Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le récepteur ERRα (Estrogen Receptor-Related Receptor alpha) appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires. Une forte expression de ERRα est corrélée à un mauvais pronostic, suggérant l’implication de ce récepteur dans le processus métastatique. Mon projet est d'analyser le rôle de ERRα dans les mouvements cellulaires. J’ai montré qu’inhiber ERRα perturbe la migration cellulaire. L’étude des mouvements montre que l’absence de ERRα induit une perturbation de l’orientation cellulaire, du nombre des fibres de stress et des protrusions membranaires. Les cellules migrent de façon désorientée. J’ai démontré l’existence d’une cascade de régulation où ERRα stimule transcriptionnellement l'expression de la protéine BACURD2/TNFAIP1, elle-même régulant la stabilité de RhoA. Inhiber ERRα induit également une surexpression de RhoA, sa suractivation et une perturbation de la migration orientée. Cette cascade a été confirmée par des expériences de complémentation. J’ai vérifié ces résultats par des expériences in vivo et ex vivo, chez les souris KO pour ERRα. L’absence de ce récepteur induit une diminution de l’expression de TNFAIP1 inhibant la dégradation de RhoA et entrainant finalement une perturbation des mouvements cellulaires. Ainsi ERRα régule positivement la migration cellulaire conduisant à une forte potentialité métastatique dans les tumeurs surexprimant ce récepteur.L’ensemble de mes résultats pourrait faire de ERRα une nouvelle cible en vue de nouvelles thérapies anticancéreuses et nous pourrions proposer BACURD2/ TNFAIP1 comme un nouveau marqueur de pronostic dans les cancers. / High expression of the orphan nuclear receptor ERRα is strongly correlated with poor prognosis in various types of tumors, including those of the breast. The fact that high ERRα expression in tumors is also correlated with elevated invasiveness suggests that this nuclear receptor positively regulates cell migration and invasiveness.This possibility was investigated using MDA-MB231 breast cancer cell line as a model. Inactivating ERRα impairs cell migration. Using time-lapse-based cell tracking analysis and Golgi positioning, we show that this impairment is not due to reduced migration speed but rather to cell disorientation. The enhanced number of cell protrusions present in migrating cells and disorganized actin fibers confirm this. In summary cells do migrate but do not sustain persistent linear movement. We observed that upon ERRα inactivation, RhoA, which is instrumental in oriented movement, is overexpressed at the protein level. Further analysis showed that the stability and proteasome-dependent degradation of the protein is affected. To analyze the relationship between ERRα (as a transcription factor) and RhoA protein stability we performed a transcriptomic analysis comparing (by RNA-Seq) wt cells to ERRα-depleted ones. We identified genes regulated by ERRα that are involved in both cell migration (as a biological process) and in protein stability and degradation, more specifically that of RhoA protein (as a molecular process). TNFAIP1/Bacurd2 is stimulated by ERRα and fits these criteria: this protein mediates the Culin3-based, proteasome-dependent of RhoA and its inactivation leads to defects in cell migration.TNFAIP1/RhoA cascade is a major downstream effector of ERRα in cell migration

Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription qui exercent leur fonction via le contrôle de la transcription de leurs gènes cibles, une régulation qui est dépendante de cofacteurs associés. Les complexes transcriptionnels ainsi formés dialogueront avec l’environnement chromatinien (méthylation de l’ADN, remodelage des nucléosomes, modifications post-traductionnelles des histones) afin de promouvoir la répression ou l’activation transcriptionnelle des cibles géniques de ces récepteurs. Ce projet a identifié une interaction entre la lysine déméthylase LSD1 et le récepteur nucléaire orphelin ERRα dans des cellules humaines de cancers du sein. LSD1 protège ERRα d’une dégradation protéasomale de manière indépendante de son activité catalytique. Par ailleurs, LSD1 déméthyle H3K9 et H3K4 in vivo, mais est incapable in vitro de déméthyler H3K9. La présence de ERRα révèle cette activité de LSD1 sur H3K9, suggérant que le complexe ERRα -LSD1 agit comme un régulateur positif de la transcription. En ce sens, ERRα et LSD1 régulent un nombre important de gènes communs identifiés par RNAseq. Ainsi, 10 gènes activés ont été sélectionnés et le recrutement de ERRα et LSD1 a été examiné sur ces cibles géniques. En association avec les résultats obtenus in vitro, nous avons observé in vivo qu’en absence de ERRα ou LSD1, les gènes activés par ces deux partenaires présentent une augmentation de la marque répressive H3K9me2 sans affecter H3K4me2 au niveau du site d’initiation de la transcription. En conclusion, LSD1 interagit avec ERRα et inhibe sa dégradation, conduisant à une coopération transcriptionnelle de ces protéines. Pour la première fois, un rôle direct de ERRα sur l’environnement chromatinien a été identifié via l’activité de LSD1 sur des marques répressives d’histones. / Nuclear receptors are transcription factors that cooperate with chromatin associated factors to promote their activities. These transcriptional complexes are able to modulate the chromatin landscape to repress or promote transcription. Interestingly, there is an intricate cross-talk between these complexes and the chromatin environment that can influence each other to coordinate gene expression led by nuclear receptors. Post-translational modifications of histones regulate in part, DNA accessibility and the activities of nuclear receptors. One of these histone modifiers is LSD1, which is known to demethylate lysines 4 (H3K4) and 9 (H3K9) on histone 3. This manuscript focuses on the discovered LSD1-ERRα complex in human cancer cell lines. LSD1 interacts with ERRα, hence, modulates ERRα protein stability via a demethylation independent manner. Moreover, LSD1 is able to demethylate H3K4me2 in vitro but not H3K9me2. Interestingly, we observed that ERRα is able to switch LSD1 activity toward H3K9me2 to promote gene transcription without any additional cofactor in vitro. To confirm this effect in vivo, a transcriptomic analysis on mammary cancer cells was performed and highlights common target genes between ERRα and LSD1. We selected 10 genes activated by both and verified ERRα and LSD1 recruitment on these targets. Moreover, upon knock-down of ERRα or LSD1, the transcriptional start sites of activated genes -bound and regulated by both proteins- are enriched in the repressive mark H3K9me2. Altogether, these results describe a positive regulation of ERRα by LSD1 which in turn, drives the demethylase activity on H3K9me2 to promote transcription. Finally, these data highlight a direct function of ERRα on chromatin landscape.

L’intestin joue un rôle clé dans le contrôle de l’homéostasie énergétique. Les entérocytes sont des cellules polarisées qui permettent les échanges entre la lumière intestinale (membrane apicale) et le compartiment lymphatique et sanguin (membrane baso-latérale). Dans cette thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés au contrôle par les entérocytes de deux processus liés au métabolisme des lipides et du cholestérol : l’excrétion trans-intestinale de cholestérol (TICE) et l’absorption des lipides alimentaires.Très récemment, il a été montré que l’intestin contribue à 20-30% de l’excrétion fécale du cholestérol chez la souris. Ce mécanisme, appelé TICE, implique le passage direct du cholestérol provenant de la circulation sanguine à travers les entérocytes vers les fèces. De par son caractère modulable par des substances pharmacologiques comme l’ézétimibe et les statines, le TICE représente une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies athérogènes du diabétique. Cependant, les mécanismes moléculaires gouvernant le transport rétrograde du cholestérol (du pôle baso-latéral au pôle apical) dans l’entérocyte lors du TICE, sont complètement inconnus. Dans une première étude, nous avons mis en évidence la lignée entérocytaire humaine Caco-2/TC7 comme un modèle d’étude des processus trans-entérocytaires liés au TICE. Nous avons d’abord montré que suite à l’incubation avec du plasma humain dans le compartiment baso-latéral et des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 miment des caractéristiques du TICE in vivo. De plus, grâce à ce modèle in vitro, nous avons pu identifier les microtubules comme acteurs nécessaires au transport rétrograde du cholestérol dans l’entérocyte. Dans une seconde étude, nous nous sommes intéressés au contrôle par le récepteur nucléaire Rev-erbα de la production des chylomicrons (CM) par les entérocytes. En effet, bien qu’essentiellement vue comme la conséquence d’une clairance retardée, des données émergentes présentent la surproduction de CM par l’intestin comme un contributeur majeur de la dyslipidémie chez l’insulino-résistant. Il existe une balance, au sein de l’entérocyte, entre l’utilisation des lipides absorbés pour un stockage transitoire sous forme de gouttelettes lipidiques (GL) cytosoliques ou pour l’assemblage de lipoprotéines riches en triglycérides (LRT). Le récepteur nucléaire Rev-erbα est un répresseur transcriptionnel impliqué dans le métabolisme énergétique et le rythme circadien. Rev-erbα contrôle particulièrement le métabolisme lipidique au niveau du foie et le catabolisme des LRT. Pour cette seconde étude, une lignée Caco-2/TC7 invalidée pour Rev-erbα (sh Rev-erbα) a donc été développée par infection lentivirale et différenciée sur insert. Les résultats indiquent que suite à l’incubation avec des micelles lipidiques dans le compartiment apical, les cellules Caco-2/TC7 sh Rev-erbα sécrètent plus de LRT dans le milieu baso-latéral et stockent moins de lipides sous la forme de GL cytosoliques. De plus, la lignée Caco-2/TC7 sh Rev-erbα présente une activité lipophagique plus importante et l’inhibition de l’autophagie par la bafilomycine dans cette lignée restaure la sécrétion baso-latérale de LRT et le stockage intracellulaire de GL aux mêmes niveaux que ceux de la lignée sh control. Cette seconde étude montre donc que l’invalidation de Rev-erbα dans l’entérocyte entraîne une augmentation de la mobilisation des lipides des GL via le processus de la lipophagie résultant en une augmentation de la sécrétion de LRT. Notre hypothèse est que Rev-erbα joue un rôle clé dans le contrôle de la balance GL/LRT et donc de la triglycéridémie post-prandiale.Les deux études présentées dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes liés au contrôle du métabolisme lipidique par l’intestin et mettent ainsi en avant l’intestin comme une cible thérapeutique potentielle pour corriger les dyslipidémies du diabétique. / The intestine plays a key role in the control of energy homeostasis. Enterocytes, which constitute the main cellular type of intestinal epithelium (> 90%), are polarized cells allowing exchanges between intestinal lumen (apical membrane) and lymph/blood compartment (basolateral membrane). In this thesis, cholesterol and lipid metabolism control by enterocytes was studied and particularly, trans intestinal cholesterol excretion (TICE) and dietary lipid absorption.Recently, it has been estimated that intestine contributes 20-30% of fecal neutral sterol excretion in chow-fed mice. This pathway called TICE involves the direct luminal secretion of plasma-derived cholesterol by enterocytes. Moreover, TICE can be pharmacologically modulated, for instance by ezetimibe and statins and so, represents a new therapeutic target in order to prevent atherosclerosis in type 2 diabetic patients. However, at present, the molecular mechanisms behind the trans-enterocytic process of TICE are still unknown, especially the steps sustaining cholesterol entry, trafficking and efflux in enterocytes. In the first study of this thesis, we highlighted the human enterocytic Caco-2/TC7 cell line as a suitable model to study the enterocyte-related processes of TICE. We have first shown that upon basolateral incubation with human plasma and apical incubation with lipid micelles, differentiated Caco-2/TC7 cells mimic some of the in vivo TICE features. Moreover, using this model, we have identified a key role of the microtubule network in the process.In the second study of this thesis, chylomicron secretion by enterocytes and its control by the nuclear receptor Rev-erbα were investigated. Indeed, although chylomicron remnant accumulation has been associated to a delayed clearance by the liver, some recent studies show that chylomicron overproduction by the intestine is a major contributor to dyslipidemia in insulin resistant patients. Dietary lipid absorption results from a balance between transient storage in enterocytes as cytosolic lipid droplets (LD) and secretion as triglyceride-rich lipoproteins (TRL). The nuclear receptor Rev-erbα is a transcriptional repressor involved in the energy metabolism and the circadian rhythm. Particularly, Rev-erbα controls lipid metabolism in the liver and thus the catabolism of TRL. The aim of this second study was to investigate the role of Rev-erbα in intestinal lipid metabolism and particularly in TRL secretion. To study that, Caco-2/TC7 cells infected with lentivirus encoding or not a shRNA targeting Rev-erbα (sh Rev-erbα) were grown on transwells. Compared to sh control, sh Rev-erbα Caco-2/TC7 cells secrete higher amounts of micelle-derived LRT in the basolateral medium and exhibit lower quantity of neutral lipids stored as cytosolic LD, whereas the apical uptake is not different. Activation of lipophagy in sh Rev-erbα compared to sh control cells was evidenced by a higher autophagic flux and an increased colocalization of the autophagy marker LC3 with LD. Finally, autophagy inhibition with bafilomycin in sh Rev-erbα cells restores lipid secretion to the same level as in sh control cells. This second study show that Rev-erbα knock-down in enterocytes leads to a higher lipophagy-mediated remobilization of intracellular lipids and an increased TRL secretion. Our hypothesis is that Rev-erbα may be a molecular gear in the control of chylomicron secretion and a major regulator of post-prandial triglyceridemia.In conclusion, these two studies allow to better understand lipid metabolism control by the intestine: the first one by identifying the contribution of the microtubule network in enterocytes for trans-enterocytic retrograde cholesterol transport; the second one by highlighting the nuclear receptor Rev-erbα as a regulator of TRL secretion by enterocytes. These two studies point out the intestine as a potential therapeutic target to treat dyslipidemia in type 2 diabetic patients.

CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) et PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) sont deux récepteurs nucléaires dédiés à la reconna issance et à l'élimination de molécules lipophiles potentiellement toxiques pour l'organisme. Ces facteurs de transcription peuvent être activés par des ligands d'origines et de structures diverses (médicaments, polluants environnementaux, produits de l'alimentation et de phytothérapies). L'activation de ces récepteurs entraîne l'expression des gènes majeurs de la fonction de détoxication entéro-hépatique (CYP450, transférases, transporteurs) permettant l'élimination de ces toxiques. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps 1) montré que CAR contrôle l'expression de Spot14, une protéine pro-lipogénique, et 2) nous avons identifié une nouvelle isoforme de PXR (PXR-small) codant uniquement pour le domaine de liaison des ligands de PXR. Nous avons pu déterminer les origines de transcription par 5'-RACE PCR et montrer que PXR-small représente environ 10% de l'ensemble des transcrits de PXR dans le tissu hépatique sain par une approche de PCR qua ntitative. Nous avons pu détecter sa présence par western-blot sur des extraits de protéines nucléaires issus de tissus hépatiques et de lignées cellulaires hépatiques. Par des expériences de gel retard, nous avons observé que cette nouvelle isoforme tronquée, qui ne code que pour le LBD de PXR, ne peut pas se lier à l'ADN. Des expériences de gènes rapporteurs suggèrent que cette isoforme se comporte comme un dominant négatif de PXR. Enfin, la présence d'un ilot CpG situé juste en amont de PXR-small suggère que cette nouvelle isoforme pourrait être régulée épigénétiquement par méthylation, notamment dans les cellules tumorales. / CAR (Constitutive Androstane Receptor, NR1I3) and PXR (Pregnane X Receptor, NR1I2) are two nuclear receptors devoted to the recognition and elimination of lipohilic molecules potentially toxic to the body.These transcription factors can be activated by ligands of different origins and structures (drugs, environmental pollutants, food products and herbal medicine...). The activation of these receptors leads to the expression of major genes of the detoxification process (CYP450, transferases, transporters) leading to the elimination of these toxics. In this work, we 1) showed that Spot14, a pro-lipogenic protein, is a target gene of CAR, then 2) we identified a novel isoform of PXR (PXR-small), coding only the ligand binding domain of PXR. By using 5'-RACE PXR, we established the origins of transcription of PXR-small and by quantitative PCR we observed that PXR-small represents about 10% of all PXR transcripts in human liver. By using western blo t, we detect its presence on nuclear protein extracts from liver tissues and hepatic cell lines. In Electromobility shift essays experiments, we observed that PXR-small cannot bind to DNA, while reporter essay experiments suggest that this isoform acts as a dominant negative of PXR. Finally, the presence of a CpG island just upstream of PXR-small suggests that this novel isoform might be regulated epigenetically by methylation, more particularly in tumor cells.

MyD88 est une protéine adaptatrice clé dans la signalisation des TLRs/IL-1R qui mène à l'activation de NF-KB et des MAPK, et à la production de cytokines inflammatoires. MyD88 participe à la tumorigénèse par le biais de son activité inflammatoire dans la signalisation des TLRs/IL-1R, et également via son interaction directe avec la kinase Erk dans la cellule cancéreuse. Dans cette thèse, nous identifions de nouveaux partenaires protéiques de MyD88 et nous examinons comment leurs interactions peuvent réguler sa fonction. Nous démontrons que MyD88 interagit avec Ubc9, ce qui conduit à sa sumoylation, et que cette modification posttraductionnelle régule négativement l'inflammation dépendante de MyD88. Nos résultats montrent également que MyD88 interagit avec le récepteur nucléaire, ER-α, et que cette interaction est nécessaire pour la réponse inflammatoire. Enfin, nous avons étudié l'importance de l'interaction MyD88/Erk dans le maintien de la transformation des tumeurs dépendant de l'oncogène Ras. Ces résultats pourraient éventuellement être exploités pour cibler MyD88 et ses interactions dans le traitement des maladies inflammatoires et le cancer / MyD88 is a protein that is at the interface between inflammation and cancer. It is the key adaptor protein used by TLRs/IL-1R to mediate their downstream signaling, resulting in NF-κB and MAPK activation, and inflammatory cytokine production. MyD88 also plays a role in tumorigenesis via two mechanisms, an inflammatory one dependent on its function in TLRs/IL- 1R signaling, and an intrinsic, cell-autonomous mechanism mediated by its interaction with the kinase Erk. Based on the different roles played by MyD88, this thesis work consisted in studying how MyD88 protein-protein interactions can regulate its function. We show that MyD88 interacts with Ubc9, resulting in its sumoylation and subsequent negative regulation of MyD88- mediated inflammation. We also demonstrate that MyD88 interacts with the nuclear receptor ER-α, an interaction necessary for the inflammatory response. Finally, we have studied the importance of the MyD88/Erk interaction in the maintenance of the transformed phenotype of Ras-dependent tumors. These findings could eventually be exploited to target MyD88 and its interactions in the treatment of inflammatory disorders and cancer

Les récepteurs nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcriptions se liant à des séquences spécifiques d'ADN et activant la transcription de gènes en réponse à la fixation de ligands spécifiques. Parmi tous les RNs impliquées dans l'étiologie des cancers, les récepteurs liés aux œstrogènes ERR jouent un rôle important dans les cancers du sein, de l'ovaire, du colon, de l’endomètre et la prostate. Ce RN est dit orphelin car il ne possède pas de ligand naturel connu à ce jour. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant cryo-microscopie électronique, bioinformatique et évolution, mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude structurale de ERR et sur l'origine et l'évolution des RNs. Dans ce contexte, 3 outils informatiques ont été développés. Les résultats obtenus ont permis d'une part la révision des connaissances fondamentales sur l'origine des récepteurs nucléaires et leur évolution. D'autre part, l'étude structurale de ERR a permis d'acquérir de nouvelles données sur la topologie des récepteurs nucléaires stéroidiens fixés sur un élément de réponse ERRE/ERE ainsi que sur le mécanisme allostérique de la liaison du coactivateur PGC-1α sur le dimère de ERR. La résolution du complexe à l'échelle atomique par cryo-microscopie électronique permettra d'ouvrir la voie vers la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. / Nuclear receptors (NRs) are transcription factors which bind to specific DNA sequences and activate gene transcription in response to the binding of specific ligands. Among all of the RNs involved in the etiology of cancers, ERR estrogen receptors play an important role in breast, ovarian, colon, endometrial and prostate cancers. This NR is said to be orphan because it does not have a natural ligand known to date. Using an integrative structural biology approach combining cryo-electron microscopy, bioinformatics and evolution, my PhD work focused on the structural study of ERR and the origin and evolution of RNs. In this context, three informatic tools have been developed. The results obtained allowed, on the one hand, the revision of fundamental knowledge on the origin of nuclear receptors and their evolution. On the other hand, structural study of ERR allow us to acquire new data on topology of steroid nuclear receptors fixed on an element of ERRE / ERE response as well as on the allosteric mechanism of the binding of the coactivator PGC-1α on the dimer of ERR. The resolution of the complex at the atomic scale by cryo-electron microscopy will open the way towards the design of new therapeutic molecules.

Le récepteur de la vitamine D (VDR) est un facteur de transcription activé par la forme active de la vitamine D3. VDR est une cible thérapeutique potentielle pour de multiples pathologies telles que les maladies auto-immunes et neurodégénératives et certains cancers. VDR module l’expression de gènes par le recrutement sélectif de corégulateurs. Les données structurales disponibles à ce jour pour des complexes de récepteur nucléaire-corégulateurs sont très limitées. Cette étude se focalise sur l’architecture du complexe formé par VDR et un grand fragment du coactivateur MED1, une sous-unité du complexe Médiateur qui fait le lien entre les récepteurs nucléaires et la machinerie basale de transcription. Les résultats obtenus nous sont permis de caractériser l'interaction du récepteur avec le coactivateur et de révéler l'architecture globale du complexe. Ce travail fournit une base solide pour la détermination structurale d’autres complexes impliqués dans le contrôle de la transcription. / The vitamin D nuclear receptor (VDR) is a transcription factor activated by the biologically active form of vitamin D3. VDR is a potential candidate to treat neurodegenerative and autoimmune disorders, and cancer. VDR modulates the expression of vitamin D3-regulated genes by selective recruitment of coregulators of transcription which are, in turn, attractive targets in epigenetic-oriented drug discovery. Available structural data for receptor-coregulator complexes are limited; investigation of such complexes is highly important. The present work focuses on the architecture of the complex between VDR and a large part of the coactivator MED1, a subunit of the Mediator complex linking nuclear receptors to the basal transcription machinery. Obtained results revealed important details of the interaction, as well as the overall organization of the complex. This work provides a solid background for the structural investigation of similar complexes involved in the transcriptional control.