O objetivo do presente estudo foi detectar Leishmania spp. pela PCR em tempo real (qPCR) em amostras de DNA extraído de sangue e suabe conjuntival de cães, gatos e equinos. E também, verificar a positividade dessas amostras pela PCR convencional (cPCR), utilizando oligonucleotídeos específicos para L. infantum (inf.cPCR). Para isso, amostras de sangue e suabe conjuntival de 204 cães, 108 gatos e 54 equinos saudáveis foram testadas pela qPCR para Leishmania spp. e os resultados comparados pelo índice kappa a resultados de cPCR para Leishmania spp. (ssp.cPCR) previamente obtidos. A qPCR de sangue não detectou nenhum animal positivo. Já os resultados da qPCR de suabe conjuntival (qPCR-SC), revelaram 0,98% (2/204) de cães positivos. Ao comparar os resultados obtidos pela qPCR-SC com os resultados obtidos pela cPCR de suabe conjuntival (ssp.cPCR-SC), observou-se uma concordância baixa entre os métodos, k=0,32. Em relação aos gatos, 1,85% (2/108) desses animais foram detectados positivos para Leishmania spp. pela qPCR-SC, esse resultado corroborou com o resultado obtidos pela ssp.cPCR-SC o que resultou em uma excelente concordância entre os métodos comparados, k=1. Em relação aos equinos, 12,96% (7/54) dos animais foram detectados positivos para o parasito pela qPCR-SC. Esses resultados não possuem concordância com os resultados obtidos pela ssp.cPCR-SC, uma vez que por esse método, 66,66% (36/54) foram detectados infectados pela Leishmania spp. Ao realizar a inf.cPCR, 11,11% (6/54) dos equinos foram positivos. Submetidas ao sequenciamento, dois fragmentos apresentaram 99% de similaridade com sequencias de L. infantum disponíveis no GenBank. Enquanto a qPCR-SG não foi capaz de detectar Leishmania spp. em cães, gatos e equinos, a qPCR-SC foi capaz de detectar o parasito nas três espécies avaliadas. A associação entre a qPCR e o uso de um método prático, fácil e não invasivo, como o suabe conjuntival, representa um grande avanço no diagnóstico da doença em cães, gatos e equinos uma vez que, a qPCR-SC, foi capaz de detectar um maior número de animais infectados pela Leishmania spp. em relação a qPCR-SG. Além disso, a detecção de Leishmania spp. nas diferentes espécies avaliadas reforça a possível atuação desses animais como reservatórios de agentes da leishmaniose cutânea e a confirmação de L. infantum em equinos, associado à inexistência de sinais clínicos nestes animais revela a possibilidade de equinos serem reservatórios desse parasito. / The aim of this study was to detect Leishmania spp. by real-time PCR (qPCR) on DNA extracted from blood samples and conjunctival swab dogs, cats and equines. Also, check the positivity of these samples by conventional PCR (cPCR) using specific oligonucleotídeos for L. infantum (inf.cPCR). For this, blood samples and conjunctival swab of 204 dogs, 108 cats and 54 horses healthy were tested by qPCR for Leishmania spp. and the results compared by kappa index to cPCR results for Leishmania spp (ssp.cPCR). previously obtained. The blood qPCR detected no positive animal. Already the qPCR results of conjunctival swab (CS-qPCR), revealed 0.98% (2/204) of positive dogs. Comparing the results obtained by CS-qPCR with the results obtained by conjunctival swab cPCR (ssp.CS-cPCR), there was a low correlation between the methods, k = 0.32. In relation to cats, 1.85% (2/108) of these animals were detected positive for Leishmania spp. by CS-qPCR, this results corroborated with the results obtained by ssp.CS-cPCR which resulted in excellent agreement between the methods compared, k = 1. Already in horses, 12.96% (7/54) of the animals were found positive for parasites by CS-qPCR. These results not have agreement with the results obtained by ssp.CS-cPCR, since by this method, 66.66% (36/54) were found to be infected by Leishmania spp. When performing inf.cPCR, 11.11% (6/54) of the horses were positive. Submitted to sequencing, two fragments showed 99% similarity to L. infantum sequences available in the GenBank. While blood qPCR was not able to detect Leishmania spp. in dogs, cats and horses, CS-qPCR was able to detect the parasite in the three species evaluated. The association between the use of qPCR and a practical, easy and non-invasive method, such as conjunctival swab, is a great advance in the diagnosis of disease in dogs, cats and horses since CS-qPCR was able to detect a greater number of animals infected with Leishmania spp. in respect of blood qPCR. Furthermore, the detection of Leishmania spp. the different species evaluated reinforces the possible role of these animals as reservoirs of cutaneous Leishmaniasis agents and confirmation of L. infantum in equines associated with the absence of clinical signs in these animals reveals the possibility of equines being reservoirs of this parasite.

Orientadores: Getulio da Rocha Nogueira Filho, Maria Cristina Foss de Freitas / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tunes_RobertaSantos_D.pdf: 3904894 bytes, checksum: 5bfa07e25946e02ccbf23c44e8160e08 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este estudo objetiva verificar a influência sistêmica da periodontite crônica severa frente ao controle metabólico bem como do tratamento periodontal na resposta imunológica de indivíduos diabéticos tipo 2 através da análise da expressão gênica e protéica de citocinas por células mononucleares aderentes de sangue periférico. Foram selecionados 20 pacientes divididos em: grupo teste - 10 diabéticos tipo 2 com periodontite crônica severa e controle metabólico inadequado; grupo controle - 10 diabéticos tipo 2 sem periodontite e controle metabólico inadequado. Primeiramente, os pacientes foram hospitalizados por 8 dias para a obtenção de um controle metabólico adequado, permanecendo inalterada a condição periodontal nesta fase. Posteriormente, o grupo teste foi submetido à terapia mecânica em estágio único associada à antibioticoterapia sistêmica com amoxicilina e metronidazol. Amostras sanguíneas foram obtidas no primeiro e último dias de hospitalização, e 4 a 6 semanas após o tratamento periodontal para a análise imunológica. Para avaliação dos parâmetros laboratoriais relacionados ao controle metabólico, como HbA1c, foram obtidas amostras sanguíneas antes e após a hospitalização, e 3 a 6 semanas após o tratamento periodontal. Culturas de um total de 2,5x106 células/mL mononucleares aderentes, foram realizadas por 24h na presença e ausência de LPS (5µg/mL). As citocinas TNF- a, IL-1 ß, IL-8 e IL-6 foram detectadas nos sobrenadantes das culturas através do ELISA, enquanto que a sua expressão gênica foi verificada por PCR em tempo real. Enquanto o controle metabólico diminuiu a secreção de TNF- a (p=0,02), IL-1ß(p=0,03), IL-8 (p=0,04) e IL-6 (p=0,02) nos sobrenadantes das células estimuladas do grupo controle, os pacientes do grupo teste apresentaram níveis maiores destas citocinas após o controle metabólico quando comparados ao grupo controle (p<0,01 ou p=0,01). O controle metabólico bem como a infecção periodontal severa, apesar de não terem influenciado a expressão gênica das citocinas próinflamatórias pelas células estimuladas de ambos os grupos, aumentou a expressão gênica em 2 vezes da IL-8 (p=0,04) pelas células basais do grupo teste, evidenciando-se uma hipoexpressão, respectivamente, de 4, 3 e 11 vezes, da IL-1 ß, IL-8 e IL-6 (p<0,01 ou p=0,01) por estas células no grupo teste em relação ao grupo controle, antes do controle metabólico. Enquanto o tratamento periodontal promoveu uma diminuição da secreção de TNF-?(p=0,04) pelas células estimuladas do grupo teste, o mesmo não influenciou a expressão gênica das citocinas nestas condições. O controle metabólico associado ao tratamento periodontal promoveu um aumento da expressão gênica em 6 e 5 vezes, respectivamente da IL-1 a e IL-6 (p<0,01), pelas células basais do grupo teste. Enquanto, o controle metabólico promoveu reduções na HbA1c de 1% no grupo controle (p=0,04) e 1,1% no grupo teste (p=0,03), o tratamento periodontal promoveu uma redução adicional de 1,6% na HbA1c do grupo teste. Assim, demonstrou-se o papel modulador da periodontite crônica severa na resposta imunológica dos pacientes diabéticos tipo 2, mantendo a capacidade reativa próinflamatória das células mononucleares frente ao controle metabólico, e que o tratamento desta infecção local pode exercer efeitos sistêmicos, diminuindo o potencial próinflamatório das células mononucleares circulantes, contribuindo para a melhor sensibilidade insulínica e facilitando o controle metabólico destes indivíduos / Abstract: The purpose of this study was to evaluate the systemic influence of chronic severe periodontitis in relation to metabolic control and of periodontal therapy in the immune response of diabetic type 2 patients through the evaluation of cytokine protein and gene expression in human adherent peripheral blood mononuclear cells. Twenty patients were studied, distributed in 2 groups: test group - 10 type 2 diabetic patients with severe chronic periodontitis and inadequate metabolic control; control group - 10 type 2 diabetic patients without periodontitis and inadequate metabolic control. First, all participants were hospitalized for 8 to 10 days to obtain adequate metabolic control, without any periodontal condition alterations. Afterwards, the test group received one-stage non-surgical eriodontal therapy associated with Amoxicilin and Metronidazole. Blood samples were obtained on he first and last day of hospitalization, and 4 to 6 weeks after periodontal therapy for immunological analyses. For metabolic parameters analyses, like HbA1c, blood samples were obtained before and after hospitalization, and 3 to 6 weeks after periodontal therapy. Mononuclear cells were isolated by gradient density using Ficoll-Hypaque?. A total of 2.5 X 106 adherent cells/mL were cultivated during 24hs in the presence or absence of LPS. The cytokines TNF-a, IL-1ß, IL-8, IL-6 were quantified in cell culture supernatants using ELISA, while their gene expression was verified by Real Time PCR. It was demonstrated that metabolic control promoted a reduction of TNF- a (p=0,02), IL-1? (p=0,03), IL-8 (p=0,04) and IL-6 (p=0,02) levels in control group supernatants stimulated cells, while the test group showed increased levels of that cytokines compared to the control group after metabolic control (p<0,01 or p=0,01). The metabolic control as the presence of chronic severe periodontal infection, although did not affect the gene expression of that cytokines by stimulated cells from both groups, increased IL-8 gene expression 2 times (p=0,04) by test group unstimulated cells while it was verified a lower gene expression respectively of IL-1 ß, IL-8 and IL-6 (p<0,01 or p=0,01) by 4, 3, and 11 times related to the control group, before metabolic control. Moreover, periodontal therapy promoted a reduction of TNF- a (p=0,04) levels in test group supernatants stimulated cells, although did not affect the gene expression of the cytokines studied by these cells. There was observed combined effect of metabolic control and periodontal therapy on IL-1 ß and IL-6 (p<0,01) gene expression, that were increased by 6 and 5 times, respectively, by test group unstimulated cells. While metabolic control promoted reductions of 1% and 1,1% in HbA1c levels of control and test group respectively, periodontal therapy promoted an additional reduction of 1,6% in HbA1c levels of test group. Therefore, it was suggested that chronic severe periodontal infection can modulate the immunological response of type 2 diabetic patients, through the maintenance of the inflammatory reactive capacity of mononuclear cells even if in the presence of metabolic control, and that the local infection treatment can promote systemic effects, through decreasing the pro-inflammatory potential of mononuclear circulating cells, helping to restore insulin sensitivity, resulting in an improved glycemic control in those individuals / Doutorado / Periodontia / Doutor em Clínica Odontológica

Os primeiros 30 dias pós-nascimento do bezerro, chamado período neonatal, é caracterizado por grande desenvolvimento imunológico. O sistema imune começa a se desenvolver ainda no início da gestação, porém, após o nascimento, mesmo que morfologicamente desenvolvido, não se apresenta totalmente funcional pela ausência de estímulos antigênicos. Ademais as particularidades anatômicas e fisiológicas da placentação dos bovinos são um impediente à transferência de imunidade durante a gestação, assim sendo o feto se desenvolve sem a influência das imunoglobulinas maternas, ficando altamente dependente ao início da vida extrauterina da transferência de imunidade passiva via colostro. As características do sistema imune do bezerro em seu período neonatal fazem com que este seja muito susceptível a doenças. Conhecer o comportamento imunitário dos bezerros recém-nascidos pode auxiliar a diminuir a incidência de doenças e o custo desse animal, além de aumentar o seu bem-estar. Deste modo, buscou-se avaliar o padrão de resposta imunitária do neonato nos primeiros 30 dias de vida, por meio de avaliações: da atividade fagocítica e do metabolismo oxidativo de neutrófilos circulantes e imunoenotipagem de linfócitos T (CD3+) e suas subpopulações (CD4+) e CD8+)) por citometria de fluxo e a expressão gênica das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-&#978; por PCR em Tempo Real. O exame físico, o hemograma e avaliação de transferência de imunidade passiva foram considerados como critério de inclusão para garantir a sanidade dos animais durante o período experimental. Com base nos resultados obtidos nesta pesquisa para pode se concluir que: a atividade de fagocitose dos granulócitos foi constante nos 30 dias avaliados; a produção de espécies reativas de oxigênio por granulócitos foi observada nos ensaios basal e estimulado; e com comportamento semelhante, apresentando os dois ensaios, maiores porcentagens nos dias 1, 25 e 30 p.n.; os linfócitos CD3+) e suas subpopulações:CD4+), CD8+), estes apresentaram porcentagens semelhantes àquelas encontradas nos bovinos adultos; e a relação CD4+) /CD8+) aumentou aos 30 dias de vida, pelo aumento de CD4+). Não foi possível mensurar a expressão gênica das citocinas IL-4 e IFN-&#978; em nenhum dos momentos avaliados; no entanto, foi verificada a expressão gênica de citocinas IL-10 e IL-12, com uma inclinação para o perfil Th2 induzido pela expressão mais frequente de IL-10, observando-se influência da expressão gênica das citocinas IL-10 e IL-12 no leucograma, na atividade dos granulócitos, e nas subpopulações de linfócitos T. / The first 30 days post-birth of the calf, called the neonatal period, is characterized by large immunological development. The immune system begins to develop even at the beginning of gestation, but after birth, even if morphologically developed, it is not fully functional due to the absence of antigenic stimuli. In addition, the anatomical and physiological characteristics of bovine placentation are an impediment to the transfer of immunity during gestation, so the fetus develops without the influence of maternal immunoglobulins, being highly dependent at the beginning of the extrauterine life of the transference of passive immunity via colostrum. The characteristics of the immune system of the calf in its neonatal period make it very susceptible to diseases. Knowing the immune behavior of newborn calves can help reduce the incidence of diseases and the cost of this animal, and increase their well-being. The aim of this study was to evaluate the immune response pattern of the neonate in the first 30 days of life through evaluations of phagocytic activity and oxidative metabolism of circulating neutrophils and T lymphocyte (CD3 +) immuno-typing and its subpopulations (CD4 + and CD8 +) by flow cytometry and the gene expression of the IL-4, IL-10, IL-12 and IFN-&#978; cytokines by Real-Time PCR. Physical examination, blood count and passive immunity assessment were considered as inclusion criteria to guarantee the health of the animals during the experimental period. Based on the results obtained in this research it can be concluded that: granulocyte phagocytosis activity was constant in the 30 days evaluated; the production of reactive oxygen species by granulocytes was observed in the basal and stimulated assays; and with similar behavior, presenting the two trials, highest percentages on days 1, 25 and 30 p.n .; the CD3 + lymphocytes and their subpopulations: CD4 +, CD8 +, these presented percentages similar to those found in adult bovines; and the CD4 + / CD8 + ratio increased at 30 days of life, due to the increase in CD4 +. It was not possible to measure the gene expression of IL-4 and IFN-&#978; cytokines in any of the evaluated moments; However, IL-10 and IL-12 cytokine gene expression was observed, with an inclination to the Th2 profile induced by the more frequent expression of IL-10, with the influence of the gene expression of the cytokines IL-10 and IL- 12 on leukogram, granulocyte activity, and T lymphocyte subpopulations.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-10-20T16:57:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rívia Aparecida Reinalda Arruda - 2016.pdf: 3000238 bytes, checksum: 221f622157672c4f34ee32f2aed12d0b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-10-21T19:20:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rívia Aparecida Reinalda Arruda - 2016.pdf: 3000238 bytes, checksum: 221f622157672c4f34ee32f2aed12d0b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T19:20:24Z (GMT). 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These aptamers showed, by dot-blot and magnetic beads ligand capture and subsequent qPCR detection, similar affinities and specificities to binding to the DENV 5'UTR. Probably, the analogy of the motifs and secondary structures presented in these ligands, identified by in silico studies, are responsible for these similarities. Data obtained by using Fluorescence Resonance Energy Transfer Assays (FRET) confirmed the affinity of A03 as DENV ligand by conformational changes in the double labeled aptamer (5’-FAM, 3’-TAMRA). Aptamer conformacional changes resulting from its interaction with the target were detected by the modifications in the fluorescence intensities between FAM and TAMRA fluorophores. These conformational changes results in donor-acceptor distance modification that has an effect on FRET efficiency and on fluorescence intensity of these molecules. The ionic strength of the buffer used in the trials had significant influence on the conformation of the aptamer, allowing the detection of interactions between A03 and DENV. The ions in the buffer lead an effect in the conformation of the aptamer, increasing its thermal stability, and the Mg2+ ion has led to major conformational changes on A03 compared to Na+ ion. The data presented herein demonstrated the importance of the studies of oligonucleotides binding affinity and specificity to Dengue virus. It can be concluded that the A03 and C10 aptamers have potential in application for diagnostic and/or therapeutic purposes, considering the diluent buffer, since different salts have influence on the secondary and tertiary conformational structures of aptamers, and on bioavailability of interaction with the target. / O objetivo principal desse trabalho foi avaliar alterações conformacionais nos aptâmeros A03 e C10 previamente selecionados contra regiões não traduzidas presentes no genoma do vírus da dengue (DENV), por meio de testes de biologia e física molecular. Os aptâmeros são moléculas de ácidos nucleicos com potencial aplicação na teranóstica das mais diversas doenças. Nesse contexto, destaca-se a dengue, uma doença infecciosa viral com altos índices de morbi-mortalidade em um cenário mundial, principalmente em regiões tropicais e subtropicais, onde são altas as incidências do mosquito vetor Aedes aegypti. Esses aptâmeros demonstraram, por meio de dot blot e de captura de ligantes por beads magnéticos com detecção por PCR em Tempo Real, afinidades e especificidades semelhantes de ligação à 5’UTR do DENV. Provavelmente, essas semelhanças se deram em função dos motivos e das estruturas secundárias análogas apresentadas por esses ligantes, obtidas por ensaios in silico. Os ensaios de Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência (FRET) permitiram a confirmação dessa afinidade de ligação entre A03:DENV, devido às alterações estruturais ocorridas no aptâmero duplamente marcado em sua sequência (5’-FAM; 3’-TAMRA). As alterações conformacionais no aptâmero resultantes de sua interação com o alvo foram detectadas pelas mudanças nas intensidades de fluorescência do FAM e do TAMRA, decorrentes de alterações nas distâncias entre o doador e o aceitador que afetam a eficiência FRET e por conseguinte as intensidades de fluorescência destas moléculas. A força iônica do tampão utilizado nos ensaios apresentou importante influência na conformação do aptâmero, permitindo a detecção das interações entre A03 e o DENV. Os íons presentes na solução tampão afetaram a conformação estrutural do aptâmero e aumentaram sua estabilidade térmica, sendo que o íon Mg2+ levou a maiores alterações estruturais sobre o A03 comparado ao íon Na+. Os dados aqui apresentados demostraram a importância dos estudos de afinidade e especificidade dos oligonucleotídeos ligantes ao vírus da dengue. É possível concluir que os aptâmeros A03 e C10 apresentam potencial de aplicação para fins diagnósticos e/ou terapêuticos, considerando o tampão diluente, uma vez que os diferentes sais presentes exercem influência sobre as estruturas conformacionais secundárias e terciárias dos aptâmeros, e em sua biodisponibilidade de interação com o alvo.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-12-21T16:24:41Z No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Nobre Marra - 2012.pdf: 2565911 bytes, checksum: f0057800bcb5bba97865ae5ccc3e4507 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-26T14:21:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Nobre Marra - 2012.pdf: 2565911 bytes, checksum: f0057800bcb5bba97865ae5ccc3e4507 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-26T14:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Kelly Nobre Marra - 2012.pdf: 2565911 bytes, checksum: f0057800bcb5bba97865ae5ccc3e4507 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2012-05-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The involvement of Clostridium estertheticum as agents of deterioration of chilled beef packaged under vacuum from slaughterhouse brazilian, has been reported since 2007. Once detected, and presents the main sources of contamination in slaughter establishments, there was the need to advance the search for new knowledge about this Clostridia, however, the classical microbiological methods for their detection are considered difficult to implement because they require hard work and take a long time. PCR can be a quick and efficient detection of clostridia incriminated in the deterioration of beef chilled vacuum packaged and refrigerated environments slaughterhouses, without isolation of pure cultures. The objective of this study was to develop a test for realtime PCR for detection of Clostridium estertheticum in bovine meat and environments of slaughterhouse brazilian, as well as the molecular identification of isolates of Clostridium estertheticum by means of AFLP and RFLP techniques - PCR. The analytical results were compared with conventional PCR and confirmed by isolation. The Real-Time PCR assay for detection of Clostridium estertheticum in bovine meat and environments of slaughterhouse brazilian, was efficient. Evidence for the presence and distribution of C. estertheticum the sources studied and the technique of RT-PCR provided the highest percentage of positive samples from slaughterhouses that refrigerators Conventional PCR, and this is confirmed by isolation, which has become an important alternative for the detection of C. estertheticum in bovine meat and environments of slaughterhouse without isolation. The isolates used showed general similarity of 42.4%, suggesting high genetic diversity. In addition, the isolates obtained from samples of ambient and refrigerated meat tufted not show significant similarity, greater than 80%, used with any typical strain. The similarity found between the isolates may be indicative of possible similarity between those from meats and puffed from between those environments and equipment. The study revealed that additional steps necessary x for the characterization of Brazilian isolates, especially sequencing of other regions of the DNA so as to determine their taxonomic position. / O envolvimento de Clostridium estertheticum como agente de deterioração de carnes bovinas refrigeradas embaladas a vácuo provenientes de ambientes de frigoríficos no Brasil, vem sendo relatado desde 2007. Uma vez detectados, bem como apontadas as principais fontes de contaminação nos estabelecimentos de abate, surgiu à necessidade de avançar na busca de novos conhecimentos sobre esses clostrídios. No entanto, os métodos microbiológicos clássicos para sua detecção são considerados de difícil execução, pois exigem muito trabalho e demandam muito tempo. A PCR pode ser uma alternativa rápida e eficiente para detecção de clostrídios incriminados na deterioração de carnes bovinas refrigeradas embaladas a vácuo e ambientes de matadouros-frigoríficos, sem a necessidade de isolamento em culturas puras. Objetivou-se com o presente estudo desenvolver um ensaio de PCR em Tempo Real para detecção de Clostridium estertheticum em carnes bovinas e superfícies diversas de matadouros-frigoríficos brasileiros, assim como a identificação molecular de isolados de Clostridium estertheticum, por meio das técnicas RFLP e AFLP – PCR. Os resultados analíticos foram comparados com PCR Convencional e confirmados pelo isolamento. O ensaio PCR em Tempo Real desenvolvido para detecção de Clostridium estertheticum em carnes bovinas e superfícies diversas de matadouros-frigoríficos brasileiros, mostrou-se eficiente. Evidencia-se a presença e disseminação de C. estertheticum nas fontes estudadas e a técnica de PCR em Tempo Real proporcionou maior percentual de positividade para amostras de matadouros- frigoríficos que a técnica de PCR Convencional, sendo este confirmado pelo isolamento, o que demonstra ser uma alternativa importante na detecção de C. estertheticum de carnes bovinas e superfícies diversas de matadouros-frigoríficos sem a necessidade de isolamento. Os isolados utilizados revelaram similaridade geral de 42,4%, sugerindo alta diversidade genética. Além viii disso, os isolados obtidos a partir de amostras de ambientes frigoríficos e carnes tufadas não apresentaram similaridade significativa, maior que 80%, com nenhuma cepa padrão utilizada. A similaridade encontrada entre os isolados pode ser indicativa de possível semelhança entre aqueles provenientes de carnes tufadas e entre aqueles provenientes de ambientes e equipamentos. O estudo mostrou serem necessárias etapas complementares de caracterização dos isolados brasileiros, principalmente sequenciamento de outras regiões do DNA para assim determinar sua posição taxonômica.

A sequência de eventos bacterianos que ocorre durante a colonização do trato gastrointestinal pode afetar o futuro da saúde do hospedeiro, particularmente no que diz respeito à regulação do sistema imunológico. Um entendimento claro do processo de colonização do intestino humano neonatal nos países em desenvolvimento está faltando, porque os poucos estudos disponíveis foram, em sua maioria, realizados utilizando técnicas de cultura. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar as bactérias dos gêneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Eubacterium e Lactococcus, importantes componentes anaeróbios da microbiota intestinal usando PCR em tempo real. O grupo de estudo foi composto por 10 crianças, acompanhadas durante o primeiro ano de vida, vivendo em baixas condições sócio-econômicas em São Paulo, Brasil. Amostras de fezes foram avaliadas em períodos de 24 horas, 7 dias, 30 dias, 3 meses, 6 meses e 1 ano. Durante o primeiro ano de vida, há um aumento da quantidade de Bifidobacterium spp., quando comparada com as outras bactérias anaeróbias estudadas, com médias variando de 8,27x1010 a 2,51x1012 número de cópias de DNA/g de fezes. Lactobacillus spp. também foi encontrado em todos os pontos de tempo estudado, com médias variando de 4,03x108 a 1,46x1010 número de cópias de DNA/g de fezes. Lactococcus spp. foi o gênero bacteriano encontrado em quantidades menores. As contagens máximas desses gêneros foram encontradas entre o terceiro e sexto mês de vida. Embora o gênero Eubacterium seja descrito como um dos principais membros da microbiota intestinal, este foi encontrado em amostras de apenas duas crianças. A inclusão de dieta sólida e a mudança do tipo de amamentação influenciam a composição da microbiota. No entanto, não se pode estabelecer um padrão para a presença destes micro-organismos ao longo dos meses, mostrando que a microbiota é única e está sujeita a interferências ambientais. / The sequence of bacterial events that occurs during the colonization of the gastrointestinal tract may affect the future health of the host, particularly with respect to the regulation of the naive immune system. A clear understanding of the colonization process of the human neonatal gut in developing countries is lacking because the few available studies were mostly performed using culture techniques. The aim of this study was to detect and quantify the bacterial genera Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus and Lactococcus, important anaerobic components of the intestinal microbiota using real-time PCR. The study group comprised 10 children followed during the first year of life, living in low socio-economic conditions in São Paulo, Brazil. Fecal samples were evaluated at times of 24 hours, 7 days, 30 days, 3 months, 6 months and 1 year. During the first year of life, there is an increased amount of Bifidobacterium spp. compared to others studied anaerobic bacteria, with averages ranging from 8,27x1010 to 2,51x1012 DNA copy number/g of feces. Lacotbacillus was also found in all studied time point, with averages ranging from 4,03x108 to 1,46x1010 DNA copy number/g of feces. Bacterial genus Lactococcus is found in smaller quantities. The maximum counts of these genera were found between the third to sixth month of life. Although the genus Eubacterium is described as one of the leading members of the intestinal microbiota, this was found in samples of only 2 children. The inclusion of solid diet and change of type of feeding influences the composition of the microbiota, however, could not set a standard for the presence of these micro-organisms over the months, showing that the microbiota is unique and is subject to environmental interference.

A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma grave zoonose, causada pela Leishmania infantum (syn. chagasi). O ciclo deste parasito é heteroxeno e a transmissão acontece principalmente pela picada da fêmea do vetor, dípteros da espécie Lutzomyia longipapis. O cão doméstico é o principal alvo das campanhas de controle da doença por ser a principal fonte de infecção para o vetor no ambiente urbano. O Ministério da Saúde adota testes sorológicos para a detecção de animais positivos; no entanto a sensibilidade e especificidade desses testes são questionáveis. Além das falhas inerentes a qualquer teste diagnóstico, no caso da LVC existem alguns entraves, especialmente pela distribuição geográfica, comum a outras doenças causadas por tripanossomas, e pela similaridade genética com os outros parasitas da mesma família. Nessas áreas de sobreposição pode haver tanto reação cruzada quanto co-infecção, dificultando a interpretação dos testes. No presente estudo, foram coletadas amostras de suabe conjuntival e sangue de cães em inquérito soroepidemiológico realizado no município de Ilha Solteira - SP. A presença de Leishmania spp. e Leishmania infantum foram testadas por PCR convencional e PCR em tempo real com primers direcionados ao kDNA de Leishmania spp. A avaliação sorológica foi realizada através da RIFI, e a identificação e caracterização dos tripanossomatídeos foi realizada através da PCR com primers ITS1. A SC-qPCR foi o teste que detectou o maior número de animais. De 204 cães utilizados no estudo, 19,12% (30/204) foram positivos na SC-qPCR. Na SG-qPCR foram 12,74% (26/204) de animais positivos. O teste que detectou o menor número de animais foi a SC-cPCR, com 10,78% (22/204). Enquanto na SG-cPCR obtivemos 13,23% (27/204) animais positivos. De 28 amostras selecionadas para o sequenciamento do gene ITS1, 19 (67,85%) foram 100 ou 99% similares à L. infantum, sugerindo que a maioria dos cães positivos para LVC estavam realmente infectados com esta espécie. Entretanto, 2 cães (7,14%), que tiveram suas amostras sequenciadas para tal gene, revelaram 99% de similaridade com Crithidia fasciculata. Dos testes avaliados, esses cães foram positivos apenas na SG-cPCR para Leishmania spp. Os resultados indicam que a SC-qPCR foi o teste mais eficaz em detectar amostras realmente positivas para L. infantum, e que se deve atentar ao fato de existirem outros tripanossomatídeos infectando os cães em área endêmica de LVC, podendo dificultar o diagnóstico adequado dos animais infectados por L. infantum. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a serious zoonosis caused by Leishmania infantum (syn. chagasi). The life cycle of this parasite is heteroxenous and the transmission occurs through the bite of the female sandfly, diptera species Lutzomyia longipalpis. The domestic dog is the main focus disease control campaigns, since it is the most important source of infection for the vector in urban environment. For positive dogs detection the health ministry uses serological tests, however the sensitivity and specificity of these tests are questionable. In addition to flaws inherent in any diagnostic test, in case of CVL there are some obstacles, especially by geographic distribution, common to other diseases caused by trypanosomes, and also by genetic similarity with other parasites of the same family. In areas of disease overlap, cross-reaction or co-infection may occur, making it difficult to interpret the results. In this study, conjunctival swab samples and whole blood of dogs were collected in seroepidemiological survey conducted in Ilha Solteira - SP. The presence of Leishmania spp. and Leishmania infantum were tested by conventional PCR and real-time PCR with Leishmania spp. kDNA-targeted primers. The serological evaluation was carried out by RIFI, and the identification and characterization of trypanosomatids was performed by PCR with ITS1 primers. SC-qPCR was the test that detected the largest number of animals. Of 204 dogs used in this study, 19.12% (30/204) were positive in SC-qPCR. In SG-qPCR 12.74% (26/204) animals were positive. The test that detected the lowest number of animals was SC-cPCR, with 10.78% (22/204). While in the SG-cPCR we obtained 13.23% (27/204) positive animals. From 28 samples selected for ITS1 gene sequencing, 19 (67.85%) were 100 or 99% similar to L. infantum, suggesting that most CVL positive dogs were infected with this species. However, two dogs (7.14%), which had their samples sequenced for the same gene, showed 99% similarity with Crithidia fasciculata. From the evaluated tests, these dogs were only positive in SG-cPCR for Leishmania spp. The results indicate that SC-qPCR was the most effective test to detect L. infantum positive samples , and it should be noted that there are other trypanosomatids infecting dogs in an endemic CVL area, which can difficult to diagnose animals properly infected by L. infantum.

O objetivo do estudo foi avaliar, o efeito do laser de Diodo 808nm como coadjuvante ao tratamento periodontal na redução de periodontopatógenos Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real. Foram selecionados vinte e quatro pacientes portadores de periodontite crônica neste estudo de boca dividida, duplo cego e randomizado. Dois sítios uniradiculares de cada paciente foram utilizados e divididos em dois grupos experimentais: TESTE - raspagem alisamento polimento corono radicular (RAPCR) associado à duas aplicações de laser de Diodo de alta potência (comprimento de onda de 808nm, 1,5 Watts, 597,1 W/cm2, durante 20 segundos no modo contínuo). A primeira aplicação foi realizada 24 horas após RAPCR e a segunda após sete dias; CONTROLE foi realizado o mesmo procedimento porém sem a aplicação do laser. O biofilme subgengival foi coletado antes do tratamento e seis semanas após a segunda aplicação do laser. A avaliação microbiológica foi feita através da Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real para a quantificação de Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia. A comparação entre os grupos não demonstram diferenças estatisticamente significantes (p<0,05). Concluiu-se que, dentro dos limites deste estudo, a aplicação do laser de Diodo de 808nm como coadjuvante ao tratamento periodontal não reduziu de forma significativa os periodontopatógenos: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia quando comparado à RAPCR. / The aim of this study was to evaluate, by real-time polymerase chain reaction, the effect of Diode laser 808nm as an adjuvant in the reduction of Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia in to periodontal treatment. Twenty-four patients with chronic periodontitis the study designs was split-mouth, double blind and ramdomized controlled trial. Two sites from uniradicular teeth of each patient were used and divided in two experimental groups: TEST scalling and root planing (SRP) associated with two high power Diode laser application (wavelength of 808nm, 1,5W at the display (597,1 W/cm2) for 20 seconds in the continuous-wave mode) the first laser application was 24 hours after SRP and the second seven days later; CONTROL a similar procedure without laser application. The subgingival biofilm was colleted before treatment and six weeks after the second laser application. The microbiologic evaluation was done by real-time polymerase chain reaction for the quantification of Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia. The comparison between the groups did not show significant differences (p<0,05). Within the limits of this study, it can be concluded that Diode laser 808nm application as an adjuvant in the periodontal treatment did not reduce the periodontal pathogens Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tannerella forsythia when compared by scaling root planning.

A transformação plastidial oferece uma série de vantagens em relação à transformação nuclear, como: altos níveis de expressão de proteínas, capacidade de expressar múltiplos transgenes em operons e contenção gênica pela ausência de transmissão pelo pólen. Devido ao alto número de cópias do genoma plastidial por cloroplasto e ao alto número de cloroplastos por células vegetais, são necessários ciclos de regeneração sob condições seletivas para obter transformantes homoplásmicos. A análise de homoplasmia é realizada pela metodologia de Southern blot ou pelo teste de herança do transgene pela germinação de sementes em meio seletivo. O Southern blot é trabalhoso, demorado e para maior sensibilidade envolve o uso de radioisótopos, enquanto o teste de germinação é realizado somente após a produção de sementes necessitando de um ciclo de reprodução da planta. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido, sensível e eficaz para determinar o grau de homoplasmia de plantas transplastômicas, baseado na técnica de PCR em tempo real. Folhas de fumo foram transformadas com vetores compostos pelos genes 9 dessaturase (pMR1), 15 dessaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) e 12/3 dessaturase (pMR10), todos contendo o gene de seleção aadA. No total, 44 plantas foram obtidas, sendo 21 plantas positivas para a inserção do transgene. O grau de homoplasmia foi determinado pela proporção entre o número de cópias do transgene e o número de cópias do gene endógeno. Inicialmente, misturas de DNA de plantas transplastômicas homoplásmicas (pMR1 e pMR3) com DNA de planta tipo selvagem foram preparadas para simular diferentes graus de homoplasmia. DNA da planta transplastômica ou do plasmídeo foi diluído em série para construção das curvaspadrão, com a quantidade dos genes sendo estimada por meio da plotagem nessas curvas. Os índices de homoplasmia detectados na PCR em tempo real foram compatíveis com os resultados do teste de germinação com valores abaixo de 1 para plantas heteroplásmicas, 1 para a planta homoplásmica e 0 para as plantas sem a inserção do transgene. Os resultados das análises de amostras coletadas após o primeiro ciclo de regeneração mostraram que 13 das 21 plantas já se apresentavam em estado homoplásmico não sendo necessários mais ciclos de regeneração. A PCR em tempo real mostrou ser um método eficiente para análise do grau de homoplasmia de plantas transplastômicas. / Plastid transformation offers several advantages in relation to nuclear transformation, such as high-level of protein expression, the feasibility of expressing multiple transgenes in operons and gene containment through the lack of pollen transmission. Due to the high copy number of plastidial genome in chloroplasts and the high number of chloroplasts per plant cells, regeneration cycles under selective conditions are necessary to obtain homoplasmic transformants. Homoplasmy analysis is performed by Southern blot methodology or transgene inheritance test through seed germination in selective medium. Southern blot is laborious, time consuming and for more sensitivity it would require the use of radioisotopes, while germination test can be performed only after seed production which require a plant reproduction cycle. The objective of this study was to develop a fast, sensitive and effective method to determine the homoplasmy degree of transplastomic plants, based on real-time PCR. Tobacco leaves were transformed with vectors containing the 9 desaturase (pMR1), 15 desaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) and 12/3 desaturase (pMR10) each one with the aadA selection gene. In total, 44 plants were obtained, of which 21 were positive for the insertion of the transgene. The homoplasmy degree was determined by the proportion between the number of transgene copies and the number of endogenous gene copies. Initially, mixtures of homoplastomic plants DNA (pMR1 and pMR3) with wild-type plant DNA were prepared to simulate different degrees of homoplasmy. Transplastomic plant DNA or plasmid DNA was diluted to construct the standard curves and the gene amount was detected by plotting in this curves. The homoplasmy rate detected in real-time PCR were consistent with the results of germination test with values below 1 for heteroplasmic plants, 1 for homoplasmic plants and 0 for plants without the transgene insertion. The results obtained from the samples collected after the first regeneration cycle showed that 13 of the 21 plants were already in a homoplasmic state and did not require more cycles of regeneration. The real-time PCR proved to be an effective method for analyzing the homoplasmy degree of transplastomic plants.

Endometriose é uma doença de etiopatogenia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina principalmente no peritônio pélvico e ovários, envolvendo predisposição genética, fatores ambientais, anatômicos, endócrinos e alterações imunológicas. Afeta 10 a 15 % das mulheres em idade reprodutiva e 35 a 50% das mulheres com infertilidade, dor pélvica ou ambos. Apesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia, sua etiologia ainda não está clara e várias são as teorias para explicá-la. O estudo de genes que regulam de alguma forma os processos envolvidos com a endometriose como o ID2 (proliferação celular), PRELP (matriz extracelular) e SMOC2 (angiogênese) pode ajudar a esclarecer o desenvolvimento da mesma. O objetivo desse trabalho foi analisar a expressão gênica destes genes em amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio eutópico e lesões endometrióticas peritoneais e 10 de endométrio eutópico e endometrioma ovariano com idade entre 18 e 40 anos e em 10 amostras de endométrio de mulheres sem endometriose (controle), padronizadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em fase proliferativa. O estudo foi realizado através de técnicas de Biologia Molecular como a Transcrição Reversa (RT-PCR) e análise quantitativa da expressão gênica (PCR em tempo real). A análise estatística mostrou que não houve diferença na expressão gênica entre o endométrio de mulheres sem endometriose e o endométrio eutópico de mulheres com endometriose. O gene ID2 foi mais expresso na fase avançada da endometriose quando comparada a inicial e no endometrioma ovariano quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose e o PRELP na lesão peritoneal quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Nas análises realizadas com todas as lesões endometrióticas juntas, o SMOC2 foi mais expresso na lesão (peritônio e ovário) quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Os resultados citados demonstram que a expressão dos genes estudados pode sofrer influência do meio peritoneal, podendo ser alterada dependendo do local da implantação (ovário ou peritôneo). / Endometriosis is a complex disease and its etiology is multifactorial, characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity especially in the pelvic peritoneum and ovaries, involving genetic predisposition, environmental factors, anatomical, endocrine and immunological changes. It affects 10 to 15% of women of reproductive age and 35 to 50% of women with infertility, pelvic pain or both. Despite being one of the most studied diseases in gynecology, its etiology remains unclear and there are several current theories to explain it. The study of genes that regulate the processes involved somehow with endometriosis as ID2 (cell proliferation), PRELP (extracellular matrix) and SMOC2 (angiogenesis) may help clarify its development. The aim of this study was to analyze the gene expression of these genes in tissue samples from 20 women paired with 10 endometrial tissue and 10 peritoneal endometriotic lesions 10 endometrial tissue and 10 ovarian endometriotic lesions in proliferative phase of the menstrual cycle. Sixteen samples of endometrium of women without endometriosis, in the same phase of the menstrual cycle were collected to control (C). The study was conducted through molecular biology techniques such as reverse transcription (RT-PCR) and quantitative gene expression analysis (real-time-time PCR). Statistical analysis showed no difference in gene expression between the endometrium of women without endometriosis and endometrium from women with endometriosis. Showed a greater expression of the ID2 gene in advanced stage of endometriosis when compared to the initial stage and ovarian endometrioma compared to eutopic endometrium of women with endometriosis and PRELP in peritoneal lesion compared to eutopic endometrium of women with endometriosis. In the analysis performed with all lesions the SMOC2 was expressed more in the lesions (ovarian and peritoneal) compared to the eutopic endometrium of women with endometriosis. The results cited show that the expression of the genes studied may be influenced through the peritoneal cavity, and may be modified depending on the implantation site (ovary or peritoneum).