Estudos têm demonstrado que o microambiente tumoral é rico em ATP e adenosina, sugerindo o envolvimento da sinalização purinérgica no desenvolvimento e/ou manutenção do câncer. Ainda, o receptor purinérgico P2X7, conhecido pelo seu papel na indução de apoptose, encontra-se reduzido em alguns tecidos tumorais em comparação aos tecidos saudáveis, indicando que a sua redução possa ser um mecanismo de resistência celular à apoptose. Dessa forma, compreender o papel da sinalização purinérgica no contexto do câncer se torna indispensável e permite que novas abordagens terapêuticas sejam implementadas. Nesse trabalho, avaliamos a função dos nucleotídeos e nucleosídeos da adenina, bem como do receptor P2X7 na indução da morte celular em células de câncer cervical. Também verificamos o efeito do heat shock na potencialização da atividade do receptor P2X7 frente à curta exposição ao ATP em células de câncer de cólon. De acordo com os nossos resultados, o efeito citotóxico do ATP extracelular nas linhagens de câncer cervical é mediado principalmente pela ação do seu metabólito adenosina, que ao entrar no interior das células, promove o aumento dos níveis intracelulares de AMP, ativação de AMPK, aumento da p53 e indução de autofagia. O papel do receptor P2X7 nesse contexto parece ser apenas coadjuvante, visto que o seu bloqueio ou silenciamento impediu em apenas 20% a morte celular. Além disso, utilizando células de câncer de cólon, nós demonstramos que o heat shock aumenta a funcionalidade do receptor P2X7, independente da interação com heat shock proteins ou canais do tipo conexina/panexina, potencializando o efeito citotóxico do ATP. Esse efeito parece estar relacionado à mudanças na composição e arquitetura da membrana celular, visto que o uso do agente fluidizador de membrana benzil álcool foi capaz de mimetizar o efeito do heat shock na potencialização do receptor P2X7 a 37ºC. Este estudo fornece evidências adicionais sobre o papel da sinalização purinérgica no contexto da biologia celular tumoral e abre novas perspectivas para o uso dos nucleotídeos de adenina associados a hipertermia como agentes adjuvantes na terapia do câncer. / The tumor microenvironment is rich in ATP and adenosine, suggesting an involvement for purinergic signaling in cancer development and surveillance. The P2X7 receptor, among the P2 purinergic receptors, is broadly recognized as the “death receptor”, because it promotes cell apoptosis when exposed to high levels of extracellular ATP. Researches have been shown that P2X7 protein levels are decreased at the tumor site in comparison to adjacent healthy tissue, suggesting a mechanism of tumor escape to cell death. Thus, understanding purinergic signaling in a cancer context becomes urgent and opens a new field for therapeutic strategies. Here, we evaluated adenine nucleotides and nucleosides cytotoxicity, as well as P2X7 role in cell death induction using cervical cancer cell lines. Indeed, we investigated heat shock effect on P2X7 functionality through exposing colon cancer cell shortly to ATP at 40ºC. According to our data, adenosine uptake formed from ATP metabolism is the main responsible for the extracellular ATP cytotoxicity in cervical cancer cells. While inside of the cell, adenosine is converted to AMP, leading to AMPK activation, p53 increase and autophagy induction. ATP induced cell death per se through P2X7 in this context seems to be less important, since P2X7 blockage or knocking down reduced only 20% of cell death. In colon cancer cells, we found that heat shock stress was able to increase P2X7 pore formation independently of heat shock protein interaction or native pore-forming transporters association (e.g pannexin-or connexin-type channels), thus leading to an increase ATP cytotoxicity. The mechanism enrolled in this process seems to be related to changes in the lipid composition and architecture of membrane, as the membrane fluidizer benzyl alcohol could reproduce heat stress effect in potentiating P2X7 activation at 37ºC. In conclusion, our work provides further evidence for a purinergic signaling role in the cancer biology context and opens new perspectives for the utility of purine-based drugs associated to hypertermia as adjunctive agents in cancer therapy.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

Vários estudos têm apontado a sinalização e os receptores purinérgicos, representados em mamíferos pelos receptores ionotrópicos (P2X1 P2X7) e metabotrópicos (P2Y1,2,4,6, 11,12,14), como um sistema primitivo, envolvido não somente na sinalização neuronal, mas também em muitos outros processos vitais incluindo resposta imune, inflamação, dor, agregação plaquetária e nos processos de diferenciação, proliferação e morte celular, que ocorrem no desenvolvimento e na regeneração tecidual. Condizente com as descrições da literatura, dados do nosso laboratório, baseados na farmacologia dos receptores purinérgicos, sugeriram o envolvimento do subtipo P2Y2 na proliferação e na neurogênese in vitro de células de carcinoma embrionário P19. Tendo em vista a ausência de agonistas e antagonistas específicos para a maioria dos subtipos de receptores purinérgicos, o que vem dificultando a elucidação das funções exatas desses receptores em processos fisiológicos e patológicos, optamos para o screening de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos para a identificação de ligantes de alta afinidade e especificidade para o receptor P2Y2 (procedimento de SELEX, Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Essa abordagem envolve passos reiterativos de seleção in vitro de moléculas de RNA, estabilizadas por substituição do grupo 2´OH das pirimidinas por um átomo de flúor, que possuem afinidade pelo receptor, até que a mistura de RNAs, originalmente de 1013 diferentes seqüências que adotam uma gama de estruturas secundárias e terciárias, esteja purificada para uma população homogênea de ligantes de alta afinidade pelo receptor P2Y2. O processo envolve a transcrição in vitro da biblioteca de DNA para RNA, a apresentação desta ao alvo, a eluição dos ligantes específicos, denominados aptâmeros, e a regeneração da biblioteca de DNA por RT-PCR, a qual, após uma reação de transcrição in vitro, gera a mistura de RNAs para o próximo ciclo de seleção. Neste trabalho, nós utilizamos como alvo o receptor P2Y2 recombinante humano expresso na linhagem de células de astroglioma humano 1321N1. Ao final de nove ciclos de SELEX, nós isolamos 46 sequências que foram agrupadas em três classes estruturais, de acordo com a presença de regiões consensos. A mistura destas moléculas se ligou ao receptor P2Y2 humano com uma constante de dissociação de 164 nM. Um dos clones isolados, o aptâmero B7, se ligou preferencialmente ao receptor P2Y2 (Kd 184 nM), em relação aos receptores P2Y1 e P2Y4 recombinantes expressos em células 1321N1. A interação deste aptâmero não foi dependente da espécie, uma vez que ele foi capaz de se ligar tanto ao receptor P2Y2 de origem humana como murina. A atividade biológica do aptâmero foi avaliada em células P19 (sabidamente expressando receptores P2Y2 endógenos), na qual a proteção do ATP contra a apoptose, provavelmente interagindo com o receptor P2Y2, foi anulada na presença deste aptâmero em uma concentração mil vezes menor do que a do ATP. Além de confirmar a viabilidade da técnica SELEX para identificar ligantes subtipos-específicos dos receptores purinérgicos, o aptâmero anti-P2Y2 serve como ferramenta fundamental para definir demais funções fisiológicas deste receptor. Passos de otimização das suas propriedades como ligante e biodisponibilidade tornarão este aptâmero um composto de alta relevância farmacêutica. / Many published studies have focused on purinergic signaling and receptors, represented by ionotropic (P2X1 P2X7) and metabotropic (P2Y1,2,4,6,11,12,14) subtypes as a universal system which is not only involved in neuronal signaling, but also in various other vital processes including immune response, inflammation, platelet aggregation as well as differentiation, proliferation and cell death occurring during development and tissue regeneration. In agreement with other published reports, results of our laboratory based on overlapping purinergic receptor pharmacology suggest the participation of the P2Y2 subtype in proliferation and in vitro neurogenesis of P19 embryonal carcinoma cells. In view of the lack of availability of specific agonists and antagonists for most purinergic receptors making the elucidation of exact functions of these receptors in their cellular context almost impossible, we used a combinatorial oligonucleotide library approach, denominated SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) for the development of high-affinity and specificity ligands for the P2Y2 receptor. This approach is based on re-iterative steps of in vitro selection of 2´-fluoro-pyrimidine-modified RNA molecules for receptor-binding affinity from an RNA pool containing 1013 different sequences and secondary and tertiary structures until this pool is purified to a homogeneous population of ligands with high affinity to the P2Y2 receptor. The combinatorial DNA library is in vitro transcribed into RNA followed by target presentation of the RNA library and elution of the target-binders, denominated aptamers, and RT-PCR amplification in order to restore the DNA library used for in vitro transcription for next SELEX cycle. Following nine SELEX cycles using 1321N1 human astroglial cells expressing recombinant human P2Y2 receptors as target, we isolated 46 aptamer sequences which, based on consensus sequence motifs, were grouped in three structural groups. The mixture of the isolated sequences bound themselves to human P2Y2 receptors with a dissociation constant (Kd) of 164 nM. One of the isolated clones, the aptamer denominated B7, bound itself to P2Y2 receptors in preference to P2Y1 and P2Y4 recombinant receptors expressed in 1321N1 cells. The binding activity of the aptamer was not limited to P2Y2 receptors of human origin, as the aptamer also interacted with mouse P2Y2 receptors. The capability of the aptamer of affecting the biological activity of P2Y2 receptors was verified in P19 cells in which ATP-induced protection against apoptosis, mediated by P2Y2 receptors, was abolished in the presence of the aptamer. In addition to providing a proof of principle for the feasibility of developing purinergic subtype-specific ligands by using the SELEX technique, the anti-P2Y aptamer provides a fundamental tool for gaining insights of physiological functions of this receptor in various cellular contexts. Moreover, steps of optimization of receptor binding properties and aptamer half-life in vivo will turn this aptamer into a compound of high pharmaceutical relevance.

Receptores purinérgicos são expressos em neurônios e glia e, por certo, participam dos processos de sinalização entre estes células. Nos gânglios da raiz dorsal o soma dos neurônios sensoriais é envolto por uma camada de células satélites (CSt), que são células de glia, cuja função é desconhecida. Até o momento a natureza dos receptores purinérgicos presentes nas células satélites foi pouco investigada. No presente trabalho demonstra-se a presença dos receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6 nas CSt de gânglios da raiz dorsal de ratos recém-nascidos. A prova da existência dos receptores foi a elevação na concentração intracelular do Ca2+, induzida pela aplicação de um agonista dos receptores. Nas culturas de mais de 24 horas, estimuladas por soro bovino fetal, proliferam de forma notável células de glia de aspecto predominantemente fusiforme. Determinou-se que as células fusiformes expressam receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6. As informações obtidas contribuem para o esclarecimento da sinalização entre neurônios e glia nos gânglios sensoriais da raiz dorsal. / Purinergic receptors are expressed and play role in the sinalization between neurons and glia. In dorsal root ganglia the soma of the sensory neurons is surrounded by a layer of satellite glial cells, whose function is unclear. There are evidences that ATP is released by neurons to act on receptors in satellite cells. So far, the nature of the purinergic receptors of satellite cells was not fully investigated. This study shows the presence of metabotropics purinergic receptors P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 in satellite cells from dorsal root ganglia of newborn rats. The demonstration was carried on following the transient increases in intracellular calcium concentration induced by a purinergic agonist. As time goes by, in the presence of fetal bovine serum, there is a remarkable proliferation of glial cells, with predominant fusiform shapes. The fusiform cells also express P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 receptors. These informations add on the understanding of the complex phenomena of neuron-glia interaction.

Os receptores purinérgicos são divididos em receptores P1 e P2 de acordo com o seu agonista endógeno, os receptores metabotrópicos P1 são ativados por adenosina, enquanto os metabotrópicos P2Y e ionotrópicos P2X são estimulados através do ATP e outros nucleotídeos. Além de sua função bem estabelecida na neurotransmissão, a sinalização purinérgica tem despertado crescente interesse científico devido à sua importância nas funções no metabolismo celular, incluindo os processos de desenvolvimento embrionário e reparação de tecidos. Isso ocorre especialmente no sistema nervoso central, onde eles controlam a proliferação, diferenciação, apoptose e a liberação de fatores neurotróficos. Nesse trabalho nós focamos nas ações sinérgicas entre a sinalização purinérgica e o fator de crescimento de nervos (NGF), tendo em vista três formas conhecidas de interação entre o NGF e os receptores purinérgicos, a potencialização dos efeitos do NGF através de uma ligação cruzada entre as vias, a regulação da expressão dos receptores purinérgicos pelo NGF e regulação da liberação de NGF pela adenosina. Com o objetivo de investigar estes processos sinérgicos na regulação da proliferação, migração e determinação fenotípica, células precursoras neurais foram obtidas do telencéfalo de embriões de rato e cultivadas na forma de neuroesferas, sendo então submetidas a tratamentos com agonistas e antagonistas dos receptores purinérgicos, em associação com o NGF, ao longo da diferenciação. Os efeitos desses tratamentos foram analisados por citometria de fluxo. Nós mostramos que o NGF age sobre as células aumentando a proliferação, migração e população de células indiferenciadas e diminuindo a apoptose. A ativação dos receptores P1 levou à diminuição da gliogênese e ao aumento da proliferação e da migração. A estimulação de receptores P2 resultou em aumento da proliferação e redução da taxa de apoptose. Os receptores purinérgicos potenciaram a proliferação mediada por NGF, resultando assim num aumento da população de células indiferenciadas. Neste último efeito percebemos a participação do receptor P2Y2 na sinergia. Os resultados aqui apresentados revelam novos mecanismos para a interação entre o NGF e a sinalização purinérgica na biologia de células tronco neurais / Purinergic receptors are divided into P1 and P2 receptors according to agonist selectivity, G-protein- coupled P1 receptors are activated by adenosine, while metabotropic P2Y and ionotropic P2X subtypes are stimulated by ATP and other nucleotides. In addition to its well-established function in neurotransmission, purinergic signaling has raised increasing scientific interest due to its importance in essential cellular functions and metabolism including embryonic developmental processes and tissue repair, specially in the central nervous system, where they control proliferation, differentiation, apoptosis and the release of neurotrophic factors. Here we focus on synergistic actions between purinergic P1 and P2 receptor-mediated signaling and the nerve growth factor (NGF), in view of three recognized forms of interaction between NGF and purinergic signaling, the potencialization of NGF-mediated effects through a crosstalk, the regulation of purinergic receptor expression by NGF and the regulation of NGF release by adenosine. With the objective to investigate such synergistic processes in regulating proliferation, neural migration and phenotype determination, neurospheres obtained as proliferating neural stem and progenitor from rat embryonic telencephalon were subjected to treatments with purinergic receptor agonists and antagonists in association with NGF along differentiation. Effects of these treatments were analyzed by flow cytometry. We show that NGF acted on cells by increasing the population of undifferentiated cells, proliferation, migration and reducing apoptosis. P1 receptor activation led to decreased gliogenesis, increased proliferation and migration. Stimulation of P2 receptors resulted in increased proliferation and decreased apoptosis rates. Purinergic receptors potentiated NGF-mediated proliferation, thereby resulting in increased population of undifferentiated cells, in this latter effect, the P2Y2 receptor subtype participated in synergistic processes. The herein presented results reveal novel mechanisms for the interaction of NGF and purinergic signaling in neural stem cell biology

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A homologia entre diferentes enzimas dessa família estimula investigações das interações dos anticorpos direcionados contra as isoformas destas enzimas presentes em parasitos e sua conexão com as isoformas expressas em seus hospedeiros mamíferos. As isoformas de NTPDases do helminto Schistosoma mansoni, denominadas SmATPDases 1 e 2 são antigênicas e exibem uma homologia significativa com as isoformas de NTPDases presentes em células de mamíferos. O objetivo do trabalho foi verificar se anticorpos anti-SmATPDase 1 presentes no soro de animal infectado com S. mansoni podem ter imunorreatividade cruzada com isoforma NTPDase 1 das células do sistema imune de mamíferos. Essa imunorreatividade pode afetar a proliferação e sinalização celular, justificando uma modulação direta da sinalização purinérgica desenvolvida durante a progressão da esquistossomose. Na primeira etapa, foi detectado que os anticorpos contra a isoforma de SmATPDase 1 presente no “pool” de soros de animais infectados foram capazes de reconhecer a isoforma NTPDase 1 em preparações de macrófagos e esplenócitos, resultando na visualização de bandas nítidas com peso molecular de aproximadamente 53 e 58 kDa. A isoforma NTPDase 1 também foi identificada na superfície destas células por imunofluorescência. A reatividade entre preparações de células e anticorpos anti-IgG presentes no soro de animais com esquistossomosse (diluições 1:50 e 1:100) também sugeriu a existência de proteínas homólogas entre o parasito e as células imunes, podendo estar relacionadas às NTPDases. Estes anticorpos utilizados foram capazes de reduzir a atividade fosfohidrolítica nas preparações de macrófagos (22%) e esplenócitos (58%), assim como os anticorpos anti-CD39 promoveram decréscimo nessa atividade em 40% e 83%, respectivamente. Em ensaios de proliferação celular, houve redução na proliferação de macrófagos em 24 h (14%), 48 h (14%) e 72 h (11%) em células incubadas com “pool” soros de animais infectados e com anti-CD39 29%, 12% e 90%, respectivamente. A atividade proliferativa de esplenócitos incubadas com anti-CD39 aumentou nos tempos de 48h (45%) e 72h (70%) e nas células mantidas com soro imune de animal infectado não foi observada nenhuma diferença significativa. Em ensaio de proliferação de linfócitos por citometria de fluxo houve um aumento significativo do número de linfócitos T nos grupos incubados com soro imune (36%) e anti-CD39 (>100%). Por sua vez, houve um decréscimo de 44% na proliferação de linfócitos B tratados previamente com soro de animal infectado e de 34% no grupo tratado com anti-CD39. Com esses resultados sugerimos que a inibição da NTPDase 1 de células imunes por anticorpos produzidos contra a isoforma da enzima do S. mansoni pode ser responsável pela modulação da resposta imune que ocorre na esquistossomose, contribuindo para um perfil Th2. Porém, outros testes são necessários para corroborar essa hipótese. A inibição das NTPDases pode contribuir para o estudo dos mecanismos envolvidos em diversas disfunções relacionadas a defeitos na sinalização purinérgica. / Extracellular nucleotides and nucleosides may act as signaling molecules that control inflammation and immune response. In this context, NTPDases represent an important family of enzymes capable of hydrolyzing di- and tri-phosphate nucleosides which regulate purinergic signaling in most living beings. The homology between different enzymes from the NTPDase family supports new investigations about the interactions of antibodies directed against isoforms of these enzymes in parasites and the connection to their isoforms expressed in mammalian hosts. The NTPDase isoforms in Schistosoma mansoni, called SmATPDases 1 and 2 are antigenic and display a significant homology with the NTPDases isoforms found in mammalian cells. The aim of this work was to verify if anti-SmATPDase 1 antibodies from serum of animals infected with S. mansoni show cross-immunoreactivity with the NTPDase 1 isoform from immune system cells of mammalians. This cross-immunoreactivity could affect cell proliferation and cell signalization, justifying a direct modulation of the purinergic signaling developed during the progression of schistosomiasis. Through western blotting technique we verified that antibodies against SmATPDase isoforms from serum of infected animals were able to recognize NTPDase isoform 1 from homogenized splenocytes and macrophages, resulting in clear display of bands with molecular weights of approximately 53 and 58 kDa. Additionally, NTPDase 1 was identified and localized in these cells by immunofluorescence. The reactivity between preparations of cells and anti-IgG antibodies present in the serum of animals with schistosomiasis (dilutions 1:50 and 1: 100) also suggested the existence of homologous proteins between the parasite and the immune cells that could be related to NTPDases. Antibodies were also able to reduce activity enzyme in preparations of macrophages (22%) and splenocytes (58%). Anti-CD39 promoted decrease in this activity by 40% and 83%, respectively. In cell proliferation assays, there was a reduction in the proliferation of macrophages in 24 h (14%), 48 h (14%) and 72 h (11%) in cells incubated with pool infected animal sera and with anti-CD39 29%, 12% and 90%, respectively. When the splenocytes culture was incubated with anti-CD39, proliferative activity increased in 48h (45%) and 72 h (70%) and in cells maintained with immune serum of the infected animal, it observed no significant difference. The lymphocyte proliferation assay by flow cytometry there is a significant increase in the number of T lymphocytes incubated with immune serum (36%) and anti-CD39 (> 100%). In turn, there was a 44% decrease in proliferation of B cells previously treated with infected animal serum and 34% in the group treated with anti-CD39. These results suggest that inhibition of NTPDase 1 of immune cells by antibodies produced against the isoforms of the S. mansoni could be responsible for modulation of the immune response during the schistosomiasis, conducting to a Th2 response. However, more tests should be carried out to confirm this hypothesis. The NTPDases inhibition may contribute for studies of the mechanisms involved in various disorders related to defects in purinergic signaling.

Orientador: Cláudia Herrera Tambeli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_JulianaMaia_D.pdf: 23889164 bytes, checksum: c8f281ea2cb5d4c68fb62ac535731385 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa e progressiva, caracterizada pela degradação da cartilagem que reveste as extremidades ósseas e inflamação da membrana sinovial, causando incapacidade física, inchaço articular e dor. Embora o alívio da dor severa seja o principal objetivo no tratamento agudo, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento da dor na OA. Estudos demonstram a participação do ATP (adenosina 5¿-trifosfato) em processos de hiperalgesia através da ativação dos receptores purinérgicos P2X3, P2X2/3 e P2X7. Portanto, os objetivos deste estudo foram: (1) investigar a participação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 na hiperalgesia articular em modelo de artrite na articulação do joelho de ratos machos e fêmeas em estro e se há diferenças sexuais no efeito induzido pelos antagonistas de receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7. (2) testar a hipótese de que a inflamação articular induzida pela carragenina aumenta a expressão do receptor P2X3 nos condrócitos da cartilagem articular da articulação do joelho de ratos. (3) verificar se o mecanismo pelo qual a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 contribui para a hiperalgesia articular depende da liberação prévia de citocinas pró-inflamatórias e da migração de neutrófilos. (4) investigar se a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 induz hiperalgesia na articulação do joelho de ratos dependente da liberação de mediadores inflamatórios. (5) testar a hipótese de que a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 contribui para a hiperalgesia articular induzida pelos mediadores inflamatórios: bradicinina, citocinas pró-inflamatórias, PGE2 e dopamina. Para os objetivos 1, 4 e 5, a hiperalgesia articular foi quantificada através do teste de Incapacitação Articular. Para o objetivo 2, foi utilizado o ensaio de imunofluorescência. Para os objetivos 3 e 4 foram utilizados os ensaios imuno-enzimáticos ELISA e MPO. Os resultados demonstram que a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 pelo ATP endógeno é essencial para o desenvolvimento da hiperalgesia articular induzida pela carragenina na articulação do joelho de ratos machos e fêmeas em estro, que são mais sensíveis do que os machos aos efeitos anti-hiperalgésicos e anti-inflamatórios induzidos pelo antagonista de receptor P2X7. Durante a inflamação articular induzida pela carragenina ocorre um aumento na expressão dos receptores P2X3 nos condrócitos da cartilagem articular. O papel dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 na hiperalgesia articular é mediado pela sensibilização indireta dos nociceptores aferentes primários, dependente da liberação prévia de citocinas pró-inflamatórias e da migração de neutrófilos. Além disso, a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 induz hiperalgesia articular dependente da liberação de bradicinina, aminas simpatomiméticas, prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias. Finalmente, a hiperalgesia articular induzida pelos mediadores inflamatórios bradicinina, PGE2 e dopamina depende da ativação de receptores P2X3 e P2X2/3, enquanto que a ativação de receptor P2X7 contribui para a hiperalgesia articular induzida pela bradicinina e dopamina. Concluindo, os resultados apresentados sugerem que os receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 são alvos farmacológicos interessantes para o tratamento das doenças inflamatórias articulares como a osteoartrite. Particularmente em relação ao receptor P2X7, antagonistas seletivos podem ser usados para reduzir a dor e inflamação no joelho, especialmente em mulheres / Abstract: Osteoarthritis (OA) is a degenerative and progressive disease, characterized by cartilage breakdown which covers the bone ends and by synovial membrane inflammation, causing disability, joint swelling and pain. The relief of severe pain is the main goal of the acute treatment, but little is known about the mechanisms involved in the development of pain in OA. It has been demonstrated the role of ATP (adenosine 5'-triphosphate) in processes of hyperalgesia through activation of purinergic receptors P2X3, P2X2/3 and P2X7. Therefore, the aims of this study were: (1) to investigate the role of P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors in articular hyperalgesia in the knee joint arthritis model in males and estrus females rats and, if so, whether there are sex differences in the effect induced by the selective P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors antagonists. (2) to test the hypothesis that the carrageenan-induced articular inflammation increases the expression of P2X3 receptor in chondrocytes of articular cartilage of the knee joint. (3) to verify whether the mechanism by which the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation contributes to articular hyperalgesia depends on previous pro-inflammatory cytokines release and neutrophil migration. (4) to investigate whether the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation induces articular hyperalgesia in the rat¿s knee joint which depends on release of inflammatory mediators. (5) to verify whether the activation of P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors contributes to the articular hyperalgesia induced by the inflammatory mediators bradykinin, pro-inflammatory cytokines, PGE2 and dopamine. For the aims 1, 4 and 5, the articular hyperalgesia was quantified by the rat knee joint Incapacitation Test. The immuno?uorescence method was used for the aim 2. For aims 3 and 4, the ELISA and MPO immunoenzymatic assays were used. The results demonstrate that P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation by endogenous ATP is essential for the development of carrageenan-induced articular hyperalgesia in the knee joint of male and estrus female rats, which are more sensitive than males to anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects induced by the P2X7 receptor antagonist. During carrageenan-induced joint inflammation occurs an increased of P2X3 receptors expression in chondrocytes of the articular cartilage. The essential role played by P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors in the development of articular hyperalgesia is mediated by an indirect sensitization of the primary afferent nociceptors dependent on the previous pro-inflammatory cytokines release and neutrophil migration. Moreover, the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation induces articular hyperalgesia which depends on bradykinin, sympathomimetic amines, prostaglandins and pro-inflammatory cytokines release. Finally, the articular hyperalgesia induced by inflammatory mediators bradykinin, PGE2 and dopamine depends on the P2X3 and P2X2/3 receptors activation, while the P2X7 receptor activation contributes to the bradykinin- and dopamine-induced articular hyperalgesia. In conclusion, our results suggest that P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors are interesting pharmacological targets for the treatment of inflammatory joint diseases such as osteoarthritis. In particular, selective P2X7 receptor antagonists can be used to reduce inflammation and pain in the knee joint, especially in women / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Toxoplasmosis, caused by the intracellular protozoan Toxoplasma gondii is an infectious disease, and this triggers the activation of the immune system. The pregnancy, in turn, shows characteristics of systemic inflammatory response. The ecto-enzymes as E-NTPDase and E- ADA activities in addition to possessing important in regulating the levels of adenine nucleotides and nucleoside, have shares extremely important in the immune system. Thus, the aim of this study was to determine the activity of enzymes that degrade adenine nucleotides and nucleoside in lymphocytes of women with antibodies to Toxoplasma gondii. Were included in the study, pregnant women seropositive (immune) and seronegative (susceptible) to toxoplasmosis in the last trimester of pregnancy, previously diagnosed service prenatal HUSM. Also, non-pregnant women seropositive and seronegative for toxoplasmosis, in the period from March to December 2012. We determined the enzymatic activities of ecto-enzymes: E-NTPDase and E-ADA in lymphocytes of pregnant and non-pregnant. The results showed an increase of the E-NTPDase activity and may lead to decreased levels of nucleotides ATP and ADP, and an increase in the activity of E-ADA, which may cause a decrease in the concentration of adenosine in groups: III (seronegative pregnant women toxoplasmosis) and IV (seropositive pregnant women for toxoplasmosis) when compared to the control group (I: non-pregnant women seronegative for toxoplasmosis). Pregnant women seropositive for toxoplasmosis compared with seronegative pregnant women did not change, thus revealing that toxoplasmosis in its chronic phase, may not interfere with purinergic signaling. In conclusion, the third trimester of pregnancy appears to be a physiological condition that involves purinergic signaling and toxoplasmosis in its chronic phase does not seem to be able to change this signaling. / A toxoplasmose, causada pelo protozoário intracelular Toxoplasma gondii é uma doença infecciosa,e com isso, desencadeia a ativação do sistema imune. A gestação, por sua vez, demonstra características da resposta inflamatória sistêmica. As ectoenzimas como: E-NTPDase e E-ADA, além de possuírem importante atividade na regulação dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeo da adenina, possuem ações extremamente importantes no sistema imunológico. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade de enzimas que degradam nucleotídeos e nucleosídeo da adenina em linfócitos de gestantes com anticorpos para Toxoplasma gondii. Foram incluídas na pesquisa, gestantes com sorologia positiva (imunes) e com sorologia negativa (suscetíveis) para toxoplasmose, no último trimestre gestacional, previamente diagnosticadas no serviço pré-natal do HUSM. E também, mulheres não gestantes com sorologia positiva e com sorologia negativa para toxoplasmose, no período de março a dezembro de 2012. Foram determinadas as atividades enzimáticas das ectoenzimas: E-NTPDase e E-ADA nos linfócitos das gestantes e das não gestantes. Os dados encontrados revelaram uma alteração nas atividades das ectoenzimas do sistema purinérgico no grupo de gestantes. Os resultados demonstraram um aumento da atividade da E-NTPDase, podendo levar a uma diminuição dos níveis de nucleotídeos ATP e ADP; e um aumento na atividade da E-ADA, podendo ocasionar uma diminuição da concentração de adenosina nos grupos: III (gestantes soronegativas para toxoplasmose) e IV (gestantes soropositivas para toxoplasmose) quando comparados ao grupo controle (I: mulheres não gestantes soronegativas para toxoplasmose). As gestantes soropositivas para toxoplasmose quando comparadas com as gestantes soronegativas não apresentaram alteração, revelando assim, que a toxoplasmose na sua fase crônica, possivelmente não interfere na sinalização purinérgica. Em conclusão, o terceiro trimestre gestacional mostra-se uma condição fisiológica que envolve a sinalização purinérgica e que a toxoplasmose em sua fase crônica não parece ser capaz de alterar esta sinalização.