O uso de culturas GM (geneticamente modificadas) tem sido questionado quanto ao destino dos produtos derivados da transgenia no ambiente. Com a liberação de exsudatos das raízes das plantas e a decomposição dos resíduos culturais, aumenta-se a quantidade de DNA transgênico no ambiente, que pode ser adsorvido à superfície ativa das partículas do solo e/ou degradado pela ação de enzimas microbianas. A comunidade microbiana do solo pode entrar em contato direto com estes produtos, aumentando a probabilidade de transferência horizontal de fragmentos de DNA transgênico para os microrganismos. Também, alterações na composição dos exsudatos das plantas GM e mudanças em função das práticas de manejo, podem resultar em alterações na composição funcional e estrutural da comunidade microbiana. Assim, faz-se necessário avaliar a persistência dos produtos derivados da transgenia no solo e seus possíveis efeitos sobre a comunidade microbiana. Os objetivos deste estudo foram: avaliar a persistência dos fragmentos 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta da construção gênica do milho Bt (evento MON810) em diferentes tipos de solo e temperaturas, em condições de microcosmo e de campo; e determinar a abundância do número de cópias dos gene 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea, e 18S rRNA de Fungo nas mesmas condições, e avaliar a estrutura da comunidade bacteriana em áreas agrícolas de cultivo de milho Bt. No primeiro estudo, o DNA do milho Bt MON810 foi adicionado em solos arenoso e argiloso. Como controle negativo, apenas água estéril foi misturada ao solo. Amostras de solo foram incubadas a 15 e 25ºC. Em campo, os solos foram amostrados em três áreas agrícolas em Fátima do Sul, MS, em dois anos consecutivos. Após extração de DNA, os fragmentos foram quantificados por qPCR. No segundo estudo, foram determinadas a abundância dos genes 16S rRNA de Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria e Archaea e 18S rRNA de Fungo e avaliada a estrutura da comunidade bacteriana por T-RLFP. Os resultados mostraram que em condições de microcosmo, os fragmentos hsp70-cry1Ab e cry1Ab-planta persistiram até 291 dias, e o fragmento 35S-hsp70 até 180 dias. A temperatura e o tipo de solo não afetaram a persistência dos fragmentos. Em campo, o número de cópias desses fragmentos foi maior na segunda coleta. No segundo estudo, o número de cópias do gene 16S rRNA de Bacteria aumentou com adição de DNA do milho Bt nos microcosmos, e uma redução do número de cópias foi verificada para Archaea, Verrucomicrobia e Fungo. Para Firmicutes, os resultados não foram consistentes. As temperaturas não resultaram em efeito na abundância dos genes, enquanto o tipo de solo teve efeito apenas para Archaea e Verrucomicrobia. Áreas agrícolas com cinco anos de cultivo de milho Bt apresentaram variações na estrutura da comunidade bacteriana em nível de filo, e maior abundância de Fungos no segundo ano de amostragem, enquanto em área com um ano de cultivo, observouse uma redução da população de Firmicutes e Verrucomicrobia. Os maiores efeitos na comunidade microbiana foram verificados entre os anos de amostragem / The use of GM (genetically modified) crops has been questioned about the fate of transgenes is derived products on the environment. With the release of exudates from roots of GM plants and the decomposition of its residues, the amount of transgenic DNA in the environment increases, which can be adsorbed to the active surface of soil particles and/or be degraded by the action of microbial enzymes. Soil microbial communities can come into direct contact with these products, raising the probability of horizontal transfer of transgenic DNA fragments to soil microorganisms. Moreover, changes in exudates composition of GM plants and changes depending on the management practices may result in structural and functional alterations in the microbial community. Thus, it is necessary to evaluate the persistence of transgenes is derivatives in the soil and effects on microbial community. The objectives of this study were to assess the persistence of fragments 35S-hsp70, hsp70-cry1Ab and cry1Abplant from the genetic construct of Bt corn (event MON810) in different soil types and temperatures, in microcosm and field conditions; and to determine the abundance of 16S rRNA copy number of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi under the same conditions, and to evaluate the structure of bacterial communities in agricultural areas of Bt corn cultivation. In the first study, DNA from Bt corn MON810 was added to sandy and clay soils. As negative control, only sterile water was mixed with soil. Soil samples were incubated at 15 and 25°C. At the field, soils were sampled in three agricultural areas in Fátima do Sul, MS, in two consecutive years. After DNA extraction, fragments were quantified by qPCR. In the second study, the abundance of 16S rRNA of Bacteria, Firmicutes, Verrucomicrobria and Archaea and 18S rRNA of Fungi were determined and the structure of bacterial communities was evaluated by T-RFLP. The results showed that in microcosm conditions, hsp70-cry1Ab and cry1Ab-plants fragments persisted until 291 days and the 35S-hsp70 up to 180 days. The temperature and the type of soil did not affect the persistence of fragments. In field, the copy number of these fragments was greater in the second sampling. In the second study, the copy number of 16S rRNA of Bacteria increased with the addition of DNA from Bt corn in microcosm, and a reduction in copy number was observed for Archaea, Verrucomicrobia and Fungi. The results were not consistent for Firmicutes. Temperatures resulted in no effect in gene abundance, while the soil was effective only for Archaea and Verrucomicrobia. Agricultural areas with five years of Bt corn cultivation showed variations in bacterial community structure at the phylum level, and greater abundance of fungi in the second year of sampling, while in the area with a year of cultivation, a reduction in population of Firmicutes and Verrucomicrobia was observed. The largest effects on the microbial community were observed between the sampled years

O objetivo do presente estudo foi detectar Leishmania spp. pela PCR em tempo real (qPCR) em amostras de DNA extraído de sangue e suabe conjuntival de cães, gatos e equinos. E também, verificar a positividade dessas amostras pela PCR convencional (cPCR), utilizando oligonucleotídeos específicos para L. infantum (inf.cPCR). Para isso, amostras de sangue e suabe conjuntival de 204 cães, 108 gatos e 54 equinos saudáveis foram testadas pela qPCR para Leishmania spp. e os resultados comparados pelo índice kappa a resultados de cPCR para Leishmania spp. (ssp.cPCR) previamente obtidos. A qPCR de sangue não detectou nenhum animal positivo. Já os resultados da qPCR de suabe conjuntival (qPCR-SC), revelaram 0,98% (2/204) de cães positivos. Ao comparar os resultados obtidos pela qPCR-SC com os resultados obtidos pela cPCR de suabe conjuntival (ssp.cPCR-SC), observou-se uma concordância baixa entre os métodos, k=0,32. Em relação aos gatos, 1,85% (2/108) desses animais foram detectados positivos para Leishmania spp. pela qPCR-SC, esse resultado corroborou com o resultado obtidos pela ssp.cPCR-SC o que resultou em uma excelente concordância entre os métodos comparados, k=1. Em relação aos equinos, 12,96% (7/54) dos animais foram detectados positivos para o parasito pela qPCR-SC. Esses resultados não possuem concordância com os resultados obtidos pela ssp.cPCR-SC, uma vez que por esse método, 66,66% (36/54) foram detectados infectados pela Leishmania spp. Ao realizar a inf.cPCR, 11,11% (6/54) dos equinos foram positivos. Submetidas ao sequenciamento, dois fragmentos apresentaram 99% de similaridade com sequencias de L. infantum disponíveis no GenBank. Enquanto a qPCR-SG não foi capaz de detectar Leishmania spp. em cães, gatos e equinos, a qPCR-SC foi capaz de detectar o parasito nas três espécies avaliadas. A associação entre a qPCR e o uso de um método prático, fácil e não invasivo, como o suabe conjuntival, representa um grande avanço no diagnóstico da doença em cães, gatos e equinos uma vez que, a qPCR-SC, foi capaz de detectar um maior número de animais infectados pela Leishmania spp. em relação a qPCR-SG. Além disso, a detecção de Leishmania spp. nas diferentes espécies avaliadas reforça a possível atuação desses animais como reservatórios de agentes da leishmaniose cutânea e a confirmação de L. infantum em equinos, associado à inexistência de sinais clínicos nestes animais revela a possibilidade de equinos serem reservatórios desse parasito. / The aim of this study was to detect Leishmania spp. by real-time PCR (qPCR) on DNA extracted from blood samples and conjunctival swab dogs, cats and equines. Also, check the positivity of these samples by conventional PCR (cPCR) using specific oligonucleotídeos for L. infantum (inf.cPCR). For this, blood samples and conjunctival swab of 204 dogs, 108 cats and 54 horses healthy were tested by qPCR for Leishmania spp. and the results compared by kappa index to cPCR results for Leishmania spp (ssp.cPCR). previously obtained. The blood qPCR detected no positive animal. Already the qPCR results of conjunctival swab (CS-qPCR), revealed 0.98% (2/204) of positive dogs. Comparing the results obtained by CS-qPCR with the results obtained by conjunctival swab cPCR (ssp.CS-cPCR), there was a low correlation between the methods, k = 0.32. In relation to cats, 1.85% (2/108) of these animals were detected positive for Leishmania spp. by CS-qPCR, this results corroborated with the results obtained by ssp.CS-cPCR which resulted in excellent agreement between the methods compared, k = 1. Already in horses, 12.96% (7/54) of the animals were found positive for parasites by CS-qPCR. These results not have agreement with the results obtained by ssp.CS-cPCR, since by this method, 66.66% (36/54) were found to be infected by Leishmania spp. When performing inf.cPCR, 11.11% (6/54) of the horses were positive. Submitted to sequencing, two fragments showed 99% similarity to L. infantum sequences available in the GenBank. While blood qPCR was not able to detect Leishmania spp. in dogs, cats and horses, CS-qPCR was able to detect the parasite in the three species evaluated. The association between the use of qPCR and a practical, easy and non-invasive method, such as conjunctival swab, is a great advance in the diagnosis of disease in dogs, cats and horses since CS-qPCR was able to detect a greater number of animals infected with Leishmania spp. in respect of blood qPCR. Furthermore, the detection of Leishmania spp. the different species evaluated reinforces the possible role of these animals as reservoirs of cutaneous Leishmaniasis agents and confirmation of L. infantum in equines associated with the absence of clinical signs in these animals reveals the possibility of equines being reservoirs of this parasite.

Endometriose é uma doença de etiopatogenia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina principalmente no peritônio pélvico e ovários, envolvendo predisposição genética, fatores ambientais, anatômicos, endócrinos e alterações imunológicas. Afeta 10 a 15 % das mulheres em idade reprodutiva e 35 a 50% das mulheres com infertilidade, dor pélvica ou ambos. Apesar de ser uma das doenças mais estudadas em ginecologia, sua etiologia ainda não está clara e várias são as teorias para explicá-la. O estudo de genes que regulam de alguma forma os processos envolvidos com a endometriose como o ID2 (proliferação celular), PRELP (matriz extracelular) e SMOC2 (angiogênese) pode ajudar a esclarecer o desenvolvimento da mesma. O objetivo desse trabalho foi analisar a expressão gênica destes genes em amostras teciduais pareadas de 20 mulheres, sendo 10 de endométrio eutópico e lesões endometrióticas peritoneais e 10 de endométrio eutópico e endometrioma ovariano com idade entre 18 e 40 anos e em 10 amostras de endométrio de mulheres sem endometriose (controle), padronizadas de acordo com a fase do ciclo menstrual em fase proliferativa. O estudo foi realizado através de técnicas de Biologia Molecular como a Transcrição Reversa (RT-PCR) e análise quantitativa da expressão gênica (PCR em tempo real). A análise estatística mostrou que não houve diferença na expressão gênica entre o endométrio de mulheres sem endometriose e o endométrio eutópico de mulheres com endometriose. O gene ID2 foi mais expresso na fase avançada da endometriose quando comparada a inicial e no endometrioma ovariano quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose e o PRELP na lesão peritoneal quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Nas análises realizadas com todas as lesões endometrióticas juntas, o SMOC2 foi mais expresso na lesão (peritônio e ovário) quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com endometriose. Os resultados citados demonstram que a expressão dos genes estudados pode sofrer influência do meio peritoneal, podendo ser alterada dependendo do local da implantação (ovário ou peritôneo). / Endometriosis is a complex disease and its etiology is multifactorial, characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity especially in the pelvic peritoneum and ovaries, involving genetic predisposition, environmental factors, anatomical, endocrine and immunological changes. It affects 10 to 15% of women of reproductive age and 35 to 50% of women with infertility, pelvic pain or both. Despite being one of the most studied diseases in gynecology, its etiology remains unclear and there are several current theories to explain it. The study of genes that regulate the processes involved somehow with endometriosis as ID2 (cell proliferation), PRELP (extracellular matrix) and SMOC2 (angiogenesis) may help clarify its development. The aim of this study was to analyze the gene expression of these genes in tissue samples from 20 women paired with 10 endometrial tissue and 10 peritoneal endometriotic lesions 10 endometrial tissue and 10 ovarian endometriotic lesions in proliferative phase of the menstrual cycle. Sixteen samples of endometrium of women without endometriosis, in the same phase of the menstrual cycle were collected to control (C). The study was conducted through molecular biology techniques such as reverse transcription (RT-PCR) and quantitative gene expression analysis (real-time-time PCR). Statistical analysis showed no difference in gene expression between the endometrium of women without endometriosis and endometrium from women with endometriosis. Showed a greater expression of the ID2 gene in advanced stage of endometriosis when compared to the initial stage and ovarian endometrioma compared to eutopic endometrium of women with endometriosis and PRELP in peritoneal lesion compared to eutopic endometrium of women with endometriosis. In the analysis performed with all lesions the SMOC2 was expressed more in the lesions (ovarian and peritoneal) compared to the eutopic endometrium of women with endometriosis. The results cited show that the expression of the genes studied may be influenced through the peritoneal cavity, and may be modified depending on the implantation site (ovary or peritoneum).

Nos últimos anos, o Brasil tem liderado a produção e exportação mundial de cana-de-açúcar e seus derivados. Com isso, a produtividade agrícola aumenta necessitando-se ampliar as pesquisas de caráter sócio-ambiental, a fim de modelar um desenvolvimento tecnológico mais próximo do sustentável. Desta forma, torna-se necessário conhecer a contribuição do plantio da cana-de-açúcar com o aumento da concentração de gases de efeito estufa na atmosfera, especialmente no que se refere ao óxido nitroso (N2O), derivado do uso de fertilizantes nitrogenados. Sabe-se que na ausência de oxigênio, bactérias específicas passam a reduzir compostos nitrogenados, formando este poderoso gás de aquecimento global durante as etapas decorrentes de um processo conhecido como desnitrificação biológica. Através dos avanços nas áreas da biologia molecular, tornou-se possível conhecer os microorganismos não cultiváveis e suas respectivas funções em um determinado ambiente. Este trabalho teve como objetivo estimar as emissões de N-N2O nos solos de cana-de-açúcar derivadas da aplicação de fertilizantes nitrogenados durante um período de trinta dias, em duas situações de manejo da cultura: I- Sem queima: colheita mecanizada com a manutenção da palha da cana; II-Com queima: colheita manual precedida pela queima da palha da cana. Simultaneamente, os genes envolvidos na desnitrificação e produção de N2O no solo (norB, nirK, nirS e nosZ) foram quantificados por PCR quantitativo em tempo real em condições de laboratório e de campo. Sob condições de laboratório, pode-se observar que as emissões de NN2O atingiram 0,8 mg.m-2 h-1 em solos com a manutenção da palha, tanto com a aplicação de uréia quanto de nitrato de amônio. Os mesmos produtos, quando aplicados em solos sem a presença da palha emitiram 0,45 mg.m-2 h-1. No campo, os maiores fluxos de N-N2O foram encontrados no período de elevada precipitação pluviométrica, que ocorreu na primeira semana após a aplicação do fertilizante nitrato de amônio, chegando a 0,7 mg.m-2 h-1 nos solos com palha e 0,37 mg.m-2 h-1 nos solos sem a palha. Tanto no campo quanto no laboratório foram encontradas as maiores quantidades dos genes envolvidos na desnitrificação em solos com a permanência da palha, com valores próximos de 107 genes por grama de solo. A atual tendência a substituir a colheita manual da cana pela colheita mecanizada favorece a agregação do solo, diminui o grau de erosão e aumenta os estoques de carbono, mas também pode resultar em aumento das emissões de N-N2O e do fator de emissão dos fertilizantes nitrogenados, conforme encontrado para o nitrato de amônio aplicado no campo, onde o valor obtido foi de 0,3% para os solos sem a palha e 0,7% para solos com palha. Sendo assim, é fundamental estudar as melhores condições do uso da terra e o papel exercido pela microbiota que nela existe, proporcionando um tratamento mais adequado aos resíduos culturais, diminuindo assim as emissões de gases estufas. / In recent years, Brazil has led the production and worldwide export of sugarcane and its products. Thus, agricultural productivity increases need to expand research of socio-environmental, in order to model a technology development closer sustainable. Therefore, it is necessary to know the contribution of planting sugarcane with increasing concentration of greenhouse gases in the atmosphere, especially with regard to nitrous oxide (N2O), derived from nitrogenous fertilizer use. It is known that in the absence of oxygen, bacteria are specific to reduce nitrogen, forming this powerful global warming gas arising during the stages of a biological process known as denitrification. Through advances in molecular biology, it has become possible to know the non-cultivable micro-organisms and their functions in a given environment. This study aimed to measure the emissions of N-N2O in soils of sugarcane derived from the application of nitrogen fertilizers for a period of thirty days, in two situations crop management: I-No burning: mechanized harvesting with maintaining cane straw; II-With burning: manual harvest preceded by burning the straw. Simultaneously, the genes involved in denitrification and N2O production in soil (norB, nirS, nirK, and nosZ) were quantified by real-time quantitative PCR in the laboratory and the field. Under laboratory conditions, it can be seen that the N-N2O reached 0,8 mg.m-2 h-1 in soils with maintaining the straw, either with the application of urea and ammonium nitrate. The same products, when applied to soils without the presence of straw delivered 0,45 mg.m-2 h-1. In the field, the highest N-N2O fluxes were found in the period of high rainfall, which occurred in the first week after application of ammonium nitrate, reaching 0,7 mg.m-2 h-1 in soils with straw and 0,37 mg.m-2 h-1 in the soil without straw. Both in the field and in the laboratory were found greater amounts of genes involved in denitrification in soils fertilized with the permanence and straw, with values close to 107 per gram of soil. The current trend is to replace manual harvesting of sugarcane by mechanized harvesting promotes soil aggregation, decreases the degree of erosion and increases carbon stocks, but can also result in increased emission factor of nitrogen fertilizers, as found for nitrate applied in the field, where the value was 0,3% for the soil without straw and 0.7% for soils with straw. Therefore, it is essential to study the best conditions of land use and the role played by the microbiota that is therein, providing appropriate treatment to crop residues, thus reducing greenhouse gas emissions.

A transformação plastidial oferece uma série de vantagens em relação à transformação nuclear, como: altos níveis de expressão de proteínas, capacidade de expressar múltiplos transgenes em operons e contenção gênica pela ausência de transmissão pelo pólen. Devido ao alto número de cópias do genoma plastidial por cloroplasto e ao alto número de cloroplastos por células vegetais, são necessários ciclos de regeneração sob condições seletivas para obter transformantes homoplásmicos. A análise de homoplasmia é realizada pela metodologia de Southern blot ou pelo teste de herança do transgene pela germinação de sementes em meio seletivo. O Southern blot é trabalhoso, demorado e para maior sensibilidade envolve o uso de radioisótopos, enquanto o teste de germinação é realizado somente após a produção de sementes necessitando de um ciclo de reprodução da planta. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido, sensível e eficaz para determinar o grau de homoplasmia de plantas transplastômicas, baseado na técnica de PCR em tempo real. Folhas de fumo foram transformadas com vetores compostos pelos genes 9 dessaturase (pMR1), 15 dessaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) e 12/3 dessaturase (pMR10), todos contendo o gene de seleção aadA. No total, 44 plantas foram obtidas, sendo 21 plantas positivas para a inserção do transgene. O grau de homoplasmia foi determinado pela proporção entre o número de cópias do transgene e o número de cópias do gene endógeno. Inicialmente, misturas de DNA de plantas transplastômicas homoplásmicas (pMR1 e pMR3) com DNA de planta tipo selvagem foram preparadas para simular diferentes graus de homoplasmia. DNA da planta transplastômica ou do plasmídeo foi diluído em série para construção das curvaspadrão, com a quantidade dos genes sendo estimada por meio da plotagem nessas curvas. Os índices de homoplasmia detectados na PCR em tempo real foram compatíveis com os resultados do teste de germinação com valores abaixo de 1 para plantas heteroplásmicas, 1 para a planta homoplásmica e 0 para as plantas sem a inserção do transgene. Os resultados das análises de amostras coletadas após o primeiro ciclo de regeneração mostraram que 13 das 21 plantas já se apresentavam em estado homoplásmico não sendo necessários mais ciclos de regeneração. A PCR em tempo real mostrou ser um método eficiente para análise do grau de homoplasmia de plantas transplastômicas. / Plastid transformation offers several advantages in relation to nuclear transformation, such as high-level of protein expression, the feasibility of expressing multiple transgenes in operons and gene containment through the lack of pollen transmission. Due to the high copy number of plastidial genome in chloroplasts and the high number of chloroplasts per plant cells, regeneration cycles under selective conditions are necessary to obtain homoplasmic transformants. Homoplasmy analysis is performed by Southern blot methodology or transgene inheritance test through seed germination in selective medium. Southern blot is laborious, time consuming and for more sensitivity it would require the use of radioisotopes, while germination test can be performed only after seed production which require a plant reproduction cycle. The objective of this study was to develop a fast, sensitive and effective method to determine the homoplasmy degree of transplastomic plants, based on real-time PCR. Tobacco leaves were transformed with vectors containing the 9 desaturase (pMR1), 15 desaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) and 12/3 desaturase (pMR10) each one with the aadA selection gene. In total, 44 plants were obtained, of which 21 were positive for the insertion of the transgene. The homoplasmy degree was determined by the proportion between the number of transgene copies and the number of endogenous gene copies. Initially, mixtures of homoplastomic plants DNA (pMR1 and pMR3) with wild-type plant DNA were prepared to simulate different degrees of homoplasmy. Transplastomic plant DNA or plasmid DNA was diluted to construct the standard curves and the gene amount was detected by plotting in this curves. The homoplasmy rate detected in real-time PCR were consistent with the results of germination test with values below 1 for heteroplasmic plants, 1 for homoplasmic plants and 0 for plants without the transgene insertion. The results obtained from the samples collected after the first regeneration cycle showed that 13 of the 21 plants were already in a homoplasmic state and did not require more cycles of regeneration. The real-time PCR proved to be an effective method for analyzing the homoplasmy degree of transplastomic plants.

Resumo: A divergência genética entre Bos taurus taurus e Bos taurus indicus é estimada em ~ 250.000 anos mas, apesar dessa proximidade filogenética, estes dois grupos de bovinos apresentam diferenças marcantes em relação à taxa de crescimento muscular e a maciez da carne. De maneira que este estudo foi delineado para avaliar perfil da expressão gênica diferencial no musculo Longissimus dorsi das raças Nelore e Aberdeen Angus com o objetivo de identificar conjuntos de genes cuja expressão está associada à manifestação das características acima mencionadas. Vinte bezerros machos de cada raça foram criados e terminados em regime de confinamento, metade dos quais foi abatida aos 15 e a metade restante aos 19 meses de idade. Nossos resultados sugerem fortemente que a ação autócrina e/ou parácrina do IGF-1 produzido no tecido muscular deve exercer um papel crucial na modulação da taxa de crescimento muscular e na maciez da carne de bovinos. Por outro lado, nossa análise das redes de interação gênica mostrou um grande número de genes que codificam proteínas que agem na proteólise muscular, pequeno número de inibidores e reguladores de proteases, assim como diversos genes relacionados com a morte celular programada nos animais que apresentaram maior maciez da carne, reforçando a hipótese do envolvimento de um complexo multi-enzimático (incluindo as calpaínas e outras proteases) no processo de amaciamento da carne, o qual seria semelhante ao processo de apoptose. / Abstract: The genetic divergence between Bos taurus taurus and Bos taurus indicus is estimated to be ~ 250.000 years but, in despite of their phylogenetic proximity, this two bovine groups show remarkable differences in regard to the muscle growth rate and meat tenderness. Thus, this study was aimed to evaluate the differential gene expression profile in Longissimus dorsi muscle of Nellore and Aberdeen Angus breeds in order to identify set of genes whose expression is associated with the manifestation of the above-mentioned traits. Twenty male calves of each breed were grown and finished in the feedlot system, half of which was slaughtered at 15 and the remaining half at 19 months of age. Our results strongly suggest that the autocrine and/or paracrine action of the IGF-1 produced in the muscle might play a crucial role in the modulation of muscle growth rate and meat tenderness in beef cattle. On the other hand, our gene interaction network analysis revealed a large number of genes encoding proteins acting in the skeletal muscle proteolysis, a small number of inhibitors and regulators of proteases, as well as several genes related to the programmed cell death in animals that had greater tenderness of meat, reinforcing the hypothesis of the involvement of a multi-enzymatic complex (including calpains and other proteases) in the meat tenderization process, which resembles the apoptosis process. / Orientador: Luiz Roberto Furlan / Coorientadora: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Leandro Marcio Moreira / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Doutor

Os rotavírus são um dos principais agentes causadores de doenças entéricas em várias espécies animais, com ocorrência generalizada na suinocultura do Brasil. O seu diagnóstico é um componente essencial para estudos epidemiológicos e delimitação de medidas profiláticas visando o controle da doença. Apesar da relevância, não existem testes, tais como PCR em tempo real desenvolvido para detectar a diversidade genética de rotavírus suíno do grupo A (RVA). Este trabalho descreve o desenvolvimento de uma PCR em tempo real com SYBR® Green, para a detecção de rotavírus suíno e os seus resultados comparados com a PCR convencional e ELISA. Foram desenhados primers visando o segmento codificador da proteína NSP5 (137pb) e também foram utilizados primers visando o mRNA do gene mitocondrial bovino NADH5 (191pb) para o controle interno exógeno. Amostras de fezes de suínos de até 60 dias de idade de suínos do estado de São Paulo foram usadas para compor um painel de teste. Foram utilizadas como amostras de referencia o isolado 32/00 (controle positivo de rotavírus suíno do grupo A), concentrado de células MDBK (controle positivo do controle interno exógeno) e água tratada com DEPC (controle negativo). A extração do RNA total foi realizado com Trizol a partir de suspensões fecais contendo MDBK e o cDNA foi sintetizado utilizando primers aleatórios e M-MLV. Para as reações de PCR em tempo real utilizou-se o reagente MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Life Science). Durante a padronização da PCR convencional, a temperatura de 54°C foi definida como a Tm ótima para a reação. O desempenho do ensaio foi validado em sete amostras positivas inicialmente testadas pelos métodos ELISA e PAGE. O isolado viral RV8209 foi utilizado para determinar o limiar de detecção da PCR em tempo real através de diluições seriadas sendo defino como ponto de corte Ct=33,5 (10-12,28TCID50%). O segmento codificador da NSP5 foi clonado no vetor pTZ57R/T submetido a restrição enzimática e usado como alvo para gerar uma curva padrão, onde obteve-se uma eficiência de 93,39%, slope de -3,49 e R2 de 0,993. A detecção do controle interno exógeno mostrou 82,9% de positividade para PCR convencional e 76,31% para a PCR em tempo real, com correlação significativa (0,718). O ensaio de ELISA para RVA apresentou 10,5% (8/78) de positividade, enquanto que as taxas de detecção da PCR em tempo real e PCR convencional foram de 50% (29/58) e 30,1% (24/63), respectivamente. Foi encontrada uma correlação moderada (0,546) entre PCR convencional e PCR em tempo real; baixa (0,056) entre a PCR convencional e ELISA; ausente (0,0) entre a PCR em tempo real e ELISA. Os resultados obtidos sugerem que a detecção por PCR em tempo real para a detecção do rotavírus suíno do grupo A em amostras fecais possa ser utilizada como diagnostico rápido e eficiente aumentando o repertório dos testes já estabelecidos, de modo a proporcionar uma maior sensibilidade para o diagnóstico clínico e epidemiológico. / Rotavirus is one of the main causative agents of enteric diseases in several animal species with widespread occurrence in Brazilian pig farm. Diagnosis is an essential component for epidemiological studies and delineation of prophylactic measures aiming disease control. Despite the relevance, there are no assays such as real-time PCR developed to detect the genetic diversity of porcine rotavirus from group A (RVA). This work describes the development of SYBR Green real-time PCR assay for the detection of porcine rotavirus and the results were compared with conventional PCR and ELISA. Primers were designed targeting the coding segment of the protein NSP5 (137pb) and also primers targeting the bovine mitochondrial gene mRNA NAD5 (191pb) were used for the exogenous internal control. Fecal samples from pigs up to 60 days of age from São Paulo state were used to compose a panel test. The reference sample was the isolate 32/00 (positive control for porcine rotavirus group A), concentrated MDBK cells (Exogenous Internal Positive Control) and DEPC-treated water (negative control). Total RNA extraction from supernatants of fecal samples containing MDBK cells were carried out with TRIzol reagent and cDNA was synthesized using random primers and M-MLV Reverse Transcriptase. For real-time PCR reactions were used MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Life Science). For conventional PCR optimization, 54oC was defined as the optimum reaction temperature (Tm). The performance of the assay was validated on seven samples initially tested positive by ELISA and PAGE methods. The limit of detection of the developed real-time-PCR assay was determined using serial dilutions of the isolated RV8209 with Ct=33,5 (10-12,28TCID50%). The NSP5 gene segment was cloned into vector pTZ57R/T submitted to enzymatic restriction and used as template to generate a standard curve which Efficiency of 93.39%, slope of -3.49 and R2 □ 0.993. The Exogenous internal control showed 82.9% positivity for conventional PCR and 76.31% for real-time PCR with substantial correlation (0.718). The ELISA assay detected porcine RVA in 10,5% (8/78) of fecal samples, whereas the detection rates of both SYBR Green real-time PCR and conventional PCR assays were 50% (29 of 58) and 30.1% (24 of 63), respectively. A moderate correlation (0.546) was found between conventional PCR and real-time PCR; low (0.056) between the conventional PCR and ELISA; absent (0.0) between the real-time PCR and ELISA. Our findings suggest that detection of Group A porcine rotavirus in fecal samples by use of the real-time PCR assay may be fast and efficient increasing the repertoire of tests established to improve sensitivity for epidemiology and clinical diagnosis.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-02-11T11:04:21Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nadielly Xavier de Medeiros - 2013.pdf: 1507098 bytes, checksum: 3e76159239ff4a156048bd0d749eb1ac (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-02-11T11:08:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Nadielly Xavier de Medeiros - 2013.pdf: 1507098 bytes, checksum: 3e76159239ff4a156048bd0d749eb1ac (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-11T11:08:43Z (GMT). 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In order to investigate the presence of Salmonella in slaughterhouses, this study aimed to evaluate swabs of picking machines and evisceration flume, carcasses, hearts, livers, and gizzards of poultry. Laboratory tests were developed in the Laboratory of Bacteriology and Molecular Biology, Department of Veterinary Preventive Medicine, Medicine Veterinary College and Animal Science of the Universidade Federal de Goiás (Federal University of Goiás), and circumscribed to the laboratory research of pre-enrichment broths composed of peptone water to 1%, added to the samples. Therefore, after inoculation of broth samples were incubated for a period of 18 to 24 hours, and then frozen at -18 °C for a later analyzes. The analytical methods of choice for detecting Salmonella sp. were conventional polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR, there had been also check for previous studies with conventional bacterial isolation and VIDAS - SLM. Target genes were, respectively, iroB and bipA, associated to bacterial virulence and its adaptation face to stressful situations. Gizzard was the sample category with the largest contamination percentage (13.3%). The real-time PCR technique was able to identify a greater number of positive samples, 22 (7.3%) compared to 5 (1.6%) by conventional PCR; however, there was no equivalent to the most previous results of total bacterial isolation. In conclusion, Real-time PCR can expedite the laboratory diagnosis, being made selective enrichment with immediately pre-application of the culture method, and salmonella is present in poultry source food, in installations, and equipment. / Salmonella é reconhecida como agente etiológico de intoxicações alimentares e classifica-se como um dos microrganismos de maior relevância à saúde pública, bem como ao monitoramento dos plantéis avícolas. Esta bactéria está amplamente distribuída no meio ambiente, e possui portadores assintomáticos, o que, também, favorece sua disseminação durante etapas do processamento de alimentos, transformando-se em grande problema para as agroindústrias. O monitoramento de patógenos em abatedouros de aves demanda a aplicação de metodologias rápidas e confiáveis. Com o intuito de investigar a presença de Salmonella em abatedouros, objetivou-se avaliar suabes de depenadeiras e de calhas de evisceração, carcaças, coração, fígado e moela de aves. As análises laboratoriais foram desenvolvidas no Laboratório de Bacteriologia e Biologia Molecular, do Setor de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás e circunscreveram-se à investigação laboratorial de caldos de pré-enriquecimento compostos por água peptonada a 1%, adicionados das amostras. Para tanto, após a inoculação das amostras os caldos foram incubados pelo período de 18 a 24 horas e em seguida congelados a temperatura de -18°C, para posteriormente, serem analisados. Os métodos analíticos de eleição, para detecção de Salmonella sp., foram a reação em cadeia pela polimerase (PCR) convencional e PCR em tempo real, havendo também verificação para estudos prévios com isolamento bacteriano convencional e VIDAS-SLM. Os genes alvo foram, respectivamente, iroB e bipA, associados à virulência da bactéria e sua adaptação frente às situações de estresse. Moela foi a categoria de amostra de maior percentual de contaminação (13,3%). Verificou-se que a técnica de PCR em tempo real foi capaz de identificar maior número de amostras positivas, 22 (7,3%) em comparação à PCR convencional que detectou cinco (1,6%), no entanto, não houve equivalência à maioria dos resultados prévios do isolamento bacteriano total. Conclui-se que a PCR em tempo real pode agilizar o diagnóstico laboratorial, sendo feito pré-enriquecimento seletivo com aplicação do meio de cultura de forma imediata e que Salmonella está presente em alimentos de origem avícola e em instalações e equipamentos.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Janaina Roriz Hipolito.pdf: 4312682 bytes, checksum: ecb7ef268b16e006660e9770d5f663b4 (MD5) Previous issue date: 2006-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / A malária é um problema de saúde pública na região Amazônica, mais de 200 mil casos dessa doença ocorrem anualmente no Amazonas, sendo 80% deles causados pelo P. vivax, que vem apresentando índices crescentes de morbidade, principalmente associados à diminuição da sensibilidade aos antimaláricos. Dentre as estratégias para combate e controle da doença, a identificação rápida e precisa da espécie é ferramenta indispensável para um tratamento apropriado, diminuição do risco de transmissão e melhor entendimento da epidemiologia desses parasitas. A técnica microscópica da gota espessa é a principal para diagnóstico da malária, entretanto, outros métodos vêm sendo testados, principalmente os moleculares que tem se mostrado mais sensíveis e específicos para detectar e diferenciar as espécies em baixas parasitemias. Avanços desse método, como a PCR em tempo real, permitem que o resultado do teste seja detectado simultaneamente a amplificação, diminuindo o tempo gasto para a realização do diagnóstico. Com o intuito de detectar molecularmente a malária, verificando a presença de plasmódios, o diagnóstico molecular foi realizado através das técnicas de PCR em tempo real e nested-PCR, para se fazer uma comparação desses dois métodos com o diagnóstico microscópico da gota espessa em 300 amostras criopreservadas, 200 coletadas no dia inicial do tratamento (D0), das quais 88% (176/200) eram provenientes de pacientes de Manaus, as 24 amostras restantes (12%) eram provenientes de localidades do interior do Amazonas: São Gabriel da Cachoeira (09), Tefé (08), Humaitá (04) e Careiro (03). Apenas 9% dessas amostras tinham diagnóstico microscópico de monoinfecção por P. falciparum e 91% (182/200) por P. vivax, não havia nenhuma amostra mista pelo diagnóstico microscópico. O diagnóstico molecular por nested-PCR confirmou a presença de DNA de plasmódio em 100% das amostras monoinfectadas. Adicionalmente, foram observadas infecções mistas, co-infecção de P. falciparum e P. vivax, em 19% (38/200) destas amostras. O diagnóstico molecular por PCR em tempo real (Lightcycler, Roche®) foi realizado em apenas 17% (34/200) dessas amostras. A co-positividade (sensibilidade) dos testes para P. vivax foi em média 71% e a co-negatividade (especificidade) 92%, para P. falciparum a co-positividade foi 91% e a conegatividade 79%. A concordância entre os testes foi regular. As 100 amostras restantes haviam sido coletadas no sétimo dia (D7) de tratamento e eram negativas pela microscopia. O diagnóstico molecular demonstrou 21% de positividade. Este estudo mostrou que muitas infecções mistas vêm sendo subestimadas para fins de avaliação epidemiológica, demonstrando que a sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular são superiores a do teste microscópico. O diagnóstico molecular seria então mais indicado como teste complementar no diagnóstico de pacientes com baixas parasitemias, na análise da quantidade de portadores assintomáticos, em estudo de infecções criptônicas e na avaliação da negativação da parasitemia para monitoramento terapêutico, e em estudos que visem a diminuição da transmissão pela existência de prováveis gametócitos persistentes após o tratamento. Entretanto, esse método não é indicado para rotina de diagnóstico de malária, uma vez que os resultados positivos por essa técnica não significam necessariamente que o paciente desenvolva a doença.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-11-10T16:06:34Z No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-10T16:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / The determination of fetal sex using maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test (NIPDT), offered to pregnant women, especially those with an increased risk of having children with conditions X-linked inheritance. Because it is a non-invasive technique, it presents a greater advantage over other methods of invasive prenatal diagnosis such as amniocentesis, cordocentesis and biopsy of chorionic villi. The use of cell free fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma has become a promising alternative for the diagnosis of noninvasive and early sex determination. The porpuse this study is to conduct a qualitative test in pregnant women with gestational age ranging from 6 to 20 weeks using the noninvasive prenatal test for the early sex determination of fetal by the real time PCR technique. Twenty-one healthy pregnant women, over 18 years of age, single gestation and attended at the Gynecology and Obstetrics Clinic of the Unigen Laboratory belonging to the Private Health Care Network of the City of Goiânia-GO were selected. After venous blood collection, plasma was separated and frozen (-20 ° C). The material to be analyzed followed the laboratory of the company Qiagen® located in São Paulo, SP, where DNA extraction and purification were performed using fully automated equipment (QIAcube®, with the QIAamp® DNA Micro kit, using the protocol "Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples", according to the manufacturer's specifications), and then the quantitative PCR technique (Rotor-Gene® Qiagen) was run for specific Y-sequence amplification. Of the 21 pregnant women selected, two participants aborted and were excluded from the study. The results showed that, in the 19 cases analyzed, comparing the results of qPCR with fetal sex determined by ultrasonography (USG), 7/19 (36.8%) pregnancies with positive results for the Y chromosome (determining the male sex) and 11/19 (57.9%) pregnancies with a negative result for the Y chromosome (determining the female sex) and only one gestation (5.3%) presented false-negative results for males. The analysis of the concordance index, between the results of the qPCR and the USG, found a concordance of 0.89. These results confirmed a good sensitivity and specificity of the method for the gestation period studied (mean of 12 weeks), indicating that this procedure should be used in the medical routine as an auxiliary tool in cases where fetal sexing becomes necessary for health fetal and/or decreased parents anxiety. / A determinação do sexo fetal utilizando o plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN), oferecido as gestantes, principalmente para aquelas com risco aumentado de terem crianças com doenças ligadas ao sexo. Por se tratar de uma técnica não invasiva, apresenta-se com maior vantagem sobre outros métodos de diagnóstico pré-natal invasivos como a amniocentese, cordocentese e a biópsia de vilosidades coriônicas. O diagnóstico pré-natal (DPN) tem sido importante no acompanhamento de gestações com anormalidades fetais, além de permitir um planejamento mais adequado para o parto e de cuidados neonatais específicos. Dessa forma, o DPN tem sido estabelecido na prática obstétrica moderna e integra um conjunto de procedimentos para identificar uma anormalidade no feto durante a gravidez. Diversas pesquisas têm buscado a utilização de novas tecnologias para o diagnóstico pré-natal não invasivo (DPNI). O uso de DNA fetal livre (cffDNA) no plasma materno passou a ser uma alternativa promissora para diagnóstico do sexo não invasivo e precoce. O objetivo do presente trabalho é realizar um estudo qualitativo em pacientes gestantes, com idade gestacional variando de 6 a 20 semanas utilizando o teste pré-natal não invasivo para a determinação precoce do sexo fetal pela técnica de qPCR. Foram selecionadas 21 gestantes saudáveis, maiores de 18 anos e gestação única e atendidas em clínica de ginecologia e obstetrícia do Centro de Diagnóstico Clínico UNIGEN pertencente à Rede Privada de Atendimento à Saúde da Cidade de Goiânia-GO. Após a coleta de sangue venoso, houve a separação e o congelamento do plasma (-20°C). O material a ser analisado seguiu para o laboratório da empresa Qiagen® localizado em São Paulo-SP, onde foram realizadas a extração e purificação do DNA utilizando equipamento automatizado (QIAcube®, com o kit QIAamp® DNA Micro, empregando-se o protocolo “Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples”, conforme especificações do fabricante), e em seguida foi ralizada a técnica de PCR quantitativa (Rotor-Gene® Qiagen) para amplificação de sequência Y específica. Das 21 gestantes selecionadas, duas participantes abortaram, sendo dessa forma excluídas do estudo. Os resultados revelaram que dos 19 casos analisados, ao comparar os resultados da qPCR com o sexo fetal determinado pela ultrassonografia (USG), 7/19 (36,8%) gestações com resultados positivos para o cromossomo Y (determinando o sexo Masculino) e 11/19 (57,9%) gestações com resultado negativo para o cromossomo Y (determinando o sexo Feminino) e apenas uma gestação (5,3%) apresentou resultado falso-negativo para o sexo masculino. A análise do índice de concordância, entre os resultados da qPCR com a USG foi de 0,89. Esses resultados confirmaram uma boa sensibilidade e especificidade do método para o período de gestação estudado (média de 12 semanas), indicando que este procedimento deve ser utilizado na rotina médica como ferramenta auxiliar nos casos onde a sexagem fetal torna-se necessária para tratamento fetal e/ou diminuição da ansiedade dos pais.