Submitted by GISLAINE RAQUEL SANTOS (g_raquelsantos@yahoo.com.br) on 2016-07-12T13:44:01Z No. of bitstreams: 1 Tese CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA E MOLECULAR DA RAIVA EM BOVINOS NO ESTADO Gislaine Raquel dos Santos.pdf: 3457607 bytes, checksum: 5f07e27a43061393bdefd203b8570a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-14T18:07:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_gr_dr_jabo.pdf: 3457607 bytes, checksum: 5f07e27a43061393bdefd203b8570a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T18:07:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_gr_dr_jabo.pdf: 3457607 bytes, checksum: 5f07e27a43061393bdefd203b8570a11 (MD5) Previous issue date: 2016-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A raiva é uma antropozoonose de evolução letal causada por vírus do gênero Lyssavirus. É uma das doenças infecciosas responsáveis por causar prejuízos aos produtores rurais, levando a impactos econômicos significativos no agronegócio. Objetivou-se com o presente trabalho determinar o perfil epidemiológico da raiva em herbívoros no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012. Foi realizado um estudo retrospectivo dos dados relativos aos casos positivos de raiva de herbívoros, levando em consideração o mês e o ano da ocorrência e a região geográfica. As análises moleculares foram desenvolvidas a partir de amostras de encéfalos provenientes das cinco Mesorregiões (Agreste, Mata, Sertão, Metropolitana e São Francisco) do Estado. No período estudado foram detectados 238 resultados positivos para o vírus da raiva em herbívoros, distribuídas espacialmente nas cinco mesorregiões, em 78 (42,1%) dos 185 municípios. Observou-se no decorrer do período uma diminuição significativa na taxa de incidência, com ausência de sazonalidade. Quando se analisou a taxa de incidência levando em consideração as Mesorregiões, observou-se que a Mata foi a que apresentou maior oscilação. Para complementar a análise epidemiológica, 16 amostras foram submetidas à técnica de RT-PCR para amplificação parcial do gene N. As sequências geradas foram alinhadas com sequências homólogas obtidas no GenBank para a construção da árvore filogenética, pelo método Bayesiana. Todas as amostras foram homólogas às sequências de vírus da raiva relacionadas à linhagem do morcego hematófago Desmodus rotundus. Diante dos resultados obtidos, constata-se que o vírus da raiva está presente em todo o Estado de Pernambuco, relacionado à linhagem do morcego hematófago Desmodus rotundus. Os focos de raiva em herbívoros estão distribuídos em graus diferenciados em todas as mesorregiões, porém não se constatou um aumento no número de casos que se repita de forma sistemática em uma mesma época do ano, indicando ausência de sazonalidade. Observou-se, também, uma significativa diminuição da incidência no decorrer do período estudado. Esse panorama enfatiza a importância da contínua realização das atividades de prevenção e controle pela Vigilância Agropecuária. / Rabies is an anthropozoonosis with lethal evolution caused by genus lyssavirus viruses. It is one among infectious diseases who are responsible for causing losses to farmers, leading to a significant economic impacts on agribusiness. The objective of this study was to determine the epidemiological profile in herbivores whithin the State of Pernambuco, Brazil, from 2007 to 2012. A retrospective study was conducted based on data from positive cases of rabies of herbivores, considering the month, the year of occurrence and geographic region. The molecular analyzes were developed using brain samples from the five Mesoregions (Agreste, Mata, Sertão, Metropolitana and São Francisco) within the State. During the study period, were detected positive for rabies 238 from herbivores, spatially distributed in 78 (42.1%) of 185 municipalites from the five mesoregions. It was observed, during the period cited, a significant decrease in the incidence rate, with no seasonal nature. While analyzing the incidence rate considering the mesoregions, the Mata region showed the greatest oscillation. As a complement to the epidemiological analysis, 16 samples were subjected to RT-PCR for the partial amplification of the gene N. The generated sequences were aligned with homologous sequences obtained from the GenBank to build the phylogenetic tree by bayesian method. On the results, it was found that the rabies virus is present all over the state of Pernambuco, related to the lineage of vampire bat Desmodus rotundus. The rabies outbreaks in herbivores are distributed in different degrees throughout the mesoregions but it was not found an increase in cases numbers that repeats systematically during the same time of the years, indicating, therefore, the absence of seasonality. It was observed also a significant decrease in incidence over the studied period. This scenario emphasizes the importance of continued prevention and control activities by the Agricultural Surveillance.

O comportamento biológico de uma amostra de vírus recém-isolada de eqüino (M82-02), procedente de uma região próxima de São Paulo, foi estudado em camundongos, inoculados pelas vias intracerebral e intramuscular, avaliando-se as características relacionadas com a infectividade, patogenicidade, período de incubação, período do curso clínico e capacidade invasiva do vírus para outros tecidos não-nervosos. A amostra, com uma passagem em cérebro de camundongos, foi tipificada antigenicamente, utilizando um conjunto de anticorpos monoclonais (MABs), desenvolvido pela \"Canadian Food and Inspection Agency\", de Ottawa, Canadá, correspondendo ao perfil de morcego hematófago Desmodus rotundus. Após ser submetida à extração do material genético, a amostra foi caracterizada geneticamente no \"National Institute of Infectious Diseases\", de Tóquio, Japão, confirmando pertencer ao genótipo 1 do gênero Lyssavirus, com característica próxima a do \"Vampire -bat related virus-VRRV\", comuns entre as amostras brasileiras isoladas de herbívoros e morcegos hematófagos. As sucessivas passagens da amostra em camundongos, por via intracerebral e intramuscular, provocaram ligeiro aumento no título do vírus e estabilização do período de incubação, quando então foi utilizado como antígeno para a prova de soroneutralização, para avaliar o comportamento deste vírus frente aos soros de eqüinos vacinados com uma vacina comercial de vírus PV inativado. Os soros de eqüinos vacinados foram titulados em paralelo com o antígeno viral constituído de vírus CVS. Com o uso da amostra M82-02 como antígeno para a prova de soroneutralização não foi possível demonstrar diferença significativa, quando comparado com o antígeno fixo de vírus CVS, no entanto, alguns soros de eqüinos vacinados foram encontrados com níveis de anticorpos acima de 0,5UI/mL. Pela prova de imunofluorescência direta (IFD), a presença do antígeno do vírus da raiva foi evidenciada no pulmão e nos rins de animais inoculados por via IM, notadamente nos materiais de passagem mais elevada. No teste de avaliação da vacina comercial, pelo método do CDC de Atlanta, o resultado do desafio com a amostra M82-02 foi inferior ao do vírus fixo CVS, no entanto, este método ainda necessita ser melhorado para sua utilização na rotina. / The biologic behavior of a rabies virus recently isolated from an equine raised at a region neighbor to São Paulo, Southeast Brazil, the isolate M82-02, was studied in mice by inoculating through intracerebral and intramuscular route, for evaluation of characteristics related to its infectivity, pathogenicity, incubation period and course of clinical illness and also the virus capacity to invade other non-nervous tissues. The first intracerebrally passaged mouse brain was submitted for antigenic typing by using a set of monoclonal antibodies (MABs) prepared at the Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canada, and it was found to be a variant of vampire-bat related rabies virus. After extraction of genetic material, the sample was characterized genetically at the National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan, ant the isolate belonged to genotype 1 of the Lyssavirus gene, closely related to the Vampire-bat related virus group-VRRV, common among the Brazilian rabies virus isolates from herbivores and vampire bat Desmodus rotundus. The successive intracerebral and intramuscular passages in mice provoked a slight increase in the virus titer, and the stabilization of the incubation period. In its 10th passage, the isolate was used as the antigen in mouse serum neutralization test, for the assessment of equine sera which had been vaccinated with a commercial PV rabies inactivated virus vaccine, the equine sera were tested in parallel with the CVS strain and some sera were found with neutralizing titer >0.5 IU/mL. Using the isolate M82-02 of rabies virus as an antigen in the neutralization test, no significant difference could be detected, when the results were compared to that of the CVS strain. By means of direct fluorescent antibody (dFA) test, the presence of rabies virus antigen was detected in tissues of brain, lung and kidneys of mice inoculated by intramuscular route, especially in serially passaged materials. The CDC-potency test for evaluation of a commercial vaccine using the field isolate M82-02 as a challenge virus showed a poorer result than the challenge with the fixed CVS strain, however, this method needs further modifications for the routine use.

Com o controle da raiva nos cães do Estado de São Paulo nos últimos 20 anos, a raiva em animais silvestres, sobretudo nos quirópteros, assume crescente importância, visto que, atualmente, estes são os principais reservatórios para a raiva neste Estado. Apesar dos morcegos manterem ciclos epidemiológicos da raiva há centenas de anos, somente a partir da década de 50 a raiva em morcegos insetívoros foi reconhecida como um problema de saúde publica. Desde então foram feitos muitos avanços na compreensão da raiva nestes animais. Atualmente, o vírus da raiva (RABV) já foi detectado em 37 espécies de morcegos brasileiros, tendo sido determinadas quatro linhagens genéticas específicas associadas a quatros gênero/espécies destes morcegos, três destas exclusivas de morcegos insetívoros. Entretanto, apesar da importância da raiva em morcegos insetívoros, estudos voltados a um conhecimento mais amplo das implicações da diversidade de amostras de RABV detectadas nos mesmos aplicados à Epidemiologia Molecular são escassos. Assim, a presente investigação teve por objetivos estabelecer genealogias para amostras de RABV isoladas de diversas espécies de morcegos insetívoros do Estado de São Paulo a partir de seqüências parciais dos genes N (40 amostras) e G (45 amostras), avaliar a existência de linhagens gênero-específicas do RABV e determinar os marcadores moleculares para sua diferenciação. Foram encontradas linhagens específicas de RABV para os gêneros Myotis, Epitesicus e Nyctinomops e três prováveis linhagens circulantes nos gêneros Tadarida, Histiotus e Lasiurus. Além disso, esta pesquisa revelou marcadores moleculares de aminoácidos específicos para os gêneros Myotis, Eptesicus e Nyctinomops, contribuindo para um melhor entendimento da epidemiologia molecular da Raiva e da relação entre o RABV e gêneros diversos de quirópteros. / As a result of the control of canine rabies in São Paulo State in the last 20 years, rabies in wild animals, mainly in bats, has assumed an increasing importance as the last are currently the most important rabies reservoirs in this State. Despite the fact that bats have maintained epidemiological cycles of rabies for centuries, only in the 50s rabies in insectivorous bats was recognized as a threat for Public Health and several advances have been achieved since then for the comprehension of rabies in these animals. Rabies virus (RABV) has already been detected in 37 species of Brazilian bats and four specific genetic lineages associated to four genera/ species of bats have been determined, three of these exclusive to insectivorous bats. Nonetheless, despite the importance of insectivorous bats rabies, studies on a more comprehensive knowledge on the implications of the diversity of RABV strains detected on these are scarce. Thus, the present investigation aimed to establish genealogies for RABV strains isolated from diverse species from insectivorous bats from São Paulo State based on partial N (40 strains) and G (45 strains ) genes, assess the existence of genus-specific lineages of RABV and to determine molecular markers for its differentiation. Specific RABV lineages where found for the genera Myotis, Epitesicus and Nyctinomops and three other probable lineages circulating in the genera Tadarida, Histiotus and Lasiurus where found as well. Furthermore, this investigation revealed amino acids molecular markers for the genera Myotis, Eptesicus and Nyctinomops, contributing to a better understanding of rabies molecular epidemiology and the relationship amongst RABV and diverse genera of bats.

A raiva é uma zoonose que afeta o sistema nervoso central, de evolução aguda e fatal, mantida em mamíferos e conhecida há milênios. Presente na América, Europa, África e Ásia, tem como agente etiológico o vírus da raiva (RABV), um vírus RNA neurotrópico, pertencente à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus., o qual é composto por quatorze espécies. Entre os Lyssavirus, o RABV é o mais amplamente distribuído mundialmente e tem maior importância epidemiológica dada sua associação com um maior número de casos de encefalite por Lyssavirus em humanos em relação às outras espécies. São admitidos dois ciclos de transmissão para a raiva, o ciclo urbano e o ciclo silvestre. O ciclo urbano ou terrestre tem o cão como principal reservatório e transmissor do vírus para outros cães, outros animais domésticos e para o homem, enquanto o ciclo silvestre ou aéreo é mantido por diferentes mamíferos silvestres e quirópteros. A origem comum dos dois ciclos do RABV á partir de um RABV ou Lyssavirus ancestral e a divergência adaptativa ocorrida desde então, causada pela adaptação de tal vírus em paisagens adaptativas tão variadas e distintas representadas pelas ordens Carnivora e Chiroptera, levaram ao surgimento das diversas linhagens encontradas nos ciclos terrestre e aéreo. Sendo assim, com o objetivo de se estudar as diferenças geradas nos RABV dos ciclos aéreo e terrestres devido a sua evolução em paralelo nestas duas ordens foram analisadas 159 sequências genômicas do RABV (59 do ciclo terrestre e 100 do ciclo aéreo), sendo que 21 destas sequências foram obtidas neste estudo e representam oito linhagens de RABV existentes no Brasil e cinco destas linhagens de RABV tiveram seus genomas sequenciados pela primeira vez. Foram analisados aspectos como as diferentes taxas de substituição de nucleotídeos por sítios (heterotaquia) entre os mesmos genes do RABV mantidos no ciclo aéreo e terrestre, análise do melhor gene para a realização de estudo filogenéticos confiáveis para o RABV, tempo de divergência entre os ciclos, padrões de variabilidade genética e vieses quanto ao uso preferencial de códons em cada ciclo. Como resultado, concluí-se que a divergência adaptativa ocorrida entre os dois ciclos do RABV fez com que alguns aspectos evolutivos de seu genoma apresentem padrões diferentes de acordo com o ciclo do RABV analisado. / Rabies is a zoonosis that affects the central nervous system, showing an acute and fatal evolution, occurring in mammals and known for millennia. Present in America, Europe, Africa and Asia, its etiological agent is Rabies virus (RABV), a neurotropic RNA virus in the order Mononegavirales, family Rhabdoviridae, genus Lyssavirus, composed by fourteen species. Amongst the lyssaviruses, RABV is the most widely spread worldwide and has a higher epidemiological importance due to its association to a higher number of cases of encephalitis. Two cycles are accepted for rabies transmission, the urban and the wild ones. In the urban (or terrestrial) cycle, dogs are the main reservoirs and transmitters of the virus to other dogs, other domestic animals and to humans, while in the wild (or aerial) cycle bats are the reservoirs. The common origin of both cycles from an ancestor RABV or lyssavirus and the adaptive divergence that occurred since then, caused by the adaptation of this ancestor virus to a wide range of adaptive landscapes represented by the orders Carnivora and Chiroptera led to the emergence of diverse RABV lineages currently found in the aerial and terrestrial cycles. Thus, aiming to study differences found in RABV lineages from the aerial and terrestrial cycles due to their parallel evolution in these two orders, 159 genomic sequences of RABV (59 from the terrestrial and 100 from the aerial cycles) were analyzed, being 21 of these sequences referent to eight lineages of RABV found in Brazil sequenced in this study and five of these eight lineages of RABV had their genomes sequenced for the first time The study included the per site nucleotide substitution rate differences (heterotachy) between the same genes RABV maintained in the aerial and terrestrial, survey of the most suitable gene for phylogenetic analysis, time of divergence between the two cycles, patterns of genetic variability and codon usage bias. As a conclusion, the adaptive divergence occurred between the two cycles caused some evolutionary aspects of RABV genome to show an intricate cycle-specific evolutionary pattern.

Morcegos vêm recebendo crescente importância em Saúde Pública, pois são os principais reservatórios para a raiva em diversas partes do mundo. Estudos filogenéticos baseados no gene N demonstraram que os vírus da raiva (RABV) encontrados em morcegos frugívoros Artibeus spp. são próximos àqueles associados ao morcego hematófago Desmodus rotundus, mas pouco se conhece sobre a diversidade genética do RABV nestes morcegos. Este estudo teve como objetivos avaliar a filogenia de linhagens do RABV variante três (AgV3) relacionadas a morcegos Artibeus spp. e D. rotundus, com base em sequências do gene N e do gene G, e a possibilidade de distinção entre isolados de vírus da raiva detectadas em Artibeus spp. e D. rotundus para a epidemiologia molecular da raiva. Vinte amostras do RABV isoladas de Artibeus spp. e 15 obtidas de bovinos e relacionadas ao D. rotundus, todos do Estado de São Paulo, Brasil, foram submetidas a RT -PCRs, e os amplicons gerados submetidos ao sequenciamento de DNA, e as sequências alinhadas com sequências homólogas obtidas do GenBank para a construção de árvores Neighbor-Joining de nucleotídeos (modelo MCL) e aminoácidos (modelo Poisson), utilizando European bat lyssavirus 1 (EBLV1) como outgroup. A árvore filogenética gerada para o gene N demonstrou a formação de três grupos apoiados em bootstraps de no mínimo 60%. Estes grupos foram denominados como grupo D, exclusivamente com isolados relacionadas ao D. rotundus e A1 e A2 principalmente com isolados de Artibeus spp., enquanto que para o gene G, segregaram em duas linhagens, ou seja, relacionadas ao D. rotundus (grupo D) e relacionadas ao Artibeus spp. (grupo A). Para todos os grupos as identidades de aminoácidos foram superiores às de nucleotídeos, uma indicação da predominância de substituições sinônimas. Concluindo, padrões gênero-específicos para isolados do RABV AgV3 foram detectados em D. rotundus e Artibeus spp., com uma topologia concordante para linhagens fixas em cada um destes quirópteros. Estes resultados mostram uma intrincada relação com o hospedeiro na história evolutiva do RABV, sob o ponto de vista básico, como também a determinação das fontes de infecções na epidemiologia molecular da raiva. / Bats have been assigned an increasing importance in Public Health as these are the main rabies reservoirs in many parts of the world. Phylogenetic studies based on the N gene have shown that rabies virus (RABV) strains from Artibeus spp. frugivorous bats are closely associated to those from the vampire bat Desmodus rotudus, but little is known about the genetic diversity of RABV in these bats. This study aimed to assess the phylogeny of RABV strains from the antigenic variant 3 (AgV3) from these bats based on N and G sequences and to evaluate the possibility of distinction between RABV lineages of these for the molecular epidemiology of rabies. Twenty RABV strains isolated from Artibeus spp. bats and 15 obtained from cattle and related to D. rotundus, all from Sao Paulo State, Brazil, were submitted to RT-PCRs to the N and G genes amplifications and the amplicons were submitted to cycle sequencing; the sequences were aligned with homologous sequences retrieved from the Genbank for the construction of Neighbor-Joining trees for nucleotides (MCL model) and amino acids (Poisson model) with European bat lyssavirus 1 (EBLV1) as outgroup. N gene tree showed three major clusters with bootstraps 60% and named as clusters D, exclusively with strains related to D. rotundus and A1 and A2, chiefly with Artibeus spp. strains while for the G gene only two lineages, i.e., D. rotundus related (cluster D) and Artibeus-related (cluster A) were formed. For all the groups the amino acids identities were superior to the nucleotides identities, an indication of the predominance of synonymous substitutions. As a conclusion, genus specific lineages of AgV3 RABV have been detected in D. rotundus and Artibeus spp. bats with a concordant topology for fixed strains for each of these two bat genus. These results not only show an intricate host-relationship of RABV evolutionary history on the basic point of view, but have an invaluable application for the determination of sources of infections in rabies molecular epidemiology.

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lyssavirus. Ultimamente, o Protocolo de Milwaukee é a base do tratamento humano, com indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, embora tenha sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aperfeiçoamentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para este fim, foram utilizados três siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, siRNA 649) com a fita antisenso complementar ao mRNA da fosfoproteína (P) e três siRNAs (Le 1, Le 2, Le 3) contra o RNA líder do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas as amostras PV e 4005 (AgV3) do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com as amostras PV ou 4005 e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000TM. Depois de 24 e 48 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-ribonucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (Instituto Pasteur de São Paulo). Os resultados revelaram que os siRNAs contra o RNA líder do vírus não foram capazes de inibir a replicação do vírus. A utilização dos siRNAs contra mRNA P resultaram em títulos de 3,625logTCID50/ml, 3,875logTCID50/ml e 4,125logTCID50/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 4,0logTCID50/ml nas placas infectadas com PV e período de incubação de 24h. Nas placas infectadas com a amostra 4005 e tratadas com siRNAs, a maior queda de título viral foi na placa tratada com siRNA 360, de 1,0 log, comparando-se com a placa controle de incubação de 24 para a amostra 4005. Nas placas tratadas com siRNA 649 e siRNA 652, também houve a diminuição de título viral, mas em uma escala menor (0,25log e 0,125log, respectivamente) comparando-se com o controle. Nas placas infectadas com PV e incubadas durante 48h, os títulos apresentados foram de 5,625logTCID50/ml, 4,625logTCID50/ml e 4,75logTCID50%/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que na placa controle o título foi 6,0logTCID50C%/ml. A placa com período de incubação de 48h com a amostra 4005 e tratada com siRNA 360 apresentou a maior queda de título viral entre os três siRNAs, o que resultou em 1,125log de diferença. Nas monocamadas onde foram administrados siRNA 649 e siRNA 652, observou-se também uma pequena queda de título viral igual a 0,875log e 0,295log, respectivamente, comparando-se com a placa não tratada. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV e AgV3 em 10DL50% via intracerebral. Duas horas depois da infecção, foi inoculada por via intracerebral uma solução do siRNA 360 com Lipofectamine 2000TM. Os animais com paralisia foram eutanasiados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, eutanasiados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. A utilização do siRNA 360 em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente amostra 4005, enquanto que a mortalidade nos animais não tratados foi de 90%. Nos animais inoculados com a amostra PV e tratados com este siRNA, a sobrevivência foi de 40%, enquanto que no grupo controle a mortalidade foi de 100%. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são capazes de inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiência mais pronunciada para o siRNA 360. In vivo, este siRNA foi capaz de induzir a proteção parcial dos animais inoculados com as duas variantes virais. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva / Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lyssavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian one, more studies on antivirals for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in titres of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. To this end, three siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, and siRNA 649) were used with antisense strands complementary to rabies virus phosphoprotein (P) mRNA and three other (Le 1, Le 2, Le 3) to the leader RNA. Pasteur virus strain (PV) and strain 4005 (AgV3) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of the RNAs with Lipofectamine-2000 TM. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate (Pasteur Insitutte, Brazil). The plates transfected with siRNA against phosphoprotein mRNA were also incubated for 48 hours and subjected to IFD assay. Virus titres were calculated by the Spearman-Karber method. The results showed that siRNAs against virus leader RNA were not able to inhibit the replication of the virus. The use of siRNAs against P mRNA resulting titres of 3.625logTCID50/ml 3.875logTCID50/ml and 4.125logTCID50/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while, for the control plate, the titre was 4.0logTCID50/ml in plates with PV and 24h incubation period. In plates with strain 4005 and treated with siRNAs, the highest viral titre decrease was obtained with siRNA 360, with a 1.0 log difference compared to the control plate of strain 4005 incubated for 24h. The plates treated with siRNA 649 and siRNA 652 have was also shown a decrease in viral titres, but on a smaller scale (0.25log and 0.125log, respectively) compared to the control. The plates infected with PV and incubated for 48 hours showed titre of 5.625logTCID50/ml, 4.625logTCID50/ml and 4.75logTCID50%/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while for the control plate the titre was 6.0logTCID50C%/ml. The plate with strain 4005 and then treated with siRNA360 and incubated for a total of 48h had the highest viral titre decrease among the three siRNAs, which resulted in a 1.125log difference compared to the control plate. In monolayers treated with siRNA649 and siRNA652 there was also a discrete drop in viral titres (0.875log and 0.295log, respectively) compared to the control plate. For the in vivo assay, 21-day old Swiss albino mice weighing between 11 and 14g were intracerebrally inoculated with PV or 4005 strains (10DL50%). Two hours after inoculation, a solution of siRNA360 with Lipofectamine 2000 TM was also intracerebrally injected. Mice presenting paralysis and those that survived the 30 days of observation were euthanized. The central nervous system of all animals was collected and submitted to IFD. The use of siRNA360 in mice resulted in survival of 30% of animals in the group inoculated with strain 4005, whereas 90% mortality was observed in the control group. In animals inoculated with the PV strain, and treated with siRNA360, the survival rate was 40% and in the control group the mortality was 100%. The results of the in vitro assay demonstrate that the siRNAs used are effective in inhibiting the replication of rabies virus with a more intense inhibition regarding siRNA 360. In vivo, this siRNA was able to induce partial protection of animals infected with both viral variants. These results also indicate that, despite the need for further studies, RNAi is a promising technology as antiviral against rabies

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissertacaoRodrigo de Souza Ferreira.pdf: 642792 bytes, checksum: 86337c538eafa655910285127f8e67d3 (MD5) Previous issue date: 2007-10-26 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nïvel Superior / Rabies is an infectious and contagious disease that affects mammals including humans and is present in all the continents except Oceania It is caused by the genus Lyssavirus and is characterized by acute and fatal encephalitis In Brazil rabies is considered endemic but in herbivorous animals it predominates in the states of Minas Gerais and Goiás respectively and in decreasing order The main transmitters of rabies to humans are dogs followed by bats As regards herbiborous animals the main transmitters are hematophagous bats The purpose of this paper was to evaluate the diagnosis of human and animal rabies in the State of Minas Gerais observing by means of statistical analyses of time series the tendency and seasonability of bovine rabies Eight thousand and nine hundred and seven samples were analyzed by means of DIF (direct immmunofluorescence) of several animal species including humans in the 2002-2006 period The samples composed by fragments of nervous tissue came from animals and humans with nervous symptoms and clinical signs of rabies Among the samples 1.533 (17.21%) were DIF positive The DIF negative samples (7.373, or 82.79%) were submitted to the MI (mouse inoculation) examination and gave rabies-positive results in 71 samples (0.96%) Of all the species submitted to DIF and MI examinations the highest number of positive cases occurred in bovines (1.344 cases) followed by equines (140) bats (71) dogs (30) humans (5) swines (4)goats (3)sheeps (3) cats (2) asinines (1) and buffaloes (1)Bovine rabies was statistically analyzed by means of the sign test (Cox-Stuart) adapted to a regression model to determine tendency and the Fisher test to determine seasonability With regard to tendency in bovines a decreasing number of rabies-positive cases was detected at a proportion of 0.1427 cases a month A cyclical seasonability characterized by the existence of 3 annual cycles (January to April May to August and September to December) was also determined where bovine rabies occurred mainly in February (first cycle) July (second cycle) and October (third cycle) with a similar characteristic of each cycle in all the years of the study Bovine rabies was diagnosed in all the 10 macro-regions of Minas Gerais but it was predominant in the South the Center and in the Minas Gerais Triangle (Triângulo Mineiro) The regions with the least number of focuses was the North the Northwest and the Jequitinhonha/Mucuri Valley For controlling bats Desmodus rotundus 5.294 shelters were registered where 39.137 bats of such a species were captured and treated with a bat killing paste Rabies is a disease that needs for its control continuous activities of epidemiological vigilance sanitary education animal immunization and populational control of its transmitters / A raiva é uma enfermidade infecto-contagiosa que acomete os mamíferos inclusive o homem presente em todos os continentes com exceção da Oceania é causada pelo gênero Lyssavirus caracterizando-se por uma encefalomielite aguda e fatal no Brasil a raiva é considerada endêmica apesar de que a raiva dos herbívoros é mais predominante nos estados de Minas Gerais e Goiás respectivamente em ordem decrescente o principal transmissor da raiva ao ser humano é o cão seguido pelos morcegos Os morcegos hematófagos são os principais responsáveis pela transmissão da raiva aos herbívoros Objetivou-se avaliar o diagnóstico da raiva humana e animal no estado de Minas Gerais observando-se por meio de análises estatísticas de séries temporais a tendência e a sazonalidade da raiva bovina Foram analisadas 8.906 amostras por meio da IFD (imunofluorescência direta) de diversas espécies animais inclusive humana no período de 2002 a 2006 As amostras compostas por fragmentos de tecido nervoso eram provenientes de animais e humanos com sintomatologia nervosa e suspeita clínica de raiva Das amostras analisadas 1.533 (17,21%) tiveram resultado positivo pelo exame de IFD As amostras negativas (7.373 que equivalem a 82,79% do total) foram submetidas ao exame de IC (inoculação em camundongos) obtendo resultados positivos para raiva em 71 amostras (0,96% das amostras submetidas à IC) Dentre as espécies submetidas aos exames (IFD e IC) para diagnóstico da raiva a espécie com maior número de casos positivos foi a bovina (1.344 casos) seguida pela eqüina (140) morcegos (71) canina (30) humana (05) suína (04)caprina (03) ovina (03) felina (gatos domésticos com 02 casos) asinina (01) e bubalina (01) A raiva bovina foi submetida a análises estatísticas utilizando-se do teste do sinal (Cox-Stuart) ajustado a um modelo de regressão para determinar a tendência e teste de Fisher para determinar a sazonalidade Quanto à tendência desta enfermidade em bovinos detectou-se a sua existência em caráter decrescente do número de casos positivos de raiva numa proporção de 0,1427 casos por mês Determinou-se também uma sazonalidade cíclica caracterizada pela existência de 3 ciclos anuais (janeiro a abril maio a agosto e setembro a dezembro) sendo os meses de maior ocorrência de raiva bovina os meses de fevereiro (1º ciclo) julho (2º ciclo) e outubro (3º ciclo) e uma característica semelhante de cada ciclo em todos os anos pesquisados A raiva bovina foi diagnostica em todas as 10 macrorregiões de Minas Gerais mas a predominância foi nas regiões Sul Central e Triângulo Mineiro e as regiões com menor número de focos foram a Norte Noroeste e Jequitinhonha/Mucuri Quanto ao controle de morcegos Desmodus rotundus foram cadastrados 5.294 abrigos onde 39.137 morcegos desta espécie foram capturados e tratados com pasta vampiricida A raiva é uma doença que necessita para seu controle de atividades contínuas de vigilância epidemiológica educação sanitária imunização dos animais e controle populacional de seus transmissores

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O desenvolvimento de vacinas contra a raiva tão eficientes quanto as atuais ainda é considerado importante para a profilaxia dessa doença devido ao alto número de mortes por ano no mundo. Este trabalho mostra dois sistemas para a expressão recombinante do principal antígeno da raiva, a glicoproteína viral (RVGP): células Schneider 2 de Drosophila melanogaster estavelmente transfectadas (S2 rRVGP) e vírus Semliki Forest (SFV) carregando o RNA da RVGP (SFVRVGP). Ensaios de purificação por cromatografia de afinidade, da rRVGP de S2 rRVGP produzida em biorreator, demonstraram resultados promissores para o isolamento de monômeros da rRVGP. Para os estudos de imunogenicidade, camundongos foram vacinados com rRVGP de S2 rRVGP e SFV-RVGP. Dosagem de anticorpos anti-glicoproteína do vírus da raiva, neutralizantes, IgG1 e IgG2a, e citocinas demonstraram que o SFV-RVGP induziu predominantemente uma resposta imune do tipo celular e que os dois vetores foram capazes de expressar uma rRVGP imunogênica, apresentando um potencial uso clínico (veterinário e humano). / The development of new and equally efficient rabies vaccines is still considered important to the prophylaxis of the disease, which is responsible for many deaths per year worldwide. This work used two systems for recombinant expression of the major rabies antigen, the viral glycoprotein (RVGP): stably transfected Drosophila melanogaster Schneider 2 cells (S2 rRVGP) and Semliki Forest Virus (SFV) carrying the RNA of RVGP (SFV-RVGP). Purification assays of the rRVGP by metal ion affinity chromatography, from S2 rRVGP cells produced in bioreactor, showed promising results for rRVGP monomers isolation. Analysis of antibodies anti-rabies virus glycoprotein, neutralizing, IgG1 and IgG2a, and citokines showed that the SFV-RVGP induced predominantly a cellular immune response, and both vectors were capable of expressing an immunogenic rRVGP, what reinforces potential clinical applications (veterinary or human).

Este estudo buscou estabelecer um sistema de produção de pps, contendo a proteína Gag do MLV para formação da cápside, as glicoproteínas de membrana E1 e E2 do HCV carregando o RNA da glicoproteína do vírus da raiva - RVGP (ppHCV-RVGP). Para gerar ppHCV-RVGP, células HEK293-T foram co-transfectadas com 3 vetores, utilizando lipofectamina e eletroporação. As ppHCV-RVGP foram coletadas do sobrenadante 48 h p.t e quantificadas por qRT-PCR foram obtidas 300 cópias de RNA/μL, para ambos os métodos de co-transfecção. Células Huh 7 foram infectadas e a expressão da RVGP foi analisada 48 h p.i. por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Estes imunoensaios mostraram a baixa expressão da proteína RVGP. Realizamos ensaios de qRT-PCR para detectar a adesão e entrada da ppHCV-RVGP e verificou-se que a estas foram ineficientes. Realizamos western blotting para analisar a expressão das proteínas necessárias para a formação das ppHCV, este mostrou a produção da proteína Gag e a incorporação das proteínas de membrana, porém a glicoproteína E2 não foi incorporada eficientemente na membrana da ppHCV. Concluímos que o sistema de pseudopartículas virais foi eficiente para transportar o RNA-RVGP, porém não foi capaz de infectar eficientemente células Huh 7. / The aim of this study was to establish a system for the production of pps, containing the protein Gag of MLV to form the capsid, the glycoproteins membrane E1 and E2 of HCV and carrying the RNA of glycoprotein of rabies virus - RVGP (ppHCV-RVGP). To produce ppHCV-RVGP, HEK293-T cells were co-transfected with 3 vectors using lipofectamine and electroporation. The pps were harvested from the supernatant 48 h p.t. and quantificated by qRT-PCR and resulted in 300 copies of RNA/μL, to both methods of co-transfection. Huh 7 cells were infected and RVGP expression was analyzed 48 hours after by ELISA and indirect immunofluorescence (IFI) assays. These immunoassays showed a low expression of RVGP. Others assays of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP showed that this process was inefficient. We performed western blotting assays to analyze the proteins required to form the ppHCV. Western blotting assays that the production of Gag protein and incorporation of glycoproteins were successful, however E2 glycoprotein has not been incorporated efficiently on ppHCV membrane. In conclusion, the system of virus pseudoparticles was efficient in carrying the RNA-RGVP, although was not able to efficiently infect Huh 7 cells.