada também dentro de uma única cepa. O conjunto de resultados agrupados aqui enfatiza a capacidade da L. (V.) braziliensis utilizar a plasticidade de seu genoma para modular seu fenótipo e aumentar suas chances de sobrevivência nos hospedeiros / Parasites of the genus Leishmania are protozoans transmitted during the bite of female phlebotomines and are the causative agents of visceral or tegumentary leishmaniasis, presenting a worldwide distribution. The adaptative potential of these protozoa is a reflection of their biological diversity, especially that of the species Leishmania (Viannia) braziliensis, which is found in many biomes and affect different animals and vectors. Studies about the biology of parasites and their expression of virulence factor genes are important to help on the elucidation of their mechanisms of adaptation. Therefore, the purpose of this work is to evaluate the the biology and expression of protease genes of L. (V.) braziliensis, strain MCAN/BR/1998/R619, checking for variations among clones of this strain. Initially, we performed a comparative analysis of L. (V.) braziliensis genome against L. (L.) infantum, L. (L.) major and L. (L.) mexicana genomes to identify species-specific features that could potentially relate to characteristic phenotypic and virulence traits of the species. We could observe that protease genes are present in all chromosomes of the studied species, but in different frequencies. Additionally, a high degree of alleles conservation was noted, as well as a prominent distinction among the protease gene sequences of parasites and those of mammals, with no similarity detected. Thus, the analysis of genome of Leishmania spp. pointed to a great diversity of protease genes in these species. In an additional analysis, we obtained clones from single promastigotes isolated from L. (V.) braziliensis strain MCAN/BR/1998/R619 and evaluated their behaviors in vitro as well as their potential to cause infection in BALB/c macrophage cultures. Our results suggested that this strain is, in fact, composed by many clones with different characteristics, as they are able to promote distinct patterns of infection in macrophages in vitro, with a heterogenic production of cytokines by these cells. While some clones induced lower IL-1β or IL-6 production, TNF-α, IL-12p70 and nitric oxide production were homogeneously induced by the clones. A cluster analysis led to the classification of two distinct groups of clones in this study. Data analysis indicated that the capacity to promote infection in murine macrophages was the feature that most contributed to the clusters definition. However, the possibility remain that other features, no analyzed in the present study, could also play important roles regarding the success the studied strain’s adaptation to the vertebrate host. It was also observed that the clones differentially expressed genes related to the four main protease classes of Leishmania: cysteine, serine, metallo and aspartic-proteinases. Generally, the amastigotes expressed higher levels of proteinases-related mRNAs than promastigotes. Also, it was observed that promastigotes express more aspartic and metalloproteinases mRNAs, while amastigotes express more metallo and serine proteinases mRNAs. Therefore, a reflection of the features diversity already reported among isolates of L. (V.) braziliensis can also be noted among clones of a single strain. The results gathered herein emphasize the ability of L. (V.) braziliensis to apply its genome plasticity to modulate its phenotype and, thus, increase its odds to survive in the vertebrate host.

Aeromonas são bactérias Gram-negativas aquáticas. Algumas espécies deste gênero são patógenos oportunistas de muitos animais aquáticos e terrestres, inclusive o homem. Vários fatores de virulência, tais como enterotoxinas, hemolisinas e outras enzimas, tem sido associados com a sua patogenicidade. As proteases extracelulares devem ser vistas como importantes enzimas envolvidas na versatilidade metabólica que possibilitam as Aeromonas persistir nos ambientes aquáticos, interagir com outros organismos, e causar doenças. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar: as diferenças nas atividades de proteases extracelulares e o perfil eletroforético entre espécies e isolados de Aeromonas, a especificidade por substratos de poteases de Aeromonas, e a clonagem e expressão heteróloga da elastase de Aeromonas. Os resultados mostraram que A. hydrophila apresenta maior atividade proteolítica, sem, entretanto exibir diferenças significativas entre isolados clínicos e ambientais. Zimogramas proteolíticos dos isolados de Aeromonas demonstraram diferentes perfis com 0 a 5 bandas, correspondendo a metalo, serino ou outras proteases. Duas proteases (56K Da e 22 KDa) apresentaram atividade sobre um grande espectro de substratos. A atividade caseinolítica de A. hydrophila IBAer 109 mostra um típico comportamento de "quorum sensing", sendo induzida por gelatina e reprimida por glicose, citrato e amônio. O gene da elastatse (ahyB) de A. hydrophila ATCC7966 foi clonado e expresso em E. coli sob controle do promotor lac. O transformante apresentou bandas proteolíticas de 63 e 38 KDa no espaço periplasmático e extracelular, indicando maturação parcial e dificuldade de secreção desta enzima. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-29T18:00:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jucimar Zacaria.pdf: 849191 bytes, checksum: 9baac0dee3cdbd7a5567a40e82068fff (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-29T18:00:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jucimar Zacaria.pdf: 849191 bytes, checksum: 9baac0dee3cdbd7a5567a40e82068fff (MD5) / Aeromonas are ubiquitous water-borne Gram-negative bacteria. Some species of this genus are opportunistic pathogens of a variety of aquatic and terrestrial animals, including humans. Several virulence determinants, such as enterotoxins, hemolysins and hydrolytic enzymes, have been implicated in their ability to cause diseases. Extracellular proteases may be regarded as important enzymes in the mechanisms that confer the metabolic versatility that allow Aeromonas to persist in aquatic habitats, to interact with other organisms, and to cause diseases. In this context, the objective of this work was to assess the extent of differences in extracellular proteases activity and electrophoretic profiles among Aeromonas strains, the substrate specificity among Aeromonas proteases, and the cloning and heterologous expression of Aeromonas elastase. The results showed that A. hydrophila has the highest proteolytic activity with no significant difference between clinical and environmental isolates. Protease zymograms of Aeromonas isolates showed different profiles with 0 to 5 bands, corresponding to metallo, serine and other proteases. Two proteases (56 KDa and 22 KDa) showed activity against a large spectrum of substrates. Caseinolytic activity of A. hydrophila IBAer 109 showed a typical "quorum sensing" behavior, and was induced by gelatin and repressed by glucose, citrate and ammonium. The elastase gene (ahyB) of A. hydrophila ATCC7966 was cloned and expressed in E. coli under the control of lac promoter. The transformant showed both periplasmic and extracellular proteolytic bands of 63 and 38KDa, indicating partial maturation and secretion difficulties.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-06-29T12:45:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE FINAL JULIETT XAVIER FICHA CATALOGRAFICA.pdf: 7964494 bytes, checksum: 4f95a881e713dadfb7a0c571d8b86036 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:45:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE FINAL JULIETT XAVIER FICHA CATALOGRAFICA.pdf: 7964494 bytes, checksum: 4f95a881e713dadfb7a0c571d8b86036 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / CAPEs / Carcaças e vísceras constituem um importante resíduo de processamento de peixes, podendo representar cerca de 70% do peso corporal da tilápia (Oreochromis niloticus). Esse material é uma fonte de biomoléculas, dentre elas proteínas e proteases, com propriedades interessantes para processos biotecnológicos como a produção de hidrolisado proteico de peixe (HPP). O objetivo do primeiro estudo foi avaliar o uso de resíduos do processamento de tilápia para produzir HPP. Assim, três condições de produção foram avaliadas: duas utilizando hidrolise enzimática com enzimas extraídas do intestino da tilápia em diferentes concentrações (HPP100, 100 mg de tecido/mL e HPP600, 600 mg de tecido/mL) e o terceiro utilizando 0.5% (v/v) de Alcalase (HPPcom), uma enzima comercial. Os extratos experimentais revelaram a presença de proteases totaias, tripsina, quimotripsina e leucinoaminopeptidase. O teor de proteínas, aminoácidos e ácidos graxos foram calculados em matéria seca. Depois de 4 horas de reação, o grau de hidrolise máximo (GH) do HPPcom, HPP100, HPP600 foram 34.73 ± 1.44%, 29.21 ± 0.79%, e 41.66 ± 1.33%, respectivamente. O perfil eletroforetico demonstrou bandas de 190 a 20 kDa (HPP100), 54 kDa (HPPcom) e 53 a 20 kDa (HPP600). O resultados dos teores proteicos foram, 584.8 g/kg, 492.3 g/kg, e 508.2 g/kg para HPPcom, HPP100, e HPP600, respectivamente. Metionina e lisina foram identificados em níveis de 32.0 e 77.0 g/kg (HPPcom), 31.0 e 64.0 g/kg (HPP100), e 33.0 e 69.0 g/kg (HPP600), respectivamente. O conteúdo de ácidos graxos polisanturados do HPPcom, HPP100 e HPP600 foram 101.0 g/kg, 138.0 g/kg e 70 g/kg, respectivamente, com predominância do ácido linoleico (C18:2n-6). O valor do IAAI foi de 1066.07, 688.4 e 738.51 no HPPcom, HPP100 e HPP600, respectivamente. A composição de aminoácidos, perfil lipídico e escore químico sugerem que todos os HPPs testados podem ser empregados como fonte proteica em dietas para organismos aquáticos. O segundo estudo comparou a eficiência de enzimas do intestino de tilápia (200 mg de tecido/mL) bruto e parcialmente purificados por precipitação salina (0 – 80%, v/v) e etanólica (0-30%, v/v), (30 – 70%, v/v) com duas enzimas comerciais Alcalase 0.5% (v/v) e Flavourzyme 0.5% (v/v) na hidrolise da carcaça da tilápia. O extrato enzimático semi-purificado com (NH4)2SO4 mostrou rendimento de 62.6% (ativ. esp. de 9.3 U/mg de tecido) e com etanol um rendimento de 42.6% (ativ. esp. de 37.0 U/mg de tecido) e 68.4% (33.9 U/mg de tecido). Após 4 horas de reação o HPPEC(200) mostrou maior GH (37.8%), seguidos por HPPA (35.3%), HPPET (33.2%), HPPAS (24.6%) e HPPF (18.5%). O perfil eletroforético demosntrou que o peso molecular dos HPPs variaram entre 116.25 a 29.05 KDa. O extrato bruto e os extratos semi-purificados foram mais eficientes na hidrolise da carcaça de tilápia que a enzima comercial Flavourzime. O terceiro estudo testou os efeitos da esterilização térmica, acidificação e irradiação na conservação de HPP. Foram realizadas análises físico-quimicas (TBARS, pH, composição centesimal), microbiológicas (mesófilos, piscicrófilos e microorganismos específicos) e sensorial (coloração) durante 60 dias. As análises mostraram que os HPPs possuem alto teor proteico e lipídico e são susceptíveis a mudanças de pH, oxidação lipídica e descoloração. A partir do décimo dia de estocagem todos os HPPs tiveram teores de TBARS aumentados e sofreram descoloração. O conteúdo proteico e lipídico foi alterado, mas não comprometeu o valor nutricional dos HPPs. A esterilização térmica com adição de ácidos e esterlização por irradiação foram eficientes na à eliminação dos microorganismos garantindo a segurança do produto por 60 dias de armazenamento. No quarto trabalho obteve-se uma patente referente à separação da parte lipídica da proteica do hidrolisado proteico de peixe a partir da irradiação. / Fish viscera and carcasses represent about 70% of body weight of tilapia (Oreochromis nilotic), and are known sources of biomolecules such as protein and proteases. These enzymes can be employed in various biotechnological processes, e.g. preparation of fish protein hydrolysates. In this way, the aims of the first study were to evaluate the use of processing waste from Nile tilapia (Oreochromis niloticus) as a source of protein and proteases to produce FPH. Three FPH production conditions were evaluated: two conditions used autolysis with enzymes extracted from the tilapia intestine at different concentrations (FPH100, 100 mg of tissue/mL and FPH600, 600 mg of tissue/mL) and the third used 0.5% (v/v) Alcalase (FPHcom), a commercial protease preparation. The experimentais extracts showed total proteolytic activities, trypsin, chymotrypsin, and leucine aminopeptidase activities proteases. Protein, amino acids and fatty acids content were calculated as DM basis. After a 4- h reaction, maximum hydrolysis percentages (DH) from FPHcom, FPH100, and FPH600 systems were 34.73 ± 1.44%, 29.21 ± 0.79%, and 41.66 ± 1.33%, respectively. The protein content in the resulting FPS were 584.8 g/kg, 492.3 g/kg, and 508.2 g/kg for FPHcom, FPH100, and FPH600, respectively. Methionine and lysine were found at levels of 32.0 and 77.0 g/kg (FPHcom), 31.0 and 64.0 g/kg (FPH100), and 33.0 and 69.0 g/kg (FPH600), respectively. Polyunsaturated fatty acid contents of FPHcom, FPH100, and FPH600 were 101.0 g/kg, 138.0 g/kg, and 70 g/kg, respectively, with a predominance of linoleic acid (C18:2n-6). IAAI reached a value of 1066.07 in FPHcom, 688.4 in FPH100 and 738.51 in FPH600. Amino acid composition, lipid profile, and amino acid score suggested that all of the experimental FPHs could be employed as a protein source in diets for aquatic organisms and other farmed animals. The second study compared the efficiency of the enzymes from tilapia intestine (200 mg tissue/mL) crude and partially purified by salting-in (0 - 80% v/v) and ethanol (0-30%, v/v), (30 - 70% v/v) with two commercial enzymes Alcalase 0.5% (v/v) and 0.5% Flavourzyme (v/v) hydrolysis of the carcass tilapia. The partial purified enzyme extract with (NH4)2SO4 showed a yield of 62.6% (act. esp. of 9.3 U/mg of tissue) and ethanol a yield of 42.6% (act. esp. of 37.0 U/mg tissue ) and 68.4% (33.9 U/mg tissue). After 4 hours the reaction, FPHEC (200) showed a higher DH (37.8%), followed by FPHA (35.3%), FPHET (33.2%), FHPAS (24.6%) and FPHF (18.5%). The electrophoretic profile of FPHs showed molecular weight ranged from 116.25 to 29.05 kDa. The crude extract and partial purified extracts were more effective in the hydrolysis of tilapia carcasses than commercial enzyme Flavourzime. The third study tested the effects of heat sterilization, irradiation and acidification in the conservation of FPH. They were carried out physical-chemical analysis (TBARS, pH, chemical composition), microbiological (mesophilic, piscicrophilic and specific microorganisms) and sensorial (color) for 60 days. Analyzes have shown that FPHs have high protein and lipid content and FPHs are susceptible to changes in pH, lipid oxidation and discoloration. From the 10th day of storage all FPH had increased TBARS levels and discoloration. The protein and lipid content has changed, but did not compromise the nutritional value of FPHs. Heat treatment with citric acid and gamma irradiation were effective in the removal of microorganisms pathogenic securing of the product for 60 days of storage. In the fourth work we obtained a patent for the separation of the lipid portion of the protein fish protein hydrolyzate from the irradiation.

Aeromonas são bactérias Gram-negativas aquáticas. Algumas espécies deste gênero são patógenos oportunistas de muitos animais aquáticos e terrestres, inclusive o homem. Vários fatores de virulência, tais como enterotoxinas, hemolisinas e outras enzimas, tem sido associados com a sua patogenicidade. As proteases extracelulares devem ser vistas como importantes enzimas envolvidas na versatilidade metabólica que possibilitam as Aeromonas persistir nos ambientes aquáticos, interagir com outros organismos, e causar doenças. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar: as diferenças nas atividades de proteases extracelulares e o perfil eletroforético entre espécies e isolados de Aeromonas, a especificidade por substratos de poteases de Aeromonas, e a clonagem e expressão heteróloga da elastase de Aeromonas. Os resultados mostraram que A. hydrophila apresenta maior atividade proteolítica, sem, entretanto exibir diferenças significativas entre isolados clínicos e ambientais. Zimogramas proteolíticos dos isolados de Aeromonas demonstraram diferentes perfis com 0 a 5 bandas, correspondendo a metalo, serino ou outras proteases. Duas proteases (56K Da e 22 KDa) apresentaram atividade sobre um grande espectro de substratos. A atividade caseinolítica de A. hydrophila IBAer 109 mostra um típico comportamento de "quorum sensing", sendo induzida por gelatina e reprimida por glicose, citrato e amônio. O gene da elastatse (ahyB) de A. hydrophila ATCC7966 foi clonado e expresso em E. coli sob controle do promotor lac. O transformante apresentou bandas proteolíticas de 63 e 38 KDa no espaço periplasmático e extracelular, indicando maturação parcial e dificuldade de secreção desta enzima. / Aeromonas are ubiquitous water-borne Gram-negative bacteria. Some species of this genus are opportunistic pathogens of a variety of aquatic and terrestrial animals, including humans. Several virulence determinants, such as enterotoxins, hemolysins and hydrolytic enzymes, have been implicated in their ability to cause diseases. Extracellular proteases may be regarded as important enzymes in the mechanisms that confer the metabolic versatility that allow Aeromonas to persist in aquatic habitats, to interact with other organisms, and to cause diseases. In this context, the objective of this work was to assess the extent of differences in extracellular proteases activity and electrophoretic profiles among Aeromonas strains, the substrate specificity among Aeromonas proteases, and the cloning and heterologous expression of Aeromonas elastase. The results showed that A. hydrophila has the highest proteolytic activity with no significant difference between clinical and environmental isolates. Protease zymograms of Aeromonas isolates showed different profiles with 0 to 5 bands, corresponding to metallo, serine and other proteases. Two proteases (56 KDa and 22 KDa) showed activity against a large spectrum of substrates. Caseinolytic activity of A. hydrophila IBAer 109 showed a typical "quorum sensing" behavior, and was induced by gelatin and repressed by glucose, citrate and ammonium. The elastase gene (ahyB) of A. hydrophila ATCC7966 was cloned and expressed in E. coli under the control of lac promoter. The transformant showed both periplasmic and extracellular proteolytic bands of 63 and 38KDa, indicating partial maturation and secretion difficulties.