No Estado de São Paulo, a Coordenadoria de Defesa Agropecuária CDA, Unidade da Administração Direta, subordinada à Secretaria Estadual da Agricultura, foi criada em 1998. Subseqüentemente a elevada freqüência de surtos de raiva paralítica em herbívoros na parte leste do Estado, incluindo as regiões do Vale do Paraíba e Grande São Paulo, entre 1999 e 2001, obrigou mudanças nas estratégias de controle para a doença, que vinha sendo adotada anteriormente no Estado. Em 2001, a vacinação dos herbívoros domésticos foi declarada obrigatória nas regiões sobre a circunscrição dos Escritórios de Defesa Agropecuária EDAs, localizados nas áreas classificadas como áreas epidêmicas e endêmicas para a raiva e com o reforço das medidas de controle direto contra o Desmodus rotundus, morcegos vampiros, utilizando redes de neblina e vampiricidas (pasta nticoagulante), além do registro e do georreferenciamento para a localização dos abrigos, nas regiões estratégicas em ordem contrária a progressão da doença, causando a redução da população de morcegos vampiros e da circulação viral. Neste estudo, foi considerado o número de herbívoros com raiva com confirmação laboratorial e de acordo com o ano de ocorrência, espécie animal, distribuição por EDAs e por Municípios, providenciados pelo Instituto Pasteur de São Paulo. Com respeito à data de 2001, as porcentagens de vacinação, foram agrupadas sem as divisões por EDAs, devido à ausência de dados. A partir de 2002, os dados foram divididos por EDAs, onde a vacinação foi declarada obrigatória e os dados foram discriminados entre estabelecimentos que vacinaram e herbívoros vacinados contra raiva. O número de morcegos vampiros capturados agrupados por EDAs. Analisando as tendências, indicando os estabelecimentos que vacinaram, herbívoros vacinados contra raiva e a quantidade de morcegos vampiros capturados, foi observado um decréscimo nos casos de raiva em 90% ou mais e com estes resultados, concluiu-se que para o controle da raiva nos herbívoros, as medidas adotadas devem ser focadas, primeiramente na vacinação das espécies alvo e no bom planejamento e organização das medidas de controle diretamente nos principais reservatórios de Desmodus rotundus. / In the State of São Paulo, the Coordenadoria de Defesa Agropecuária-CDA, an administrative unit directly subordinated to the State Secretary of Agriculture was established in 1998. Subsequently, the frequent outbreaks of paralytic rabies in herbivores in Eastern part of the State, including the region of Vale do Paraiba and the Greater São Paulo, between 1999 and 2001, have led to change the strategies for controlling the disease being conducted up to that time in the State. In 2001, the vaccination of domestic herbivores was declared obligatory in regions under the jurisdiction of Escritórios de Defesa Agropecuária - EDAs located in areas classified as rabies epidemic and endemic, and by the reinforcement of the control measures directed against the Desmodus rotundus vampire bats by means of joint effort of EDAs to capture and control the bats using mist nets and the vampiricides (anticoagulant paste), besides the registration, revision and the use of geographical information systems to locate the bats roosts and shelters in strategic regions, in order to interrupt the progression of the disease through the reduction of the bat population density and the viral circulation. In this study, it was considered the number of rabies in herbivores with laboratorial confirmation and according to the year of occurrence, animal species, and distributed by EDAs and by municipalities, provided by the Pasteur Institute-São Paulo. Data regarding 2001, the percentages of vaccination were grouped without the division into EDAs, due to the absence of data. From 2002, the data were divided into EDAs where vaccination has been declared obligatory, and data discriminated into properties that vaccinated and herbivores vaccinated against rabies. The number of captured vampire bats was provided by the respective EDAs. By analyzing the trends indicated by the properties that vaccinated against rabies and the herbivores vaccinated and the amount of vampire bats captured, it was observed a decrease in rabies cases in 90% or more, and with these results we conclude that for the control of rabies in herbivores, the easures adopted must be focused primarily in vaccinating the target animal species and in a well planned and organized measures of control directed to the main reservoirs, i.e., the Desmodus rotundus bats.

Morcegos vêm recebendo crescente importância em Saúde Pública, pois são os principais reservatórios para a raiva em diversas partes do mundo. Estudos filogenéticos baseados no gene N demonstraram que os vírus da raiva (RABV) encontrados em morcegos frugívoros Artibeus spp. são próximos àqueles associados ao morcego hematófago Desmodus rotundus, mas pouco se conhece sobre a diversidade genética do RABV nestes morcegos. Este estudo teve como objetivos avaliar a filogenia de linhagens do RABV variante três (AgV3) relacionadas a morcegos Artibeus spp. e D. rotundus, com base em sequências do gene N e do gene G, e a possibilidade de distinção entre isolados de vírus da raiva detectadas em Artibeus spp. e D. rotundus para a epidemiologia molecular da raiva. Vinte amostras do RABV isoladas de Artibeus spp. e 15 obtidas de bovinos e relacionadas ao D. rotundus, todos do Estado de São Paulo, Brasil, foram submetidas a RT -PCRs, e os amplicons gerados submetidos ao sequenciamento de DNA, e as sequências alinhadas com sequências homólogas obtidas do GenBank para a construção de árvores Neighbor-Joining de nucleotídeos (modelo MCL) e aminoácidos (modelo Poisson), utilizando European bat lyssavirus 1 (EBLV1) como outgroup. A árvore filogenética gerada para o gene N demonstrou a formação de três grupos apoiados em bootstraps de no mínimo 60%. Estes grupos foram denominados como grupo D, exclusivamente com isolados relacionadas ao D. rotundus e A1 e A2 principalmente com isolados de Artibeus spp., enquanto que para o gene G, segregaram em duas linhagens, ou seja, relacionadas ao D. rotundus (grupo D) e relacionadas ao Artibeus spp. (grupo A). Para todos os grupos as identidades de aminoácidos foram superiores às de nucleotídeos, uma indicação da predominância de substituições sinônimas. Concluindo, padrões gênero-específicos para isolados do RABV AgV3 foram detectados em D. rotundus e Artibeus spp., com uma topologia concordante para linhagens fixas em cada um destes quirópteros. Estes resultados mostram uma intrincada relação com o hospedeiro na história evolutiva do RABV, sob o ponto de vista básico, como também a determinação das fontes de infecções na epidemiologia molecular da raiva. / Bats have been assigned an increasing importance in Public Health as these are the main rabies reservoirs in many parts of the world. Phylogenetic studies based on the N gene have shown that rabies virus (RABV) strains from Artibeus spp. frugivorous bats are closely associated to those from the vampire bat Desmodus rotudus, but little is known about the genetic diversity of RABV in these bats. This study aimed to assess the phylogeny of RABV strains from the antigenic variant 3 (AgV3) from these bats based on N and G sequences and to evaluate the possibility of distinction between RABV lineages of these for the molecular epidemiology of rabies. Twenty RABV strains isolated from Artibeus spp. bats and 15 obtained from cattle and related to D. rotundus, all from Sao Paulo State, Brazil, were submitted to RT-PCRs to the N and G genes amplifications and the amplicons were submitted to cycle sequencing; the sequences were aligned with homologous sequences retrieved from the Genbank for the construction of Neighbor-Joining trees for nucleotides (MCL model) and amino acids (Poisson model) with European bat lyssavirus 1 (EBLV1) as outgroup. N gene tree showed three major clusters with bootstraps 60% and named as clusters D, exclusively with strains related to D. rotundus and A1 and A2, chiefly with Artibeus spp. strains while for the G gene only two lineages, i.e., D. rotundus related (cluster D) and Artibeus-related (cluster A) were formed. For all the groups the amino acids identities were superior to the nucleotides identities, an indication of the predominance of synonymous substitutions. As a conclusion, genus specific lineages of AgV3 RABV have been detected in D. rotundus and Artibeus spp. bats with a concordant topology for fixed strains for each of these two bat genus. These results not only show an intricate host-relationship of RABV evolutionary history on the basic point of view, but have an invaluable application for the determination of sources of infections in rabies molecular epidemiology.

Os óleos vegetais são matérias primas de fontes renováveis. São metabolizáveis, biodegradáveis, de fácil disponibilidade e baixo custo. A necessidade de adjuvantes vacinais seguros e que possam modular a resposta imunológica Th1/Th2, favorece a busca por novas substâncias que assim se comportem. Este trabalho tem o objetivo de avaliar e identificar óleo vegetal capaz de mimetizar ação adjuvante dos óleos minerais comercialmente usados e modular a resposta imune. Foram realizados testes de toxicidade aguda in vivo, testes de formação de emulsões, de estabilidade, de qualidade e, por fim, de imunogenicidade com formulações com o vírus rábico. Algumas formulações derivadas dos óleos de girassol, canola e buriti se mostraram não tóxicas, estáveis e de boa qualidade. Os grupos de camundongos inoculados com estas formulações obtiveram respostas imunológicas que apoiam sua capacidade adjuvante, não diferenciando significativamente (p<0,05) dos resultados do óleo mineral comercial. Concluiu-se que é possível elaborar emulsões estáveis não tóxicas a partir de óleos vegetais para sua utilização como veículos e adjuvantes vacinais. Formulações vacinais em forma de emulsões de óleos vegetais, compostas na sua maior parte pelos óleos de girassol e de canola possuem potência e atividade adjuvante semelhantes e tão eficientes quanto aos do óleo mineral. Os óleos vegetais devem estar em seu estado bruto ou semirrefinado, sem a adição de antioxidantes e conservantes. Por último, parece haver uma tendência de equilíbrio de resposta Th1/Th2 para as formulações com óleos vegetais. / Vegetable oils are renewable raw materials. These substances are metabolizable, biodegradable, of easy availability and low cost. The need for safe vaccine adjuvants that can modulate the Th1/Th2 immune response drives the search for new substances with similar behavior. This study aims to evaluate and identify a vegetable oil able to mimic the adjuvant action of the mineral oils used commercially, and modulate the immune response. There were performed tests of in vivo acute toxicity, emulsion formation, stability, quality and immunogenicity with formulations with rabies virus. Some formulations derived from the sunflower, canola and buriti oils proved to be non-toxic, stable and of good quality. Groups of mice inoculated with these formulations had immune responses supporting their adjuvant capacity, not differing significantly (p <0.05) from the results of the commercial mineral oil. It was concluded that it is possible to prepare stable non-toxic emulsions from vegetable oils to be used as vaccine adjuvants and vehicles. Vaccine formulations as emulsions from vegetable oil, composed mostly by the oils of sunflower and canola had adjuvant activity and potency similar to and as effective as the mineral oil. The vegetable oils should be in its raw state or semi refined, without the addition of antioxidants and preservatives. Finally, there seems to be a tendency to balance Th1/Th2 response by formulations with vegetable oils.

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lyssavirus. Ultimamente, o Protocolo de Milwaukee é a base do tratamento humano, com indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, embora tenha sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aperfeiçoamentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para este fim, foram utilizados três siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, siRNA 649) com a fita antisenso complementar ao mRNA da fosfoproteína (P) e três siRNAs (Le 1, Le 2, Le 3) contra o RNA líder do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas as amostras PV e 4005 (AgV3) do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com as amostras PV ou 4005 e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000TM. Depois de 24 e 48 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-ribonucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (Instituto Pasteur de São Paulo). Os resultados revelaram que os siRNAs contra o RNA líder do vírus não foram capazes de inibir a replicação do vírus. A utilização dos siRNAs contra mRNA P resultaram em títulos de 3,625logTCID50/ml, 3,875logTCID50/ml e 4,125logTCID50/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 4,0logTCID50/ml nas placas infectadas com PV e período de incubação de 24h. Nas placas infectadas com a amostra 4005 e tratadas com siRNAs, a maior queda de título viral foi na placa tratada com siRNA 360, de 1,0 log, comparando-se com a placa controle de incubação de 24 para a amostra 4005. Nas placas tratadas com siRNA 649 e siRNA 652, também houve a diminuição de título viral, mas em uma escala menor (0,25log e 0,125log, respectivamente) comparando-se com o controle. Nas placas infectadas com PV e incubadas durante 48h, os títulos apresentados foram de 5,625logTCID50/ml, 4,625logTCID50/ml e 4,75logTCID50%/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que na placa controle o título foi 6,0logTCID50C%/ml. A placa com período de incubação de 48h com a amostra 4005 e tratada com siRNA 360 apresentou a maior queda de título viral entre os três siRNAs, o que resultou em 1,125log de diferença. Nas monocamadas onde foram administrados siRNA 649 e siRNA 652, observou-se também uma pequena queda de título viral igual a 0,875log e 0,295log, respectivamente, comparando-se com a placa não tratada. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV e AgV3 em 10DL50% via intracerebral. Duas horas depois da infecção, foi inoculada por via intracerebral uma solução do siRNA 360 com Lipofectamine 2000TM. Os animais com paralisia foram eutanasiados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, eutanasiados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. A utilização do siRNA 360 em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente amostra 4005, enquanto que a mortalidade nos animais não tratados foi de 90%. Nos animais inoculados com a amostra PV e tratados com este siRNA, a sobrevivência foi de 40%, enquanto que no grupo controle a mortalidade foi de 100%. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são capazes de inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiência mais pronunciada para o siRNA 360. In vivo, este siRNA foi capaz de induzir a proteção parcial dos animais inoculados com as duas variantes virais. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva / Rabies is a zoonotic disease that affects all mammals and causes more than 55.000 human deaths every year, caused by rabies virus (RABV) a virus of the Mononegavirales order, Family Rhabdoviridae and the Lyssavirus genus. After the onset of the symptoms, the illness has a fast progression and the patients feel intense physical suffering. Currently, human rabies treatment has been based on the Milwaukee Protocol which consists on the induction of coma and massive antiviral therapy. Despite this protocol has been successful in two cases, including a Brazilian one, more studies on antivirals for human rabies treatment are required. RNA interference is a new antiviral approach, which gives hope to the possibility of rabies antiviral treatment. The aim of this study was to assess the decrease in titres of rabies virus in vitro and in vivo using short-interfering RNAs. To this end, three siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, and siRNA 649) were used with antisense strands complementary to rabies virus phosphoprotein (P) mRNA and three other (Le 1, Le 2, Le 3) to the leader RNA. Pasteur virus strain (PV) and strain 4005 (AgV3) of rabies virus and BHK-21 cells were used, and the monolayers were transfected with each of the RNAs with Lipofectamine-2000 TM. After 22 hours, the siRNA-treated and the control plates were tested by direct fluorescent antibody test (DFAT) with anti-rabies virus nucleocapsid antibody conjugate with fluorescein isothiocianate (Pasteur Insitutte, Brazil). The plates transfected with siRNA against phosphoprotein mRNA were also incubated for 48 hours and subjected to IFD assay. Virus titres were calculated by the Spearman-Karber method. The results showed that siRNAs against virus leader RNA were not able to inhibit the replication of the virus. The use of siRNAs against P mRNA resulting titres of 3.625logTCID50/ml 3.875logTCID50/ml and 4.125logTCID50/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while, for the control plate, the titre was 4.0logTCID50/ml in plates with PV and 24h incubation period. In plates with strain 4005 and treated with siRNAs, the highest viral titre decrease was obtained with siRNA 360, with a 1.0 log difference compared to the control plate of strain 4005 incubated for 24h. The plates treated with siRNA 649 and siRNA 652 have was also shown a decrease in viral titres, but on a smaller scale (0.25log and 0.125log, respectively) compared to the control. The plates infected with PV and incubated for 48 hours showed titre of 5.625logTCID50/ml, 4.625logTCID50/ml and 4.75logTCID50%/ml for siRNAs 360, 649 and 652, respectively, while for the control plate the titre was 6.0logTCID50C%/ml. The plate with strain 4005 and then treated with siRNA360 and incubated for a total of 48h had the highest viral titre decrease among the three siRNAs, which resulted in a 1.125log difference compared to the control plate. In monolayers treated with siRNA649 and siRNA652 there was also a discrete drop in viral titres (0.875log and 0.295log, respectively) compared to the control plate. For the in vivo assay, 21-day old Swiss albino mice weighing between 11 and 14g were intracerebrally inoculated with PV or 4005 strains (10DL50%). Two hours after inoculation, a solution of siRNA360 with Lipofectamine 2000 TM was also intracerebrally injected. Mice presenting paralysis and those that survived the 30 days of observation were euthanized. The central nervous system of all animals was collected and submitted to IFD. The use of siRNA360 in mice resulted in survival of 30% of animals in the group inoculated with strain 4005, whereas 90% mortality was observed in the control group. In animals inoculated with the PV strain, and treated with siRNA360, the survival rate was 40% and in the control group the mortality was 100%. The results of the in vitro assay demonstrate that the siRNAs used are effective in inhibiting the replication of rabies virus with a more intense inhibition regarding siRNA 360. In vivo, this siRNA was able to induce partial protection of animals infected with both viral variants. These results also indicate that, despite the need for further studies, RNAi is a promising technology as antiviral against rabies

A raiva é uma zoonose que afeta o sistema nervoso central, de evolução aguda e fatal, mantida em mamíferos e conhecida há milênios. Presente na América, Europa, África e Ásia, tem como agente etiológico o vírus da raiva (RABV), um vírus RNA neurotrópico, pertencente à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus., o qual é composto por quatorze espécies. Entre os Lyssavirus, o RABV é o mais amplamente distribuído mundialmente e tem maior importância epidemiológica dada sua associação com um maior número de casos de encefalite por Lyssavirus em humanos em relação às outras espécies. São admitidos dois ciclos de transmissão para a raiva, o ciclo urbano e o ciclo silvestre. O ciclo urbano ou terrestre tem o cão como principal reservatório e transmissor do vírus para outros cães, outros animais domésticos e para o homem, enquanto o ciclo silvestre ou aéreo é mantido por diferentes mamíferos silvestres e quirópteros. A origem comum dos dois ciclos do RABV á partir de um RABV ou Lyssavirus ancestral e a divergência adaptativa ocorrida desde então, causada pela adaptação de tal vírus em paisagens adaptativas tão variadas e distintas representadas pelas ordens Carnivora e Chiroptera, levaram ao surgimento das diversas linhagens encontradas nos ciclos terrestre e aéreo. Sendo assim, com o objetivo de se estudar as diferenças geradas nos RABV dos ciclos aéreo e terrestres devido a sua evolução em paralelo nestas duas ordens foram analisadas 159 sequências genômicas do RABV (59 do ciclo terrestre e 100 do ciclo aéreo), sendo que 21 destas sequências foram obtidas neste estudo e representam oito linhagens de RABV existentes no Brasil e cinco destas linhagens de RABV tiveram seus genomas sequenciados pela primeira vez. Foram analisados aspectos como as diferentes taxas de substituição de nucleotídeos por sítios (heterotaquia) entre os mesmos genes do RABV mantidos no ciclo aéreo e terrestre, análise do melhor gene para a realização de estudo filogenéticos confiáveis para o RABV, tempo de divergência entre os ciclos, padrões de variabilidade genética e vieses quanto ao uso preferencial de códons em cada ciclo. Como resultado, concluí-se que a divergência adaptativa ocorrida entre os dois ciclos do RABV fez com que alguns aspectos evolutivos de seu genoma apresentem padrões diferentes de acordo com o ciclo do RABV analisado. / Rabies is a zoonosis that affects the central nervous system, showing an acute and fatal evolution, occurring in mammals and known for millennia. Present in America, Europe, Africa and Asia, its etiological agent is Rabies virus (RABV), a neurotropic RNA virus in the order Mononegavirales, family Rhabdoviridae, genus Lyssavirus, composed by fourteen species. Amongst the lyssaviruses, RABV is the most widely spread worldwide and has a higher epidemiological importance due to its association to a higher number of cases of encephalitis. Two cycles are accepted for rabies transmission, the urban and the wild ones. In the urban (or terrestrial) cycle, dogs are the main reservoirs and transmitters of the virus to other dogs, other domestic animals and to humans, while in the wild (or aerial) cycle bats are the reservoirs. The common origin of both cycles from an ancestor RABV or lyssavirus and the adaptive divergence that occurred since then, caused by the adaptation of this ancestor virus to a wide range of adaptive landscapes represented by the orders Carnivora and Chiroptera led to the emergence of diverse RABV lineages currently found in the aerial and terrestrial cycles. Thus, aiming to study differences found in RABV lineages from the aerial and terrestrial cycles due to their parallel evolution in these two orders, 159 genomic sequences of RABV (59 from the terrestrial and 100 from the aerial cycles) were analyzed, being 21 of these sequences referent to eight lineages of RABV found in Brazil sequenced in this study and five of these eight lineages of RABV had their genomes sequenced for the first time The study included the per site nucleotide substitution rate differences (heterotachy) between the same genes RABV maintained in the aerial and terrestrial, survey of the most suitable gene for phylogenetic analysis, time of divergence between the two cycles, patterns of genetic variability and codon usage bias. As a conclusion, the adaptive divergence occurred between the two cycles caused some evolutionary aspects of RABV genome to show an intricate cycle-specific evolutionary pattern.

Com o controle da raiva nos cães do Estado de São Paulo nos últimos 20 anos, a raiva em animais silvestres, sobretudo nos quirópteros, assume crescente importância, visto que, atualmente, estes são os principais reservatórios para a raiva neste Estado. Apesar dos morcegos manterem ciclos epidemiológicos da raiva há centenas de anos, somente a partir da década de 50 a raiva em morcegos insetívoros foi reconhecida como um problema de saúde publica. Desde então foram feitos muitos avanços na compreensão da raiva nestes animais. Atualmente, o vírus da raiva (RABV) já foi detectado em 37 espécies de morcegos brasileiros, tendo sido determinadas quatro linhagens genéticas específicas associadas a quatros gênero/espécies destes morcegos, três destas exclusivas de morcegos insetívoros. Entretanto, apesar da importância da raiva em morcegos insetívoros, estudos voltados a um conhecimento mais amplo das implicações da diversidade de amostras de RABV detectadas nos mesmos aplicados à Epidemiologia Molecular são escassos. Assim, a presente investigação teve por objetivos estabelecer genealogias para amostras de RABV isoladas de diversas espécies de morcegos insetívoros do Estado de São Paulo a partir de seqüências parciais dos genes N (40 amostras) e G (45 amostras), avaliar a existência de linhagens gênero-específicas do RABV e determinar os marcadores moleculares para sua diferenciação. Foram encontradas linhagens específicas de RABV para os gêneros Myotis, Epitesicus e Nyctinomops e três prováveis linhagens circulantes nos gêneros Tadarida, Histiotus e Lasiurus. Além disso, esta pesquisa revelou marcadores moleculares de aminoácidos específicos para os gêneros Myotis, Eptesicus e Nyctinomops, contribuindo para um melhor entendimento da epidemiologia molecular da Raiva e da relação entre o RABV e gêneros diversos de quirópteros. / As a result of the control of canine rabies in São Paulo State in the last 20 years, rabies in wild animals, mainly in bats, has assumed an increasing importance as the last are currently the most important rabies reservoirs in this State. Despite the fact that bats have maintained epidemiological cycles of rabies for centuries, only in the 50s rabies in insectivorous bats was recognized as a threat for Public Health and several advances have been achieved since then for the comprehension of rabies in these animals. Rabies virus (RABV) has already been detected in 37 species of Brazilian bats and four specific genetic lineages associated to four genera/ species of bats have been determined, three of these exclusive to insectivorous bats. Nonetheless, despite the importance of insectivorous bats rabies, studies on a more comprehensive knowledge on the implications of the diversity of RABV strains detected on these are scarce. Thus, the present investigation aimed to establish genealogies for RABV strains isolated from diverse species from insectivorous bats from São Paulo State based on partial N (40 strains) and G (45 strains ) genes, assess the existence of genus-specific lineages of RABV and to determine molecular markers for its differentiation. Specific RABV lineages where found for the genera Myotis, Epitesicus and Nyctinomops and three other probable lineages circulating in the genera Tadarida, Histiotus and Lasiurus where found as well. Furthermore, this investigation revealed amino acids molecular markers for the genera Myotis, Eptesicus and Nyctinomops, contributing to a better understanding of rabies molecular epidemiology and the relationship amongst RABV and diverse genera of bats.

O comportamento biológico de uma amostra de vírus recém-isolada de eqüino (M82-02), procedente de uma região próxima de São Paulo, foi estudado em camundongos, inoculados pelas vias intracerebral e intramuscular, avaliando-se as características relacionadas com a infectividade, patogenicidade, período de incubação, período do curso clínico e capacidade invasiva do vírus para outros tecidos não-nervosos. A amostra, com uma passagem em cérebro de camundongos, foi tipificada antigenicamente, utilizando um conjunto de anticorpos monoclonais (MABs), desenvolvido pela \"Canadian Food and Inspection Agency\", de Ottawa, Canadá, correspondendo ao perfil de morcego hematófago Desmodus rotundus. Após ser submetida à extração do material genético, a amostra foi caracterizada geneticamente no \"National Institute of Infectious Diseases\", de Tóquio, Japão, confirmando pertencer ao genótipo 1 do gênero Lyssavirus, com característica próxima a do \"Vampire -bat related virus-VRRV\", comuns entre as amostras brasileiras isoladas de herbívoros e morcegos hematófagos. As sucessivas passagens da amostra em camundongos, por via intracerebral e intramuscular, provocaram ligeiro aumento no título do vírus e estabilização do período de incubação, quando então foi utilizado como antígeno para a prova de soroneutralização, para avaliar o comportamento deste vírus frente aos soros de eqüinos vacinados com uma vacina comercial de vírus PV inativado. Os soros de eqüinos vacinados foram titulados em paralelo com o antígeno viral constituído de vírus CVS. Com o uso da amostra M82-02 como antígeno para a prova de soroneutralização não foi possível demonstrar diferença significativa, quando comparado com o antígeno fixo de vírus CVS, no entanto, alguns soros de eqüinos vacinados foram encontrados com níveis de anticorpos acima de 0,5UI/mL. Pela prova de imunofluorescência direta (IFD), a presença do antígeno do vírus da raiva foi evidenciada no pulmão e nos rins de animais inoculados por via IM, notadamente nos materiais de passagem mais elevada. No teste de avaliação da vacina comercial, pelo método do CDC de Atlanta, o resultado do desafio com a amostra M82-02 foi inferior ao do vírus fixo CVS, no entanto, este método ainda necessita ser melhorado para sua utilização na rotina. / The biologic behavior of a rabies virus recently isolated from an equine raised at a region neighbor to São Paulo, Southeast Brazil, the isolate M82-02, was studied in mice by inoculating through intracerebral and intramuscular route, for evaluation of characteristics related to its infectivity, pathogenicity, incubation period and course of clinical illness and also the virus capacity to invade other non-nervous tissues. The first intracerebrally passaged mouse brain was submitted for antigenic typing by using a set of monoclonal antibodies (MABs) prepared at the Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canada, and it was found to be a variant of vampire-bat related rabies virus. After extraction of genetic material, the sample was characterized genetically at the National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan, ant the isolate belonged to genotype 1 of the Lyssavirus gene, closely related to the Vampire-bat related virus group-VRRV, common among the Brazilian rabies virus isolates from herbivores and vampire bat Desmodus rotundus. The successive intracerebral and intramuscular passages in mice provoked a slight increase in the virus titer, and the stabilization of the incubation period. In its 10th passage, the isolate was used as the antigen in mouse serum neutralization test, for the assessment of equine sera which had been vaccinated with a commercial PV rabies inactivated virus vaccine, the equine sera were tested in parallel with the CVS strain and some sera were found with neutralizing titer >0.5 IU/mL. Using the isolate M82-02 of rabies virus as an antigen in the neutralization test, no significant difference could be detected, when the results were compared to that of the CVS strain. By means of direct fluorescent antibody (dFA) test, the presence of rabies virus antigen was detected in tissues of brain, lung and kidneys of mice inoculated by intramuscular route, especially in serially passaged materials. The CDC-potency test for evaluation of a commercial vaccine using the field isolate M82-02 as a challenge virus showed a poorer result than the challenge with the fixed CVS strain, however, this method needs further modifications for the routine use.

Os óleos vegetais são matérias primas de fontes renováveis. São metabolizáveis, biodegradáveis, de fácil disponibilidade e baixo custo. A necessidade de adjuvantes vacinais seguros e que possam modular a resposta imunológica Th1/Th2, favorece a busca por novas substâncias que assim se comportem. Este trabalho tem o objetivo de avaliar e identificar óleo vegetal capaz de mimetizar ação adjuvante dos óleos minerais comercialmente usados e modular a resposta imune. Foram realizados testes de toxicidade aguda in vivo, testes de formação de emulsões, de estabilidade, de qualidade e, por fim, de imunogenicidade com formulações com o vírus rábico. Algumas formulações derivadas dos óleos de girassol, canola e buriti se mostraram não tóxicas, estáveis e de boa qualidade. Os grupos de camundongos inoculados com estas formulações obtiveram respostas imunológicas que apoiam sua capacidade adjuvante, não diferenciando significativamente (p<0,05) dos resultados do óleo mineral comercial. Concluiu-se que é possível elaborar emulsões estáveis não tóxicas a partir de óleos vegetais para sua utilização como veículos e adjuvantes vacinais. Formulações vacinais em forma de emulsões de óleos vegetais, compostas na sua maior parte pelos óleos de girassol e de canola possuem potência e atividade adjuvante semelhantes e tão eficientes quanto aos do óleo mineral. Os óleos vegetais devem estar em seu estado bruto ou semirrefinado, sem a adição de antioxidantes e conservantes. Por último, parece haver uma tendência de equilíbrio de resposta Th1/Th2 para as formulações com óleos vegetais. / Vegetable oils are renewable raw materials. These substances are metabolizable, biodegradable, of easy availability and low cost. The need for safe vaccine adjuvants that can modulate the Th1/Th2 immune response drives the search for new substances with similar behavior. This study aims to evaluate and identify a vegetable oil able to mimic the adjuvant action of the mineral oils used commercially, and modulate the immune response. There were performed tests of in vivo acute toxicity, emulsion formation, stability, quality and immunogenicity with formulations with rabies virus. Some formulations derived from the sunflower, canola and buriti oils proved to be non-toxic, stable and of good quality. Groups of mice inoculated with these formulations had immune responses supporting their adjuvant capacity, not differing significantly (p <0.05) from the results of the commercial mineral oil. It was concluded that it is possible to prepare stable non-toxic emulsions from vegetable oils to be used as vaccine adjuvants and vehicles. Vaccine formulations as emulsions from vegetable oil, composed mostly by the oils of sunflower and canola had adjuvant activity and potency similar to and as effective as the mineral oil. The vegetable oils should be in its raw state or semi refined, without the addition of antioxidants and preservatives. Finally, there seems to be a tendency to balance Th1/Th2 response by formulations with vegetable oils.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08Bitstream added on 2014-06-13T18:55:56Z : No. of bitstreams: 1 babboni_sd_me_botfmvz.pdf: 464043 bytes, checksum: 4a0150fc7d07e50de496056f29b69fbc (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Raiva é uma zoonose de distribuição mundial, causada por um vírus do gênero Lyssavirus transmitida ao homem por mamíferos por meio da inoculação do vírus existente na saliva do animal infectado, com prognóstico fatal em quase 100% dos casos. Mundialmente, o cão infectado é responsável por 99% dos casos de raiva humana e por 92% dos tratamentos pós-exposição. Já no Brasil, o cão raivoso é historicamente o responsável por 40% das mortes humanas. O controle da Raiva em animais de companhia por meio da vacinação em massa deve culminar com a quebra do elo epidemiológico de transmissão da doença e, consequentemente, a diminuição dos casos de Raiva humana. Com o objetivo de avaliar a imunidade ativa de cães primovacinados na campanha anual de vacinação contra a Raiva na zona urbana do município de Botucatu/SP, foram analisados 576 soros caninos, colhidos em cinco momentos diferentes. A técnica utilizada para quantificação dos títulos de anticorpos antirrábicos neutralizantes foi a inibição de focos de fluorescência rápida (RFFIT). Os resultados foram analisados pelo teste Goodman. Os resultados apresentados permitiram concluir que do total dos animais pesquisados, 51,5% dos cães tiveram título antirrábico protetor durante todo o período de um ano e que para a manutenção de títulos ≥0.5 UI/mL nos cães até a próxima campanha de vacinação antirrábica, deve ser realizada uma dose da vacina 180 dias após a primovacinação / Rabies is a worldwide zoonoses caused by a virus from Lyssavirus gender, transmitted to humans by mammals through the inoculation of the virus present in the saliva of infected animal, with fatal prognosis in almost 100% of the cases. Worldwide, the infected dog is responsible for 99% of the human cases and by 92% of post-exposition treatments. In Brazil, rabid dog is historically the responsible by 40% of human deaths. Rabies control in companion animals by mass vaccination must culminate in the break of the epidemiological link of disease transmission and, consequently, decreasing human cases of rabies. The aim of the present study was to evaluate the active immunity of primo vaccinated dogs in annual vaccination campaign against rabies in urban area of Botucatu/SP, using 576 canine serum samples, collected in five different moments. The technique used to quantify antibodies titers against rabid virus was rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT). Results were analyzed by Goodman test. Results allowed to conclude that from all studied animals, 51.5% had protector antirabies titer during the period o fone yaer and to keep titer ≥0.5 UI/mL in dogs until next campaign must be done a dose of vaccination 180 days after primo vaccination

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1835.pdf: 1426469 bytes, checksum: f474e4a11463f269c448f21cb7cd2ed6 (MD5) Previous issue date: 2008-03-14 / Universidade Federal de Sao Carlos / The increment of the expression of complex correctly processed recombinant proteins, like the ones produced by animal cells, is essential for the development of an efficient large scale bioprocess. The manipulation of culture conditions plays a very important role in the controlled and optimized expression of these proteins in bioreactors. The response of mammalian and insect cells to temperature effect has been studied by several researchers as a potential strategy to enhance production of recombinant proteins. The present study evaluated the influence of the temperature in the culture of recombinant Drosophila melanogaster S2 cells in Sf-900 II medium supplemented with aminoacids with the aim of enhancing the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP). The cultures were carried out in Schott flasks (in shaker) as well as in a bubble-free stirred tank bioreactor. Five temperatures were tested in Schott flasks cultures: 16, 20, 24, 28 and 34ºC. The results obtained in cultures at those temperatures in terms of maximum specific growth rate (µmax) and maximum RVGP concentration (CGPV max) were, respectively: 0.009, 0.020, 0.039, 0.036 and 0.022 h-1, and 0.075, 2.973, 0.480, 1.404 and 0.013 mg.mL-1. The best temperature for RVGP production (20oC) was chosen to be evaluated in the bioreactor operated in batch and feed-batch mode, keeping 28oC as control. The results of µmax and CGPV max in batch mode were: 0,061 h-1 and 0,149 mg.mL-1 at 28oC and 0,027 h-1 and 0.354 mg.mL-1 at 20oC. A batch experiment with stepwise temperature decrease from 20ºC to 16ºC presented a µmax ranging from 0.024 to 0.012 h-1 and a final CGPV max of 0.567 mg.mL-1. On the other hand, at 20ºC in feed-batch mode, µmax was 0.024 h-1 and CGPV max 1.155 mg.mL-1. The larger production of RVGP observed in Schott flasks can be a consequence of a more favorable condition for the expression of the protein at low values of dissolved oxygen concentrations that are seen in flasks but not in controlled bioreactor cultures at 50% DO. Overall, these results show an increase of recombinant protein expression at lower temperatures, especially when µmax is kept fairly low. The largest production of RVGP was obtained in the culture at 20°C in Schott flask when CGPV max was 2.973 mg.mL-1, while the production obtained at the control temperature of 28ºC was only of 1.404 mg.mL-1. Thus, the use of reduced culture temperatures, around 20°C, seems to be the best strategy for the optimization of RVGP production. / aumento da expressão de proteínas recombinantes complexas corretamente processadas como as produzidas por células animais é essencial para o desenvolvimento de um bioprocesso eficiente em larga escala. A manipulação das condições de cultivo desempenha um papel muito importante na expressão otimizada e controlada dessas proteínas em biorreatores. A resposta de células de mamíferos e de insetos quando submetidas ao efeito da temperatura vem sendo estudada por vários pesquisadores como estratégia potencial para o aumento de expressão de proteínas recombinantes. No presente trabalho propõe-se avaliar a influência da temperatura no cultivo celular com o propósito de intensificar a produção da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) em cultivo de células de Drosophila melanogaster S2 recombinante em meio de cultura Sf900-II suplementado com aminoácidos, em frascos Schott (em shaker) e em biorreator de tanque agitado livre de bolhas. Para tal, foram avaliadas cinco temperaturas de cultivo em frasco Schott: 16, 20, 24, 28 e 34ºC. Os resultados obtidos de velocidade específica de crescimento máxima (µmax) nesses cultivos foram, respectivamente: 0,009, 0,020, 0,039, 0,036 e 0,022 h-1, e de concentração máxima de GPV (CGPV max): 0,075, 2,973, 0,480, 1,404 e 0,013 mg.mL-1. A melhor temperatura para produção de GPV (20oC) foi escolhida para ser testada em biorreator operado em batelada e batelada alimentada, mantendo 28oC como controle. Os resultados de µmax e CGPV max em batelada foram: 0,061 h-1 e 0,149 mg.mL-1 a 28oC e 0,027 h-1 e 0,354 mg.mL-1 a 20oC. Um experimento em batelada com temperatura decrescente em etapas de 20ºC a 16oC apresentou um µmax variando de 0,024 a 0,012 h-1 e uma CGPV max final de 0,567 mg.mL-1. Por outro lado, a 20ºC em batelada alimentada, µmax foi de 0,024 h-1 e CGPV max de 1,155 mg.mL-1. A maior produção de GPV observada em frascos Schott pode ser conseqüência de uma condição mais favorável para expressão da proteína em condições de baixa concentração de oxigênio dissolvido como as usuais em frascos Schott mas não em cultivos em biorreator com oxigênio dissolvido controlado a 50%. Em geral, estes resultados mostram uma maior expressão da proteína recombinante nas temperaturas mais baixas, especialmente quando µmax é mantido razoavelmente baixa. A maior produção de GPV foi obtida no cultivo realizado a 20ºC em frasco Schott quando CGPV max=2,973 mg.mL-1 em comparação a 1,404 mg.mL-1 obtida no cultivo controle a 28ºC. Assim, a utilização de temperaturas de cultivo mais baixas, próximas de 20ºC, pode ser considerada a melhor estratégia na otimização da produção de GPV.