Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_belinato_ioc_dout_2012.pdf: 3612135 bytes, checksum: 690556f02680b7036308993d110f343d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Ainda hoje o uso de inseticidas é um componente importante das estratégias de controle de vetores. O organofosforado temephos, por exemplo, é utilizado para controle de populações de Aedes aegypti no Brasil desde 1967. Um dos problemas relacionados ao uso intenso de inseticidas por um longo período de tempo é a seleção de indivíduos resistentes. A resistência a inseticidas está, em grande parte, relacionada com o aumento da expansão de A. aegypti ao longo das últimas décadas e é desafio atual dos programas de controle do vetor. Outros compostos, com diferentes mecanismos de ação, têm sido empregados nos locais onde as populações encontram-se resistentes aos inseticidas tradicionais. Uma vez que poucos produtos estão disponíveis para controle de A. aegypti, entender os mecanismos de resistência relacionados aos principais inseticidas atualmente empregados pode ser fundamental para compreender a evolução da resistência em campo. No presente trabalho, foi avaliada, usando a linhagem Rockefeller e populações de campo de A. aegypti, a atividade de enzimas detoxificantes, em resposta a doses parcialmente letais de representantes das principais classes de inseticidas empregados no país: os larvicidas temephos e o inibidor de síntese de quitina (ISQ) diflubenzuron, além do piretróide permetrina Também foi realizada seleção com diflubenzuron em duas populações de campo, com diferentes níveis de resistência ao OP temephos. Foram investigados, nessas populações, diversos parâmetros do fitness, antes e depois da seleção com o ISQ. Verificamos que todas as populações estudadas apresentaram altos níveis de resistência aos inseticidas químicos tradicionais, mas não ao diflubenzuron. Quando aplicado em larvas, temephos provocou diminuição progressiva da atividade de acetilcolinesterase e de esterases, confirmando reação, com OP, dos substratos utilizados nas avaliações do monitoramento dos mecanismos de resistência. Diflubenzuron provocou mudanças no perfil da atividade de GST e MFO em Rockefeller e em uma população de campo. Além disso, populações selecionadas com o ISQ apresentaram aumento da atividade destas duas classes de enzimas. Esses dados apontam para a potencial participação de GST e MFO na metabolização de diflubenzuron. Também verificamos que a resistência a temephos está associada a comprometimento de diversos parâmetros da biologia dos mosquitos. Reversão da resistência em populações mantidas na ausência do inseticida, aliada à recuperação de diversos aspectos do fitness, reforça essa hipótese. Do mesmo modo que temephos, a resistência a diflubenzuron também acarreta problemas no fitness. De modo geral, houve redução na taxa de aceitação do repasto sanguíneo, quantidade de sangue ingerido, número de ovos e quantidade de fêmeas inseminadas. Esperamos que os resultados aqui apresentados possam contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos de resistência a inseticidas em populações de campo de A. aegypti e para promover o desenho de estratégias de controle diferenciadas e racionais do vetor / Insecticides still play an important role in vector control strateg ies. For instance, i n Brazil , the organophosphate (OP) temephos has been employed since 1967 against A edes aegypti . One ma jor consequence related to the intense use of insecticides for long period s is selection of resistance . Insecticide resistance is associated to A. aegypti expansion over the past decades and is a current challenge for vector control programs . Compounds with different mechanisms of action are presently being employed in localities whe re vector populations are resistant to traditional insecticides . Since there are few products available for A. aegypti control, knowledge of the mechanisms of resistance to insecticides currently in use could be essential to understanding the evolution of resistance in the field . In this study, the activity of detoxifying enzymes of A. aegypti Rockefeller strain and field populations was evaluated after expos ure to partially lethal doses of th ree insecticides , representative of the main classes employed in the country: t he OP temephos, the chitin synthesis inhibitor (CSI) diflubenzuron and the pyrethroid (PI) permethrin . S election with diflubenzuron of two field populations, with distinct temephos resistance levels w as also performed. Several fitness paramet ers were i nvestigate d in these populations, before and after selection with the ISQ . We previously identified, in both populations , high resistance levels to the conventional chemical insecticides, but not to diflubenzuron . When applied to larvae, temephos caused progressive decrease in the activity of a cetylcholinesterase and e sterases, confirming that substrates used in routine monitoring of resistance mechanisms indeed reacts with OP. Diflubenzuron caused changes in the activity profile of MFO and GST in both Rockefeller strain and in a field population . In addition, populations selected with the ISQ showed increased activity of these two enzyme classes . These data point to the potential participation of MFO and GST in diflubenzuron metabolism . We also fo und that temephos resistance is associated with the impairment of several parameters of mosquitoes ’ biology . Reversion of resistan ce in populations maintained in absence of insecticides, coupled with the recovery of various fitness aspects, support s this h ypothesis . As with temephos, diflubenzuron resistance causes fitness problems. Overall, there was a reduction in b lood meal acceptance, amount of ingested blood, number of eggs and frequency of inseminated females . Our results may contribute to a better kn owledge of insecticide resistance mechanisms in A. aegypti field populations and to the developm ent of novel and rational control strategies.

SILVA, B. H. M. Clonagem, sequenciamento e modelagem molecular por homologia da sequência parcial de uma vicilina de genótipos de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] contrastantes em relação à resistência ao caruncho Callosobruchus maculatus. 2014. 51 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-12-03T12:02:29Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_bhmsilva.pdf: 2047999 bytes, checksum: 5b8c51e3c9bf10451a2d551396875637 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-13T14:47:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_bhmsilva.pdf: 2047999 bytes, checksum: 5b8c51e3c9bf10451a2d551396875637 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-13T14:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_bhmsilva.pdf: 2047999 bytes, checksum: 5b8c51e3c9bf10451a2d551396875637 (MD5) Previous issue date: 2014 / The cowpea bean [Vigna unguiculata (L.) Walp.] is a legume with high protein levels, largely cultivated and consumed in the Northeast of Brazil. Due to your economic importance, there are several studies that search resistant forms of cultivars of this kind of bean, as they is often attacked by different kinds of pests and predators. One of the most common is the weevil Callosobruchus maculatos. With the discovery of resistant cultivars for this insect many questions emerged about what biological component of the plant was responsible for such defensive action. Some studies suggest that this resistance is due to vicilin, which are reserve nutritious proteins, present in the seeds of cowpea. In this work, regions belonging to the vicilin gene of two contrasting cultivars in relation to resistence to weevil were sequenced, one resistant (IT81D-1053) and a susceptible (EPACE-10). These sequences, which come from several clones, were analyzed and thereby deducting its three-dimensional structure was made through a homology modeling using as template one 7S globulin from adzuki bean (Vigna angularis) identified as 2EA7 in the PDB database. Sequence analysis revealed that there are two regions highly variable in sequence from the vicilin gene, and these regions are rich in glutamine. Previous studies suggest that resistance to weevil occurs in the fact that the vicilin can bind to chitin and such glutamine rich regions are potentially chitin binding due to the high ability to form hydrogen bonds between the residues of glutamine and residues of N-acetylglucosamine. The structural analysis also supports this assumption, because the region rich in glutamine is very exposed, in relation to the protein surface, which facilitates the interaction of these amino acid residues with chitin. However more refined studies are needed to have a certainty of how is this interaction between vicilin and chitin, and if these same proteins are in fact fundamental in the resistance against the weevil. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] é uma leguminosa com alto teor de proteínas, muito consumida e cultivada na região Nordeste do Brasil. Devido a sua importância econômica, existem vários estudos que procuram formas de cultivares resistentes desta espécie de feijão, pois esta é muito atacada por diversos tipos de pragas e predadores. Um dos mais comuns é o caruncho Callosobruchus maculatos. Com a descoberta de cultivares resistentes a este inseto, questionou-se sobre o componente biológico da planta responsável por tal ação defensiva. Alguns estudos sugerem que essa resistência ocorre devido as vicilinas, que são proteínas de reserva nutritiva, presentes nas sementes do feijão-de-corda. No presente trabalho, foram sequenciadas regiões pertencentes ao gene de vicilina de dois cultivares contrastantes em relação ao ataque do caruncho, sendo um resistente (IT81D-1053) e outro suscetível (EPACE-10). Essas sequências, advindas de vários clones, foram analisadas e com isso foi feita a dedução de sua estrutura tridimensional através de uma modelagem por homologia, utilizando como molde uma globulina 7S de feijão-azuki (Vigna angularis) identificada como 2EA7 no banco de dados PDB. A análise das sequências revelou que há duas regiões bastante variáveis na sequência do gene da vicilina, sendo essas regiões ricas em glutamina. Estudos anteriores sugerem que a resistência ao gorgulho se dá no fato de que as vicilinas conseguem se ligar a quitina, e tais regiões são potencialmente ligantes a quitina devido a grande capacidade de formar ligações de hidrogênio entre os resíduos de glutamina e os resíduos de N-acetilglucosamina. A análise estrutural também corrobora esta hipótese, pois a região rica em glutamina é bastante exposta, em relação à superfície proteica, o que facilita a interação destes resíduos de aminoácidos interagirem com a quitina. Entretanto estudos mais refinados são necessários para se ter uma maior certeza de como se dá esta interação entre vicilinas e a quitina, e se de fato essas proteínas são mesmo fundamentais na resistência contra o caruncho.

JEREISSATI, E. S. Transformação genética de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I. 2012, Transformação genética de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I. 120 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-15T18:58:02Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_esjereissati.pdf: 8084916 bytes, checksum: 05dd57f88cba77dba6c72ab53b984f08 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-19T17:21:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_esjereissati.pdf: 8084916 bytes, checksum: 05dd57f88cba77dba6c72ab53b984f08 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-19T17:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_esjereissati.pdf: 8084916 bytes, checksum: 05dd57f88cba77dba6c72ab53b984f08 (MD5) Previous issue date: 2012 / Heterologous expression of genes encoding pathogenesis related proteins (PR-proteins) represents a promising alternative for the development of plants resistant to fungi. Among the PR-proteins with great biotechnological potentials are the chitinases, a class of hydrolases which catalyze the degradation of chitin, a polymer constituent of cell wall of several species of pathogenic fungi. Besides their function related to defense mechanisms, it is believed that these enzymes may play other roles, such as regulation of growth and development processes in plants. Using two approaches, this study sought to investigate the role of a class I chitinase of cowpea (VuChiI) in defense and plant development. The first approach consisted of silencing of the gene encoding for VuChiI in cowpea. Apical meristems excised from cowpea seeds were bombarded with microparticles containing a silencing vector (pKANNIBAL), which was cloned with a construct harboring an intron harpin of the gene VuChiI. Plants regenerated in a Murashige and Skoog (MS) media containing imazapyr as a selection agent, were analyzed by PCR, resulting in confirmation of genetic transformation of five plants from the 1092 apical meristems bombarded. Northern blot analysis of total RNA extracted from the putative transgenic plants allowed for the detection of siRNAs. Upon regeneration and germination, only one of the five transformed plants produced a pod containing six seeds. Of these, only one germinated when further planted. The transformed plants exhibited a life cycle of over 365 days, as against the normal cycle of 65-70 days. Based on these results we posit that silencing of class I cowpea chitinase may have led to changes in plant development. The second strategy consisted of co-cultivation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens strain LB4404 suspension to express recombinant protein in the extracellular space of the regenerated plants in order to expose the protein fungus even before its penetration into the plant cell. To achieve this, a sequence of cowpea chitinase insert was cloned into the binary vector pCAMBIA1305.2 under the control of CaMV35S promoter and signal peptide fused to glycine-rich protein of Oryza sativa (GRP), which allowed the secretion of recombinant protein via apoplast. This led to the generation of three strains as confirmed by PCR. Seeds obtained from transformed R1 generation of the plants were germinated and analyzed for transmission of the transgene using X2 test, which confirmed its transmission to the progeny in a Mendelian fashion. The experimental models developed in this work may serve to further assess the biological roles of class I chitinase from cowpea. / A expressão heteróloga de genes que codificam proteínas relacionadas à patogênse (PR-proteínas) representa uma alternativa promissora para o desenvolvimento de plantas resistentes ao ataque de fungos. Dentre as PR-proteínas com grande potencial biotecnológico, estão as quitinases, hidrolases que catalisam a degradação da quitina, que é um polímero constituinte da parede celular de muitas espécies de fungos fitopatogênicos. Além da função relacionada aos mecanismos de defesa, acredita-se que essas enzimas podem desempenhar outros papéis, como a regulação de processos de crescimento e desenvolvimento em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de uma quitinase de classe I de feijão-caupi (VuChiI) na defesa e no desenvolvimento vegetal e para isso duas abordagens foram conduzidas. A primeira consistiu no silenciamento do gene que codifica esta proteína em plantas de feijão-caupi. Nos experimentos de silenciamento gênico foram utilizados meristemas apicais de plântulas de feijão-caupi, que foram então bombardeados com micropartículas portando um vetor de silenciamento (pKANNIBAL), onde foi clonada uma construção em grampo (intron harpin) do gene de VuChiI. As plantas regeneradas em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS) contendo o herbicida imazapyr, como agente de seleção, foram analisadas por PCR, o que resultou na confirmação da transformação genética de cinco plantas, a partir de 1.092 meristemas apicais bombardeados. O RNA foi extraído das plantas transformadas e utilizado em análises de Northern blot que possibilitou a detecção de siRNAs no RNA total extraído das plantas putativamente transgênicas. Apenas uma das plantas transformadas produziu uma vagem contendo seis sementes, das quais apenas uma germinou. As plantas transformadas apresentaram ciclo de vida de mais de 365 dias enquanto que o esperado é de 65-70 dias. Com base nos resultados sugere-se que o silenciamento da quitinase de classe I de feijão-caupi pode ter promovido alteração no desenvolvimento da planta. A segunda estratégia de transformação genética consistiu no co-cultivo de discos foliares de tabaco com suspensão de Agrobacterium tumefaciens LB4404, com o intuito de expressar a proteína recombinante no espaço extracelular das plantas regeneradas. Essa estratégia tem como objetivo fazer com que a proteína entre em contato com o fungo antes mesmo que este agente patogênico penetre na célula vegetal. Para tanto, o inserto referente à quitinase de feijão-caupi foi clonado no vetor binário pCAMBIA1305.2 sob controle do promotor CaMV35S e fundido ao peptídeo sinal GRP (glycine-rich protein de Oryza sativa), que permite a secreção da proteína recombinante via apoplasto. Foram produzidas três linhagens de plantas que tiveram a transformação genética confirmada por PCR. As sementes obtidas das plantas transformadas, geração R1, foram semeadas em meio seletivo para a análise da transmissão do transgene. O teste de X2 indicou que o transgene foi transmitido para a progênie em proporções Mendelianas. Os modelos experimentais desenvolvidos neste trabalho poderão contribuir para a elucidação dos papéis biológicos da quitinase de classe I de feijão-caupi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-graduação em Engenharia Ambiental / Made available in DSpace on 2013-06-25T19:28:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 309797.pdf: 3232867 bytes, checksum: 271641ac68a89741ca7db783319d4e57 (MD5) / Existem cada vez mais evidências de que o alumínio é prejudicial para a saúde. Seu excesso no organismo prejudica o transporte de ferro e as funções do ATP, além de provocar osteomalacia, encefalopatia por diálise e anemia microcítica. Suspeita-se também que possa ser um fator desencadeante da doença de Alzheimer e da esclerose múltipla. Uma das fontes mais importantes de entrada de alumínio no organismo humano é a água potável. A tecnologia empregada para remover o alumínio foi a remoção via uso de biopolímeros, por serem materiais abundantes e biodisponíveis, renováveis, de custo relativamente baixo e não tóxicos. Os biopolímeros escolhidos em base à literatura foram a carboximetilcelulose e a quitina. Estes biomateriais podem remover alumínio via processos de adsorção e/ou de complexação via formação de ligações entre seus grupos funcionais e o alumínio. O presente trabalho objetivou: a) determinar a capacidade de remoção de Al3+ por ambos os biopolímeros na faixa de concentração do metal encontrada em água de abastecimento público; b) caracterizar o mecanismo e a velocidade do processo de remoção de Al3+ pelos biopolímeros por meio de estudos isotérmicos, espectroscópicos e cinéticos; c) efetuar estudos de remoção de alumínio em fluxo contínuo visando encontrar os melhores parâmetros operacionais. Os ensaios de remoção de alumínio foram efetuados em regime de batelada utilizando soluções aquosas sintéticas contendo diferentes concentrações de alumínio e diferentes quantidades de biopolímeros. Foram efetuados diferentes experimentos para determinar as condições ideais de pH, temperatura, relação quantidade de biopolímero/concentração de alumínio e tempo de contacto água/biopolímero que levam às melhores remoções de alumínio. Os resultados permitiram concluir que a carboximetilcelulose não é um agente de remoção de alumínio adequado quando este se encontra presentes em baixas concentrações características de águas para abastecimento. Em contraste, a quitina demonstrou uma capacidade de remoção excelente, mesmo a temperatura ambiente e sem necessidade de modificar o pH da amostra. Com objeto de caracterizar o mecanismo que rege a remoção de alumínio pelos biopolímeros, foram efetuados estudos de isotermas de adsorção utilizando soluções sintéticas. Os dados experimentais dos ensaios foram comparados com os modelos de isoterma de Langmuir, Freundlich, Sips e Tóth. O modelo que melhor ajustou-se foi o de Tóth, o que indica um mecanismo de remoção via quimissorção, mas com interações Al-biopolímero mais fracas que as correspondentes ao modelo de Langmuir. A capacidade máxima de remoção de alumínio calculada foi de 20,144 mg Al3+ / g quitina, valor muito adequado para o emprego de quitina em procedimentos em maior escala. Análises por espectroscopia infravermelha (IFTR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) contribuíram para uma melhor caracterização do material, antes e após o processo de remoção, bem como do mecanismo envolvido no processo. Os estudos cinéticos, efetuados com soluções sintéticas, água de poço e água decantada de estação de tratamento de água, revelaram cinéticas de pseudo-segunda ordem, atingindo-se os residuais de alumínio permitidos pela normativa em ~30 minutos para o biopolímero quitina. Para a remoção total de alumínio foram necessários tempos de contacto de ~160 minutos, dependendo da relação Al3+/biopolímero usada. Os ensaios em fluxo contínuo e descendente de água de poço através de uma coluna contendo quitina compactada mostraram-se muito promissores. A técnica mostrou-se capaz de remover alumínio de grandes volumes de água com tempos curtos de contacto sem atingir a saturação do biopolímero, demonstrando uma capacidade de remoção máxima de 9,53 mg Al3+/ g quitina, sendo capaz de manter a água abaixo do valor máximo permitido nas condições analisadas por mais de 2 horas com uma taxa de 6,7 m3 m-2 h-1. O estudo efetuado demonstrou que a quitina é um biomaterial muito adequado para a remoção de alumínio de água para abastecimento, tanto em regime de batelada como em contínuo. Estes resultados, junto com seu baixo custo, que faz desnecessário aplicar processos para sua regeneração após saturação, permitem concluir que a quitina é um excelente agente de remoção de alumínio a escala de laboratório que pode ser testado em experimentos em maior escala / There is increasing evidence that aluminum may be harmful to human health. Its excess impairs the body iron transport and functions of ATP, besides causing osteomalacia, dialysis encephalopathy and microcytic anemia. It is suspected that can also be a trigger factor of Alzheimer's disease and multiple sclerosis. One of the most important sources of aluminum intake and ingestion in the human body is drinking water. Therefore, this study aimed to remove the aluminum present in water supplies, from both natural and introduced from coagulants used in water treatment stations. The technology employed to remove the aluminum was via use of biopolymers, to be bioavailable, abundant, renewable, relatively inexpensive non-toxic materials. The polymers chosen were based on literature were carboxymethylcellulose and chitin. Those biomaterials can remove aluminum via adsorption processes and/or complexing via the formation of bonds between their functional groups and aluminum. This study aimed to: a) determine the removal capacity of Al3+ for both polymers in the concentration range of metal found in public water supply, b) to characterize the mechanism and speed the process of Al3+ removal by the biopolymers through isothermal, kinetic and spectroscopic studies; c) conduct aluminum removal studies in continuous flow in order to find the best operating parameters. The aluminum removal tests were made under batch conditions, using synthetic aqueous solutions containing different concentrations of Al3+ and different amounts of biopolymers. Several experiments were performed to determine the optimal conditions of pH, temperature, relative amount of biopolymer/aluminum concentration and contact time water/biopolymer that lead to a better Al3+ removal. The results showed that carboxymethylcellulose is not an suitable agent for Al3+ removal when it is present in low concentrations of features for water supply. In contrast, a chitin demonstrated excellent ability to remove Al3+, even at room temperature and without need to modify the pH of the sample. Aiming characterizing the mechanism governing the removal of aluminum by biopolymers, adsorption isotherms studies using synthetic solutions were carried out. The experimental tests were compared with the Langmuir, Freundlich, Sips and Toth isothermal models. The model that best fitted the experimental data was Tóth model, which indicates a removal mechanism through chemisorption, but with a Al-biopolymer interaction weaker than those corresponding to the Langmuir model. The maximum aluminum removal was estimated to be 20.144 mg Al3+/g chitin, a very suitable value for the use of chitin in procedures on a larger scale. Analysis by infrared spectroscopy (IFTR) and scanning electron microscopy (SEM) contributed to a better characterization of the material before and after the removal process as well as the mechanism involved. The kinetic studies performed with synthetic solutions, well water and decanted Water Treatment Plant water, showed kinetics of pseudo-second order, reaching the residual aluminum allowed by WHO guide in ~ 30 minutes for the biopolymer chitin, with a complete Al3+ removal from the solution within a contact time of ~ 160 minutes, depending on the relationship Al3+/QTN used. The tests and down-stream flux of well water through a packed column containing QTN were very promising. The QTN was capable of removing aluminum from large volumes of water with short times of contact without reaching the saturation of the biopolymer, showing a maximum adsorption capacity of 9.53 mg Al3+/g chitin, being capable of maintaining the water below the maximum permitted concentration for over two hours at a rate of 6,7 m3 m2 h-1. The studies performed demonstrated that chitin is a biomaterial very suitable for the removal of water for aluminum, both under batch and continuous. These results, along with its low cost, which makes it unnecessary to apply processes for regeneration after saturation, allow to conclude that the chitin is an excellent agent for removing aluminum laboratory scale that can be tested in experiments on a larger scale

Orientador: Eduardo René Pérez González / Banca: Alvicler Magalhães / Banca: Luiz Carlos da Silva Filho / Resumo: O presente trabalho descreve modificações estruturais feitas na cadeia lateral do polímero quitina-quitosana mediante a N-alquilação com um aldeído aromático, a qual origina a base de Schiff como produto intermediário, seguido de uma redução com cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) para a formação do composto N-Benzilquitosana. Subsequentemente, reações de acoplamento entre o produto sintetizado e diferentes sais de diazônio foram realizadas para produzir uma nova classe de compostos poli-azóicos a partir deste polímero. Estas modificações são importantes pela síntese de novos derivados com potencial aplicação como materiais orgânicos. Pela técnica de ressonância magnética nuclear de próton em solução, determinou-se o grau de desacetilação do polímero que foi de 68 %. O grau de substituição do derivado N-Benzilquitosana também foi determinado por RMN de 1H e o valor encontrado foi de 46 %. Todos os compostos foram caracterizados por espectroscopia de absorção na região do infravermelho e ressonância magnética nuclear em solução e no estado sólido, que confirmaram a síntese dos derivados poliméricos. Devido ao alto peso molecular do polímero e seus derivados, estes foram hidrolisados e os oligômeros formados foram estudados por espectrometria de massas com ionização por eletrospray. Além de confirmar a formação do composto N-Benzilquitosana, constatou-se uma reação de substituição nucleofílica aromática do átomo de bromo e do grupo nitro pelo átomo de cloro promovido pela alta concentração de íons cloretos no meio reacional. Entretanto, a técnica não se mostrou adequada para a caracterização dos poli-azo-compostos, pois a reação de hidrólise ácida leva a uma degradação dos mesmos. A espectroscopia de UV-VIS permitiu identificar as bandas de absorção dos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present work describes the structural modifications made in the side chain of the polymer chitin-chitosan by N-alkylation with an aromatic aldehyde, which forms the Schiff base as an intermediate, followed by reduction with sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) to form the N-Benzyl chitosan compound. Subsequently, coupling reactions between the synthesized product and different diazonium salts were made to produce a new class of poly-azo-compounds from this polymer. These changes are important for the synthesis of new derivatives with potential use as organic materials. By proton nuclear magnetic resonance, it was determined the degree of deacetylation of the polymer, which was 68%. The degree of substitution of N-Benzyl chitosan derivative was also determined by 1H NMR and the value was 48%. All compounds were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance, which confirmed the synthesis of polymeric derivatives. Due to the high polymer molecular weight and its derivatives, they were hydrolysed and the oligomers formed were analyzed by mass spectrometry with electrospray ionization. In addition to confirm the formation of the compound N-Benzyl chitosan, there was a nucleophilic aromatic substitution reaction of the bromine atom and the nitro group by chlorine atom promoted by high concentration of chloride ions in the reaction medium. However, the technique was not suitable for the characterization of poly-azo-compounds because the reaction of acid hydrolysis leads to their degradation. The UV-VIS spectroscopy allowed the identification of the absorption bands of poly-azo-compounds and showed that the substituents influence the absorption causing an batocromic effect to a longer wavelength. Finally, it was studied the thermal behavior of the polymer chitin-chitosan and its derivatives by thermogravimetry... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-21Bitstream added on 2014-06-13T19:58:56Z : No. of bitstreams: 1 pereira_fs_me_bauru.pdf: 1450189 bytes, checksum: abd0b71fa89bda3df1f8153f2dcbe346 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho descreve modificações estruturais feitas na cadeia lateral do polímero quitina-quitosana mediante a N-alquilação com um aldeído aromático, a qual origina a base de Schiff como produto intermediário, seguido de uma redução com cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) para a formação do composto N-Benzilquitosana. Subsequentemente, reações de acoplamento entre o produto sintetizado e diferentes sais de diazônio foram realizadas para produzir uma nova classe de compostos poli-azóicos a partir deste polímero. Estas modificações são importantes pela síntese de novos derivados com potencial aplicação como materiais orgânicos. Pela técnica de ressonância magnética nuclear de próton em solução, determinou-se o grau de desacetilação do polímero que foi de 68 %. O grau de substituição do derivado N-Benzilquitosana também foi determinado por RMN de 1H e o valor encontrado foi de 46 %. Todos os compostos foram caracterizados por espectroscopia de absorção na região do infravermelho e ressonância magnética nuclear em solução e no estado sólido, que confirmaram a síntese dos derivados poliméricos. Devido ao alto peso molecular do polímero e seus derivados, estes foram hidrolisados e os oligômeros formados foram estudados por espectrometria de massas com ionização por eletrospray. Além de confirmar a formação do composto N-Benzilquitosana, constatou-se uma reação de substituição nucleofílica aromática do átomo de bromo e do grupo nitro pelo átomo de cloro promovido pela alta concentração de íons cloretos no meio reacional. Entretanto, a técnica não se mostrou adequada para a caracterização dos poli-azo-compostos, pois a reação de hidrólise ácida leva a uma degradação dos mesmos. A espectroscopia de UV-VIS permitiu identificar as bandas de absorção dos... / The present work describes the structural modifications made in the side chain of the polymer chitin-chitosan by N-alkylation with an aromatic aldehyde, which forms the Schiff base as an intermediate, followed by reduction with sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) to form the N-Benzyl chitosan compound. Subsequently, coupling reactions between the synthesized product and different diazonium salts were made to produce a new class of poly-azo-compounds from this polymer. These changes are important for the synthesis of new derivatives with potential use as organic materials. By proton nuclear magnetic resonance, it was determined the degree of deacetylation of the polymer, which was 68%. The degree of substitution of N-Benzyl chitosan derivative was also determined by 1H NMR and the value was 48%. All compounds were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance, which confirmed the synthesis of polymeric derivatives. Due to the high polymer molecular weight and its derivatives, they were hydrolysed and the oligomers formed were analyzed by mass spectrometry with electrospray ionization. In addition to confirm the formation of the compound N-Benzyl chitosan, there was a nucleophilic aromatic substitution reaction of the bromine atom and the nitro group by chlorine atom promoted by high concentration of chloride ions in the reaction medium. However, the technique was not suitable for the characterization of poly-azo-compounds because the reaction of acid hydrolysis leads to their degradation. The UV-VIS spectroscopy allowed the identification of the absorption bands of poly-azo-compounds and showed that the substituents influence the absorption causing an batocromic effect to a longer wavelength. Finally, it was studied the thermal behavior of the polymer chitin-chitosan and its derivatives by thermogravimetry... (Complete abstract click electronic access below)

La quitina es un biopolímero muy abundante presente en el caparazón de crustáceos, insectos y en la pluma del calamar y la pota, entre otras fuentes. La desacetilación de la quitina forma la quitosana, un polisacárido más versátil por su solubilidad y mayor reactividad química. La quitosana es utilizada en aplicaciones médicas, farmacéuticas, cosméticas, tratamiento de aguas, agricultura e industria alimentaria. / Chitin is an abundant biopolymer that can be found in shells of crustaceans, insects and in squid and pota pen. Deacetylation of chitin produces chitosan, a more versatile polysaccharide due to its solubility and increased chemical reactivity. Chitosan is used in medicine, pharmaceutics, cosmetics, water treatment, agriculture and food industry.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A expressÃo heterÃloga de genes que codificam proteÃnas relacionadas à patogÃnse (PR-proteÃnas) representa uma alternativa promissora para o desenvolvimento de plantas resistentes ao ataque de fungos. Dentre as PR-proteÃnas com grande potencial biotecnolÃgico, estÃo as quitinases, hidrolases que catalisam a degradaÃÃo da quitina, que à um polÃmero constituinte da parede celular de muitas espÃcies de fungos fitopatogÃnicos. AlÃm da funÃÃo relacionada aos mecanismos de defesa, acredita-se que essas enzimas podem desempenhar outros papÃis, como a regulaÃÃo de processos de crescimento e desenvolvimento em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de uma quitinase de classe I de feijÃo-caupi (VuChiI) na defesa e no desenvolvimento vegetal e para isso duas abordagens foram conduzidas. A primeira consistiu no silenciamento do gene que codifica esta proteÃna em plantas de feijÃo-caupi. Nos experimentos de silenciamento gÃnico foram utilizados meristemas apicais de plÃntulas de feijÃo-caupi, que foram entÃo bombardeados com micropartÃculas portando um vetor de silenciamento (pKANNIBAL), onde foi clonada uma construÃÃo em grampo (intron harpin) do gene de VuChiI. As plantas regeneradas em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS) contendo o herbicida imazapyr, como agente de seleÃÃo, foram analisadas por PCR, o que resultou na confirmaÃÃo da transformaÃÃo genÃtica de cinco plantas, a partir de 1.092 meristemas apicais bombardeados. O RNA foi extraÃdo das plantas transformadas e utilizado em anÃlises de Northern blot que possibilitou a detecÃÃo de siRNAs no RNA total extraÃdo das plantas putativamente transgÃnicas. Apenas uma das plantas transformadas produziu uma vagem contendo seis sementes, das quais apenas uma germinou. As plantas transformadas apresentaram ciclo de vida de mais de 365 dias enquanto que o esperado à de 65-70 dias. Com base nos resultados sugere-se que o silenciamento da quitinase de classe I de feijÃo-caupi pode ter promovido alteraÃÃo no desenvolvimento da planta. A segunda estratÃgia de transformaÃÃo genÃtica consistiu no co-cultivo de discos foliares de tabaco com suspensÃo de Agrobacterium tumefaciens LB4404, com o intuito de expressar a proteÃna recombinante no espaÃo extracelular das plantas regeneradas. Essa estratÃgia tem como objetivo fazer com que a proteÃna entre em contato com o fungo antes mesmo que este agente patogÃnico penetre na cÃlula vegetal. Para tanto, o inserto referente à quitinase de feijÃo-caupi foi clonado no vetor binÃrio pCAMBIA1305.2 sob controle do promotor CaMV35S e fundido ao peptÃdeo sinal GRP (glycine-rich protein de Oryza sativa), que permite a secreÃÃo da proteÃna recombinante via apoplasto. Foram produzidas trÃs linhagens de plantas que tiveram a transformaÃÃo genÃtica confirmada por PCR. As sementes obtidas das plantas transformadas, geraÃÃo R1, foram semeadas em meio seletivo para a anÃlise da transmissÃo do transgene. O teste de X2 indicou que o transgene foi transmitido para a progÃnie em proporÃÃes Mendelianas. Os modelos experimentais desenvolvidos neste trabalho poderÃo contribuir para a elucidaÃÃo dos papÃis biolÃgicos da quitinase de classe I de feijÃo-caupi. / Heterologous expression of genes encoding pathogenesis related proteins (PR-proteins) represents a promising alternative for the development of plants resistant to fungi. Among the PR-proteins with great biotechnological potentials are the chitinases, a class of hydrolases which catalyze the degradation of chitin, a polymer constituent of cell wall of several species of pathogenic fungi. Besides their function related to defense mechanisms, it is believed that these enzymes may play other roles, such as regulation of growth and development processes in plants. Using two approaches, this study sought to investigate the role of a class I chitinase of cowpea (VuChiI) in defense and plant development. The first approach consisted of silencing of the gene encoding for VuChiI in cowpea. Apical meristems excised from cowpea seeds were bombarded with microparticles containing a silencing vector (pKANNIBAL), which was cloned with a construct harboring an intron harpin of the gene VuChiI. Plants regenerated in a Murashige and Skoog (MS) media containing imazapyr as a selection agent, were analyzed by PCR, resulting in confirmation of genetic transformation of five plants from the 1092 apical meristems bombarded. Northern blot analysis of total RNA extracted from the putative transgenic plants allowed for the detection of siRNAs. Upon regeneration and germination, only one of the five transformed plants produced a pod containing six seeds. Of these, only one germinated when further planted. The transformed plants exhibited a life cycle of over 365 days, as against the normal cycle of 65-70 days. Based on these results we posit that silencing of class I cowpea chitinase may have led to changes in plant development. The second strategy consisted of co-cultivation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens strain LB4404 suspension to express recombinant protein in the extracellular space of the regenerated plants in order to expose the protein fungus even before its penetration into the plant cell. To achieve this, a sequence of cowpea chitinase insert was cloned into the binary vector pCAMBIA1305.2 under the control of CaMV35S promoter and signal peptide fused to glycine-rich protein of Oryza sativa (GRP), which allowed the secretion of recombinant protein via apoplast. This led to the generation of three strains as confirmed by PCR. Seeds obtained from transformed R1 generation of the plants were germinated and analyzed for transmission of the transgene using X2 test, which confirmed its transmission to the progeny in a Mendelian fashion. The experimental models developed in this work may serve to further assess the biological roles of class I chitinase from cowpea.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The cowpea bean [Vigna unguiculata (L.) Walp.] is a legume with high protein levels, largely cultivated and consumed in the Northeast of Brazil. Due to your economic importance, there are several studies that search resistant forms of cultivars of this kind of bean, as they is often attacked by different kinds of pests and predators. One of the most common is the weevil Callosobruchus maculatos. With the discovery of resistant cultivars for this insect many questions emerged about what biological component of the plant was responsible for such defensive action. Some studies suggest that this resistance is due to vicilin, which are reserve nutritious proteins, present in the seeds of cowpea. In this work, regions belonging to the vicilin gene of two contrasting cultivars in relation to resistence to weevil were sequenced, one resistant (IT81D-1053) and a susceptible (EPACE-10). These sequences, which come from several clones, were analyzed and thereby deducting its three-dimensional structure was made through a homology modeling using as template one 7S globulin from adzuki bean (Vigna angularis) identified as 2EA7 in the PDB database. Sequence analysis revealed that there are two regions highly variable in sequence from the vicilin gene, and these regions are rich in glutamine. Previous studies suggest that resistance to weevil occurs in the fact that the vicilin can bind to chitin and such glutamine rich regions are potentially chitin binding due to the high ability to form hydrogen bonds between the residues of glutamine and residues of N-acetylglucosamine. The structural analysis also supports this assumption, because the region rich in glutamine is very exposed, in relation to the protein surface, which facilitates the interaction of these amino acid residues with chitin. However more refined studies are needed to have a certainty of how is this interaction between vicilin and chitin, and if these same proteins are in fact fundamental in the resistance against the weevil. / O feijÃo-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] à uma leguminosa com alto teor de proteÃnas, muito consumida e cultivada na regiÃo Nordeste do Brasil. Devido a sua importÃncia econÃmica, existem vÃrios estudos que procuram formas de cultivares resistentes desta espÃcie de feijÃo, pois esta à muito atacada por diversos tipos de pragas e predadores. Um dos mais comuns à o caruncho Callosobruchus maculatos. Com a descoberta de cultivares resistentes a este inseto, questionou-se sobre o componente biolÃgico da planta responsÃvel por tal aÃÃo defensiva. Alguns estudos sugerem que essa resistÃncia ocorre devido as vicilinas, que sÃo proteÃnas de reserva nutritiva, presentes nas sementes do feijÃo-de-corda. No presente trabalho, foram sequenciadas regiÃes pertencentes ao gene de vicilina de dois cultivares contrastantes em relaÃÃo ao ataque do caruncho, sendo um resistente (IT81D-1053) e outro suscetÃvel (EPACE-10). Essas sequÃncias, advindas de vÃrios clones, foram analisadas e com isso foi feita a deduÃÃo de sua estrutura tridimensional atravÃs de uma modelagem por homologia, utilizando como molde uma globulina 7S de feijÃo-azuki (Vigna angularis) identificada como 2EA7 no banco de dados PDB. A anÃlise das sequÃncias revelou que hà duas regiÃes bastante variÃveis na sequÃncia do gene da vicilina, sendo essas regiÃes ricas em glutamina. Estudos anteriores sugerem que a resistÃncia ao gorgulho se dà no fato de que as vicilinas conseguem se ligar a quitina, e tais regiÃes sÃo potencialmente ligantes a quitina devido a grande capacidade de formar ligaÃÃes de hidrogÃnio entre os resÃduos de glutamina e os resÃduos de N-acetilglucosamina. A anÃlise estrutural tambÃm corrobora esta hipÃtese, pois a regiÃo rica em glutamina à bastante exposta, em relaÃÃo à superfÃcie proteica, o que facilita a interaÃÃo destes resÃduos de aminoÃcidos interagirem com a quitina. Entretanto estudos mais refinados sÃo necessÃrios para se ter uma maior certeza de como se dà esta interaÃÃo entre vicilinas e a quitina, e se de fato essas proteÃnas sÃo mesmo fundamentais na resistÃncia contra o caruncho.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T14:59:22Z No. of bitstreams: 2 Tese Lucia Raquel Ramos Berger.pdf: 4046628 bytes, checksum: 24c661f71d38a470b0140037dc947dcd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:59:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Lucia Raquel Ramos Berger.pdf: 4046628 bytes, checksum: 24c661f71d38a470b0140037dc947dcd (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-12-19 / CAPES CNPq FACEPE / Nos últimos anos, muitos estudos têm demonstrado o interesse em relação à produção e aplicação dos biopolímeros quitina e quitosana como materiais funcionais na medicina, farmácia, alimentação, biologia e engenharia. Especialmente devido a suas características únicas como biocompatibilidade, biodegradabilidade, não- toxicidade, atividade antimicrobiana, capacidade quelante e fácil produção. Após a celulose, a quitina é o segundo composto orgânico mais abundante na Terra, e é encontrado naturalmente como elemento estrutural em invertebrados e paredes celulares de fungos, principalmente na ordem Mucorales (classe Zygomycetes). A quitosana é obtida a partir da desacetilação da quitina (poli-(1-4)-2-acetamida-2-desoxi-β-D-glicosamina). A produção simultânea desses polímeros por via microbiológica mostrou ser vantajosa quando comparada com a extração tradicional a partir de crustáceos. A produção controlada por fermentação têm permitido o uso de resíduos agroindustriais como substratos de baixo custo, tais como: milhocina, manipueira, melaço e casca de mamão, o que corresponde a fontes de nutrientes alternativas para as culturas de fungos.Entre as várias aplicações da quitosana , destaca-se a sua capacidade de formar membranas, que podem ser aplicadas durante a remoção de metais pesados em ambientes aquosos . Esse método poderia ser considerado alternativa promissora, tendo em vista a inviabilidade operacional e o alto custo dos procedimentos habituais para remoção de metais. O objetivo deste estudo foi selecionar as melhores condições de cultivo para a produção satisfatória de quitina e quitosana a partir de Cunninghamella elegans e Rhizopus arrhizus e posterior aplicação de membranas de quitosana para a remoção de cádmio em soluções aquosas. Inicialmente, a produção de biomassa e de biopolímeros por estes fungos foi realizada através dos seguintes meios de cultura: meio específico modificado para Mucorales, e meios alternativos enriquecidos com milhocina (como fonte de nitrogênio) e suplementados manipueira, melaço ou suco de casca de mamão (como fontes de carbono). As caracterizações físico-químicas realizadas foram: infravermelho, difração de raios X, microscopia eletrônica de varredura, viscosidade, massa molecular, termogravimetria e densidade calorimétrica. Foi realizada a comparação entre as membranas obtidas utilizando quitosana fúngica com baixa massa molecular e quitosana comercial com massas moleculares baixa e média. Essas membranas de quitosana foram aplicadas para a remoção de Cd ( II ) a partir de soluções aquosas. E a remoção de cádmio foi estimada utilizando as análises de voltametria de redissolução anódica e voltametria de onda quadrada. Os resultados mostraram claramente as maiores produções de biomassa entre 16,00-24,60 g/L e produção de quitosana entre 77,78-77,76 mg/g obtidas utilizando os meios de cultura alternativos para R. arrhizus e C. elegans, respectivamente. Por outro lado, as produções mais elevadas de quitina de 137,17 e 235,00 mg/g foram obtidas usando os mesmos fungos e o meio de cultura padrão para Mucorales. A caracterização físico-química dos polímeros foi semelhante à encontrada para a quitina e quitosana comerciais utilizadas como padrões. A remoção de aproximadamente 100% de cádmio utilizando a membrana de quitosana de baixo custo sugere uma alternativa para complementar, ou até mesmo substituir, procedimentos de alto custo e baixa eficiência na descontaminação de efluentes industriais por metais pesados.