Le récepteur opioïde mu est responsable des propriétés analgésiques et addictives puissantes de la morphine et de l’héroïne, mais son mode d’action à l’échelle des circuits neuronaux est mal connu et a été peu étudié par des approches génétiques. Le récepteur mu est largement exprimé dans le système nerveux, essentiellement dans des neurones GABAergiques. Le premier objectif de mon projet a été d’inactiver le gène codant pour le récepteur mu dans les neurones GABAergiques du cerveau antérieur et d’en étudier les conséquences comportementales. Notre étude montre que ces récepteurs ne sont pas impliqués dans l’analgésie et la dépendance physique à la morphine, mais qu’ils sont essentiels à l’effet hyperlocomoteur de l’héroïne. De plus, nos résultats indiquent que ces récepteurs limitent la motivation à consommer de l’héroïne et du chocolat, révélant un rôle entièrement nouveau pour cette population particulière de récepteurs (Manuscrit 1 : Mu opioid receptors in GABAergic forebrain neurons are necessary for heroin hyperlocomotion and reduce motivation for heroin and palatable food). Aussi, cette population de récepteurs mu n’est pas responsable du syndrome autistique décrit chez les souris knockout totales (Manuscrit 2 : Mu opioid receptors in GABAergic forebrain neurons are not involved in autistic-like symptoms). Enfin, nous avons développé un nouveau modèle transgénique visant l’inactivation génétique du récepteur mu dans les neurones glutamatergiques, mais qui n’a pas abouti à un knockout conditionnel détectable. Nous avons aussi initié la création d’une lignée transgénique Cre pour l’inactivation de gènes d’intérêt dans l’amygdale étendue, qui permettra notamment d’étudier le rôle du récepteur mu dans ce microcircuit. / Mu opioid receptors mediate the strong analgesic and addictive properties of morphine and heroin;however mu receptor function at circuit levels is not well understood and has been poorly studied by genetic approaches. These receptors are widely expressed throughout the nervous system, essentially in GABAergic neurons. The first aim of my project was to genetically inactivate the mu receptor gene in GABAergic forebrain neurons and study the behavioral consequences. Our study shows that these mu receptors are not implicated in morphine-induced analgesia and physical dependence, but are essential for locomotor effects of heroin. Moreover, our data show that these receptors inhibit motivation to consume heroin and chocolate, revealing an entirely new role for this particular population of mu receptors (Manuscript 1: Mu opioid receptors in GABAergic forebrain neurons are necessary for heroin hyperlocomotion and reduce motivation for heroin and palatable food). Also, mu receptors expressed in forebrain GABAergic neurons are not responsible for the autistic syndrome described in total mu receptor knockout mice (Manuscript 2: Mu opioid receptors in GABAergic forebrain neurons are not involved in autistic-like symptoms). Finally, we developed a new transgenic model targeting the mu receptor gene in glutamatergic neurons, but receptor deletion was not detectable in conditional mice. We also initiated the creation of a transgenic Cre driver line to knockout genes of interest in the extended amygdala, and this tool will enable us to study mu receptor function within this microcircuit.

GPR88 est un récepteur couplé aux protéines G orphelin exprimé principalement au niveau du striatum spécifiquement dans les neurones moyens épineux de la voie striato-nigrale et de la voie striato-pallidale.Premièrement nous avons étudié les souris Gpr88 KO et montré des altérations biochimiques, structurales et comportementales. Aussi les résultats montrent que l’hyperactivité des souris Gpr88 KO est diminuée par l’administration de méthylphénidate. Deuxièmement nous avons montré que la diminution des comportements liés à l’anxiété dépend de GPR88 dans la voie striato-pallidale et que la coordination motrice est régulée par GPR88 dans le striatum adulte (injection AAV-Cre) et dans la voie striato-pallidale. Dernièrement, nous avons confirmé un déficit d’inhibition du prépulse chez les souris Gpr88 KO, mais aussi montré que celui-ci s’étend à la modalité visuelle et n’est pas lié à un déficit général d’inhibition ou à la délétion de Gpr88 dans les neurones striato-pallidaux. / Among brain orphan G protein-coupled receptors, GPR88 shows high expression mainly in the striatum specifically in medium spiny neurons of both the striatonigral and striatopallidal pathwaysFirst, we examine full Gpr88 KO mice and show biochemical, structural and behavioral alterations. Results also show that the hyperactivity phenotype of Gpr88 KO mice is reversed by methylphenidate.Second, we show that Gpr88 in striatopallidal neurons (cKO approach) exerts anxiogénic activity and that motor coordination is regulated by GPR88 in the adult brain (AAV-Cre approach) and in the striatopallidal pathway.Finally, we confirmed previous data showing impaired acoustic prepulse inhibition in Gpr88 KO mice and further show that this deficit is not the result of a general inhibition deficit or of the lack of GPR88 in striatopallidal neurons.

L’utilisation de glucocorticoïdes (GC) pour le traitement de maladies inflammatoires ou d’antagonistes des androgènes pour le cancer de la prostate est limitée par l’induction d’effets secondaires, tels que l’atrophie musculaire. Comme les mécanismes sous-jacents étaient mal connus, nous avons caractérisé le rôle de ces hormones dans la régulation des fonctions musculaires. Nos résultats montrent que le récepteur aux GC des myofibres contrôle négativement la masse musculaire par des actions distinctes en présence de concentrations physiologiques et pharmacologiques de GC. De plus, notre étude a permis d’identifier de nouveaux réseaux de gènes contrôlés par les GC dans le muscle. Nous avons également démontré que les androgènes favorisent le gain de performance musculaire via l’amélioration de la force. Ainsi, cette étude a clarifié les mécanismes régulant l’homéostasie musculaire et ouvre des perspectives prometteuses pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. / The use of glucocorticoids (GC) to treat inflammatory diseases or androgen antagonists for prostate cancer is limited by the occurrence of side effects such as muscle atrophy. As the underlying mechanisms were unclear, we characterized the effects of GC and androgens on muscle mass and function. Our results demonstrate that myofiber GC receptor negatively controls muscle mass by distinct actions under physiological and pharmacological levels of GC. Moreover, our data identified many genes and networks controlled by GC in myofibers. We also showed that androgens promote the gain in muscle performance during postnatal development via the improvement of specific maximal force and power. Thus, this study allowed to clarify the molecular and cellular mechanisms regulating muscle homeostasis, and paves the way to identify new therapeutic targets.

Les infections graves entraînent une dysrégulation de la réaction inflammatoire associée à une immunodépression complexe associée à la survenue d’infections nosocomiales. Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent ces phénomènes demeurent largement incompris. A l’interface entre système immunitaire inné et adaptatif, les cellules dendritiques et les lymphocytes innés pourraient être impliqués dans l’immunodépression post-infectieuse. Par ailleurs, les récepteurs de type Toll (TLR) déterminent l’amplitude de la réponse inflammatoire initiale, mais leur contribution dans le développement de l’immunodépression post-infectieuse n’a pas été établie. Les objectifs de ce projet de recherche étaient d’investiguer le rôle des cellules dendritiques, des lymphocytes de type innés et des voies de signalisation dépendantes des TLRs dans l’immunodépression induite par le sepsis. Nous avons mené ce programme de recherche en combinant une double approche translationnelle et expérimentale. Nous avons étudié la cinétique des cellules dendritiques circulantes chez le patient septique et montré que leur déplétion était associée à la survenue d’infections nosocomiales. L’analyse des trois souspopulations de lymphocytes T innés (lymphocytes γδ, NKT et MAIT) chez le patient septique a montré que seuls les lymphocytes MAIT présentaient une déplétion associée au sepsis sévère, dont la persistance était également corrélée à la survenue d’infections nosocomiales. Enfin, à l’aide de souris knockout nous avons étudié le rôle de TLR2, TLR4 et TLR5 sur la réponse anti-bactérienne dans un modèle murin de pneumonie secondaire à P. aeruginosa à distance d’un sepsis polymicrobien sublétal. Nous avons montré que les souris déficientes pour TLR2 étaient protégées de l’infection secondaire grâce à une meilleure clairance bactérienne. Ce travail introduit des perspectives nouvelles dans la physiopathologie de l’immunodépression post-infectieuse et suggère des applications thérapeutiques potentielles. / Severe sepsis leads to a dysregulated inflammatory response followed by a complex immunosuppressive state that can favor the emergence of nosocomial infections. The cellular and molecular mechanisms that drive the post-infective immunosuppression remain poorly understood. They may involve immune cells that link innate and adaptive immunity such as dendritic cells or innate-like lymphocytes. Furthermore, Toll-like receptors (TLR) are critical determinants of the inflammatory response but their role to the development of sepsis-induced immune dysfunction are unknown. The aim of this research project was to investigate the role of dendritic cells, innatelike T cells and TLR-dependent signalling pathways in the sepsis-induced immunosuppression process. For this purpose, we combined a translational and experimental approach. We assessed dendritic cells blood count in septic patients and showed that the depletion of dendritic cells was associated with the advent of nosocomial infections. We studied 3 populations of innate-like T-cells (γδ lymphocytes, NKT- and MAIT-cells) in septic patients and demonstrated that only the MAIT-cells presented a significant depletion following severe sepsis, the persistence of which was correlated with the advent of nosocomial infection. Last, using knockout mice, we analyzed the relative contribution of TLR2, TLR4 and TLR5 to the host response in a model of late-onset secondary Pseudomonas aeruginosa pneumonia following a sublethal polymicrobial sepsis. We observed that TLR2 deficient mice were specifically protected against the secondary pneumonia through a better bacterial clearance. Our results provide new insights in the pathophysiology of post-infective immunosuppression and suggest potential therapeutic applications.

Le cancer de la prostate (CaP) représente le premier cancer chez l'homme et la seconde cause de mortalité. Alors que la plupart des malades atteints de cancer de la prostate évoluent favorablement (forme indolente), une fraction non négligeable développera une maladie agressive avec l’apparition de métastases. La recherche des biomarqueurs tumoraux peut aider à différencier les CaP dits indolent et les CaP agressifs qui sont responsables du décès des patients. Ils permettront de mieux sélectionner des patients afin d’éviter le surtraitement. La protéine CRIPTO est le premier membre de la superfamille des protéines EGF-CFC. Ce facteur de croissance est largement impliqué dans le développement embryonnaire et s'exprime dans de nombreux types de cancers. Son rôle dans le CaP reste encore non élucidé. L’objectif de mon travail de thèse consiste à examiner le profil d'expression de CRIPTO et d'évaluer son impact potentiel sur l’agressivité du cancer de la prostate.Les résultats ont montré que CRIPTO est exprimé de manière significative dans 37,9% de CaP. Il est absent voire faiblement détecté dans les prostates hyperplasiques bénignes et dans les tissus sains. Nous avons montré ensuite que la surexpression de CRIPTO favorise une transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM) associée à l’augmentation de la capacité de migration et de la survie des cellules tumorales. Les voies de signalisation régulées par CRIPTO impliquent l’activation des voies PI3K / AKT et FGFR1 / ERK.De manière très intéressante, les cellules tumorales mésenchymateuses surexprimant CRIPTO secrètent excessivement des vésicules. Nous avons tenté alors de découvrir le rôle de ces vésicules dans la progression du cancer de la prostate. Les vésicules extracellulaires (VEs) purifiés étaient capables de moduler la signalisation du récepteur des androgènes et d’activer la voie du TGFß. Les cellules tumorales prostatiques traitées par ces VEs deviennent plus agressive et acquierent des caractéristiques mésenchymateuses.En conclusion, nos résultats mettent en évidence une nouvelle fonction importante de CRIPTO dans le cancer de la prostate. Nous démontrons également que les cellules tumorales surexprimant ce facteur de croissance secrètent excessivement des vésicules qui participent activement dans la communication intercellulaire et promeuvent la progression du CaP. L’ensemble de nos travaux suggère que le ciblage thérapeutique de CRIPTO et le blocage de la sécrétion des VEs pourraient être des nouvelles approches thérapeutiques innovantes pour le traitement du cancer de la prostate. / Prostate cancer (PCa) remains at the top of the list of the most common malignant tumors and the dominant cause of mortality and morbidity in men worldwide. Detection of tumor biomarkers to aid differentiate indolent from severe PCa cases and well-choose patients at high risk for intensive treatment. The founding member of EGF-CFC protein superfamily, CRIPTO, is widely implicated in embryonic development and is found to be expressed in a wide spectrum of human tumors. As its role in PCa was still unclear, we aimed to investigate expression profile of CRIPTO in PCa and relate its potential impact on prostate malignancy.Prostatic tissues and cell lines, both normal and cancerous, were engaged in experimental studies and design was based on techniques used in biochemistry, cellular and molecular biology.CRIPTO showed to be upregulated in 37.9% of PCas, while being absent or marginally detected in benign conditions. Our results displayed that CRIPTO overexpression promoted epithelial-mesenchymal transition (EMT) associated with enhanced migration capacity and survival under stress conditions due to propensity to stimulate PI3K/AKT and FGFR1/ERK signaling pathways.More interestingly, tumor mesenchymal like cells overexpressing CRIPTO secreted vesicles excessively. Thus we attempted to uncover the role of these vesicles in the progression of PCa. Extracellular vesicles derived from these cells were highly capable to modulate androgen receptor signaling through TGF-ß pathway and rendering the recipient prostatic cells more aggressive by acquisition of mesenchymal features.Our results highlight a new substantial function of CRIPTO in PCa and put in evidence its importance as a new promising target for PCa treatment. Moreover, we emphasize on an original role of mesenchymal extracellular vesicles in the interclonal communication to carry and transfer tumorigenic contents and enhance progression of PCa. This opens new scopes towards better understanding of vesicles secreted by prostate cancer cells and their impact to better cure the disease.

Les récepteurs à dépendance constituent une nouvelle classe de récepteurs à activité pro-apoptotique capables en présence de leur ligand de transduire un signal de survie cellulaire et à l’inverse, en absence de ligand d’induire l’apoptose. Parmi ces récepteurs, la famille des récepteurs UNC5H et leur ligand la Nétrine-1 (i.e. UNC5H1-4) sont plus particulièrement impliqués dans la morphogenèse des organes branchés, l’angiogenèse et le guidage axonal mais aussi dans le contrôle de la tumorigenèse et de l’homéostasie. En effet, ces récepteurs et leur ligand seraient capables de contrôler la prolifération et la survie cellulaire car le ligand induirait un état de dépendance des cellules exprimant les récepteurs UNC5H. Nous avons pu mettre en évidence un mode particulier de dérégulation tumorigène de la signalisation apoptotique des récepteurs UNC5H : la surexpression de Nétrine-1. Nous avons montré que l’acquisition de cette surexpression par les cellules tumorales constitue un réel avantage sélectif car cette surexpression permet aux cellules tumorales de s’affranchir de leur dépendance à la Nétrine-1 et ainsi de former des tumeurs voire de former des métastases. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la signalisation apoptotique des récepteurs UNC5H grâce à un crible d’ARNinterférence et 47 nouveaux effecteurs potentiels de l’apoptose sont actuellement en cours de caractérisation. Parmi eux, le complexe PP2A/PR65β a été caractérisé comme essentiel à l’apoptose induite par le récepteur à dépendance UNC5H2 et plus particulièrement dans la régulation de l’angiogenèse médiée par le couple UNC5H2/Nétrine-1. / Dependence receptors are a new class of pro-apoptotic receptor able to induce a survival signal in presence of their ligand and, on the opposite site to induce apoptosis in abaence of their ligand. Among them, UNC5H receptors (i.e UNC5H1-4) and their ligand Netrin-1 are implicated in morphogenesis of branched organs, angiogenesis and nervous system development but also in tumorigenesis control and homeostasis regulation. Indeed, this couple of ligand/receptors could control proliferation and cell survival by inducing a state of cellular dependance to the ligand presence for cell expressing UNC5H receptors. First, we have discovered a particular tumorigenic inhibition of UNC5H apoptotic activity due to Netrin-1 overexpression by tumor cells. In this context we have shown that this overexpression is a selective advantage for tumor cells as they loss their dependence to Netrin-1 and could (i) survive and proliferate without any ligand limitation and could also (ii) migrate and form metastasis. In a second part, we started to study UNC5H apoptotic pathway using and RNAi screening and 47 new potential effectors have been identified. Among them, PR65β/PP2A complex have been characterised as an essential actor of UNC5H2 induced apoptosis through the regulation of DAP-kinase by phosphorylation and particularly in angiogenesis regulation mediated by UNC5H2/Netrin-1.

L’acétylcholine (ACh) est un important neurotransmetteur qui est produit dans le système nerveux. Cependant, cette molécule est aussi produite par d’autres cellules non-neuronales du corps humain. Cette dernière est produite en abondance par les lymphocytes T CD4+, qui sont la cible principale du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). ACh exerce ses effets sur les cellules par l’intermédiaire de ses récepteurs nicotiniques (n) et muscariniques (m) qui sont exprimés à la fois sur les cellules immunitaires et non immunitaires dans le corps. Il est bien connu que l’ACh a des effets anti inflammatoires sur les cellules immunitaires, et c’est le récepteur nicotinique qui est un joueur indispensable de cet effet. SLURP-1 (Secreted Ly6/uPAR-related Protein-1), est une autre molécule secrétée par les cellules T activées et d’autres cellules. Elle agit comme un ligand allostérique pour le récepteur α7, et module les effets de l'ACh sur les lymphocytes T. Il est peu connu comment ce système cholinergique extra-neuronal (ENCS) est régulé chez les individus infectés par le VIH. Nos résultats démontrent que le taux d'ACh et de SLURP-1 en circulation ne change pas significativement chez les sujets infectés par le VIH comparé aux témoins sains. Cependant, le niveau de ces médiateurs est plus élevé chez les sujets infectés à long termes non progresseur (LTNP), qui contrôlaient la réplication virale, depuis plus que sept ans, sans aucune thérapie. Il est tentant de spéculer que le niveau élevé de ces deux composantes de l'ENCS peut jouer un rôle dans leur capacité à contrôler la réplication du VIH. Les résultats de cette étude montrent que l’agoniste du récepteur α7 diminue, et que l’antagoniste de ce même récepteur augmente la réplication virale in vitro, dans les cellules activées par le phytohaemagglutinin (PHA). En outre, l'hémicholinium (HC-3), un composé qui inhibe la capacité des cellules à produire ACh en compétition avec leur absorption de choline, augmente la réplication virale. L'expression du récepteur α7 sur les lymphocytes T CD4 + provenant du sang périphérique, mais pas sur les monocytes, était significativement réduite (p <0,01) chez les individus infectés par le VIH, et elle n'a pas été entièrement restaurée par le traitement antirétrovirale (TAR). Tandis que l'expression du récepteur adrénergique β-2 a diminué significativement (p <0,01) sur les monocytes et les lymphocytes T CD4 + chez des individus infectés par le VIH. Ces cellules répondent à la norépinephrine via ce récepteur et l’ACh secrété. Dans l'ensemble, les résultats cette étude suggèrent que le VIH provoque une modulation significative des différentes composantes de l'ENCS chez les individus infectés par le virus. Ce système pourrait être manipulé pour réduire la réplication virale et l’inflammation chez ces patients. / Acetylcholine (ACh) is an important neurotransmitter produced in the nervous system. However, the molecule is also produced by non-neuronal cells in the body. CD4+ T cells, the main targets of HIV-1, produce it abundantly. ACh exerts its effects on cells via its nicotinic (n) and muscarinic (m) receptors that are expressed on both immune and non-immune cells in the body. ACh is well known to exert anti-inflammatory effects on immune cells. The main receptor that is indispensable for the anti-inflammatory effects of ACh is the α7 nicotinic receptor. Another molecule, secreted by activated T cells and by other cells is SLURP-1 (Secreted Ly6/uPAR-related Protein-1), which acts as an allosteric ligand for α7 and fine tunes the effects of ACh on T cells. Little is known as to how this extra-neuronal cholinergic system (ENCS) is regulated in HIV-infected individuals. Our results show that the circulating levels of ACh and SLURP-1 do not change significantly in HIV-infected individuals, as compared to the circulating levels in healthy controls. Interestingly, higher levels of these soluble mediators were detected in HIV-infected long-term non-progressors (LTNP) who control the viral replication for more than seven years without any chemotherapy. It is tempting to speculate that the increase in levels of these two soluble mediators of the ENCS present in HIV-infected LTNPs may play a role in their ability to control HIV replication. The results from this study show that an α7 agonist decreased HIV replication, whereas a receptor antagonist increased its replication in vitro in human PHA blasts. Furthermore, hemicholinium (HC-3), a compound that inhibits the ability of the cells to produce ACh, by competing with their uptake of choline, increases the viral replication. The expression of the α7 receptor on peripheral blood CD4+ T cells, but not on monocytes, was significantly reduced (p<0.01) in HIV-infected individuals, and it was not fully restored by antiretroviral therapy (ART). Interestingly, the expression of the β2 adrenergic receptor was decreased significantly (p<0.01) on both monocytes and CD4+ T cells in HIV-infected individuals. These cells respond to norepinephrine via this receptor and secrete ACh. Overall, the results of this study suggest that HIV causes significant modulation of different components of the ENCS in virus-infected individuals. This system could be manipulated to reduce viral replication and inflammation in these patients.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le rhumatisme inflammatoire le plus fréquent dont l’étiologie reste inconnue. Le rôle de l’immunité adaptative est bien décrit dans cette maladie auto-immune (auto-anticorps anti protéines citrullinées (ACPA)) mais le rôle de l’immunité innée reste peu étudié, en particulier l’impact des polynucléaires neutrophiles (PNN) et de certaines molécules, comme le TLR9 (Toll-like receptor 9) ou la protéine C1q. Les PNN, cellules clé dans l’inflammation et la lutte contre les pathogènes peuvent faire le lien entre immunité innée et adaptative. Ils pourraient avoir d’autres fonctions que celles communément admises. Le TLR9 reconnaît les ADN viraux et bactériens mais pourraient reconnaitre des ligands endogènes de la PR. C1q est le membre du système du complément qui initie l’activation de la voie classique. Il reconnait des complexes immuns, formés dans certains cas d’ACPA, mais aussi d’autres ligands. L’objectif de ce travail était de mieux comprendre certains mécanismes de l’immunité innée, parfois non décrits, qui pourraient être impliqués dans la PR. Tout d’abord, nous avons montré que les PNN expriment un TLR9 de surface fonctionnel en plus du TLR9 normalement présent dans les endosomes, et produisent de l’interféron (IFN)-α, cytokine principalement produite par les cellules dendritiques plasmacytoïdes. Ces nouvelles fonctions pourraient participer aux phénomènes inflammatoires retrouvés dans certaines maladies auto-immunes. Le modèle d’arthrite expérimentale au collagène nous a permis de montrer que le TLR9 n’est pas nécessaire au développement de l’arthrite et que C1q est essentiel dans les phases précoces de l’inflammation. Les expériences faites chez l’homme confirment ces résultats car le TLR9 n’est pas surexprimé chez les patients PR alors que la capacité des leucocytes du sang à lier C1q est corrélée à l’activité de la maladie. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives sur le rôle de l’immunité innée dans la PR. / Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune inflammatory and disabling disease with unknown etiology. Many studies have shown the involvement of adaptative immunity. Especially autoantibodies such as anti-citrullinated protein antibodies (ACPA) are specific for this pathology. However, the role of innate immunity is not much studies, in particular polymorphonuclear neutrophils (PMN) and some molecules, such as TLR9 (Toll-like receptor 9) or C1q. PMN are key cells involved in inflammation and pathogen elimination and can link innate adaptative immunity. All PMN functions are not known. TLR9 recognizes pathogen-derived DNA and even self DNA under certain circumstances. TLR9 might also recognize damage-associated molecular patterns found in RA. C1q is the first component of the classical complement pathway and is activated by immune complexes, potentially containing ACPA. It can also recognize apoptotic cells. The aim of this study was to better understand innate immune mechanisms, sometimes not described, potentially involved in RA. We first demonstrate that PMN express a functional TLR9 at the cell surface, in addition to the normal endosomal expression. They can also produce interferon (IFN)-α described as a plasmacytoid dentritic cell cytokine. Those new PMN functions might participate in inflammatory events found in some autoimmune diseases.We demonstrated that TLR9 is not involved in collagen-induced arthritis model whereas C1q is absolutely required, especially in early steps. Human experiments confirm those results : RA patients do not over-express TLR9 and C1q binding by PMN is correlated with disease activity. All those results offer new insights in the involvement of innate immunity in RA.

Sur la cinquantaine de maladies rares lysosomales, seules 8 peuvent être traitées par enzymothérapie substitutive avec plus ou moins d’efficacité. Il y a donc un réel besoin de développer de nouveaux traitements mais aussi de mieux caractériser les causes de ces maladies. Durant cette thèse nous nous sommes intéressés à la maladie de Pompe qui résulte de l’absence ou de la carence en enzyme lysosomale alpha-glucosidase acide (GAA) responsable de la dégradation du glycogène en glucose dans de nombreux tissus. Actuellement seule la forme infantile de cette maladie peut être traitée alors que la forme juvénile/adulte est faiblement améliorée par le traitement Myozyme®. Cette thèse a eu pour but de développer une nouvelle enzymothérapie qui, à terme, permettrait d’empêcher la progression de la maladie et de soigner, de manière satisfaisante, les formes juvéniles et adultes de la maladie de Pompe. Dans ce but, nous avons utilisé des dérivés monosaccharidiques « Analogues du Mannose-6-phosphate (M6P) Fonctionnalisés sur l’Aglycone (AMFA) », qui sont ensuite greffés sur la GAA recombinante humaine (rhGAA) afin d’améliorer son adressage aux lysosomes obtenant la rhGAA-AMFA.Une première étude in vitro, sur des fibroblastes de patients atteints de la forme adulte de la maladie, a démontré que le greffage des AMFA sur la rhGAA produite en cellules d’insectes Sf9 améliorait significativement l’affinité pour le récepteur du M6P (RM6P), l’internalisation et l’activité de l’enzyme et lui conférait une efficacité sur les souris GAA-/-, modèles de la maladie de Pompe, par rapport au traitement actuel (Article 1). Puis nous avons pu démontrer, pour la première fois, l’efficacité de la rhGAA-AMFA produite en cellules CHO sur des souris GAA-/- âgées. Ces résultats suggèrent, ainsi, la possibilité d’utiliser cette néo-enzyme dans le traitement de la forme adulte de la maladie (Article2). Enfin, le greffage des AMFA permet d’obtenir une maturation intracellulaire complète de la rhGAA sous forme active dans des myoblastes et myotubes de patients adultes et dans les quadriceps de souris âgées modèles Pompe, ce qui n’a pas été observé pour Myozyme® (Article 3). Lors de cette thèse, nous avons également démontré que de nouveaux analogues disaccharidiques, ayant une meilleure affinité que les monosaccharides pour le RM6P, peuvent efficacement cibler la rhGAA pour le traitement de la maladie de Pompe. Un brevet a été déposé sur ces résultats (Brevet PCT/FR2016/052339).En conclusion, ce travail a permis de développer une nouvelle technologie de ciblage plus efficace des enzymes lysosomales par des analogues synthétiques. La désignation de médicament orphelin pour l’alpha glucosidase acide conjuguée aux analogues du mannose-6-phosphate a été obtenue suite à ces travaux auprès de l’Agence Européenne du Médicament pour le traitement de la maladie de Pompe (EMA/OD/098/16).Mots clés: maladies lysosomales, maladie de Pompe, enzymothérapie, récepteur du mannose 6-phosphate / On 53 known rare lysosomal diseases, only 8 can be treated by enzyme replacement therapy with more or less efficiency. There is therefore a need to develop new treatments but also to better characterize these diseases. During this thesis, we focused on Pompe disease which results from the absence or deficiency of the lysosomal enzyme alpha-glucosidase acid (GAA), responsible for the degradation of glycogen in glucose in many tissues. Currently only the infantile form of this disease can be treated while the juvenile/adult form is slightly improved by Myozyme® treatment. This thesis aimed to devel a new enzyme replacement therapy which could prevent the progression of the disease and satisfactorily treat the late onset form of the disease. To do that, we used monosaccharide derivatives “Mannose-6-phosphate analogues (M6P) Functionalized on Aglycone (AMFA)”, which were grafted onto human recombinant GAA (rhGAA) in order to improve its lysosome addressing obtaining the rhGAA-AMFA.A first in vitro study on adult patient fibroblasts showed that the addition of AMFA to rhGAA, produced in Sf9 insect cells, significantly improved its affinity for the M6P receptor (RM6P), its internalization and activity. It was also more efficient on the GAA-/- Pompe mouse model compared to current treatment (Article 1). Then, we demonstrated for the first time the efficiency of rhGAA-AMFA produced in CHO cells in aged mice model. These results suggest the possibility to use this neo-enzyme in the treatment of the adult form that still resists to treatment (Article 2). Finally, the addition of AMFA allows a complete maturation of rhGAA into its active form in myoblasts and myotubes of adult patients and in the quadriceps of aged mice Pompe model. This was not observed for Myozyme® (Article 3). In this thesis we have also demonstrated that novel disaccharide analogues with a better affinity than monosaccharides for RM6P can efficiently target GAA for the treatment of Pompe disease. A patent has been filed on these results (Patent PCT / FR2016 / 052339).In conclusion, this work has led to the development of a new technology more efficient in targeting lysosomal enzymes by mean of new synthetic analogues. An orphan drug designation for the recombinant human acid alpha-glucosidase conjugated with mannose-6-phosphate analogues was obtained on the basis of this work at the European Medicines Agency for the treatment of Pompe disease (EMA/OD/098/16).Key words: lysosomal diseases, Pompe disease, enzyme replacement therapy, mannose 6-phosphate receptor

De nouveaux composants du système rénine angiotensine (SRA) continuent d'être découverts et leurs fonctions étudiées. Cette thèse présente de nouvelles relations entre enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA), thrombose et maladies cardiovasculaires (MCV), d’une part, et d’autre part, un rôle pour le récepteur de la (pro)rénine dans le développement du système nerveux central (SNC). Tout d’abord, nous avons étudié l'association de la double mutation de l’ECA et l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène-1 (PAI-1) sur l’incidence d’évènements cardiovasculaires chez les patients Libanais hypertendus et hypercholestérolémiques, par rapport à d'autres gènes cardiovasculaires polymorphes des cytokines pro-inflammatoires dans les cellules mononuclées circulantes. Les résultats ont montré que les patients exprimant une double mutation ECA/PAI-1, respectivement Del/4G, sont à haut risque d’apparition des MCV. Dans une deuxième partie, nous avons étudié la relation entre récepteur de la (pro)rénine dont le gène est appelé Atp6ap2, et la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine dans les cellules souches/progénitrices neurales (CSPN). À cette fin, nous avons isolé des CSN à partir d’embryons de souris Atp6ap2-/Y, et étudié leur auto-renouvellement et leur différenciation en neurones, astrocytes et oligodendrocytes in vitro. Nos résultats suggèrent que Atp6ap2 est nécessaire à l’auto-renouvellement des CSN indépendamment de la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine chez les mammifères. Enfin, nous avons montré qu’il existait une corrélation entre l’expression ATP6AP2 et le degré de différenciation neuronale des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) isolées à partir du tissu adipeux. / New components of the renin angiotensin system (RAS) continue to be discovered and their functions studied. This thesis provides new insights on the role of angiotensin converting enzyme (ACE) in thrombosis and cardiovascular diseases (CVD) and of the (pro)renin receptor in the development of the central nervous system (CNS). First, we studied the role of ACE in CVD by analyzing the impact and the association of a mutation in ACE and in plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) genes compared to other polymorphic cardiovascular genes of proinflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells in hypertensive hypercholesterolemic Lebanese patients. We showed that Lebanese patients expressing a double mutation (Del/4G) of ACE and PAI-1, respectively, are at high risk of developing CVD, suggesting that combined ACE/PAI-1 mutations may be considered as a potential marker of CVD onset. In the second part, we studied the relation between the (pro)renin receptor, whose gene is called Atp6ap2, and Wnt/beta-catenin signaling pathway, in neural stem/progenitor cells (NSPC) during development. To this end, we used an in vitro model of neural stem cells (NSC) isolated from Atp6ap2-/Y mice embryos and studied their self-renewal capacity and their differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Our results suggest that Atp6ap2 is necessary for self-renewal of NSC independently of the Wnt/beta-catenin signaling pathway in mammals. In addition, we showed that the expression of ATP6AP2 in human mesenchymal stem cells (hMSC) isolated from adipose tissue was correlated with their degree of neuronal differentiation.