Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-24Bitstream added on 2014-06-13T18:45:17Z : No. of bitstreams: 1 ferraz_alj_dr_jabo.pdf: 613372 bytes, checksum: 0c16778d62f1e6d94f350b8efbbbd6d8 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A divergência genética entre Bos taurus taurus e Bos taurus indicus é estimada em ~ 250.000 anos mas, apesar dessa proximidade filogenética, estes dois grupos de bovinos apresentam diferenças marcantes em relação à taxa de crescimento muscular e a maciez da carne. De maneira que este estudo foi delineado para avaliar perfil da expressão gênica diferencial no musculo Longissimus dorsi das raças Nelore e Aberdeen Angus com o objetivo de identificar conjuntos de genes cuja expressão está associada à manifestação das características acima mencionadas. Vinte bezerros machos de cada raça foram criados e terminados em regime de confinamento, metade dos quais foi abatida aos 15 e a metade restante aos 19 meses de idade. Nossos resultados sugerem fortemente que a ação autócrina e/ou parácrina do IGF-1 produzido no tecido muscular deve exercer um papel crucial na modulação da taxa de crescimento muscular e na maciez da carne de bovinos. Por outro lado, nossa análise das redes de interação gênica mostrou um grande número de genes que codificam proteínas que agem na proteólise muscular, pequeno número de inibidores e reguladores de proteases, assim como diversos genes relacionados com a morte celular programada nos animais que apresentaram maior maciez da carne, reforçando a hipótese do envolvimento de um complexo multi-enzimático (incluindo as calpaínas e outras proteases) no processo de amaciamento da carne, o qual seria semelhante ao processo de apoptose. / The genetic divergence between Bos taurus taurus and Bos taurus indicus is estimated to be ~ 250.000 years but, in despite of their phylogenetic proximity, this two bovine groups show remarkable differences in regard to the muscle growth rate and meat tenderness. Thus, this study was aimed to evaluate the differential gene expression profile in Longissimus dorsi muscle of Nellore and Aberdeen Angus breeds in order to identify set of genes whose expression is associated with the manifestation of the above-mentioned traits. Twenty male calves of each breed were grown and finished in the feedlot system, half of which was slaughtered at 15 and the remaining half at 19 months of age. Our results strongly suggest that the autocrine and/or paracrine action of the IGF-1 produced in the muscle might play a crucial role in the modulation of muscle growth rate and meat tenderness in beef cattle. On the other hand, our gene interaction network analysis revealed a large number of genes encoding proteins acting in the skeletal muscle proteolysis, a small number of inhibitors and regulators of proteases, as well as several genes related to the programmed cell death in animals that had greater tenderness of meat, reinforcing the hypothesis of the involvement of a multi-enzymatic complex (including calpains and other proteases) in the meat tenderization process, which resembles the apoptosis process.

Resumo: Sabendo que o processo de transformação do músculo em carne no estágio postmortem é largamente governado pela proporção de distintos tipos de fibras, e tendo em vista a necessidade de suprir as demandas do setor da pecuária bem como as exigências do consumidor por um produto de maior qualidade, inclusive da carne, o presente projeto objetivou relacionar a maciez da carne do músculo Longissimus dorsi (LD) com a expressão gênica e protéica das isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC) em dois grupos genéticos de bovinos. Foram analisados 28 bovinos jovens de dois grupos genéticos, 14 Nelores e 14 Canchins. Os animais receberam a mesma dieta, o mesmo manejo no mesmo ambiente, com a finalidade de mantê-los no mesmo estado fisiológico. Atingindo o tempo pré-estabelecido de confinamento de 140 dias, os animais foram abatidos e amostras do músculo LD foram coletadas para análise da maciez da carne e também para a quantificação das expressões gênicas e protéicas das isoformas de MHC através das técnicas de RT-qPCR e de separação eletroforética (SDS-PAGE) respectivamente. O grupo Canchim apresentou maior maciez da carne em relação ao grupo Nelore em ambas as metodologias utilizadas, força de cisalhamento e índice de fragmentação miofibrilar, bem como uma menor expressão gênica da isoforma de MHC 2X. Foi verificada uma correlação negativa da expressão das isoformas 2A e 2X e uma correlação positiva da expressão da isoforma de MHC Slow com a maciez da carne nos dois grupos genéticos. Os resultados sugerem que a menor maciez da carne do grupo Nelore em relação ao grupo Canchim possa estar relacionada com a maior expressão gênica da isoforma de MHC 2X no grupo Nelore / Abstract: Knowing that the meat tenderness process that turns muscle in meat on postmortem are largely governed by the proportion of different fiber types, and in view of the need to supply the needs of livestock industry and consumer demands for a higher quality product, including meat, this project aimed to relate meat tenderness of Longissimus dorsi muscle (LD) with gene and protein expression of myosin heavy chain (MHC) isoforms in two genetic groups of cattle. Twenty-eight steers of two genetic groups, 14 Nellores and 14 Canchins were used. The animals received the same feed, the same management in the same environment, in order to keep them in the same physiological state. After 140 days of feedlot, the animals were slaughtered and LD muscle samples were collected for meat tenderness analysis and also for gene and protein expression quantification of MHC isoforms using RT-qPCR and electrophoretic separation (SDS-PAGE) technique, respectively. The Canchim group had better meat tenderness in relation to Nellore group in both methodologies used, shear force and myofibrillar fragmentation index and lower MHC 2X isoform gene expression. It was observed a negative correlation between 2A and 2X isoforms expression and a positive correlation of MHC Slow isoform expression to meat tenderness in the two genetic groups. The results suggest that lower meat tenderness of Nellore group in relation to Canchim group may be related to higher gene expression of MHC 2X isoform in Nellore group / Orientador: Henrique Nunes De Oliveira / Coorientadora: Maeli Dal Pai Silva / Banca: Robson Francisco Carvalho / Banca: Rafael da Costa Cervieri / Mestre

O uso de culturas GM (geneticamente modificadas) tem sido questionado quanto ao destino dos produtos derivados da transgenia no ambiente. Com a liberação de exsudatos das raízes das plantas e a decomposição dos resíduos culturais, aumenta-se a quantidade de DNA transgênico no ambiente, que pode ser adsorvido à superfície ativa das partículas do solo e/ou degradado pela ação de enzimas microbianas. A comunidade microbiana do solo pode entrar em contato direto com estes produtos, aumentando a probabilidade de transferência horizontal de fragmentos de DNA transgênico para os microrganismos. Também, alterações na composição dos exsudatos das plantas GM e mudanças em função das práticas de manejo, podem resultar em alterações na composição funcional e estrutural da comunidade microbiana. Assim, faz-se necessário avaliar a persistência dos produtos derivados da transgenia no solo e seus possíveis efeitos sobre a comunidade microbiana. Os objetivos deste estudo foram: avaliar a persistência dos fragmentos 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta da construção gênica do milho Bt (evento MON810) em diferentes tipos de solo e temperaturas, em condições de microcosmo e de campo; e determinar a abundância do número de cópias dos gene 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea, e 18S rRNA de Fungo nas mesmas condições, e avaliar a estrutura da comunidade bacteriana em áreas agrícolas de cultivo de milho Bt. No primeiro estudo, o DNA do milho Bt MON810 foi adicionado em solos arenoso e argiloso. Como controle negativo, apenas água estéril foi misturada ao solo. Amostras de solo foram incubadas a 15 e 25ºC. Em campo, os solos foram amostrados em três áreas agrícolas em Fátima do Sul, MS, em dois anos consecutivos. Após extração de DNA, os fragmentos foram quantificados por qPCR. No segundo estudo, foram determinadas a abundância dos genes 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea e 18S rRNA de Fungo e avaliada a estrutura da comunidade bacteriana por T-RLFP. Os resultados mostraram que em condições de microcosmo, os fragmentos hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta persistiram até 291 dias, e o fragmento 35S-hsp70 até 180 dias. A temperatura e o tipo de solo não afetaram a persistência dos fragmentos. Em campo, o número de cópias desses fragmentos foi maior na segunda coleta. No segundo estudo, o número de cópias do gene 16S rRNA de Bacteria aumentou com adição de DNA do milho Bt nos microcosmos, e uma redução do número de cópias foi verificada para Archaea, Verrucomicrobia e Fungo. Para Firmicutes, os resultados não foram consistentes. As temperaturas não resultaram em efeito na abundância dos genes, enquanto o tipo de solo teve efeito apenas para Archaea e Verrucomicrobia. Áreas agrícolas com cinco anos de cultivo de milho Bt apresentaram variações na estrutura da comunidade bacteriana em nível de filo, e maior abundância de Fungos no segundo ano de amostragem, enquanto em área com um ano de cultivo, observouse uma redução da população de Firmicutes e Verrucomicrobia. Os maiores efeitos na comunidade microbiana foram verificados entre os anos de amostragem / The use of GM (genetically modified) crops has been questioned about the fate of transgenes is derived products on the environment. With the release of exudates from roots of GM plants and the decomposition of its residues, the amount of transgenic DNA in the environment increases, which can be adsorbed to the active surface of soil particles and/or be degraded by the action of microbial enzymes. Soil microbial communities can come into direct contact with these products, raising the probability of horizontal transfer of transgenic DNA fragments to soil microorganisms. Moreover, changes in exudates composition of GM plants and changes depending on the management practices may result in structural and functional alterations in the microbial community. Thus, it is necessary to evaluate the persistence of transgenes is derivatives in the soil and effects on microbial community. The objectives of this study were to assess the persistence of fragments 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab and cry1Abplant from the genetic construct of Bt corn (event MON810) in different soil types and temperatures, in microcosm and field conditions; and to determine the abundance of 16S rRNA copy number of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi under the same conditions, and to evaluate the structure of bacterial communities in agricultural areas of Bt corn cultivation. In the first study, DNA from Bt corn MON810 was added to sandy and clay soils. As negative control, only sterile water was mixed with soil. Soil samples were incubated at 15 and 25°C. At the field, soils were sampled in three agricultural areas in Fátima do Sul, MS, in two consecutive years. After DNA extraction, fragments were quantified by qPCR. In the second study, the abundance of 16S rRNA of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi were determined and the structure of bacterial communities was evaluated by T-RFLP. The results showed that in microcosm conditions, hsp70-cry1Ab and cry1Ab-plants fragments persisted until 291 days and the 35S-hsp70 up to 180 days. The temperature and the type of soil did not affect the persistence of fragments. In field, the copy number of these fragments was greater in the second sampling. In the second study, the copy number of 16S rRNA of Bacteria increased with the addition of DNA from Bt corn in microcosm, and a reduction in copy number was observed for Archaea, Verrucomicrobia and Fungi. The results were not consistent for Firmicutes. Temperatures resulted in no effect in gene abundance, while the soil was effective only for Archaea and Verrucomicrobia. Agricultural areas with five years of Bt corn cultivation showed variations in bacterial community structure at the phylum level, and greater abundance of fungi in the second year of sampling, while in the area with a year of cultivation, a reduction in population of Firmicutes and Verrucomicrobia was observed. The largest effects on the microbial community were observed between the sampled years

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-27Bitstream added on 2014-06-13T20:35:48Z : No. of bitstreams: 1 moreira_wmq_me_jabo.pdf: 763719 bytes, checksum: 21d0bf3b9a629afa4e42b015a9f29722 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Brasil é o segundo maior produtor de soja no mundo, cuja cultura requer o elemento nitrogênio em quantidades elevadas para manutenção do alto teor protéico dos grãos. A entrada de nitrogênio nos sistemas agrícolas pode ocorrer pela adição de fertilizantes nitrogenados ou por processos naturais como a Fixação Biológica do Nitrogênio, que se constitui como supridor de nitrogênio mais viável para a cultura da soja, tanto economicamente como ecologicamente. Este processo ocorre graças à simbiose que ocorre entre esta leguminosa e as bactérias do gênero Bradyrhizobium, resultando na formação de nódulos radiculares onde se dá a obtenção de todo o nitrogênio que a cultura necessita para alta produtividade. A introdução destas bactérias no solo se dá através da utilização de inoculantes comerciais, que incluem as bactérias Bradyrhizobium elkanii e Bradyrhizobium japonicum em sua composição. Aspectos relacionados à formulação e fabricação dos inoculantes comerciais reúnem os fatores mais importantes para a obtenção de um produto de qualidade, obedecendo à legislação vigente. Tendo em vista a análise de qualidade de inoculantes comerciais para soja em diferentes períodos de armazenamento, um estudo do metabolismo respiratório de bradirrizóbios foi realizado in vitro e em simbiose. Inoculantes comerciais com 12, 27 e 48 meses de idade foram analisados quanto suas características bioquímicas e fisiológicas, assim como testados em casa de vegetação. Adicionalmente, os mesmos testes foram realizados com Bradyrhizobium elkanii sob diferentes condições de oxigênio. Análise da expressão gênica indicou que um processo de expressão de genes relacionados à fixação biológica de nitrogênio (genes sensores a baixas tensões de oxigênio) foram expressos, entretanto não ocorrendo expressão do gene nifH, este só expresso em condições... / Brazil is the second major soybean producer in the world, whose culture requires the element nitrogen in large amounts for the maintenance of the high protein content in grains. The input of nitrogen in agricultural systems can occur by adding nitrogen fertilizer or by natural processes such as biological nitrogen fixation (BNF). BNF is the most feasible way to delivery nitrogen for the soybean crop, both economically and ecologically. This process occurs through the symbiosis between the legume and the bacteria of the genus Bradyrhizobium, resulting in the formation of root nodules where all nitrogen that the crop needs for high productivity is acquired. The introduction of these bacteria in soil is given by use of commercial inoculants, which include the bacteria Bradyrhizobium japonicum and Bradyrhizobium elkanii in its composition. Aspects related to formulation and manufacture of inoculants include the most important factors affecting the product quality, according to law. In order to analysis of the quality of commercial inoculants for soybean in different storage periods, a study of respiratory metabolism of bradyrhizobia was performed in vitro and in symbiosis. Inoculants with 12, 27 and 48 months old were analyzed accessing their biochemical and physiological characteristics, and tested at greenhouse. In addition, the same tests were conducted on cultures of Bradyrhizobium elkanii under different oxygen conditions. Analysis of gene expression have indicated that genes related to biological nitrogen fixation (genes sensors at low oxygen tension) were intensively expressed, but not occurring nifH gene expression which is only expressed under symbiosis. Similar data were found for the expression of these genes when B. elkanii grown at different oxygen tensions. These data indicate that as the oxygen level is reduced some genes related to nitrogen fixation are expressed... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Lia de Alencar Coelho / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: César Roberto Esper / Banca: Gilson Helio Toniollo / Resumo: Os objetivos deste trabalho foram de facilitar os procedimentos de formação de gradientes de- densidade de Percoll e OptiPrep para separação de espermatozóides X; avaliar a eficiência da sexagem de espermatozóides X, a viabilidade espermática e integridade do acrossoma e do DNA após a centrifugação nestes gradientes e avaliar taxa de clivagem e blastocisto durante a produção in vitro de embriões. Para isso, doses de sêmen de touros foram descongeladas e cerca de 40 milhões de espermatozóides foram colocados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas que variaram entre 1.11 Og/mL a 1.123g/mL em tubos de poliestireno de 15mL. Centrifugou-se o gradiente a 500xg por 15 min a 22°C. Os sobrenadantes foram aspirados e recuperados para verificação da viabilidade espermática e integridade do acrossoma, fragmentação do DNA, produção in vitro de embriões, avaliação da eficiência da sexagem pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e sexagem dos embriões pela PCR. A porcentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto diminuiu (P<0,05) após a centrifugação nos gradientes de densidade, mas não influenciou, de modo geral, a produção in vitro de embriões (taxa de clivagem e blastocistos) utilizando estes espermatozóides centrifugados. Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozóides nas amostras centrifugadas. Os resultados demonstraram que o Percoll enriqueceu as amostras com espermatozóides X (62% de fêmeas, P<0,05). No OptiPrep e grupo Controle a porcentagem de fêmeas foi de 47,1 e 48,7%, respectivamente. Estes resultados foram confirmados pela qPCR do DNA dos espermatozóides, com uma subestimação apenas no Percoll. Foi possível realizar a sexagem, por uma metodologia mais simples, facilitando o procedimento de centrifugação em gradiente de densidade e sem provocar danos aos espermatozóides. / Abstract: The objectives of this work were to facilitate the procedures of formation of density gradients of Percoll and OptíPrep for separation of X-bearing bovine spermatozoa; to evaluate the efficiency of sexing and viability of acrosome integrity and DNA after centrifugation in these gradients and to assess the cleavage and blastocyst rate during in vitro production of embryos. For this, frozen-thawed spermatozoa (20 to 40 millions) were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers that varied between 1.110g/mL to 1.123g/mL, in 15mL polystyrene tubes. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 min at 22oC. Supernatants were carefully aspirated and sediments recovered for verification of sperm quality, DNA fragmentation, in vitro fertilization of embryos, evaluation of the efficiency of sexing by real time polymerase chain reaction (qPCR) and sexing of embryos by PCR. Percentage of live spermatozoa with intact acrosome decreased (P<0.05) after centrifugation in density gradients, however, it not influence, in general, the production of embryos in vitro (cleavage and blastocyst rates) using these centrifuged sperm. No sperm DNA fragmentation was detected in centrifuged samples. The results of embryo sexing by PCR showed deviation to female in the Percoll group (62%, P<0.05). In the OptiPrep and Control group the percentage of females was 47.1 and 48.7%, respectively. These results were confirmed by qPCR of DNA of spermatozoa, with an underestimation only in the Percoll group. It was possible the sexing, by a simple approach, facilitating the process of the centrifugation in density gradient and without damage to sperm. / Doutor

Orientador: Ruben Pablo Schocken-Iturrino / Banca: Alessandra Aparecida Medeiros / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Anna Monteiro Correia Lima / Banca: Fernando Antônio de Ávila / Resumo: O presente estudo foi realizado com o intuito de desenvolver o PCR quantitativo para detecção dos níveis de mRNA da toxina botulínica tipo A em palmito. Foram desenhados primers para o gene codificador da toxina botulínica tipo A, os quais apresentaram especificidade e sensibilidade elevadas. Cepas referência de Clostridium botulinum tipo B, C, D, E, F, G e Clostridium butyricum, baratii e argentinense foram utilizadas para verificação da especificidade dos primers sintetizados. Diluições seriadas de cultura da cepa referência de Clostridium botulinum tipo A foram inoculadas em amostras de palmito e separadas em dois grupos: palmito comercial com conservantes e palmito sem conservantes e incubadas a 4°, 25° e 37°C. Alíquotas dessas amostras contaminadas experimentalmente foram submetidas a extração de RNA, para determinação do limiar de detecção da técnica de PCR quantitativo, assim como inoculadas em camundongos para o teste de toxicidade aguda (bioensaio). O bioensaio apresentou sensibilidade característica e detectou a presença da toxina botulínica nas amostras de palmito sem conservantes. No entanto, o PCR quantitativo, apresentou sensibilidade maior que aquela observada no bioensaio, detectando a expressão do gene para BoNT/A (botulinum neurotoxin type A) no tratamento de palmito sem conservantes e no tratamento de palmito comercial incubado a 37°C. Isto evidencia a possível utilização desta técnica no diagnóstico de contaminação de amostras de alimento por C. botulinum tipo A. / Abstract: The present study was realized in order to develop the quantitative assay for the detention of the levei mRNA of the botulinic toxin type A production in palm heart. Primers were designed for the gene encoding the botulinic toxin type A, which showed high specificity and sensitivity. Reference of strains of C. botulinum type S, c, D, E, F, G, C/ostridium butyricum, baratii and argentinense were used for verification of the specificity of the primers synthesized. Serial dilutions culture of the reference strain of C/ostridium botulinum type A were inoculated in the palm heart samples and separated in two groups: commercial palm heart (with preservatives) and palm heart without preservatives and incubated at 4°, 25° and 37°C. Aliquots these contaminated experimentally samples were subjected to extraction of RNA, for determination of the threshold of detection of the technique of quantitative PCR, well as inoculated into mice to test the acute toxicity (bioassay). The bioassay presented its characteristic sensitivity and detected the presence of the botulinic toxin in samples of palm heart without preservatives. However, the quantitative PCR presented greater sensibility than that observed in the bioassay, detecting the expression of the gene for SoNT/A (botulinic neurotoxin type A) in the treatment of palm heart without preservatives and treatment of commercial palm heart incubated at 37°C. This highlights the possible use of this technique in the diagnosis of contamination of samples the food by C. botulinum type A. / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-21Bitstream added on 2014-06-13T19:39:39Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_to_me_jabo.pdf: 708831 bytes, checksum: d0290b981ff3772231b28fddb042fed0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Angus Bela Vista Pecuaria Ltda / Os prejuízos causados à pecuária brasileira pelo carrapato (Rhipicephalus (B.) microplus) são significativos e, uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade dos rebanhos nas regiões tropicais tem sido a utilização de raças mais resistentes a esse ectoparasita. O objetivo desse projeto foi aplicar a tecnologia de microarray de DNA para a prospecção de genes relacionados com os mecanismos de resistência/tolerância ao carrapato, mediante a análise da expressão gênica diferencial em linfonodos de bovinos suscetíveis (Aberdeen Angus) e resistentes (Nelore) infestados artificialmente com este parasita. Os bezerros foram mantidos livres de carrapato desde o nascimento e foram infestados artificialmente com larvas de carrapato aos quatro meses de idade. As biópsias de linfonodo foram realizadas antes e após a infestação e mantidas a –80°C até o seu processamento. Essas amo stras foram submetidas a extração de RNA, síntese de cDNA e marcação . Depois elas foram submetidas a hibridização pela técnica de microarray. Foram identificados 341 genes diferencialmente expressos nos bovinos da Raça Angus e 254 para bovinos da Raça Nelore, os quais foram agrupados em categorias funcionais. Foram identificadas diferenças no padrão de expressão de genes de resposta imune entre as raças, tais como: Moléculas CD, Imunoglobulinas, Fator de Necrose tumoral, Integrinas e Interferon-γ. Para validação dos resultados de expressão diferencial foi empregada a técnica de PCR em tempo real, onde se verificou a expressão dos genes das citocinas IL-5 e IL12p40 nas duas Raças estudadas. / Significant losses are brought by ticks (Rhipicephalus (B.) microplus) to Brazilian beef farming. One of the strategies to increase yield in tropical regions is the use of resistant breeds. This study was undertaken to apply the DNA microarray technology for the prospection of genes related to tick resistance/tolerance mechanisms, through differential gene expression analysis in lymphonodes of susceptible (Aberdeen Angus) and resistant (Nelore) breeds artificially infested with the parasite. Calves were kept tick-free since birth and infested with tick larvae when they reached four months of age. Lymphonode biopsies were performed before and after infestation and kept at -80°C until analyses. Samples were subjected to RNA extraction, cDNA synthesis and labelling. Hybridization was then performed through the microarray technique. In Angus, 341 differentially expressed genes were found against 254 in Nelore, which were grouped in functional categories. Different expression patterns were identified immune response genes between breeds, such as: CD molecules, Immunoglobulines, Tumor Necrosis Factor, Integrins and Interferon-γ. Real-time PCR was used to validate results, which showed the expression of cytokines IL-5 and IL12p40 in both breeds.

The relative amount of viral RNA of two comoviruses (RaMV and TuRSV) in different parts of plant during infection was determined. The two viruses were compared according to their ability to spread and multiply in plants.

Genetically modified (GM) or transgenic crops, now more often called ``Biotech crops{\crqq} they are commercially cultivated since 1996. And also since 1996, the first year of commercialization of biotech crops, GM potatoes were cultivated in USA, Mexico, Canada and later in South Africa, China and India. The global area of approved biotech crops in 2006 was 102 million hectares and 22 countries grew biotech crops, 11 developing countries and 11 industrial countries. The Czech Republic is on of the six EU countries where biotech crops are cultivated at present. The most compelling case for biotechnology, and more specifically biotech crops, is their capability to contribute to: increasing crop productivity and stability of productivity and production; conserving biodiversity, as a land-saving technology; the production of renewable resource based bio-fuels. This diploma paper was focused on developing of fast, precise and cheap method based on PCR to detect the presence of transgenes in potatoes {--} tubers and leaves, allows monitoring the presence of GM potatoes in market, environment, etc. and to quantify ``contamination{\crqq} of ware potatoes (tubers) with GM ones.

Os rotavírus são um dos principais agentes causadores de doenças entéricas em várias espécies animais, com ocorrência generalizada na suinocultura do Brasil. O seu diagnóstico é um componente essencial para estudos epidemiológicos e delimitação de medidas profiláticas visando o controle da doença. Apesar da relevância, não existem testes, tais como PCR em tempo real desenvolvido para detectar a diversidade genética de rotavírus suíno do grupo A (RVA). Este trabalho descreve o desenvolvimento de uma PCR em tempo real com SYBR® Green, para a detecção de rotavírus suíno e os seus resultados comparados com a PCR convencional e ELISA. Foram desenhados primers visando o segmento codificador da proteína NSP5 (137pb) e também foram utilizados primers visando o mRNA do gene mitocondrial bovino NADH5 (191pb) para o controle interno exógeno. Amostras de fezes de suínos de até 60 dias de idade de suínos do estado de São Paulo foram usadas para compor um painel de teste. Foram utilizadas como amostras de referencia o isolado 32/00 (controle positivo de rotavírus suíno do grupo A), concentrado de células MDBK (controle positivo do controle interno exógeno) e água tratada com DEPC (controle negativo). A extração do RNA total foi realizado com Trizol a partir de suspensões fecais contendo MDBK e o cDNA foi sintetizado utilizando primers aleatórios e M-MLV. Para as reações de PCR em tempo real utilizou-se o reagente MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Life Science). Durante a padronização da PCR convencional, a temperatura de 54°C foi definida como a Tm ótima para a reação. O desempenho do ensaio foi validado em sete amostras positivas inicialmente testadas pelos métodos ELISA e PAGE. O isolado viral RV8209 foi utilizado para determinar o limiar de detecção da PCR em tempo real através de diluições seriadas sendo defino como ponto de corte Ct=33,5 (10-12,28TCID50%). O segmento codificador da NSP5 foi clonado no vetor pTZ57R/T submetido a restrição enzimática e usado como alvo para gerar uma curva padrão, onde obteve-se uma eficiência de 93,39%, slope de -3,49 e R2 de 0,993. A detecção do controle interno exógeno mostrou 82,9% de positividade para PCR convencional e 76,31% para a PCR em tempo real, com correlação significativa (0,718). O ensaio de ELISA para RVA apresentou 10,5% (8/78) de positividade, enquanto que as taxas de detecção da PCR em tempo real e PCR convencional foram de 50% (29/58) e 30,1% (24/63), respectivamente. Foi encontrada uma correlação moderada (0,546) entre PCR convencional e PCR em tempo real; baixa (0,056) entre a PCR convencional e ELISA; ausente (0,0) entre a PCR em tempo real e ELISA. Os resultados obtidos sugerem que a detecção por PCR em tempo real para a detecção do rotavírus suíno do grupo A em amostras fecais possa ser utilizada como diagnostico rápido e eficiente aumentando o repertório dos testes já estabelecidos, de modo a proporcionar uma maior sensibilidade para o diagnóstico clínico e epidemiológico. / Rotavirus is one of the main causative agents of enteric diseases in several animal species with widespread occurrence in Brazilian pig farm. Diagnosis is an essential component for epidemiological studies and delineation of prophylactic measures aiming disease control. Despite the relevance, there are no assays such as real-time PCR developed to detect the genetic diversity of porcine rotavirus from group A (RVA). This work describes the development of SYBR Green real-time PCR assay for the detection of porcine rotavirus and the results were compared with conventional PCR and ELISA. Primers were designed targeting the coding segment of the protein NSP5 (137pb) and also primers targeting the bovine mitochondrial gene mRNA NAD5 (191pb) were used for the exogenous internal control. Fecal samples from pigs up to 60 days of age from São Paulo state were used to compose a panel test. The reference sample was the isolate 32/00 (positive control for porcine rotavirus group A), concentrated MDBK cells (Exogenous Internal Positive Control) and DEPC-treated water (negative control). Total RNA extraction from supernatants of fecal samples containing MDBK cells were carried out with TRIzol reagent and cDNA was synthesized using random primers and M-MLV Reverse Transcriptase. For real-time PCR reactions were used MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Life Science). For conventional PCR optimization, 54oC was defined as the optimum reaction temperature (Tm). The performance of the assay was validated on seven samples initially tested positive by ELISA and PAGE methods. The limit of detection of the developed real-time-PCR assay was determined using serial dilutions of the isolated RV8209 with Ct=33,5 (10-12,28TCID50%). The NSP5 gene segment was cloned into vector pTZ57R/T submitted to enzymatic restriction and used as template to generate a standard curve which Efficiency of 93.39%, slope of -3.49 and R2 &#9633; 0.993. The Exogenous internal control showed 82.9% positivity for conventional PCR and 76.31% for real-time PCR with substantial correlation (0.718). The ELISA assay detected porcine RVA in 10,5% (8/78) of fecal samples, whereas the detection rates of both SYBR Green real-time PCR and conventional PCR assays were 50% (29 of 58) and 30.1% (24 of 63), respectively. A moderate correlation (0.546) was found between conventional PCR and real-time PCR; low (0.056) between the conventional PCR and ELISA; absent (0.0) between the real-time PCR and ELISA. Our findings suggest that detection of Group A porcine rotavirus in fecal samples by use of the real-time PCR assay may be fast and efficient increasing the repertoire of tests established to improve sensitivity for epidemiology and clinical diagnosis.