Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont un groupe de maladies génétiquement et cliniquement hétérogènes, lesquelles se caractérisent par une perte progressive de la vision. La choroïdérémie (CHM) est une choriorétinopathie qui représente environ 3% des DRH. Elle se caractérise par une cécité nocturne durant l’enfance suivie par une perte du champ visuel périphérique lente et progressive. Cela aboutit à une cécité vers l’âge de 40 à 50 ans. Généralement, la vision centrale demeure préservée plus longtemps. Génétiquement, la maladie est causée par des mutations dans le gène CHM localisé dans le chromosome X qui code pour la Rab Escort Protein 1 (REP1).Cette protéine est impliquée dans la prénylation des Rab GTPasas qui régulent le trafic vésiculaire au sein de la cellule. La plupart des mutations responsables de la maladie sont des mutations pertes de fonction. La conséquence de ces mutations est l’absence de REP1 entrainant un défaut de prénylation des Rabs. Ce qui cause la dégénérescence des photorécepteurs, de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et de la choroïde. À ce jour, il n’existe pas de thérapie pour la CHM. Cependant, le diagnostic précoce de la maladie et son évolution lente donnent une fenêtre thérapeutique large et en font un candidat idéal pour la réussite d’un traitement.En raison de l’absence d’un modèle animal pertinent pour tester de nouvelles thérapies pour cette maladie, nous avons développé un modèle cellulaire humain d’EPR in vitro dérivé des cellules pluripotentes induites propres au patient. Ce tissu est morphologiquement et fonctionnellement représentatif de l’EPR in vivo et reproduit les défauts biochimiques de prénylation présents dans la CHM. De ce fait, il s’agit d’un modèle puissant pour évaluer l’efficacité de différentes approches thérapeutiques. Dans cette perspective, nous avons étudié une approche de thérapie génique par AAV2/5 afin de fournir le gène CHM dans le cas particulier de mutation faux sens et l’utilisation d’une translational read-through inducing drug (TRID) PTC124 pour le traitement des mutations non-sens.J’ai démontré pour la première fois la faisabilité de la thérapie génique pour la CHM dans le cas d’une expression résiduelle de REP1 muté, permettant de considérer les patients porteurs de mutations faux sens comme éligible à des essais cliniques de thérapie génique. De plus, j’ai démontré que l’efficacité de PTC124 peut être dépendante du type cellulaire. Dans l’ensemble, mes résultats suggèrent que l’efficacité de la molécule semblerait dépendre de la conservation de l’acide aminé muté et de sa localisation dans le domaine fonctionnel de REP1. Nous avons ainsi mis en valeur que le contexte génétique devrait être pris en compte dans la perspective d’une thérapie avec TRID pour cette maladie ainsi que d’autres pathologies.Pour conclure, j’ai souligné le potentiel prédictif du modèle d’EPR dérivé d’iPSc propre au patient pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en l’absence d’un modèle animal approprié avant les essais cliniques. / Inherited retinal dystrophies (IRDs) are a class of genetically and clinically heterogeneous diseases, which are characterized by a progressive loss of vision. Choroideremia (CHM) is a chorioretinopathy, which accounts for ~3% of all IRDs. It is characterized by night blindness in childhood, followed by slow and progressive loss of the peripheral visual field. This results in legal blindness by the fourth to fifth decade of life. Generally, central vision is preserved till late in life. Genetically, the disease is caused by mutations in the CHM gene located on the X chromosome and encoding the Rab Escort Protein 1 (REP1). This protein is involved in the prenylation of Rab GTPasas, which regulate vesicular cell trafficking. Most of the disease-causing mutations are loss-of-function and the absence of REP1 leads to a Rab prenylation defect and subsequent degeneration of photoreceptors, retinal pigment epithelium (RPE) and underlying choroid. To date, an established therapy is not available for CHM, but the early diagnosis and its slow evolution provide a large therapeutic window, that renders this disease a good candidate for successful treatment.In order to palliate the lack of a pertinent animal model for testing novel disease therapies, we developed a human cellular model using patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSc)-derived RPE. This tissue is morphologically and functionally representative of the RPE in vivo, and reproduces the biochemical prenylation defect present in CHM. Therefore, it is a powerful model to evaluate the efficacy of different therapeutic approaches. Along this line, we investigated a gene augmentation approach, via AAV2/5 delivery of the CHM gene in the particular case of a CHM missense mutation, and the use of the translational read-through inducing drug (TRID) PTC124 for treating CHM nonsense mutations.I demonstrated for the first time the feasibility of gene augmentation therapy for CHM in the case of residual mutated REP1 expression, suggesting that missense-carrying patients can be considered for inclusion in clinical gene therapy trials. Moreover, I showed that the efficiency of PTC124 may be dependent on the cell type. In addition, my results suggest that drug efficiency likely depends on the conservation of the mutated amino acid residue and its localization with regards to REP1 functional domains. We thus highlight that genetic considerations should be taken into account when considering TRID therapy for this and other disorders.Taken together, I highlighted the predictive potential of the patient-specific iPSc-derived RPE model for screening of novel and varied therapeutic approaches in the absence of a suitable animal model prior to clinical translation.

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La traduction des ARNm en protéine est un processus finement régulé grâce aux mécanismes développés par la cellule pour en contrôler l’efficacité et la fidélité. En effet, les ARNm sont sujets à diverses erreurs au cours de leur transcription et leur maturation. En particuliers, les erreurs entrainant l’apparition de codons stop précoces peuvent conduire à la synthèse de protéines tronquées à effet néfaste sur la cellule. C’est pour cela que de tels ARNm sont rapidement dégradés grâce à un mécanisme régulateur appelé la NMD (Nonsence mediated mRNA Decay). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, cette voie est régie par l’action coordonnée des protéines Upf1, Upf2 et Upf3 formant le complexe de surveillance, mais elle fait également intervenir les facteurs de terminaison classique eRF1 et eRF3, ainsi que d’autres facteurs peu caractérisés tels que la protéine Ebs1. Par ailleurs, la dégradation de ces ARNm défectueux est accélérée par la dégradation rapide de la coiffe ou « decapping ». Au cours de ce travail, nous avons caractérisé des domaines fonctionnels de protéines impliquées dans la détection et la dégradation de ces ARNm. En particuliers, nous nous sommes intéressés à l’étude structurale de la protéine Upf2 qui constitue l’élément central du complexe de surveillance. Nous avons également caractérisé un domaine de la protéine Pat1, puissant activateur du « decapping ». Cette étude nous a permis de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans le contrôle qualité et la dégradation des ARNm. / MRNA translation process is finely tuned thanks to the regulatory mechanisms evolved by the cell controlling its rate, efficiency and fidelity. Indeed, mRNAs are often subjected to transcription and maturation errors. In particular, mRNA harboring premature stop codons (PTC) in their open reading frames could be translated into truncated proteins with a deleterious impact on the cell. Thus, such mRNAs are rarely detected in the cell as they are rapidly degraded thanks to the NMD (Nonsence mediated mRNA Decay) pathway. In yeast Saccharomyces cerevisiae, this process is governed by the Upf1, Upf2 and Upf3 proteins forming the “surveillance complex”, the termination factors (eRF1 and eRF3) as well as some other poorly characterized factors like Ebs1 protein. In addition, degradation of such mRNAs is enhanced by rapid degradation of the 5’ cap or decapping. In this work, we focused on the characterization of some proteins involved in this process. In particular, we addressed the structural characterization of Upf2 protein, the central component of the surveillance complex. In addition, we characterized a functional domain of Pat1 protein, a strong decapping enhancer. This study allowed us to give a new insight into the role of these proteins in mRNA quality control and decay.

Au cours de mon travail de thèse j’ai étudié la relation entre les facteurs participant à la terminaison de la traduction et ceux participant à la dégradation des ARNm chez S. cerevisiae.D’une part, je me suis intéressée au facteur Tpa1, caractérisé pour son rôle dans la terminaison de la traduction et la stabilité des ARNm chez S. cerevisiae et dont l’homologue chez S. pombe, Ofd1, participe au contrôle de la réponse hypoxique. Je me suis basée sur la structure de ce facteur, établie par nos collaborateurs pour comprendre plus précisément la fonction moléculaire de Tpa1 et rechercher des similitudes avec sa fonction chez S. pombe.Tpa1 est composée de deux domaines de type DSBH dont le premier, contenant le site catalytique, présente des homologies structurales avec la famille des prolyl-hydroxylases.Nous avons reproduit l’effet de la protéine Tpa1 sur la translecture in vivo et montré que son site catalytique prédit, ainsi que la présence des deux domaines étaient nécessaires pour cette activité. Nous avons aussi observé que Tpa1 inhibait par un mécanisme inconnu le facteur de transcription Hap1, qui régule des gènes en fonction de la quantité d’oxygène. Basé sur l’existence d’un inhibiteur d’Ofd1 chez S. pombe, nous avons ensuite montré qu’Ett1 (l’homologue de cet inhibiteur chez S. cerevisiae) avait un rôle similaire à Tpa1 dans la translecture. Une étude structurale collaborative d’Ett1 a mis en évidence une région conservée, se liant à une molécule de sulfate et à un ligand inconnu. Cette région est importante pour la translecture. Cependant, le substrat de Tpa1 reste pour l’instant inconnu comme les rôles précis de Tpa1 et Ett1 dans la terminaison de la traduction et dans la réponse à l’hypoxie.D’autre part, j’ai étudié le processus de NMD, particulièrement en me focalisant sur le mécanisme de discrimination entre un codon stop précoce (PTC) et un codon stop normal, et en analysant également la modification post-traductionnelle d’un facteur central du NMD, Upf1. Nous avons mis en évidence, qu’en plus de la région aval, la région en amont du PTCparticipait à sa reconnaissance. Nous avons testé plusieurs hypothèses sur le rôle de cette région, qui ont confirmé son rôle sans permettre de démontrer un mécanisme définitif. En parallèle, l’étude de la protéine Upf1 s’est concentrée sur ses modifications posttraductionnelles, particulièrement par phosphorylation. En effet, une telle modification est importante chez son homologue humain. Nous avons pu confirmer l’existence d’une forme modifiée et démontrer que celle-ci était localisée entre les acides aminés 153 et 971. Cette modification s’est avérée être très labile ce qui n’a pas permis de confirmer qu’il s’agissait d’une phosphorylation, ni de la cartographier plus précisément. / During my PhD thesis, I analyzed the relation between factors that participate intranslation termination and those participating in mRNA decay in yeast S. cerevisiae.First, I focused on Tpa1, that had been proposed to participate in translationtermination and mRNA decay in S. cerevisiae, and whose homologue in S. pombe, Ofd1,participates to the control of hypoxic response. Based on the structure of Tpa1, established byour collaborators, I performed functional analysis to understand more precisely the molecularfunction of Tpa1 and similarities with its role in S. pombe. Tpa1 is composed of two DSBHdomains; the first, which contains the catalytic site, has structural homologies with the familyof prolyl-hydroxylase. We could reproduce the effect of Tpa1 on stop codon readthrough invivo and we showed that the predicted catalytic site and the presence of the two domains ofTpa1 were necessary for its activity. We also showed that Tpa1 inhibited one factor, Hap1,implicated in regulation of gene expression by oxygen. The existence of an inhibitor of Ofd1in S. pombe, allowed the identification of Ett1 (its homologue in S. cerevisiae). We showedthat Ett1 has a role similar to the one of Tpa1 in translational readthrough. A collaborativestructural and functional study of Ett1 revealed a conserved region, which binds a sulfate ion,and an unknown ligand. This region is important for the readthrough. However, thesubstrate(s) of Tpa1 remain(s) for the moment unknown, and the precise roles of Tpa1 andEtt1 in translation termination and in response to hypoxia remain to be deciphered.I also analyzed the NMD process by focusing more particularly on the mechanism thatallows the discrimination between a normal stop and a PTC (premature termination codon)and on the analysis of the post-translational modification of an important factor for the NMD,Upf1. This study revealed that, not only the region downstream of the PTC but also theupstream region participates to its recognition. We have tested several hypotheses on the roleof this upstream region, which confirmed its implication but did not reveal a definitivemechanism. In parallel, we started the study of the post-translational modifications of Upf1,and more particularly by phosphorylation. Indeed, the phosphorylation of Upf1 in human isvery important for the NMD process. We could confirm the presence of a modified form ofyeast Upf1 and we have demonstrated that it was localized between amino acids 153 and 971.This modification appeared to be highly labile. This prevented us to confirm definitively thatit was really a phosphorylation and to cartography precisely its location.

Neste trabalho foram aprofundados nossos estudos para obtenção da (S)-2-terc-butilamida-4-(3-picolil)piperazina, pela abertura da (S)-2-terc-butilcarboxamida-N-p-tosilaziridina seguida de ciclização, em 78% de rendimento, com o triflato de vinildifenilsulfônio. A aziridina foi preparada por um processo de ciclização, em condições de transferência de fase, partindo-se da L-serina, um aminoácido natural de baixo custo. Esta rota sintética rendeu um material que apresenta a mesma estereoquímica S do fragmento piperazínico usado na síntese do Indinavir, podendo vir a constituir uma via alternativa para a obtenção deste fármaco. / In this work we performed a deeper study for obtaining (S)-2-tert-butylamide-4-(3-picolyl)piperazine by opening (S)-2-tert-butylcarboxamide-N-p-tosylaziridine followed by cyclization, in 78% yield, with diphenylvinylsulfonium trifluoromethanesulfonate. The aziridine were prepared by a cyclization process in phase transfer conditions, starting from L-serine, a low cost amino acid. This synthetic route yielded a material which has the same S piperazinic fragment stereochemistry used in the synthesis of Indinavir, and may constitute an alternative route for obtaining this drug.

Nach einer kurzen Einführung in das strombegrenzende Schalten folgen Betrachtungen über den Aufbau von thermoplastischen Polymeren, den Prozess der Sphärolithbildung sowie die Struktur der Ruße. Auf Grund der Füllstoffteilchenverdrängung im Verlauf der Sphärolithbildung sowie der Neigung der Füllstoffteilchen zur Agglomeration werden Überlegungen zur elektrischen Leitfähigkeit der Compounds angestellt. Gestützt auf den stark nichtlinearen Ausdehnungs-koeffizienten der Thermoplaste und der Selbstagglomerationsneigung der Füllstoffteilchen erfolgt die Erklärung des Widerstandsverhaltens der Compoundmaterialien. Die Optimierung des Compoundmaterials für Strombegrenzung erfolgt durch Untersuchung einer Auswahl von Parametern, die das Matrixmaterial, den Ruß sowie das Herstellungsverfahren betreffen. Das Gesamtverhalten eines polymeren Strombegrenzers lässt sich nicht allein mit dem Widerstandsverhalten des Compounds erklären. Deshalb werden die Gegebenheiten im Bereich des Metall-Compound-Kontakts untersucht. Mit der so gewonnenen Modellvorstellung und dem Verständnis der Funktionsweise des Compounds ist es dann möglich das Gesamtverhalten zu beschreiben. Dabei ist zwischen oberflächennahem-PTC-Effekt und Volumen-PTC-Effekt sowie dem Oberflächeneffekt zu unterscheiden. Durch einen Alternativansatz können bisherige Diskrepanzen bezüglich der Erklärung der Phänomene beim Oberflächeneffekt ausgeräumt werden. Es erfolgt eine Gegenüberstellung von PTC- und Oberflächeneffekt hinsichtlich ihres Anteils am Gesamtverhalten. Abschließend werden Aspekte zur Dimensionierung eines polymeren Strombegrenzers behandelt.

Für die Simulation eines fasergewickelten Drucktanks werden die Ergebnisdaten einer Wickelsimulation, bestehend aus Geometrieinformationen und lokalen Wickelwinkeln, von denen wiederum die Materialeigenschaften und die erforderliche Messgrößen abhängen, automatisch in ein Creo-Simulationsmodell unter Verwendung der VB-Schnittstelle umgesetzt. Weiter wird auf die Auswertung der Ergebnisse eingegangen.

This thesis showcases a work that focused on developing processes with improved economic and environmental signatures. It illustrates the strengths of chemists and chemical engineers working together towards sustainable solutions. The joint collaboration between Drs. Liotta and Eckert allows the combination of disciplines to overcome economic and environment obstacles. This thesis depicts the application of chemical engineering and chemistry for industrial processes towards reducing cost and environmental impact. In chapter 2, a synthetic sequence yielding a pharmaceutical precursor was optimized for continuous processing. The precursor was for the pharmaceutical drug Ro 31-8959, which acts as a human immunodeficiency virus (HIV) protease inhibitor. A continuous flow reactor was designed, built and utilized successfully for the two-step reaction of the diazoketone pharmaceutical precursor, (1-benzyl-3-chloro-2-hydroxy-propyl)-carbamic acid tert-butyl ester. The best configuration for the continuous flow reactor involved a single and double coiled stainless steel reactor packed with glass beads. The yield obtained for the diazoketone was quantitative. In chapter 3, the cleavable surfactant (cleavable surfactants decompose in non-surface active ingredients upon stimulus), n-octyl thiirane oxide was synthesized, characterized and its surface activity and loss of surface activity upon heating was demonstrated. The n-octyl thiirane oxide surfactant activity was measured using a dye, Suddan III, and compared to a commercially available surfactant sodium dodecyl sulfate. In chapter 4, 5-amino-1H-tetrazole was synthesized using two novel synthetic routes starting from benign chemicals. Both routes involved Sharpless click chemistry in the first step to form the tetrazole ring. Both routes also used hydrogen transfer as the last step for the formation of the 5-amino-1H-tetrazole. These syntheses eliminated the use of highly toxic and/or explosive chemicals such as cyanamide, hydrazoic acid, and hydrazine. Finally in chapter 5, phase transfer catalysis was used as a means to improve reaction rates and yields between a siloxylated reagent (in the liquid phase) and insoluble ionic reagents (in the solid phase). The activity of commercial phase transfer catalysts like tetra-n-butylammonium bromide was compared to the activity of two novel custom-made siloxylated phase transfer catalysts. Surprisingly, the tetra-n-butylammonium resulted in superior rate constants to the custom made siloxylated phase transfer catalysts.

Neste trabalho foram aprofundados nossos estudos para obtenção da (S)-2-terc-butilamida-4-(3-picolil)piperazina, pela abertura da (S)-2-terc-butilcarboxamida-N-p-tosilaziridina seguida de ciclização, em 78% de rendimento, com o triflato de vinildifenilsulfônio. A aziridina foi preparada por um processo de ciclização, em condições de transferência de fase, partindo-se da L-serina, um aminoácido natural de baixo custo. Esta rota sintética rendeu um material que apresenta a mesma estereoquímica S do fragmento piperazínico usado na síntese do Indinavir, podendo vir a constituir uma via alternativa para a obtenção deste fármaco. / In this work we performed a deeper study for obtaining (S)-2-tert-butylamide-4-(3-picolyl)piperazine by opening (S)-2-tert-butylcarboxamide-N-p-tosylaziridine followed by cyclization, in 78% yield, with diphenylvinylsulfonium trifluoromethanesulfonate. The aziridine were prepared by a cyclization process in phase transfer conditions, starting from L-serine, a low cost amino acid. This synthetic route yielded a material which has the same S piperazinic fragment stereochemistry used in the synthesis of Indinavir, and may constitute an alternative route for obtaining this drug.

Cochlear dead regions (DRs) are areas in the cochlea where inner hair cells and/or neurones are functioning so poorly that a sound that causes peak basilar membrane motion in that region is more efficiently detected via off-frequency listening. The Threshold Equalising Noise (TEN) test is a clinical test procedure for detecting DRs. Psychophysical Tuning Curves (PTCs) can be used to identify the boundary frequency of the DR although the clinical importance of doing this has yet to be determined. Some studies have suggested that the reduction of amplification well inside the DR may be beneficial; however, other studies have been unable to replicate these findings in a more typical clinical population. Three studies were completed in order to:1. determine the prevalence of DRs in a clinical sample of the UK adult population,2. investigate repeatability, agreement and clinical feasibility of the TEN-test and fast PTCs in a clinical setting, and 3. determine the benefit of high-frequency amplification in ears with and without DRs, when listening to nonsense syllable speech material in quiet and babble. In the first study, 343 hearing-impaired adults were tested for DRs using the TEN-test. In total, 36% (95% confidence interval 31-41) of these adults had a DR in at least one ear, but frequently at 4 kHz only. Only 3% (1-5) of participants had a DR spanning more than three consecutive frequencies. These findings suggest that DRs usually only span 1 or 2 clinically-relevant frequencies. In the second study, the TEN-test was completed on 70 ears at frequencies between 0.5 and 4 kHz. Fast PTCs were measured on 20 ears at ≥ 2 frequencies. The TEN-test and fast PTCs were highly repeatable on retest (97% and 100%, respectively). There was 87% agreement between the two procedures in terms of the presence of off-frequency listening, with the TEN-test less likely to detect a DR than fast PTCs. Compared to the TEN-test, fast PTCs had a 10% lower ‘conclusive finding’ rate and the test duration was typically 40 minutes longer. Therefore, the TEN-test is more clinically acceptable, but it may underestimate the extent of a DR because of its inability to precisely identify the boundary frequency. In the third study, 18 ears with a high-frequency DR and 18 matched ears without a DR were tested. Vowel-Consonant-Vowel (VCV) stimuli were presented in quiet and babble when listening with an unfiltered and three low-pass filtered hearing aid settings. Best performance was obtained in the unfiltered condition; however the DR group performed significantly poorer than the controls in babble. There was no evidence to support reducing amplification in ears with a DR. However, participants with DRs may benefit from counseling about the limitations of listening in noise. In summary, DRs are relatively prevalent in hearing-impaired adults and can be diagnosed most efficiently in a clinical setting using the TEN-test. However, DRs are often restricted to a narrow frequency range and, in the typical adult clinical population, there is no evidence to support deviating from prescription targets.