Leptospiras são bactérias espiroquetas altamente móveis dotadas de estratégias que possibilitam grande eficiência nos processos de invasão e disseminação no hospedeiro. Nosso grupo demonstrou previamente que leptospiras patogênicas secretam proteases capazes de clivar e inativar moléculas-chave do sistema complemento humano, o que confere a essas bactérias a capacidade de driblar os mecanismos de defesa do sistema imune inato. Dada a rápida disseminação das leptospiras durante o processo de infecção, aventou-se a hipótese de que essas proteases secretadas pudessem alvejar uma gama maior de moléculas do hospedeiro. No presente estudo, a atividade proteolítica de proteínas secretadas por leptospiras sobre um painel de moléculas da matriz extracelular e do plasma foi avaliada. O sobrenadante de cultura da estirpe virulenta L. interrogans sorovar Kennewicki Fromm degradou fibrinogênio humano, fibronectina plasmática, colágeno Tipo I, e as proteoglicanas decorina, biglicam e lumicam. A atividade proteolítica foi inibida por 1,10-fenantrolina, sugerindo o envolvimento de metaloproteases. Laminina, matrigel, plasminogênio e trombina não foram clivados por proteases presentes nos sobrenadantes. Ainda, os dados indicam que a produção de proteases deve ser um determinante de virulência importante, uma vez que os sobrenadantes de estirpes saprófitas ou patogênicas atenuadas em cultura não apresentaram atividade proteolítica sobre componentes da matriz ou do plasma. A análise dos genomas de leptospiras disponíveis nos levou à identificação de quatro termolisinas, metaloproteases presentes apenas nas espécies patogênicas. Uma delas, codificada pele LIC13322, foi produzida na forma recombinante e apresentou atividade proteolítica sobre fibrinogênio, biglicam e decorina. Em paralelo, foram também realizadas análises comparativas dos exoproteomas das estirpes Fromm e Patoc I. Algumas metaloproteases que podem estar envolvidas na degradação de moléculas do hospedeiro foram identificadas. A capacidade de clivar moléculas do tecido conjuntivo e proteínas da cascata de coagulação pode certamente contribuir para a invasão e a destruição tecidual observadas durante a infecção por Leptospira. / Leptospires are highly motile spirochetes equipped with strategies for efficient invasion and dissemination within the host. Our group previously demonstrated that pathogenic leptospires secrete proteases capable of cleaving and inactivating key molecules of the human complement system, allowing these bacteria to circumvent host´s innate immune defense mechanisms. Given the successful dissemination of leptospires during infection, we wondered if such proteases would target a broader range of host molecules. In the present study, the proteolytic activity of secreted leptospiral proteases against a panel of extracellular matrix and plasma proteins was assessed. The culture supernatant of the virulent L. interrogans serovar Kennewicki strain Fromm degraded human fibrinogen, plasma fibronectin, collagen Type 1, and the proteoglycans decorin, biglycan, and lumican. Proteolytic activity was inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the participation of metalloproteases. Laminin, matrigel, plasminogen and thrombin were not cleaved by proteases present in the supernatants. Moreover, production of proteases might be an important virulence determinant since culture-attenuated or saprophytic Leptospira did not display proteolytic acticity against ECM or plasma components. A search against Leptospira genomes allowed identification of four thermolysins, which are metalloproteases found exclusively in pathogenic species. One of them, encoded by LIC13322, was produced in the recombinant form and displayed proteolytic activity against fibrinogen, biglycan and decorin. Comparative exoproteomic analyses using Fromm and Patoc I strains were also performed and allowed identification of a few metalloproteases that could be involved in the degradation of host components. The ability to cleave connective tissue molecules and coagulation cascade proteins may certainly contribute to invasion and tissue destruction observed upon infection with Leptospira.

Neste trabalho está descrito a síntese e avaliação biológica de uma série de compostos de selênio(IV) e telúrio(IV). Esta série foi planejada para que diferentes fatores estruturais pudessem ser avaliados e as possíveis relações entre a estrutura e atividade biológica dos compostos pudessem ser determinadas. Para tanto, selênio, telúrio, cloro e bromo foram diferentemente combinados em um esqueleto carbônico simples, contendo ou não um centro assimétrico. Os compostos de interesse foram sintetizados empregando metodologias quimio-enzimáticas, quando necessário, e reações clássicas da química do selênio e telúrio, levando aos compostos de interesse em poucas etapas e com bons rendimentos. No caso dos ensaios biológicos, parâmetros como potência relativa, constante de inibição de segunda-ordem, mecanismo de inibição, CI50 e viabilidade celular foram determinados dentro das possibilidades experimentais envolvendo cada enzima. As possíveis combinações deram origem a 12 compostos que foram avaliados como inibidores de cisteíno catepsinas B, K, V e S onde a potência relativa dos mesmos pode ser determinada. Para as cisteíno catepsinas V e S, as constantes de inibição de segunda-ordem foram determinadas e ficou evidenciado que a combinação entre telúrio e bromo leva aos compostos mais potentes para estas proteases, enquanto que a combinação entre selênio e cloro origina os inibidores menos potentes. A combinação, selênio e bromo, ou telúrio e cloro forneceu inibidores com potências intermediárias. Este foi o primeiro estudo descrevendo compostos de selênio(IV) como inibidores de proteases. Os mesmos compostos também foram avaliados como inibidores do proteassomo 20S, uma treonino protease, onde se pode observar pela primeira vez que compostos de selênio e telúrio atuam como inibidores desta protease. Os valores de CI50 dos compostos foram determinados e novamente os compostos de telúrio mostraram-se mais potentes do que seus congêneres de selênio. Por outro lado, ensaios em células demonstraram que os compostos de telúrio são direcionados a outro alvo biológico, diferentemente dos compostos de selênio que continuaram a inibir o proteassomo em um lisado celular. Em ensaios de viabilidade celular ficou evidenciado que os compostos de selênio foram mais citotóxicos do que os de telúrio, o que se mostrou muito interessante para desenvolvimento de um agente anticancer onde a resposta biológica desejada é a morte celular. / The synthesis and biological evaluation of a series of selenium(IV) and tellurium(IV) compounds have been described in this research. This series was designed to allow different structural factors to be evaluated, and the possible strutucture-activity relationships determinated. Selenium, tellurium, chlorine and bromine were differently combined in a carbon backbone with or without an asymmetric center. The compounds were synthetized by using both chemo-enzymatic methodology and classical selenium and tellurium chemistry. From biological assays, relative potency, second-order inactivation constant, inhibition mechanism, IC50 and cell viability were determinated according to the experimental possibilities involving each enzyme protocol. The 12 compounds synthesized from the possible combinations among selenium, tellurium, chlorine and bromine were evaluated as cysteine cathepsins B, K, V and S inhibitors, and their relative potencies were determined. By determining the second-order inactivation constant for cysteine cathepsins V and S, it was shown that a tellurium and bromine combination led to most powerfull inhibitors. Selenium and chlorine combination led to less potent inhibitiors, while selenium and bromine, and tellurium and chlorine led to inhibitors with intermediate potency. Those compounds were also evaluated as 20S proteasome inhibitors, a threonine protease. We first observed selenium and tellurium-containing compounds acting as inhibitors of 20S proteasome. The IC50 values were determinate and tellurium compounds were more potent again. On the other hand, tellurium compound did not inhibit proteasome in cells, while selenium-containing compound does it. By cell viability assays it was verified that selenium-containing compounds were more cytotoxic than their tellurium analogs. This data is interesting for someone that wishes to develop an anti-cancer agent where the biological response desired is death of cancerous cells.

O filo Cyanobacteria constitui um grupo filogeneticamente coerente, embora, apresente grande diversidade morfológica, sendo sua sistemática constantemente revisada. Esses micro-organismos são, ainda, alvos de estudos biotecnológicos em razão da produção de toxinas e na busca por substâncias de interesse farmacológico. Dentre as linhagens analisadas neste estudo, sete sequências do gene rRNA 16S foram geradas e avaliadas com sequências previamente obtidas. Ao menos dois grupos podem representar novos gêneros de cianobactérias, sendo que um grupo demonstra ser endêmico de manguezais brasileiros. Os genes de inibidores de proteases, aeuruginosina, cianopeptolina e microviridina, foram detectados e a produção de aeruginosina foi confirmada por LC-MS nos gêneros Cyanobium e Nostoc. Sequências de aminoácidos do precursor de microviridina indicaram a produção de três novas variantes em quinze linhagens de cianobactérias dos gêneros Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nodosilinea e Nostoc. O potencial genético para produção de cilindrospermopsina (cyrJ) foi confirmado em vinte e seis linhagens. Em cinco linhagens dos gêneros Cyanobium e Nostoc foram encontrados os genes mcyD, mcyE e mcyG, envolvidos na biossíntese de microcistina. A sequência McyG da linhagem Nostoc sp. CENA175 agrupou-se filogeneticamente com outras de linhagens produtoras de microcistina. Os genes sxtA e sxtI, envolvidos na biossíntese de saxitoxina, foram encontrados em nove linhagens dos gêneros Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea e Nostoc. A sequência de SxtI da linhagen Leptolyngbya sp. CENA134 apresentou similaridade >= 70 % com proteínas hipotéticas enquanto as de Nostoc sp. CENA159 e Nostoc sp. CENA160 apresentaram similaridade >= 82 % com O-carbamoiltransferase. Na análise filogenética, a sequência de SxtI da linhagem Nostoc sp. 160 agrupou-se com sequências de linhagens produtoras de saxitoxina. Nas análises químicas, a fração 3 do extrato da linhagem Oxynema sp. CENA135 revelou uma substância com características de ácidos graxos poli-insaturados e a fração 2 do extrato da linhagem Nostoc sp. CENA175 apresentou uma estrutura aromática ligada a uma cadeia alifática. Outros três extratos, obtidos das linhagens Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 e Nostoc sp. CENA184 mostraram-se promissores quanto à presença de substâncias nitrogenadas. Os ensaios de bioatividade revelaram que 48 % dos extratos metanólicos inibiram o crescimento de ao menos um isolado de bactéria e/ou levedura. Os extratos das linhagens Cyanobium sp. CENA142 e Cyanobacterium sp. CENA169 foram eficientes contra o crescimento de seis bactérias patogênicas. Nos ensaios de inibição de células tumorais, o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiu moderadamente culturas de células 3LL. Os extratos etanólicos de Oxynema sp. CENA135 (20 ?gomL-1) e Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiram as células CT-26. Em ensaios conduzidos com linhagens de células de glioma (U251), câncer de mama (MCF-7) e câncer de pulmão (NCI-H460), o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA136 inibiu 50 % do crescimento das respectivas células tumorais nas concentrações 7,8; 27,1 e 14,0 ?gomL-1. Desta forma, além de filogeneticamente diversas, as cianobactérias isoladas de ambiente marinho do Estado de São Paulo constituem fonte promissora de inibidores de proteases, cianotoxinas e substância bioativas com ação antibacteriana, antifúngica e antitumoral. / The phylum Cyanobacteria is a phylogenetically coherent group, although presenting great diversity, and its systematic have been constantly reviewed. These microorganisms are also targets of biotechnological studies due to the production of toxins and the search for novel substances of pharmacological interest. Among the strains analyzed in this study, sequences of the 16S rRNA gene were generated for seven and, than, analyzed with sequences previously obtained. At least two groups may represent new cyanobacterial genera, while a group of Cyanobium proves to be endemic of Brazilian mangroves. Genes of the proteases inhibitors, aeuruginosin, cyanopeptolin and microviridin, were detected and the production of aeruginosin was confirmed by LC-MS for Nostoc and Cyanobium. The amino acid sequences of microviridin precursor indicated the production of three new variants in fifteen cyanobacterial strains of the genera Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nostoc and Nodosilinea. The genetic potential for production of cylindrospermopsin (cyrJ) was confirmed in twenty-six strains. In five strains of the genera Nostoc and Cyanobium the mcyD, mcyE and mcyG genes, which are involved in the microcystin biosynthesis, were found. The McyG sequence of Nostoc sp. CENA175 was phylogenetically grouped with sequences of microcystin-producing strains. The sxtA and sxtI genes, from saxitoxin biosynthesis, were found in nine strains of the genera Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea and Nostoc. The SxtI sequence of Leptolyngbya sp. CENA134 showed similarity >= 70 % with hypothetical proteins, while the sequences of Nostoc sp. CENA159 and Nostoc sp. CENA160 showed similarity >= 82% with O-carbamoyltransferase. In the phylogenetic analysis, the SxtI sequence of Nostoc sp. CENA160 grouped with sequences of strains that produce saxitoxin. In chemical analysis, the fraction 3 of the Oxynema sp. CENA135 extract revealed a substance with poly-unsaturated fatty acids characteristics and the fraction 2 of Nostoc sp. CENA175 extract indicated an aromatic structure, attached to an aliphatic chain. Other three extracts obtained from Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 and Nostoc sp. CENA184 were promising for the presence of nitrogenous substances. Bioactivity assays revealed that 48 % of the methanolic extracts inhibited the growth of at least one isolate of bacteria and/or yeast. The extracts of Cyanobium sp. CENA142 and Cyanobacterium sp. CENA169 were efficient against six pathogenic bacteria. In the inhibition assays of tumor cells, the DCM extract of Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) moderately inhibited the growth of 3LL cells. Ethanol extracts of Oxynema sp. CENA135 (20 mgomL-1) and Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) were able to inhibit cultures of CT- 26 cells. In tests conducted with glioma cell lines (U251), breast cancer (MCF-7) and lung cancer (NCI-H460), the DCM extract of Cyanobium sp. CENA136 caused 50 % of growth inhibition, respectively, when used at concentrations of 7.8, 27.1 and 14.0 mgomL-1. Thus, besides their phylogenetically diversity, the cyanobacteria strains from marine environment of the São Paulo state are a promising source of protease inhibitors, cyanotoxins and bioactive compounds with antibacterial, antifungal and antitumor activities.

Este trabalho relata o isolamento e caracterização bioquímica parcial de componentes do veneno de Tityus serrulatus (VTs) com ação sobre o sistema complemento (SC). O procedimento de purificação envolveu uma cromatografia de troca iônica do VTs em CM-celulose-52, em pH 7,8 e doze frações foram obtidas, denominadas de I a XIII. A fração I, que apresenta atividade sobre o SC sérico, foi filtrada em Sephacryl S-200 e dez subfrações foram obtidas e denominadas I-1 a I-10. A subfração I-1 foi recromatografada em uma coluna de DEAE-Sepharose, em pH 7,8. Cinco subfrações foram obtidas (DE-1 a DE-5) e as subfrações DE-2, DE-3 e DE-4 incubadas com soro humano normal (SHN) induziram redução da atividade lítica da via clássica/lectina (VC/L) de forma concentração-dependente. A subfração DE-2 apresentou uma banda eletroforética única no gel de eletroforese de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), com peso molecular (PM) de aproximadamente 247.000 na ausência de b-mercaptoetanol e seis bandas na presença de b-mercaptoetanol. O procedimento de purificação dos componentes ativos da subfração I-4 envolveu basicamente uma cromatografia de troca iônica em Mono-Q, em pH 7,1. Sete subfrações (MQ-1 a MQ-7) foram obtidas neste passo cromatográfico. As proteínas MQ-5 e MQ-7 da subfração I-4 induziram redução da atividade hemolítica das VC/L e via alternativa (VA). Com o objetivo de investigar o mecanismo de ação sobre o SC, SHN foi incubado com a subfração I-4 ou seus componentes (MQ-5 e MQ-7). A imunoeletroforese mostrou a clivagem do fator B e de C3 por estas proteínas, similar ao induzido pela incubação de SHN com zimosan, o que confirma a hipótese de que MQ-5 e MQ-7 induzem a ativação do SC. A capacidade de gerar fatores quimiotáticos no soro foi investigada. Nas condições experimentais, a incubação de SHN com a subfração I-4, proteínas MQ-5 e MQ-7 induziu a migração de neutrófilos similar a induzida pela incubação de soro com zimosan, demonstrando que estas proteínas induzem clivagem de C3 e C5, gerando os fragmentos ativos de C3a e C5a. As proteínas MQ-5 e MQ-7 não foram capazes de lisar eritrócitos de coelho e carneiro. MQ-5 e MQ-7 não induziram redução da atividade hemolítica da VC/L após o aquecimento a 100ºC, portanto a ação destas proteínas não é conseqüência da presença de produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS). As proteínas MQ-5 e MQ-7 apresentaram atividade fibrinogenolítica e caseinolítica e são metaloproteases, já que a atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10-fenantrolina. Ambas proteínas apresentaram uma banda eletroforética única por SDS-PAGE, com um PM aproximado de 24.500 na ausência de b-mercaptoetanol, 33.100 na presença de b-mercaptoetanol e um ponto isoelétrico de 4,2. A seqüência N-terminal (Degradação de Edman) e a seqüência de peptídeos trípticos (Espectrometria de massa ESI-MS/MS) de MQ-5 e MQ-7 foram determinadas. Ambas proteínas apresentaram seqüência similar de aminoácidos. Em resumo, este trabalho mostrou que o VTs contém proteases (MQ-5 e MQ-7, metaloproteases) que são capazes de ativar o SC e podem ser importantes no processo inflamatório que ocorre em conseqüência do envenenamento. Além disso, estas proteínas podem ser usadas para depledar o SC em modelos experimentais de doenças em que este sistema está envolvido. / This work reports the isolation and partial biochemical characterization of components from Tityus serrulatus venom (TsV) with action on the complement system (CS). The purification procedure involved an ion-exchange chromatography of TsV on CM-celullose-52, at pH 7.8, twelve fractions were obtained and named I to XIII. Fraction I, showing activity on the serum CS, was filtered on Sephacryl S200 and ten subfractions were obtained and denominated I-1 to I-10. The subfraction I-1 was rechromatographed on a column of DEAE-sepharose, at pH 7.8. Five subfractions were obtained (DE-1 to DE-5) and subfractions DE-2, DE-3 and DE-4 incubated with NHS induced a concentration-dependent reduction in lytic activity of CP/L. Subfraction DE-2 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with a molecular weight (MW) of approximately 247,000 in the absence of -mercaptoethanol and six bands in the presence of -mercaptoethanol. The purification procedure of the active compounds of subfraction I-4 involved basically an ion-exchange chromatography on Mono-Q, at pH 7.1. Seven subfractions (MQ-1 to MQ-7) were obtained in this chromatography step. We found that proteins MQ-5 and MQ-7 of subfraction I-4 induced reduction in hemolytic activity for CP/L and AP. In order to investigate the mechanism of action on the CS, NHS was incubated with subfraction I-4 or its components (MQ-5 and MQ-7). The immunoelectrophoresis showed cleavage of factor B and C3 by these proteins, similar to that induced by incubation of NHS with zymosan, which corroborated the hypothesis that MQ-5 and MQ-7 induce activation of the CS. Their capacitiy to elicit serum-induced chemotaxis was then investigated. Under our assay conditions, incubation of NHS with subfraction I-4, protein MQ-5 and MQ-7 induced neutrophil migration similar to that induced by incubation of serum with zymosan, showing that the proteins induce cleavage of C3 and C5, thereby generating the active fragments C3a and C5a. Proteins MQ-5 and MQ-7 alone were unable to lyse rabbit or sheep erythrocytes. MQ-5 and MQ-7 did not induce reduction in hemolytic activity for CP/L after being heated to 100ºC, therefore the action of these proteins is not a consequence of the presence of bacterial products, such as lipopolyssaccharides (LPS). Proteins MQ-5 and MQ-7 showed fibrinogenolytic and caseinolytic activities and they probably are metalloproteases, since its fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenantroline. Both MQ-5 and MQ-7 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with an approximate MW of 24,500 in the absence of -mercaptoethanol, 33,100 in the presence of -mercaptoethanol and an isoelectric point of 5.9. The N-terminal sequence (Edman Degradation) and the sequence of tryptic peptides (Mass spectrometry- ESI-MS/MS) from MQ-5 e MQ-7 were determined. The proteins MQ-5 e MQ-7 showed similar sequence of aminoacids. In summary, this work showed that the TsV venom contains proteases (MQ-5 and MQ-7, metalloproteases) which are able to activate the CS, and may therefore be important in the context of the inflammatory process occurring in consequence of envenomation. In addition these proteins may be used to deplete complement in experimental models of diseases involving participation of this system.

A leptospirose é causada por bactérias que pertencem ao gênero Leptospira. Em um estudo realizado por nosso grupo, observou-se que as proteases secretadas por leptospiras patogênicas foram capazes de clivar a molécula C3 do Complemento e seus fragmentos C3b e iC3b, além de Fator B, C4b e C2. Neste trabalho expandimos a análise da atividade proteolítica sobre os componentes do Complexo de Ataque à Membrana (MAC): C6, C7, C8 e C9. Nós observamos que essas proteases clivam todos os componentes do MAC inclusive o complexo solúvel formado e que essas clivagens ocorrem de modo tempo-dependente. Além disso, as clivagens dessas moléculas ocorrem de modo seletivo, pois mesmo utilizando quantidades reduzidas de sobrenadantes ainda foi possível observar produtos de clivagem. A atividade proteolítica foi inibida pela 1,10fenantrolina, indicando a participação de metaloproteases. O reconhecimento de quais moléculas do MAC são clivadas por proteases de leptospiras patogênicas pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na infecção por estes patógenos. / Leptospirosis is a zoonosis caused by spirochetes from the genus Leptospira. In a previous study, our group observed that the proteases secreted by Pathogenic Leptospira were capable of cleaving C3 of Complement, as well as the fragments C3b and iC3b, Factor B (Alternative Pathway), C4 and C2 (Classical and Lectin Pathways). In this work, we analyze the activity of the leptospiral proteases on the components of Membrane Attack Complex (MAC). We observed that the protease cleaves all MAC components including soluble complex formed and that these cleavages occur in a time-dependent manner and in a selective way, since even when reduced quantities of supernatants were used, the cleavage products were still observed. The proteolytic activity was inhibited by 1,10phenanthroline, indicating the participation of metalloproteinases. The recognition that MAC molecules are cleaved by proteases of pathogenic leptospires can contribute to the development of therapeutic strategies for the infection by these pathogens.

Neste trabalho está descrito a síntese e avaliação biológica de uma série de compostos de selênio(IV) e telúrio(IV). Esta série foi planejada para que diferentes fatores estruturais pudessem ser avaliados e as possíveis relações entre a estrutura e atividade biológica dos compostos pudessem ser determinadas. Para tanto, selênio, telúrio, cloro e bromo foram diferentemente combinados em um esqueleto carbônico simples, contendo ou não um centro assimétrico. Os compostos de interesse foram sintetizados empregando metodologias quimio-enzimáticas, quando necessário, e reações clássicas da química do selênio e telúrio, levando aos compostos de interesse em poucas etapas e com bons rendimentos. No caso dos ensaios biológicos, parâmetros como potência relativa, constante de inibição de segunda-ordem, mecanismo de inibição, CI50 e viabilidade celular foram determinados dentro das possibilidades experimentais envolvendo cada enzima. As possíveis combinações deram origem a 12 compostos que foram avaliados como inibidores de cisteíno catepsinas B, K, V e S onde a potência relativa dos mesmos pode ser determinada. Para as cisteíno catepsinas V e S, as constantes de inibição de segunda-ordem foram determinadas e ficou evidenciado que a combinação entre telúrio e bromo leva aos compostos mais potentes para estas proteases, enquanto que a combinação entre selênio e cloro origina os inibidores menos potentes. A combinação, selênio e bromo, ou telúrio e cloro forneceu inibidores com potências intermediárias. Este foi o primeiro estudo descrevendo compostos de selênio(IV) como inibidores de proteases. Os mesmos compostos também foram avaliados como inibidores do proteassomo 20S, uma treonino protease, onde se pode observar pela primeira vez que compostos de selênio e telúrio atuam como inibidores desta protease. Os valores de CI50 dos compostos foram determinados e novamente os compostos de telúrio mostraram-se mais potentes do que seus congêneres de selênio. Por outro lado, ensaios em células demonstraram que os compostos de telúrio são direcionados a outro alvo biológico, diferentemente dos compostos de selênio que continuaram a inibir o proteassomo em um lisado celular. Em ensaios de viabilidade celular ficou evidenciado que os compostos de selênio foram mais citotóxicos do que os de telúrio, o que se mostrou muito interessante para desenvolvimento de um agente anticancer onde a resposta biológica desejada é a morte celular. / The synthesis and biological evaluation of a series of selenium(IV) and tellurium(IV) compounds have been described in this research. This series was designed to allow different structural factors to be evaluated, and the possible strutucture-activity relationships determinated. Selenium, tellurium, chlorine and bromine were differently combined in a carbon backbone with or without an asymmetric center. The compounds were synthetized by using both chemo-enzymatic methodology and classical selenium and tellurium chemistry. From biological assays, relative potency, second-order inactivation constant, inhibition mechanism, IC50 and cell viability were determinated according to the experimental possibilities involving each enzyme protocol. The 12 compounds synthesized from the possible combinations among selenium, tellurium, chlorine and bromine were evaluated as cysteine cathepsins B, K, V and S inhibitors, and their relative potencies were determined. By determining the second-order inactivation constant for cysteine cathepsins V and S, it was shown that a tellurium and bromine combination led to most powerfull inhibitors. Selenium and chlorine combination led to less potent inhibitiors, while selenium and bromine, and tellurium and chlorine led to inhibitors with intermediate potency. Those compounds were also evaluated as 20S proteasome inhibitors, a threonine protease. We first observed selenium and tellurium-containing compounds acting as inhibitors of 20S proteasome. The IC50 values were determinate and tellurium compounds were more potent again. On the other hand, tellurium compound did not inhibit proteasome in cells, while selenium-containing compound does it. By cell viability assays it was verified that selenium-containing compounds were more cytotoxic than their tellurium analogs. This data is interesting for someone that wishes to develop an anti-cancer agent where the biological response desired is death of cancerous cells.

Dermatófitos são fungos filamentosos que infectam substratos queratinizados como pele, unha e cabelo em busca de nutrientes para se desenvolverem e permanecerem no hospedeiro. Pertencem aos gêneros Epidermophyton, Microsporum ou Trichophyton, os quais, dependendo de seu habitat natural, são classificados em espécies geofílicas, zoofílicas ou antropofílicas. O uso indiscriminado de antifúngicos levou à seleção de cepas resistentes, e o comportamento invasivo desses patógenos em pacientes imunodeprimidos aumentou nos últimos anos, dificultando o tratamento das dermatofitoses. Há, portanto, a necessidade de estudos para um melhor entendimento da biologia dos dermatófitos devido as suas importâncias médica e/ou veterinária e o escasso conhecimento da interação destes patógenos com os hospedeiros. No presente trabalho, analisamos oito espécies de dermatófitos: Arthroderma benhamiae, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton equinum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans e Trichophyton verrucosum. Análises de genômica comparativa e de expressão de genes potencialmente envolvidos na degradação de queratina foram realizadas. Além disso, efetuamos o sequenciamento genômico em larga escala de uma das linhagens. A estrutura dos genes sub3, sub5 e sub7, que codificam serina endopeptidases com atividade queratinolítica, mep3 e mep4, que codificam proteínas pertencentes ao grupo das metaloendopeptidases, dppV, lap1 e lap2, que codificam exopeptidases, foi analisada por meio de ferramentas computacionais. Essas análises revelaram que os genes que codificam proteases possuem alto grau de conservação em suas estruturas, que é menor quando comparadas apenas suas regiões não codificadoras. As análises permitiram também a identificação em regiões promotoras de consensos específicos a gêneros de dermatófitos. Observamos que o acúmulo de transcritos destes genes, avaliados durante o cultivo em queratina, mimetizando o processo infeccioso, não está correlacionado à similaridade das sequências gênicas entre as espécies. Não encontramos correlação entre o nicho preferencial dos dermatófitos e suas sequências gênicas ou níveis transcricionais. Observamos que, na grande maioria das vezes, genes que codificam endo e exopeptidases, possuem acúmulo de transcritos em períodos iniciais de degradação de queratina. Nossos resultados sugerem que diferenças pontuais na sequencia gênica, diferenças em regiões promotoras ou, até mesmo, expressão variável destes genes que codificam um conjunto proteico com funções sinérgicas e provavelmente compensatórias, contribuam para os diferentes graus de reações inflamatórias no hospedeiro, bem como para a especificidade patógeno-hospedeiro. / Dermatophytes are filamentous fungi that infect keratinized substrates such as skin, nail and hair, searching for nutrients for their development and permanence in the host. They belong to the genera Epidermophyton, Microsporum or Trichophyton, and, depending on their natural habitat, are classified into geophilics, zoophilics or anthropophilics species. The indiscriminate use of antifungals has led to the selection of resistant strains, and the invasive behaviour of these pathogens in immunocompromised patients increased in the last years, hampering the treatment of the dermatophytoses. Therefore, there is a need of studies for a better understanding of the biology of the dermatophytes due to their medical and/or veterinary importance and the scarce knowledge about the interaction of these pathogens with their hosts. In this work, we analyzed eight species of dermatophytes: Arthroderma benhamiae, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton equinum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, and Trichophyton verrucosum. Comparative genomics and gene expression analyses of genes potentially involved in keratin degradation were performed. Moreover, we performed a large-scale genome sequencing of one of the strains. The structure of the genes sub3, sub5, and sub7, which encode serine endopeptidases with keratinolytic activity, mep3, and mep4, which encode proteins belonging to the group of the metalloendopeptidases, dppV, lap1, and lap2, encoding exopeptidases, were analyzed by computational tools. These analyses revealed that the genes encoding proteases possesses high degree of conservation in their structures, which are lower when their non-coding regions are compared. The analyses also allowed the identification of consensus in promoter regions, specific of dermatophytes genera. We observed that the transcripts accumulation of these genes, evaluated during the cultivation in keratin, mimicking the infection process, is not correlated to the gene sequence similarities among the species. We have not found any correlation between the preferential niche of dermatophytes and their gene sequences or transcription levels. Most of the times, we observed that genes encoding endo and exopeptidases accumulated transcripts at the beginning of keratin degradation. Our results suggest that specific differences in the genic sequencing, differences in promoter regions, or even variable expression of these genes encoding a set of proteins with synergic and probably compensatory functions, contribute to different levels of inflammatory reactions in the host, as well as to the host-pathogen specificity.

A leptospirose é causada por bactérias que pertencem ao gênero Leptospira. Em um estudo realizado por nosso grupo, observou-se que as proteases secretadas por leptospiras patogênicas foram capazes de clivar a molécula C3 do Complemento e seus fragmentos C3b e iC3b, além de Fator B, C4b e C2. Neste trabalho expandimos a análise da atividade proteolítica sobre os componentes do Complexo de Ataque à Membrana (MAC): C6, C7, C8 e C9. Nós observamos que essas proteases clivam todos os componentes do MAC inclusive o complexo solúvel formado e que essas clivagens ocorrem de modo tempo-dependente. Além disso, as clivagens dessas moléculas ocorrem de modo seletivo, pois mesmo utilizando quantidades reduzidas de sobrenadantes ainda foi possível observar produtos de clivagem. A atividade proteolítica foi inibida pela 1,10fenantrolina, indicando a participação de metaloproteases. O reconhecimento de quais moléculas do MAC são clivadas por proteases de leptospiras patogênicas pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na infecção por estes patógenos. / Leptospirosis is a zoonosis caused by spirochetes from the genus Leptospira. In a previous study, our group observed that the proteases secreted by Pathogenic Leptospira were capable of cleaving C3 of Complement, as well as the fragments C3b and iC3b, Factor B (Alternative Pathway), C4 and C2 (Classical and Lectin Pathways). In this work, we analyze the activity of the leptospiral proteases on the components of Membrane Attack Complex (MAC). We observed that the protease cleaves all MAC components including soluble complex formed and that these cleavages occur in a time-dependent manner and in a selective way, since even when reduced quantities of supernatants were used, the cleavage products were still observed. The proteolytic activity was inhibited by 1,10phenanthroline, indicating the participation of metalloproteinases. The recognition that MAC molecules are cleaved by proteases of pathogenic leptospires can contribute to the development of therapeutic strategies for the infection by these pathogens.

nÃo hà / Studies have shown that latex of plants is a rich source of enzymes with proteolytic activities. Isolation and characterization of cysteine proteases of latex have recently been reported. In this work we report the purification and characterization of three new cysteine proteases of laticifer fluid of Calotropis procera, as well as its activity in plasma coagulation assays. The three proteases, termed CpCP-1, 2-CpCP and CpCP-3 are isoforms of cysteine proteases and were purified using two sequential steps of ion exchange chromatography on CM-Sepharose and Resource S columns, coupled to FPLC system. Their molecular masses were determined by ESI-Q-TOF mass spectrometry: CPCP-1 had mass = 26.213, CPCP-2 = 26.133 and CPCP-3 = 25.086 Da. The amino acid sequences of the N-terminal region was identical for all three enzymes, being composed of 30 amino acid residues. Analysis revealed high sequence identity with others cysteine proteases. The proteolytic activity of these enzymes was tested against different substrates (azocasein, BANA and BApNA) and at different pH and temperature. The three enzymes are capable of degrading azocasein and BANA, substrates nonspecific and specific for cysteine proteases, respectively. CPCP-1 showed proteolytic activity twice that CPCP-3, and this, a little bigger than CPCP-2. Enzymes maintained 60-80% of their activities even when tested at 60 ÂC temperature, and the optimum pH for these activities was 6.0. Circular Dichroism Analysis showed that the secondary structure of the proteases was composed of 15.1 to 19.9% of alpha-helices and 20.6 to 21.3% of beta-sheets. The spectra deconvolution of proteases showed that their structures were altered in the presence of the reducing agent DTT, suggesting the presence of disulfide bridges stabilizing the three dimensional structures. In biological tests proteases were able to strongly inhibit the germination of spores of the fungus Colletotrichum gloeosporioides and also exhibited plasma coagulation activity by thrombin-like mechanism. / Estudos tÃm demonstrado que lÃtex de plantas à uma rica fonte de enzimas com atividades proteolÃticas. O isolamento e a caracterizaÃÃo de proteases cisteÃnicas de lÃtex tÃm sido recentemente relatados. Neste trabalho nÃs reportamos a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo de trÃs novas proteases cisteÃnicas do fluido laticÃfero de Calotropis procera, bem como sua atividade em ensaios de coagulaÃÃo plasmÃtica. As trÃs proteases, denominadas CpCP-1, CpCP-2 e CpCP-3 sÃo isoformas de proteases cisteÃnicas e foram purificadas utilizando dois passos sequenciais de cromatografias de troca iÃnica em colunas de CM-Sepharose e Resource S, acoplada a sistema FPLC. Suas massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massas em aparelho do tipo ESI-Q-TOF, onde: CpCP-1 apresentou massa=26,213, CpCP-2=26,133 e CpCP-3=25,086. A sequÃncia de aminoÃcidos da regiÃo N-terminal foi idÃntica para as trÃs enzimas, sendo constituÃda de 30 resÃduos de aminoÃcidos. AnÃlises de sequÃncias revelaram alto nÃvel de identidade (88%) com proteases cisteÃnicas A atividade proteolÃtica dessas enzimas foi testada frente a diferentes substratos (AzocaseÃna, BANA e BApNA) e em diferentes valores de pH e temperatura. As trÃs enzimas foram capazes de degradar AzocaseÃna e BANA, substratos inespecÃfico e especÃfico para proteases cisteÃnicas, respectivamente. CpCP-1 apresentou atividade proteolÃtica duas vezes maior que CpCP-3, e esta, um pouco maior que CpCP-2. As enzimas mantiveram 60-80% de suas atividades mesmo quando ensaiadas a 60ÂC de temperatura, e o pH Ãtimo para essas atividades foi 6,0. AnÃlises de DicroÃsmo Circular revelaram que a estrutura secundÃria das proteases era composta de 15,1-19,9% de alfa-hÃlices e 20,6-21,3% de folhas-beta. Os espectros de desconvoluÃÃo das proteases mostrou que suas estruturas foram alteradas na presenÃa do agente redutor DTT, sugerindo a presenÃa de pontes dissulfeto na estabilizaÃÃo das estruturas tridimensionais. Em testes biolÃgicos as proteases foram capazes de inibir fortemente a germinaÃÃo de esporos do fungo Colletotrichum gloesporioides e tambÃm exibiram atividade de coagulaÃÃo plasmÃtica por um mecanismo do tipo trombina.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacaofinal_larissa.pdf: 494529 bytes, checksum: f3b555a23505fef660a549439a5c9a8a (MD5) Previous issue date: 2009-02-23 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lentinus citrinus (Walleyn e Rammeloo) DPUA 1535 from Culture Collections DPUA 1535/UFAM was analyzed as the production of proteases by submerged culture. A full factorial design 25 with three central points was established to evaluate the influence of nutrient sources, pH of the culture medium, temperature and incubation time, in the production of biomass and proteases. The extraction of proteases from culture broth with higher activity was prepared by aqueous two-phase systems, PEG/phosphate by using a full factorial design 23 with three central points. The results showed that the best condition for growth and proteases production was determinated in medium formulated with soluble starch, gelatin, pH 7,0, 25 oC in 5 days. It was found, in culture conditions, that only nitrogen source and temperature were significant in growth of L. citrinus, while for proteases production all variables were statistically significant. In PEG-phosphate systems, in all runs, the proteases moved to top phase, as well as the best conditions for extraction of enzymes were with obtained with PEG 6000, 17,5% (w/w) and phosphate 25% (w/w). / Lentinus citrinus (Walleyn e Rammeloo) DPUA 1535 da Coleção de Culturas DPUA/UFAM foi submetido a fermentação submersa para a produção de proteases. Um planejamento fatorial completo 25 com 3 pontos centrais foi elaborado para avaliar a influência de fontes nutricionais, pH do meio de cultivo, temperatura e tempo de incubação na produção de biomassa e de proteases em cultivo submerso. A extração das proteases do extrato bruto de maior atividade foi realizada pelo Sistema de Duas Fases Aquosas - SDFA - PEG-fosfato, utilizando-se um planejamento fatorial 23 com 3 pontos centrais. Os resultados mostraram que a melhor condição para o crescimento e produção das proteases secretadas por L. citrinus foi determinada no meio formulado com amido solúvel 0,5% (p/v) e gelatina 0,2% (p/v), pH 7,0, a 25 ºC, em 5 dias. Verificou-se que, nas condições de fermentação somente fonte de nitrogênio e temperatura influenciaram no crescimento de L. citrinus, enquanto na atividade proteolítica todas as variáveis foram estatisticamente significativas. No processo de extração, em todos os ensaios do sistema PEG-Fostato, as proteases particionaram para a fase superior e as melhores condições de extração dessas enzimas foram obtidas com PEG 6000 17,5% (m/m) e Fosfato 25% (m/m).