Après la transcription, le pré ARNm subit des étapes de maturation avant de sortir du noyau pour être traduit. Une des étapes de maturation est l'épissage. Il permet de souder les séquences codantes de l'ARNm entre elles (les exons) et d'exclure les régions non codantes (les introns).Des mutations génétiques sont à l'origine de défaut d'épissage. Elles peuvent conduire à des rétentions d'intron, des sauts d'exon et des inclusions de séquences introniques appelées pseudo exons.Ma thèse a porté sur l'utilisation du saut d'exon pour corriger ces inclusions. Je me suis intéressé à deux pathologies : la myopathie à cores et le syndrome de LowePour le premier cas, je me suis intéressé à une mutation dans l'intron 101 du gène RyR1. Cette mutation est à l'origine de la création d'un site donneur d'épissage qui active un site accepteur provoquant l'inclusion d'un pseudo exon de 99 nucléotides. Cette inclusion induit une baisse de la quantité du canal calcique RyR1 dans les cellules du patient. Ce canal permet le couplage entre l'excitation et la contraction musculaire. Ses défauts conduisent à diverses myopathies dont la myopathie à cores. Le patient présentait une hypotonie néonatale, une scoliose et des défauts respiratoires, et n'a jamais acquis la marche. J'ai dessiné des oligonucléotides, je les ai transfectés dans les cellules du patient en culture et ainsi montré par RT PCR que le saut du pseudo exon était possible. Afin d'optimiser l'efficacité pour pouvoir évaluer la restauration au niveau protéique et fonctionnel, j'ai développé un lentivirus exprimant une cassette U7 SmOPT avec les AON choisis. Après transduction des cellules, j'ai pu montrer que le saut du pseudo exon permettait le retour de la protéine et de sa fonctionnalité, cette approche pourrait donc permettre une correction chez le patient.Pour le deuxième cas, j'ai tenté de corriger une mutation du gène OCRL. Cette mutation crée un site donneur d'épissage dans l'intron 4 du gène OCRL et active un site accepteur d'épissage 66 nucléotides en amont. L'inclusion du pseudo exon induit la chute du taux de transcrit OCRL par un mécanisme de "Non sense mediated mRNA Decay". OCRL est une phosphatidyl inositol 5 Phosphatase permettant de réguler la quantité de Ptd Ins(4,5)P2 dans la cellule. Les défauts dans OCRL sont responsables d'une pathologie multisystémique, le syndrome de Lowe. J'ai pu obtenir des fibroblastes cutanés du patient. J'ai transfecté ces cellules avec des AONs choisis pour permettre un saut de l'exon pathogène. J'ai ensuite intégré la séquence des AONs efficaces dans un lentivirus U7. J'ai transduit les cellules du patient en culture et observé un retour de la protéine et un retour de l'activité enzymatique, cette approche pourrait donc théoriquement permettre une correction chez le patient.Ces deux travaux sont les premières preuves de principes de thérapie par modulation de l'épissage pour les myopathies congénitales et pour le syndrome de Lowe. Ils ouvrent la voie à des perspectives de traitement pour ces maladies génétiques. / After transcription, the pre mRNA will undergo different maturation step before getting out of the nucleus for translation. One of these step of maturation is the splicing. It allows to concatenate the coding sequences of the mRNA (the exons) and induces the exclusion of the non coding sequences (the introns).Genetics mutations can lead to splicing defects. These defects could be intron retention, exon skipping and exonisation of intronic sequences called pseudo exons.My thesis work was to evaluate the exon skipping therapy to correct these exonisation. I focuses on two diseases: core myopathy and Lowe syndrome.For the first one, my interest was on a mutation in the 101 th intron of RYR1 gene. This mutation creates a splicing donor site wich unveils a cryptic acceptor site. This leads to the inclusion of a 99 nucleotides pseudo exon. This inclusion induces a decrease of the quantity of the calcium channel RyR1 in the patient cells. This channel allows the excitation-contraction coupling, and therefore the muscular contraction. Defects in this channel lead to different myopathies (eg. core myopathy). The patient present at birth a major neonatal hypotonia, scoliosis and respiratory defects. He has never walked. I designed oligonucleotides (AON), transfected them in the cultured patient cells and showed by RT PCR that exon skipping was possible. In order to optimise the efficiency and to evaluate the rescue at a protein level and at a fonctionnal level, I devellopped a lentivirus which express a U7 Sm OPT cassette with the choosen AONs. After cell transduction, I have shown that exon skipping allowed the rescue of the protein and of its functionnality. This approach could permit a genetic correction for the patientFor the second case, I have tried to correct an OCRL mutation. This upstream creates a splicing donor site and unveils an acceptor site 66 nucleotides before. This leads to the inclusion of a pseudo exon which induces a severe decrease of OCRL transcripts level due to a "non sense mediated mRNA Decay". OCRL is a phosphatidyl inositol 5 Phosphatase, which regulates the Ptd Ins(4,5)P2 pool in the cell. OCRL defects induces a multi systemic disease the Lowe syndrome. I obtained patient cutaneous fibroblasts. I transfected these cells with choosen AONs to correct the splicing defect. I integrated the AONs sequence into a U7 lentiviral cassette. I transduced the cultured patient cells and observed a rescue of the protein with a rescue of its activity. This approach could, theoritically permit a correction in the patient.These two studies are the first proof of concept of splicing modulation therapy for congenital myopathy and for Lowe syndrome. This work offers a lot of perspective for the tratment of these genetic illness

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La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative du système nerveux central qui se caractérise notamment par l’accumulation de peptide beta-amyloïde (Aβ) dans le tissus nerveux. Dans la première partie de cette thèse nous avons montré que l’interaction des oligomères Aβ1-42 de haut poids moléculaire avec la membrane plasmique des cellules PC12 différenciées ou des cellules nerveuses (neurones et astrocytes primaires) provoque des variations de la [Ca2+]i dépendant de l’activation des récepteurs NMDA. Dans la seconde partie nous avons montré qu’une pré-exposition des cellules PC12 et des cellules nerveuses à de faibles concentrations de peptide Aβ module l’interaction ultérieure des oligomères avec la membrane plasmique. Enfin dans le cadre d’une collaboration avec l’entreprise Innovative Health Diagnostics (IHD) nous avons participé à la caractérisation d’une sonde amyloïde fluorescente développée pour réaliser des tests de détection de la MA à partir d’échantillons sanguins. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disease of the central nervous system which is characterized in particular by the accumulation of beta amyloïde peptide (Aβ) in nerve tissues. In the first part of this thesis we showed that the interaction of high molecular weight Aβ1-42 oligomers with the plasma membrane of differenciated PC12 or nerve cells (neurons and astrocytes) triggers variations of their depending on the activation of the NMDA receptors. In the second part we showed that a pre-exposure of PC12 and nerve cells with low concentrations Aβ1-42 of modulates the later interaction of oligomers with the plasma membrane. Finally in collaboration with the company Innovative Health Diagnostics (IHD) we participated in the characterization of a fluorescent amyloid probe developed to realize detection test of AD from blood samples.

L’acide rétinoïque (AR) est le dérivé actif majeur de la vitamine A et a de multiples rôles au niveau cellulaire ainsi que pendant le développement. L’AR agit via deux familles de récepteurs nucléaires : les Récepteurs de l’Acide Rétinoïque (RAR) et les Récepteurs X des Rétinoïdes (RXR). Ces récepteurs sont des facteurs de transcription dépendants du ligand et leur activité est régulée par des phosphorylations via des kinases activées par l’AR. Durant ma thèse, je me suis intéressé à l’étude fonctionnelle et évolutive de la voie de l’AR et de la phosphorylation des RAR chez le poisson-zèbre Danio rerio. En étudiant l’activité des différents sous-types de RAR chez le poisson-zèbre, nous avons mis en avant qu’il existe une activité transcriptionnelle propre à chaque sous-type dans un embryon précoce de poisson-zèbre. De plus, mes travaux ont montré qu’au cours de l’évolution, l’acquisition d’un site de phosphorylation chez RARα permet une régulation fine de son activité chez les mammifères. Enfin, en étudiant les mécanismes moléculaires à l’origine de la diversification de la denture chez les poissons, mes travaux mettent en avant un rôle de la voie de l’AR dans la genèse de nouveaux traits phénotypiques. / Retinoic acid (RA) is the main active metabolite of vitamin A and plays multiple roles in cellular processes but also during embryonic development. RA acts through two families of nuclear receptors: Retinoic Acid Receptors (RAR) and Retinoid X Receptors (RXR). Those receptors act as ligand-dependent transcription factors and their transcriptional activity is also regulated by phosphorylation processes through kinases activated by RA. During my PhD, I focused on the functional and evolutionary study of RA pathway and of the phosphorylation of RARs using zebrafish (Danio rerio). By studying the activity of the different RAR subtypes in zebrafish, we provide evidences that they can regulate gene expression in a subtype-specific fashion in the early zebrafish embryo. Furthermore, my work showed that during evolution, the acquisition of a phosphorylated residue in RARα promotes the fine-tuned regulation of its activity in mammals. Finally, aiming at deciphering the molecular mechanisms behind dentition diversification in fish, we propose a role for RA signaling in generating morphological novel traits during evolution.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer de mauvais pronostic. Les maladies chroniques du foie provoquent le développement d'une cirrhose qui évoluera éventuellement en CHC. Le récepteur de l'insuline (IR) est exprimé sous deux isoformes, IR-A et IR-B, qui résultent de l'épissage alternatif de l'ARNm. IR-B est l'isoforme majoritairement exprimé dans l'hépatocyte adulte et IR-A dans l'hépatocyte fœtal. Plusieurs travaux montrent une surexpression de IR-A dans différents cancers, associée à une signalisation oncogénique en réponse à l'IGF-II. Le rôle de la signalisation IGF-II/IR-A a peu été investigué dans le CHC. Notre étude porte sur le rôle biologique de la surexpression de IR-A dans les cellules de CHC au regard de la surexpression d'IGF-II. Une augmentation du ratio d'expression IR-A/IR-B est observée dans 70% des tumeurs de CHC par rapport au foie adjacent non tumoral, qui est significativement associée à l'expression de marqueurs clinicopathologiques de mauvais pronostic dont des marqueurs de cellules souches/progénitrices (CSP) et à une faible survie post-hépatectomie. Seules 9,4% des tumeurs surexpriment IGF-II. In vivo, la surexpression stable de IR-A, et non de IR-B, augmente la tumorigénicité de deux lignées de CHC disposant (Huh7) ou non (PLC/PRF5) d'une boucle autocrine d'IGF-II, et est associée à l'induction de différentes signatures pro-inflammatoires. Sans effet sur la prolifération, la surexpression de IR-A stimule la migration et l'invasion in vitro et augmente l'expression de marqueurs CSP. En conclusion, ces résultats identifient IR-A comme un nouvel acteur de la progression du CHC de façon indépendante d'une boucle autocrine d'IGF-II. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is a poor prognosis cancer. Chronic liver diseases induce cirrhosis which will eventually evolve into HCC. The insulin receptor (IR) exists in two isoforms, IR-A and IR-B, resulting from mRNA alternative splicing. Adult hepatocytes predominantly express IR-B while fœtal hepatocytes mainly express IR-A. The overexpression of IR-A associated with IGF2 oncogenic signaling has been abundantly described in cancer cells. Little is known about IGF2/IR-A signaling in HCC. Our study aims to evaluate the biological functions associated to IR-A overexpression in HCC in relation to IGF2 overexpression. We observed that 70% of 85 HCC tumors showed upregulation of IR-A/IR-B ratio compared to adjacent nontumor tissue, which was significantly associated with clinicopathological markers of aggressive tumours such as stem/progenitor cell (SPC) markers and correlated with reduced patient survival after surgery. IGF2 upregulation was observed in only 9.4% of HCC. Stable overexpression of IR-A, but not IR-B, increased in vivo tumorigenicity in two HCC cell lines presenting (Huh7) or not (PLC/PRF5) an autocrine IGF2 secretion loop and was associated with the induction of different pro-inflammatory gene signatures. While IR-A overexpression did not promote cell proliferation in vitro, it stimulated migration and invasion and increased some SPC markers expression. Altogether these results highlight IR-A as a novel player in HCC progression irrespective of an IGF2 autocrine loop.

Apprendre de nouvelles séquences d'actions est l'une des fonctions cruciales du système nerveux central. Cet apprentissage est notamment assuré par les ganglions de la base ;ceux-ci jouent un rôle critique dans la sélection d'actions ou la prise de décisions en permettant l'apprentissage et la sélection des programmes moteurs les plus appropriés. Comprendre la physiologie de cette circuiterie neuronale hautement complexe et particulièrement celle du striatum - structure d'entrée des ganglions de la base - est donc d'une importance capitale dans l'amélioration de notre compréhension de ce système neuronal. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au rôle fonctionnel du récepteur NMDA (NMDA-R) dans une sous-population des neurones de projection, les neurones striatopallidaux. Ces récepteurs sont impliqués dans les modifications de l'efficacité synaptique à long terme et jouent donc un rôle central dans le mécanisme d'apprentissage. Notre travail démontre que le NMDA-R des neurones striatopallidaux est un élément essentiel de l'apprentissage au niveau des ganglions de la base. En effet, nous observons que des souris transgéniques, déficientes en NMDA-R spécifiquement dans les neurones striatopallidaux, disposent d'une capacité d'adaptation réduite aux modifications de leur environnement. De plus, nous démontrons que ces souris transgéniques présentent des connexions neuronales affaiblies susceptibles d'expliquer les altérations comportementales observées. Dans ce travail de thèse, nous avons également développé une stratégie expérimentale reposant sur l'utilisation d'outils optogénétiques afin de déterminer le rôle d'une population d'interneurones inhibiteurs du striatum, les "fast spiking interneurons" (FSI). Cette technique a été mise en oeuvre avec succès et nous avons validé son efficacité in vitro. Nous démontrons que cette approche permet un contrôle l'activité électrique des FSI à l'échelle de la milliseconde. Son application in vivo, combinée avec des paradigmes comportementaux, nous permettra d'élucider le rôle spécifique de cette sous-population neuronale, tant au niveau du contrôle moteur que de la prise de décisions, dans des situations physiologiques ou pathologiques. Dans son ensemble, le présent travail ouvre les portes vers une meilleure compréhension de l'orchestration de la microcircuiterie striatale. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le purinorécepteur P2X7 joue un rôle majeur dans les phénomènes de dégénérescences (Alzheimer, DMLA) et mort cellulaires. Récemment des études ont montré que l’activation basale de ce récepteur est indispensable dans le processus de cicatrisation et de prolifération cellulaire. Nous avons essayé de mieux comprendre le paradoxe de cette activation du récepteur P2X7 qui oriente vers la prolifération et même les métastases tumorales, mais aussi vers les mécanismes de dégénérescence cellulaire. L'influence du microenvironnement (Lipides, matrice extracellulaire, oxygène) apparait essentielle pour comprendre ces différents effets. Notre premier objectif a été d’étudier l’impact de la modulation du microenvironnement du récepteur P2X7 par des composants de la matrice extracellulaire. Ainsi, sur un modèle de cicatrisation cutanée, nous avons mis en évidence l’impact de la taille des fragments du hyaluronate de sodium (composant prédominant dans la matrice extracellulaire). Nos résultats ont montré que l’activation du récepteur P2X7 dépend du poids moléculaire du hyaluronate de sodium. Notre deuxième objectif a été de moduler le microenvironnement lipidique du récepteur P2X7. Nous avons sélectionné une huile riche en acides gras insaturés et avons ainsi étudié son effet sur l’activation du récepteur P2X7. Sur nos modèles de cicatrisation, nous avons mis en évidence qu’une modulation du microenvironnement lipidique du récepteur P2X7 influence son activation. D’autre part la modulation du microenvironnement lipidique sur des cellules tumorale de mélanome active les voies de dégénérescence ouvrant la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques. / The purinoceptor P2X7 plays a role in cytotoxic degenerative processus (Alzheimer, AMD) and cell death. Recent studies have shown that basal activation of this receptor is essential in the healing process and cell proliferation. We tried to understand the paradox that activation of P2X7 receptor that directs to the same proliferation and tumor metastasis, but also to the mechanisms of cell degeneration. The influence of the microenvironment (lipids, extracellular matrix, oxygen) appears essential to understand these effects. Our first objective was to study the impact of the modulation of P2X7 receptor microenvironment by extracellular matrix components. On cell monolayer model of wound healing we have highlighted the impact hyaluronan molecular weight (predominant component in the extracellular matrix). Our results showed that activation of P2X7 receptor is dependent on hyaluronan molecular weight. Our second objective was to modulate lipid microenvironment P2X7 receptor. We selected an oil rich in unsaturated fatty acids and thus have studied its effect on the activation of P2X7 receptor. In our models of healing and melanoma cell, we have demonstrated that modulation of lipid microenvironment affects P2X7 activation.

Cette thèse, financée dans le cadre du projet européen CSP2, porte sur l'étude d'un nouveau type de récepteur solaire thermique à concentration utilisant comme fluide caloporteur une suspension dense de fines particules en circulation ascendante dans des tubes verticaux. Ladite suspension est obtenue par fluidisation de particules de classe A. Le principe consiste à créer un écoulement ascendant de la suspension dans un tube vertical exposé au rayonnement solaire concentré qui chauffe la paroi du tube, qui transmet ensuite cette chaleur aux particules, qui la transportent jusqu'à un cycle de conversion d'énergie pour la production d'électricité. Au contraire des fluides solaires classiques, les particules peuvent atteindre les hautes températures (> 700 °C) permettant l'utilisation de cycles à haut rendement de conversion (Brayton, cycles combinés), tout en permettant un stockage direct de la pour une production continue. Au cours de la thèse, un récepteur à un tube a été testé avec succès au grand four solaire du laboratoire PROMES-CNRS à Odeillo, les particules en sortie atteignant 750 °C, ce qui a prouvé la faisabilité du concept et permis la détermination des premières valeurs de coefficient d'échange de chaleur tube-suspension. L'hydrodynamique de l'écoulement et les mécanismes d'échange de chaleur ont été observés grâce à des simulations numériques 3D. Un récepteur de 150 kWth à 16 tubes a ensuite été testé et modélisé, validant l'utilisation du procédé à plus grande échelle. / This thesis, financed in the frame of the CSP2 European project, concerns the study of a new kind of thermal concentrating solar receiver using a dense suspension of solid particles circulating upward in vertical tubes. The suspension is obtained by fluidizing Geldart A-type particles. The principle consists in creating an upward flow of the suspension in a vertical tube exposed to the concentrated solar radiation that heats the tube wall. The heat is then transmitted to the particles circulating inside that transport it to a conversion cycle for electricity production. Contrarily to usual solar heat transfer fluids, particles can reach high temperatures (> 700 °C) that permit to power high efficiency thermodynamic cycles such as Brayton or combined cycles. Moreover they can be used as a direct heat storage medium for continuous electricity production. During this thesis, a one-tube solar receiver was successfully tested at the PROMES-CNRS solar furnace in Odeillo, with particle outlet temperatures of 750 °C reached. The first values of wall-to-suspension heat transfer coefficient were calculated and a Nusselt correlation was determined. A specific flow pattern with a particle downward flux close to the wall and upward flux in the tube center was underlined. The flow hydrodynamics and the heat transfer mechanisms were studied thanks to 3D numerical simulations. A 16-tube 150 kWth receiver was finally tested and modeled, proving the process applicability at larger scale.

Le travail présenté dans cette thèse traite les séquences nominales en français écrit employées seules en dehors des énoncés verbaux, munies cependant d’une référence au monde. Dans le but d’apporter un nouvel éclairage sur de telles séquences nominales, traitées traditionnellement dans le cadre de la phrase, i.e. d’une relation prédicative entre deux termes, nous les appelons énoncés nominaux et adoptons la perspective de la grammaire japonaise qui n’est que partiellement influencée par la logique occidentale. Dans la théorie des Jutsu-tai/ Kan-tai (énoncés verbaux/ énoncés nominaux) de YAMADA Yoshio 山田孝雄 (1936), l’un des précurseurs de la grammaire japonaise, à laquelle nous recourons particulièrement, l’énonciation nominale s’explique, et ainsi s’oppose à l’énonciation verbale, par son mode d’embrayage particulier ; alors que la référence au monde des Jutsu-tai (énoncés verbaux) se définit au plan sémantico-syntaxique par la présence d’un verbe saturé et conjugué, les Kan-tai, les énoncés composés d’une séquence nominale qui n’a en soi aucune prédilection pour une fonction syntaxique spécifique, acquièrent leur énonçabilité en énonciation, par le mode même de l’énonciation. Ce mode, « Yobikake shij-suru yôtai (mode de désigner par appellation) » (YAMADA), que nous traduisons plutôt « désignation in situ », se caractérise par la mise en relation in situ entre l’énonciateur et l’entité désignée par la séquence nominale. Ce qui distingue l’énonciation nominale d’avec l’énonciation verbale qui n’est autre chose qu’une mise en relation prédicative entre deux termes du même niveau sémantico-syntaxique. / The purpose of this study is to investigate the noun phrases in written French outside of the context of verbal utterances, but nevertheless referring to the world. In order to illuminate such nominal phrases from a new angle, which have traditionally only been considered with respect to the sentence, i.e. to the predication between a subject and a predicate, this study calls them nominal utterances and adopts the perspective of Japanese grammar, which has not been influenced by the logic of Occidental grammar. In the definitions of Jutsu-tai and Kan-tai put forth by YAMADA Yoshio 山田孝雄 (1936), — verbal utterance and nominal utterance, respectively — a foundational text on Japanese grammar to which this study engages with, YAMADA defines nominal enunciations in contrast to verbal enunciations as a specific mode of anchoring. Whereas the reference to the world of Jutsu-tai (verbal utterances) is defined at the semantic-syntactic level by the presence of a conjugated verb with its arguments, (Kan-tai), utterances consisting of a noun phrase, which are not intended to assume a specific syntactic role per se, acquire the possibility of functioning as an utterance by the mode of enunciation itself. This mode, called « Yobikake shij-suru yôtai (mode of designation by naming) » (YAMADA), which this study translates as “designation in situ,” is characterised by establishing the relationship between the utterer and the referent of the noun phrase. This relationship distinguishes the nominal enunciation from the verbal enunciation by establishing the relationship between two arguments at semantic-syntactic level.

Cette thèse présente une étude de faisabilité d'un récepteur faible coût et faible consommation pour l'extension du standard DVS-S à la mobilité. L'objectif de ce projet est de proposer de solutions pour lever les verrous technologiques quant à la réalisation d'un tel système en technologie CMOS 65 nm. Ce manuscrit de thèse articulé autour de quatre chapitres décrit toutes les étapes depuis la définition des spécifications du réseau d'antennes et de la chaîne de réception jusqu'à la présentation de leurs performances, en passant par l'étude de leurs architectures et de la conception des différents blocs. Suite à l'étude au niveau système et au bilan de liaison, le démonstrateur envisagé est constitué d'un réseau d'antennes (huit sous-réseaux de huit antennes microruban) suivi de la mise en parallèle de huit chemins unitaires pour satisfaire les exigences (Gain, facteur de bruit, rapport signal-à-bruit...) de l'application visée. Ce travail a abouti à la démonstration de la faisabilité d'une architecture innovante. Par ailleurs, nous avons aussi démontré sa non-application pour le standard DVB-S en raison des limitations en bruit de la technologie CMOS. Cependant des pistes existent pour améliorer le rapport signal-à-bruit du démonstrateur, à savoir l'utilisation d'un LNA (Low Noise Amplifier) avec une technologie compétitive en bruit et/ou d'un traitement du signal après la démodulation en bande par un processeur analogique. / This work focuses on the faisability of a low cost and low power receiver in order to extend the DVB-S standard to mobility. The objective of this project is to suggest solutions to overcome technological bottlenecks fot the realization of such a demonstrator with 65 nm CMOS technology. This report composed of four chapters, describes all steps from the specification definition to the performances of the antenna array and the receiver through the architecture study and the different blocks design. [...]