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Étude des phénomènes reliés à la présence du brin complémentaire au brin cible lors d'hybridation avec sondes de captures fixées sur support solideBoissinot, Karel 20 April 2018 (has links)
Cette thèse de doctorat présente 3 études reliées à l’hybridation d’ADN fixée à un support solide et les phénomènes qui y sont associés. L’hybridation d’ADN en phase aqueuse est bien caractérisée, cependant plusieurs phénomènes et paramètres restent encore à déterminer lorsqu’un des brins est fixé sur un support solide. Un de ces paramètres est l’influence du brin complémentaire en fonction de la longueur de l’extrémité d’ADN cible immobilisée exposée à la phase aqueuse. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons établi une méthode pour digérer spécifiquement le brin d’ADN complémentaire pour simplifier l’hybridation sur support solide. La combinaison d’une molécule favorisant la digestion du brin complémentaire et d’une molécule bloquant la digestion du brin cible a permis de produire un ADN cible simple brin à l’aide de l’exonucléase Lambda, permettant d’obtenir des signaux d’hybridation supérieurs à ceux obtenus avec des ADN doubles brins. Ensuite, l’observation en temps réel de l’hybridation d’amplicons simples brins et doubles brins a permis de mieux comprendre les phénomènes de compétition entre le brin complémentaire et la cible. Finalement, les conclusions des deux premières études nous ont permis d’inventer une technologie tirant profit de la compétition entre le brin complémentaire et la sonde de capture et de l’activité exonucléase pour réaliser l’amplification PCR et l’hybridation sur biopuce en un seul site réactionnel et dans un seul tampon réactionnel. La combinaison de ces techniques aura pour effet une simplification des dispositifs et une diminution du nombre de réactifs permettant la fabrication de tests diagnostiques automatisés à moindre coûts. Les travaux de cette thèse ont permis d’approfondir nos connaissances sur les phénomènes reliés à l’hybridation sur support solide et de concevoir une technologie faisant l’objet d’une demande de brevet. La suite logique de ces travaux serait de poursuivre le développement et l’optimisation de la technologie pour augmenter ses capacités de multiplexage tout en l’intégrant à un dispositif microfluidique et à un instrument de détection qui combine amplification PCR et hybridation sur biopuce dans une seule réaction réalisée en une seule étape. / This thesis presents three studies related to the phenomenon related to DNA hybridization onto capture probes attached to solid support. The work was carried out in the context of infectious diseases detection, but the conclusions are of interest to any test based on the recognition of genetic material by solid support immobilized capture probes. DNA hybridization in aqueous phase is well characterised, however several parameters and phenomena related to hybridization onto solid supports are still to be determined. One of these parameters is the influence of the complementary strand in relation with the length of the solvent-exposed immobilized target strand. To better understand this phenomenon, we established a method to specifically digest the complementary DNA strands to simplify hybridization onto solid support. The presence of a molecule favorising digestion on the complementary strand and a blocking molecule on the target strand enabled selective digestion of the complementary strand using Lambda exonuclease in PCR buffer. Hybridization of single-stranded target DNA generated this way resulted in significantly higher fluorescence signals than those obtained with double stranded hybridization. Afterwards, observation of real-time hybridization of single-stranded amplicons and double-stranded amplicons to capture probes fixed onto solid support allowed for a better understanding of the competition phenomena between the complementary strand and the capture probe. Finally, the knowledge gained with the first two studies was used to invent a technology taking advantage of the competition between the complementary strand and the capture probe and exonuclease activity to perform single vessel and single buffer PCR amplification and microarray hybridization. The combination of these techniques will simplify devices and require fewer reagents storage and handling, facilitating production of automated diagnostic tests at lower costs. The works of this thesis have expended our understanding of the phenomena associated with hybridization onto a solid support and also resulted in the creation of a new technology covered by a patent application. The logical progression of this work is to further develop and optimize this technology by integrating it into a microfluidic device and an instrument compatible with the detection of microarrays to increase the multiplexing capabilities of molecular diagnostics.
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Une approche bio-informatique intégrée pour l'identification des cibles ARN de l'endoribonucléase III chez la levureGagnon, Jules January 2014 (has links)
Les endoribonucléases III sont conservées chez tous les eucaryotes. Ils jouent un rôle important dans le cycle de vie des acides ribonucléiques (ARN) que ce soit au niveau de leur maturation, leur régulation ou leur dégradation. Cependant, seul un petit nombre d'ARN ciblés par les ribonucléases (RNases) III sont connus et les motifs reconnus par l'enzyme sont encore mal caractérisés. Actuellement, la découverte de nouvelles cibles repose principalement sur la validation in vitro de gènes individuels. Il est important d'avoir une vue d'ensemble des cibles des RNases III pour comprendre le rôle de la dégradation spécifique des ARN dans le métabolisme cellulaire.
Ainsi, cette thèse a comme objectif de développer des approches haut débit pour permettre une identification plus rapide des cibles tout en minimisant l'utilisation des ressources expérimentales. Elle présente l'utilisation combinée d'approches bio-informatiques, d'étude génétique de l'expression et de traitement in vitro dans le but d'avoir un portrait global des cibles de l'endoribonucléase III. Elle a aussi comme but d'identifier les motifs d'ARN non codants qui guident la reconnaissance par l'endoribonucléase III.
Les principaux accomplissements de cette recherche sont : le développement de nouveaux algorithmes de prédiction des cibles de la RNase III, la détection de deux nouvelles classes de transcrits dont l'expression est dépendante de la RNase III, l'identification de quelques centaines de nouvelles cibles de la RNase III, la production d'un catalogue plus complet des motifs coupés par la RNase III et l'identification de nouvelles catégories de motifs coupées par la RNase III. Le tout procure un portrait global de l'impact de la RNase III sur le transcriptome et le cycle de vie des ARN.
De plus, ce travail montre comment une approche intégrée incluant la recherche in silico, in vivo et in vitro permet de mieux comprendre le rôle d'un enzyme dans la cellule et comment chaque approche peut pallier les déficiences des autres approches et fournir globalement des résultats plus complets.
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Etude par transcriptomique et génomique comparative de la pathogénicité de Coxiella burnetii : une approche puce à ADN / Transcriptomic and comparative genomic to explore the pathogenicity of Coxiella burnetii : a microarray approachLeroy, Quentin 14 December 2010 (has links)
L’objectif de cette thèse a été d’enrichir nos connaissances sur les bactériesintracellulaires strictes et spécialement Coxiella burnetii, agent responsable de la fièvre Q.Pour ce faire, nous avons d’une part amélioré les techniques de préparation de l’ARN pourles études transcriptionnelles et d’autre part utilisé la technologie des puces à ADN pouranalyser le transcriptome ainsi que la diversité génomique de C. burnetii.L’utilisation d’échantillons cliniques dans les études transcriptionnelles est limitéepar la quantité de matériel disponible qui ne permet pas d’analyser simultanément les profilsdu pathogène et de son hôte au cours de l’infection. De ce fait, nous avons développé, sur unmodèle d’escarres obtenus à partir de malades de fièvre boutonneuse méditerranéenne, unestratégie basée sur l’hybridation soustractive pour séparer les ARN eucaryotes etprocaryotes dans le but d’entreprendre des hybridations de puces à ADN.C. burnetii est une bactérie hautement résistante aux stress environnementaux commele changement de pH, la dessiccation, mais aussi le changement de température. Nous avonsparticulièrement étudié la réponse précoce de C. burnetii lors d’une exposition à une hauteet faible température. L’analyse globale du profil transcriptionnel a montré que la réponsede C. burnetii était limitée et similaire pour les différents stress appliqués. Cependant,malgré cette faible réponse, il apparait clairement qu’une accumulation de ppGpp, un arrêtde la croissance et des modifications de la membrane et de la paroi cellulaire permettraient àC. burnetii de résister à ces stress. Toutes ces régulations géniques convergent vers unchangement d’état de la bactérie vers une forme pseudo-sporulée. De plus, nous avonsobservé une organisation spatiale des gènes différentiellement exprimés. Nos analyses bioinformatiquesont montré que ces clusters de régulation ne répondaient ni au paradigmepromoteur - facteur de transcription – opéron, ni à des réseaux biologiques. Ayant retrouvéce phénomène dans plusieurs autres études transcriptionnelles chez d’autres bactériesintracellulaires, nous spéculons que ces clusters de régulations pourraient être dus à unerégulation épigénétique qu’il reste à caractériser.Différentes méthodes de typage ont déjà été mises au point pour classer les isolats deC. burnetii dans le but d'explorer son pouvoir pathogène. Ici, nous présentons une méthodede génomotypage basée sur la présence ou l'absence de gènes à l'aide de puces à ADN.Nous avons testé notre stratégie de génomotypage sur 52 isolats provenant de différenteszones géographiques, de différents hôtes et de patients présentant différentes manifestationscliniques. L'analyse a révélé la présence de 10 génomotypes organisés en 3 groupes avecune topologie congruente à celle observée avec le Multi Spacer Typing. Nous avons aussidécouvert 4 génomotypes particulièrement associés à la fièvre Q aiguë, alors que tous lesgénomotypes étaient associés à la forme chronique. De plus, le génomotypage a révélé queles isolats retrouvés dans les tiques dures, y compris la souche de référence Nine Mileappartiennent au même genomotype.Globalement, les données que nous avons obtenues confirment le fait que les puces àADN sont un outil adapté pour l’analyse de la pathogénicité de C .burnetti mais aussi desautres bactéries intracellulaires strictes. Cependant, de nouvelles technologies plusrésolutives comme le DNA ou RNAseq semblent être plus prometteuses mais restent encoreà optimiser / The objective of this thesis was to increase knowledge of obligate intracellular bacteriaand specifically, the causative agent of Q fever C. burnetii. In this regard, we have improvedstrategies to purify RNA for the transcriptional studies. We also used the technologymicroarrays to analyze the transcriptome and genomic diversity of C. burnetii.The use of clinical samples in the transcriptional studies is limited by the amount ofmaterial available and thus the transcriptional profiles of the pathogen and its host duringinfection can not be simultaneously analyze. We developed, with a model of eschars obtainedfrom Mediterranean spotted fever patients, a strategy based on subtractive hybridization toseparate RNA eukaryotic and prokaryotic cells in order to perform microarray experiments.Analysis of the survival strategies used by this bacterium to adapt to new environmentalconditions is critical for our understanding of C. burnetii pathogenicity. Here, we report theearly transcriptional response of C. burnetii under temperature stresses. Our data show thatC. burnetii exhibited minor changes in gene regulation under short exposure to heat or coldshock. While small differences were observed, C. burnetii seemed to respond similarly to coldand heat shock. The expression profiles obtained using microarrays produced in-house wereconfirmed by quantitative RT-PCR. Under temperature stresses, 190 genes were differentiallyexpressed in at least one condition, with a fold change of up to 4. Globally, the differentiallyexpressed genes in C. burnetii were associated with bacterial division, (p)ppGpp synthesis,wall and membrane biogenesis and, especially, lipopolysaccharide and peptidoglycansynthesis. These findings could be associated with growth arrest and witnessed transformationof the bacteria to a spore-like form. Unexpectedly, clusters of neighboring genes weredifferentially expressed. These clusters do not belong to operons or genetic networks; theyhave no evident associated functions and are not under the control of the same promoters. Wealso found undescribed but comparable clusters of regulation in previously reportedtranscriptomic analyses of intracellular bacteria, including Rickettsia sp. and Listeriamonocytogenes. The transcriptomic patterns of C. burnetii observed under temperature stressespermits the recognition of unpredicted clusters of regulation for which the trigger mechanismremains unidentified but which may be the result of a new mechanism of epigenetic regulation.Different typing methods have been previously developed to classify C. burnetii isolatesin order to explore its pathogenicity. Here, we report a comprehensive genomotyping methodbased on presence or absence of genes using microarray. The genomotyping method was thentested on 52 isolates obtained from different geographic areas, different hosts and isolated frompatient with different clinical manifestations. The analysis reveals the presence of10 genomotypes organized in 3 groups with a topology congruent with that of Multi SpacerTyping. We also found out 4 genomotypes especially associated with acute Q fever whereas allthe genomotypes could be associated to chronic human infection. Serendipity, genomotypingreveals that hard ticks isolates including Nine Mile belong to the same genomotype.Overall, the data we obtained confirm that DNA microarrays are a suitable tool forexploring pathogenicity of C. Burnetti and other obligate intracellular bacteria. However newtechnologies such as DNAseq or RNAseq seem more promising but still need to optimize andalso are still expensive compared to microarray.
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Developpement d'outils et méthodes bioinformatiques pour l'étude de l'expression des gènes et de leur régulation. : application aux pathologies / Development of bioinformatics tools and methods for gene expression and regulation study : application to diseasesBergon, Aurelie 06 February 2012 (has links)
La compréhension des mécanismes qui contrôlent l'expression des gènes est un enjeu majeur pour la recherche médicale. Elle nécessite un ensemble d'approches pangénomiques telles que les puces à ADN et plus récemment le séquençage à très haut débit qui génèrent une masse toujours plus grande de données numériques à traiter. Au cours de ma thèse, j'ai développé plusieurs outils informatiques innovants pour faciliter leur exploitation. Ainsi, j'ai créé une librairie R (AgiND) qui vérifie la qualité des données de puces à ADN Agilent et permet de les normaliser. Le nombre croissant d'expériences stockées dans Gene Expression Omnibus a motivé la mise en place du projet TBrowser. Une méthode originale DBF-MCL a été créée pour extraire des signatures transcriptionnelles annotées par l'intégration de diverses sources d'information. Stockées dans une base de données, elles sont accessibles à travers une interface Java, un service web SOAP et une librairie R/Bioconductor (RTools4TB). Enfin, un pipeline d'analyse dédié au ChIP-seq a été implémenté. Tous ces outils ont servi pour l'étude de diverses maladies dans le cadre de collaborations. / Understanding the mechanisms that control gene expression is a major challenge for medical research. This requires using a large set of pangenomic approaches such as those using DNA microarrays and high-throughput sequencing that generate an ever growing mass of digital data. During my thesis, I have developed several computer-based tools to facilitate their processing and analysis. I have created a R library (AgiND) that controls the quality of Agilent DNA microarray data and allows their statistical normalization. The growing number of experiences stored in Gene Expression Omnibus has motivated the development of the TBrowser project. An original method, DBF-MCL, was created to extract annotated transcriptional signatures by integrating various sources of information. Stored in a database, these signatures are accessible using a Java interface, a SOAP web service and a R/Bioconductor library (RTools4TB). Finally, a pipeline dedicated to the ChIP-seq analyses has been implemented. All these tools were used to study various diseases in collaborations.
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Logique floue et algorithmes génétiques pour le pré-traitement de données de biopuces et la sélection de gènesBonilla Huerta, Edmundo 13 November 2008 (has links) (PDF)
Dans le domaine de la biologie moléculaire, les technologies d'analyse d'expression génique comme les biopuces suscitent un intérêt très grand. Une des applications de ces technologies est le diagnostic et la classification de différents types de tumeurs. Une des particularités des données issues des biopuces est qu'elles sont décrites par un très grand nombre d'attributs (gènes) alors que peu d'échantillons analysés sont disponibles. Cela empêche la compréhension des données et réduit de manière considérable la performance des algorithmes de classification. Dans cette thèse, nous proposons des méthodes innovantes pour réduire la taille initiale des données et pour sélectionner des ensembles de gènes pertinents pour une classification supervisée. Nous proposons tout d'abord une méthode de pré-traitement des données et de réduction de dimension basée sur la logique floue. Le problème de la sélection d'attributs est ensuite traité par deux types d'approche. Dans la première, nous proposons une méthode enveloppe qui grâce à une double exploration génétique sélectionne un ensemble de gènes pertinents pour un classifieur SVM. Dans la deuxième, nous proposons une méthode intégrée où les informations fournies par un classifieur linéaire (ADL) guident le processus de recherche vers un sous-ensemble de petite taille et performant pour la classification. Les différentes expérimentations que nous avons menées montrent de très bonnes performances, surtout pour la méthode intégrée.
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Caractérisation et classification moléculaire des pathologies thyroïdiennes par approche transcriptomiqueFontaine, Jean-Fred 07 December 2007 (has links) (PDF)
L'accident de Tchernobyl, en 1986, a mis en lumière le cancer de la thyroïde. Ce cancer, assez rare, est pourtant en forte augmentation, et cela avant même 1986. Le diagnostic des tumeurs folliculaires thyroïdiennes par analyses anatomopathologiques est parfois difficile. Ce travail s'intéresse à la classification moléculaire de ces tumeurs ainsi qu'à la recherche de marqueurs spécifiques à chaque pathologie. En regroupant et en analysant le transcriptome de plus de 90% des types de lésions folliculaires de la thyroïde, nous avons établi une classification moléculaire globale de ces lésions, nous avons défini des marqueurs spécifiques faisant l'objet d'un brevet, et nous avons permis de préciser le diagnostic de la majorité des tumeurs de malignité incertaine. L'étude bioinformatique des données issues de biopuces apporte des précisions à la classification internationale des tumeurs, particulièrement pour les tumeurs oncocytaires, microfolliculaires et de malignité incertaine.
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Remodelage de la chromatine et transcription : Étude d'un mutant du complexe RSC chez la levure Saccharomyces cerevisiaeBordas-Le Floch, Véronique 31 October 2002 (has links) (PDF)
L'ADN est condensé dans le noyau sous forme de chromatine. La structure chromatinienne de l'ADN est un obstacle pour la transcription car elle limite l'accessibilité de l'ADN. Des complexes spécialisés sont capables de remodeler cette structure. Chez Saccharomyces cerevisiae, les complexes RSC (Remodels the Structure of Chromatin) et SWI/SNF sont apparentés comme en témoignent les homologies existant entre plusieurs de leurs sous-unités. Toutefois, seul le complexe RSC, plus abondant que SWI/SNF, est essentiel à la viabilité cellulaire. Ceci suggère qu'il pourrait avoir de multiples rôles dont un dans la transcription. <br />La transcription est réalisée chez les eucaryotes par trois ARN polymérases (pol) différentes chacune spécifique d'une classe de gènes. Nous avons montré que le complexe RSC interagit avec les ARN polymérases I et III. Notre attention s'est portée sur l'interaction entre la sous-unité Rsc4 et la protéine ABC27, commune aux trois ARN polymérases. La protéine Rsc4 interagit en double-hybride avec ABC27 par son domaine C-terminal. Nous avons étudié un mutant de la sous-unité Rsc4 ayant perdu la capacité d'interagir avec ABC27. Les profils d'expression génomiques, établis par puces à ADN, ont permis de caractériser des effets de cette mutation sur la transcription par l'ARN polymérase II. Curieusement, la majorité des gènes induits sont répartis par le chromosome XII. Cet effet n'est pas polaire. La présence de l'ADN ribosomique sur ce chromosome nous a conduits à proposer qu'il pourrait être une cause de ce comportement particulier. Nous avons mis en évidence des modifications dans la voie de maturation de l'ARN 35S, transcrit par la pol I, mais nous n'avons pas pu caractériser des défauts de transcription par les ARN polymérases I et III.
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Analyse du transcriptome de Buchnera aphidicola, la bactérie symbiotique du puceron Acyrthosiphon pisumCharles, Hubert 12 April 2006 (has links) (PDF)
Les progrès fulgurants de ces dix dernières années réalisés dans les domaines de la microinformatique et de la microfluidique associés au génie génétique (PCR et séquençage) ont permis un changement d'échelle dans la quantité des données acquises au cours d'une même expérience. La transcriptomique est directement issue de ces avancées technologiques. Ce mémoire présenté pour l'obtention d'une Habilitation à Diriger des Recherdes porte sur l'analyse du transcriptome de la bactérie intracellulaire obligatoire des pucerons, Buchnera aphidicola. Dans la première partie, les principales méthodes d'analyses statistiques différentielles et d'intégration des données transcriptomiques sont présentées sous la forme d'une analyse bibliographique. La deuxième partie est consacrée au développement d'outils bioinformatiques : ROSO, un logiciel d'optimisation des sondes oligonucléotidiques, la puce Buchnera et SITRANS, un système d'information pour la gestion et la publication des données d'expression. Enfin, la dernière partie est consacrée à la caractérisation du transcriptome de Buchnera en condition de stress trophique de son hôte, le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. La régulation transcriptionnelle chez les bactéries symbiotiques intracellulaires à génome réduit est encore actuellement très mal connue. Cette question sera abordée chez Buchnera tout d'abord au niveau évolutif par l'étude de la relation entre l'expression des gènes et leur organisation dans le génome, puis au niveau fonctionnel, par la caractérisation de la réponse de la bactérie à une diminution de la quantité d'acides aminés essentiels dans le substrat nutritif du puceron, combinée à un stress osmotique.
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Adaptation d'un algorithme génétique pour la reconstruction de réseaux de régulation génétique : COGARE.Briche, Julien 09 September 2009 (has links) (PDF)
Nous proposons une approche “algorithme génétique” pour la reconstruction génomique. Notre approche introduit le concept d'algorithmie génétique multi-échelle : l'optimisation est conduite simultanément à une échelle locale et à une échelle globale. La fonction d'efficacité est donc hybride. Notre approche prend également en compte plusieurs types de données, dynamiques, statiques, ou imposées. Il en résulte un nouveau logiciel de reconstruction génomique, COGARE. Il est étalonné sur données simulées et comparé aux algorithmes existants. Il est utilisé sur deux cas réels, sur lesquels il révèle des capacités à renvoyer des informations pertinentes au biologiste.
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Diversité bactérienne des sols : accès aux populations à effectifs minoritaires "the rare biosphere" / Bacterial diversity of soils : accessing the effective minority populations in the "rare biosphere"Faugier, Aurélie 12 March 2010 (has links)
L'exploration complète de la diversité bactérienne reste incomplète, due à des limitations techniques (extraction d'ADN incomplète, limites des techniques de caractérisation…), à la complexité et l'hétérogénéité de la matrice sol (présence de microenvironnements…) et à l'existence de populations numériquement faibles. Bien que ces populations minoritaires jouent probablement un rôle important dans le fonctionnement de la communauté, elles sont rarement détectées par les techniques conventionnelles. Nos objectifs dans le cadre de ce travail de thèse ont été de développer des approches tant conceptuelles que techniques qui permettent d‟accéder à un niveau plus important de la diversité bactérienne présente dans les environnements complexes comme les sols. La première approche a pour but de favoriser le développement de bactéries minoritaires grâce à l'inoculation de communautés bactériennes dans des sols stérilisés avec des propriétés physico-chimiques différentes, afin de confirmer ou d‟infirmer le concept de Baas Becking « tout est partout et l‟environnement sélectionne ». Les changements de structures des communautés bactériennes inoculées, sont analysés à l'aide de puces à ADN taxonomique nouvellement développées. Les résultats confirment clairement l'impact de l'environnement sur la structure des populations bactériennes. De plus l'analyse des puces à ADN révèle des bactéries précédemment non détectées, confirmant la présence de populations minoritaires et la possibilité d‟augmenter leur abondance relative sous différentes conditions. La deuxième approche consiste au développement d'une souche bactérienne capable de capturer in situ des fragments d‟ADN. Elle a pour but d'éviter l'étape d'extraction d‟ADN. Cet outil est basé sur la construction d'un système de contre sélection positive permettant de sélectionner les clones ayant intégré des gènes d'intérêt. Nos travaux montrent clairement qu'il est possible d'améliorer l'accès à cette « rare biosphere » sans toutefois pouvoir répondre entièrement à la question : est-ce que tout est partout? / No abstract
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