O Brasil é um grande produtor de alimentos e a bovinocultura tem grande importância econômica e social. Doenças virais podem ter grande impacto na pecuária e, por isso, a identificação do agente, o conhecimento de sua epidemiologia e o desenvolvimento de técnicas eficientes para seu diagnóstico são medidas extremamente importantes no seu controle. A diarréia viral bovina (“bovine viral diarrhea”- BVD) é uma enfermidade difundida nos rebanhos bovinos ocasionando grandes perdas econômicas em rebanhos de corte e leite em todo mundo. A identificação de animais persistentemente infectados (PI) pelo vírus da BVD (BVDV) é essencial em um programa de controle desta doença. No presente estudo, foi estabelecida uma transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) específica para identificação e quantificação dos diversos genótipos de pestivírus. Foi utilizado o teste de imunoperoxidase (IPX) como referência, além de outros testes de diagnóstico, como transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RTPCR), isolamento viral (IV), ELISA de captura de antígeno (ECA) e imunohistoquímica (IHQ). Os valores usados como base para quantificação foram pré-determinados pelo resultado da IPX de uma amostra padrão. A sensibilidade da RT-qPCR foi de 103,9 TCID50/mL, apresentando valor de coeficiente de correlação de 0,978 que permite identificar 95% das infecções com até 450,66 partículas virais/mL de soro. O coeficiente de variação da reprodutibilidade variou de 4 a 9%. Foram analisadas 72 amostras de soro sanguíneo de animais suspeitos de apresentarem infecção persistente pelo BVDV. Os títulos obtidos através da IPX a partir de soro de animais PI variaram de 105,55 a 107,3 TCID50/mL, enquanto que os títulos das amostras testadas pela RTqPCR variaram de 106,2 a 107,6 TCID50/mL. Os diferentes métodos laboratoriais utilizados para detectar o BVDV em rebanhos apresentaram a mesma eficiência entretanto, a utilização comparativa destes métodos aliada a uma nova estratégia permitiu que se estabelecesse uma RT-qPCR específica para detecção e quantificação do BVDV em amostras de soro de animais PI que poderá ser utilizada como uma importante ferramenta para o diagnóstico de pestivírus com diferentes características genéticas. Além disso, o presente trabalho poderá servir como base para a quantificação do agente em diferentes órgãos dos animais PI, o que contribuirá para o entendimento da patogenia do BVDV. / Brazil is an important food producer and cattle production has great economical and social importance. Viral diseases are constant problems and the identification of the agent, the knowledge of the disease´s epidemiology and the development of efficient diagnostic techniques are extremely important for its control. Bovine viral diarrhea (BVD) is a widespread disease causing great economical losses around the world. The identification of persistently infected animals (PI) in bovine herds is essential to the implementation of control programs. In the present study, a reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was established to the identification and quantification of pestivirus. Immunoperoxidase (IPX) was used as the reference test, in addition with reverse transcription followed by the polymerase chain reaction (RT-PCR), virus isolation (VI), antigen-capture ELISA (ACE) and Immunohistochemistry (IHC). The values used as standard to quantification were predetermined by the result from the IPX using a reference strain. The sensitivity of RTqPCR was 103.9 TCID50/mL, showing 0.978 of coefficient correlation, what allowed to detect 95% of infections with up to 450.66 viral particles/mL. The reproducibility of the coefficient of varied from 4 to 9%. Seventy-two samples of blood serum from animals suspected of presenting persistent infection of BVDV were analyzed. The titers obtained through the IPX from the serum of PI animals varied from 105.55 to 107.3 TCID50/mL, while the titers from the tested samples by the RT-qPCR varied from 106.2 to 107.6TCID50/mL. The different laboratory methods tested were capable of detecting the BVDV with equal efficiency, The comparative utilization of these methods allied with a new strategy allowed the establishment of a specific RT-qPCR protocol to quantify and detect the BDVD in PI sera which can be used as an important tool to the detection and quantification of the pestivirus different genetic backgrounds. Beyond this, the present protocol can be used to quantify the virus in different organs of PI animals and will contribute for the understanding of BVDV patogenicity.

Introdução: O gênero Acinetobacter representa um importante patógeno relacionado a infecções hospitalares, principalmente, à pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV). O aumento de isolados de Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos (ABRC) representa um problema mundial, pois limita drasticamente as opções terapêuticas. A produção da carbapenamase OXA-23, uma β-lactamase da classe D de Ambler, representa o principal mecanismo responsável por esta resistência em nosso país. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo padronizar a técnica de PCR em tempo real (qPCR) para a detecção do gene blaOXA-23 diretamente de aspirados traqueais (ATs) de pacientes com suspeita de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) de unidades de tratamento intensivo (UTIs). Métodos e resultados: O DNA das amostras de ATs coletadas de pacientes em ventilação mecânica foi analisado pela técnica de qPCR, utilizando o SYBR green, para a detecção do gene blaOXA-23. Dentre os 20 ATs analisados, ABRC foi isolado em 10, A. baumannii sensível aos carbapemêmicos (ABSC) em 3 e 7 foram negativos na culura bacteriológica. O gene blaOXA-23 foi detectado tanto na colônia quanto no AT em 8 das 10 amostras de ABRC. Em uma amostra não houve detecção do gene por qPCR em nenhum dos materiais e em outra amostra houve detecção só no AT. Dos ABSC, em duas amostras não houve detecção do gene na colônia e no AT enquanto que em uma amostra o gene foi detectado somente no AT. Em nenhuma das amostras de ATs negativas na cultura foi detectado o gene. Conclusão: O estudo sugere que a técnica qPCR pode ser aplicada para a detecção do gene blaoxa-23 diretamente de amostras de AT, reduzindo assim, o tempo para o início de uma terpia antimicrobiana adequada e melhorando, consequentemente, o desfecho clínico deste pacientes. / Background: The genus Acinetobacter is an important pathogen associated with nosocomial infections mainly ventilator-associated pneumonia (VAP). The increasing of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii (CRAB) isolates is a worldwide concern since it limits drastically the range of therapeutic alternatives. The OXA-23 producing, a carbapenemhydrolysing class D β-lactamase, is the major mechanism responsible for CRAB in our country. Objective: The study objective is to develop a real time PCR (qPCR) to detect the Acinetobacter baumannii blaOXA-23 gene directly in endotracheal aspirate (ETA) of patients under mechanical ventilation, with suspected ventilator-associated pneumonia (VAP). Methods and Results: DNA extracted from ETA samples from patients under mechanical ventilation was analyzed by qPCR, using SYBR green, for the presence of blaOXA-23 gene. Among the 20 ETAs examined, CRAB isolates were recovered in 10 quantitative cultures; carbapenem-susceptible A. baumannii (CSAB) in 3 and 7 cultures were negative to A. baumanni. Of the 10 CRAB, 8 were positive for blaOXA-23 on both the colony and ETA. In one blaOXA-23 qPCR was negative in colony and directly from ETA, while the other showed a qPCR negative result in the colony and positive in the ETA. In 3 CSAB, 2 samples showed negative results in colony and ETA and one showed a blaOXA-23 positive result only from the ETA. None of the 7 negative ETAs were positive for blaOXA-23 gene in the qPCR of the ETA. Conclusion: Our study suggests that qPCR can be applied to detect the presence of blaOXA-23 gene directly from ETAs reducing the time to an earlier initiation of appropriate therapy improving, consequently, the clinical outcomes for these patients.

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Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL -1 and 322.79 ng µL -1 , respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µL -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µL -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µL -1 e 322,79 ng µL -1 , respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µL -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos.

A produção animal atualmente conta com diferentes biotecnologias para aumentar sua produtividade, incluindo técnicas aplicadas na reprodução. A inseminação artificial, por exemplo, vem sendo aplicada há muitos anos e de maneira extensiva. Esta tem como objetivo o aproveitamento de apenas um ejaculado em diversas prenhezes viabilizando a realização de testes de progênies e um grande aproveitamento de touros melhoradores. Atualmente essa técnica pode contar com um material ainda mais específico, o sêmen sexado que possui maior porcentagem (acima de 87%) de espermatozóides portadores de cromossomo X ou Y resultando numa progênie com o sexo predeterminado. A pré-seleção do sexo vem sendo estudada desde final dos anos 70, uma das linhas de pesquisa resultaram no desenvolvimento de um equipamento, o citômetro de fluxo, em que a célula espermática tem seu conteúdo de DNA estimado e, na seqüência é orientado para separação. Atualmente essa técnica é utilizada para produção de sêmen sexado comercialmente, anteriormente à comercialização do produto, a confirmação da taxa de separação dos cromossomos X e Y é realizada pelo próprio equipamento, o que acrescenta um custo operacional e pode introduzir um viés na confirmação da taxa de sexagem. Sendo assim o objetivo desse trabalho foi elaborar um protocolo de confirmação da taxa de sexagem mediante PCR em tempo real, utilizando sonda TaqMan® em regiões dos genes X-específico (PLP) e Y-específico (SRY). Foram analisadas duas sub-espécies de bovinos (Bos primigenius taurus e Bos primigenius indicus), sendo 21 doses de sêmen sexado X, 21 doses de sêmen sexado Y e 42 doses de sêmen não sexado (controle). A extração do DNA foi desenvolvida com a utilização de di-etiltreitol (DTT) e isotiocianato de guanidina. As amostras foram, em seguida, submetidas à técnica de PCR em tempo real aplicando sondas específicas. Foi possível amplificar os fragmentos específicos dos cromossomos X e Y separadamente e em conjunto e estimar a proporção relativa entre ambos. Todavia a repetibilidade do teste e sua acurácia não permitem recomendá-lo da maneira que se encontra para a aplicação na prática. / There are different biotechnologies to apply to increase the animal production nowadays, reproduction techniques are including. The artificial insemination (AI), for example, is a technique very used during many years ago and it is used at extensive production. The aim of this technique is to increase the numbers of pregnancies with just one ejaculation what will propose easier testing of offspring and better use of genetic selected bulls. At present the AI can associate a more specific material, the sexed semen, that contains a higher percentage (more than 87%) of X- or Y- bearing spermatozoa. Its application will result in a offspring with the desired sex. The sorting sex process has been studied since the 1970\'s, since then, some researchers have determined the cytometric sexing flow, a \"promising technique\" that allows the separation of the X-bearing chromosome sperm from the Y-bearing chromosome sperm based on the estimation of the DNA content in each measured cell. The cytometric flow is the unique commercial technique applied for mammalian species in many countries. Before the commercialization the bovine sexed semen has its percentage of the desired sex confirmed by using the same technique that sorted at the beginning of the process. This point can improve the cost and benefits the sorting technique. This way, the objective of this study was to determine a protocol of sex proportion confirmation by real time PCR using TaqMan® probe at X-specific gene (PLP) and Y-specific gene (SRY). Two subspecies of cattle semen were analyzed (Bos primigenius taurus and Bos primigenius indicus). Twenty-one sexed semen for female, other twenty-one sexed semen for male and forty-two non sexed semen were used in this research. The DNA extraction used DTT and guanidine isothiocyanate, and then the obtained samples were used to the real time PCR applying specific probes. This study allows the amplification in different reactions of specific products of X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing. Putting the results together, it was possible to determine the relative proportion between the products. But the repeatability and accuracy of the test don\'t permit use this technique in this way of practice.

Teak tree (Tectona grandis L.f.) has a high value in the timber trade for fabrication of woody products due to its extraordinary qualities of color, density and durability. Despite the importance of this species, genetic and molecular studies available are limited. Also, the lack of molecular information about secondary xylem and tree maturation has hindered genetic exploration of teak. Therefore, gene expression studies and transcriptomic profiling are essential to explore wood formation and lignin biosynthesis through the development and aging of vascular plants. Aiming the gene expression studies, it was essential to identify and clone reference genes for teak. Eight genes were tested, commonly used in qRT-PCR, including TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ and TgEF1a. Expression profiles of these genes were evaluated by qRT-PCR in six tissue and organ samples (leaf, flower, seedling, root, stem and branch secondary xylem). Stability validation by NormFinder, BestKeeper, geNorm and Delta Ct programs showed that TgUBQ and TgEF1a are the most stable genes to use as qRT-PCR reference genes in teak in the conditions tested. Due to the availability of 12- and 60-year-old teak trees, RNA-seq was performed in diferent organs (seedlings, leaves, flowers, root, stem and branch secondary xylem). A total of 462,260 transcripts were obtained by assembling with \"Trinity\" software. Also, 1,502 and 931 genes differentially expressed were identified for stem and branch secondary xylem, respectively, using DESeq program, and MYB transcription factors, which were characterized. TgMYB1 amino acid sequence displayed a predicted coiled-coil (CC) motif while TgMYB2, TgMYB3 and TgMYB4 showed R2R3-MYB domain. All of them were phylogenetically grouped with several gymnosperms and flowering plants. High expression of TgMYB1 and TgMYB4 in lignified tissues of 60-year-old trees was observed. In this work, the Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) gene family was also studied. One complete (TgCAD1) and three partial (TgCAD2 to TgCAD4) members were characterized. The four enzymes presented residues for catalytic and structural zinc action, NADPH binding and substrate specificity, consistent with the mechanism of alcohol dehydrogenases. TgCAD3 and TgCAD4 were highly expressed in young and mature sapwood and seem to be duplicated and highly related with lignin biosynthesis. Tree genetic improvement, marker-assisted selection and plant transformation seem to be promising lines of research for the data obtained from this research. This is the first study addressing gene characterization and expression, phylogeny and transcriptomic profiling in teak. / A árvore de teca (Tectona grandis L.f.) tem alto valor no comércio de madeira para a fabricação de produtos lenhosos, devido às suas qualidades extraordinárias de cor, densidade e durabilidade. Apesar da importância desta espécie, são poucos os estudos genéticos e moleculares disponíveis. Também, a falta de informação molecular sobre xilema secundário e maturação da árvore tem dificultado a exploração genética de teca. Assim, estudos de expressão gênica e perfis transcricionais são relevantes para explorar a formação da madeira e a biossíntese de lignina durante o desenvolvimento e envelhecimento das plantas vasculares. Visando os estudos de expressão gênica, foi essencial identificar e clonar genes de referencia para a teca. Foram testados oito genes comumente usados em qRT-PCR, TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ e TgEF1a. Perfis de expressão destes genes foram avaliados por qRT-PCR em seis amostras de tecidos e órgãos (folhas, flores, plântulas, raiz, xilema secundário de caule e ramo). A validação da estabilidade pelos programas NormFinder, BestKeeper, geNorm e Delta CT mostrou que TgUBQ e TgEF1a são os genes mais estáveis para usar como genes de referência em teca nas condições testadas. Em virtude da disponibilidade de árvores de teca de diferentes idades, entre 12 e 60 anos, foi realizado o RNAseq de diferentes órgãos (plântulas, folhas, flores, raiz, ramos e caules de árvores de 12 e 60 anos). Obteve-se um total de 462.260 transcritos pela montagem com o software \"Trinity\". Foram identificados 1.502 e 931 genes diferencialmente expressos para xilema secundário de caule e ramo, respectivamente, utilizando o programa DESeq e fatores de transcrição MYB, que foram posteriormente caracterizados. A sequência de aminoácidos do TgMYB1 exibiu um motivo \"coiled-coil\" (CC), enquanto TgMYB2, TgMYB3 e TgMYB4 mostraram domínio R2R3-MYB. Todos eles foram filogeneticamente agrupados com várias gimnospermas e angiospermas. Observou-se alta expressão do TgMYB1 e TgMYB4 em tecidos lignificados de árvores de 60 anos de idade. Neste trabalho também foi estudada a família gênica Cinamil álcool desidrogenase (CAD). Foi caracterizado um membro completo (TgCAD1) e três parciais (TgCAD2 a TgCAD4). As quatro enzimas apresentaram resíduos de ação catalítica e estrutural de zinco, de ligação ao NADPH e de especificidade de substrato, em conformidade com o mecanismo conservado de álcool desidrogenases. TgCAD3 e TgCAD4 foram altamente expressos no alburno jovem e maduro e parecem estar duplicados e relacionados com a biossíntese de lignina. O melhoramento genético de árvores, a seleção assistida utilizando marcadores moleculares e a transformação de plantas parecem ser linhas promissoras de pesquisa, a partir dos dados obtidos nesta pesquisa. Este é o primeiro estudo sobre caracterização e expressão gênica, filogenia e perfis transcricionais em teca.

A ulceração aftosa recorrente (UAR) é considerada a doença ulcerativa mais frequente da cavidade bucal. Sua etiopatogenia ainda não está plenamente esclarecida, embora inúmeros fatores locais e sistêmicos já tenham sido a ela associados. Recentemente, a resposta imune anormal do tipo celular tem sido considerada a responsável pela lesão bucal na UAR, favorecendo uma resposta imunológica pró-inflamatória do tipo Th1, em conjunto com alterações em linfócitos T regulatórios. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi realizar análise da expressão gênica da FOXP3, MIP-3? e Interleucinas 2, 10 e 35 em pacientes com ulceração aftosa recorrente, por meio de estudo caso-controle. Os pacientes do grupo caso apresentavam quadros frequentes de UAR com pelo menos um ano de manifestação de surtos ulcerativos e história negativa de condições sistêmicas ou locais interferentes com a expressão das UAR. Estes foram submetidos a biópsia de lesão ulcerativa recente para a análise molecular. Os pacientes do grupo controle apresentavam história negativa de UAR, mucosa clinicamente saudável, e doaram voluntariamente fragmento de mucosa saudável para análise molecular, quando submetidos a procedimentos cirúrgicos como exodontia de terceiros molares ou biópsias ósseas. Todos os pacientes foram incluídos no grupo de pesquisa apenas após anuência com termo de consentimento livre e esclarecido. Submeteram-se a exame clínico, realizaram exames complementares para controle da saúde geral e suporte diagnóstico. Onze pacientes UAR e três controles voluntários compuseram a casuística estudada, sendo submetidos a biópsia de lesões de UAR ou de mucosa de revestimento sadia. As amostras de tecido bucal foram submetidas aos procedimentos laboratoriais de extração do RNA e análise da expressão gênica da FOXP3, MIP-3? e Interleucinas 2, 10 e 35 por meio da técnica de RT-PCR em tempo real. Não houve diferença significativa na expressão dos genes estudados entre as amostras de portadores de UAR e controles sadios. Concluímos que os genes aqui avaliados não parecem desempenhar papel distintivo na fase ulcerativa inicial das UAR, entretanto estudos adicionais são recomendados a fim de se verificar a real participação desses agentes da inflamação na expressão da doença. / Recurrent aphthous ulcers (RAU) is the most common ulcerative disease of the oral cavity. Its pathogenesis is poorly understood yet, although numerous local and systemic factors have been associated with it. Recently, abnormal immune response of cellular type has been considered responsible for the RAU oral lesions, promoting a pro-inflammatory immune response Th1-type, in conjunction with changes in regulatory T cells. Thus, the aim of this study was to analyze the gene expression of FOXP3, MIP-3? and interleukins 2, 10 and 35 in patients with recurrent aphthous ulceration through a case-control study. The case group of patients presented frequent RAU bouts with at least one year of manifestation of ulcerative outbreaks and negative history of local or systemic conditions interfering with the RAU expression. These patients were submitted to a biopsy procedure of a recent ulcerative lesion for molecular analysis. Patients in the control group presented no history of RAU, and agreed with a donation of a healthy mucosa fragment for molecular analysis when undergoing surgical procedures such as extraction of third molars or bone biopsies. All patients were included in the research group only after agreement with an informed consent. All subjects underwent clinical examination and were submitted to additional lab tests to check overall health and support diagnosis. Eleven RAU patients and three control volunteers composed the sample size and undergone biopsy of RAU lesions or healthy mucosal lining. The oral tissue samples were submitted to the laboratory procedures of RNA extraction and analysis of gene expression of FOXP3, MIP-3? and interleukins 2, 10, 35 by real time RT-PCR. There was no significant difference in gene expression between the studied samples of patients with RAU and healthy controls. It was concluded that the genes evaluated do not seem to play distinctive role in the initial ulcerative phase of RAU, however further studies are recommended in order to verify the actual participation of these inflammation agents in RAU expression.

A migração da citricultura paulista das regiões norte e central para a região sudoeste, tem submetido a cultura à clima mais chuvoso e, consequentemente, à maior ocorrência da podridão floral dos citros (PFC). A PFC, cujo agente causal é C. acutatum, induz a abscisão de frutos jovens e pode causar perdas de 100%. Alguns componentes do monociclo dessa doença ainda encontram-se indefinidos. Os processos de sobrevivência e colonização têm sido sustentados por evidências oriundas de experimentos não conclusivos. Até o momento, os métodos de detecção não têm sido eficazes para detectar o patógeno em folhas assintomáticas de citros, além de não serem capazes de quantificá-lo. Diante dessas lacunas, esse trabalho buscou avaliar o período de sobrevivência do patógeno na superfície de folhas assintomáticas entre as floradas; verificar se o patógeno coloniza os tecidos das folhas de citros; estabelecer um método sensível para detecção e quantificação de C. acutatum e C. gloeosporioides na superfície foliar e; monitorar quantitativamente os patógenos em campos de produção de citros no Estado de São Paulo. A sobrevivência do patógeno foi avaliada em condições controladas, casa de vegetação e condições ambientais. Foi notado que o patógeno sobreviveu até sete meses em condições controladas, até dez meses em casa de vegetação e até seis meses sob condições ambientais. Chuvas regulares associadas ao molhamento foliar prolongado, auxiliaram na manutenção e sobrevivência do inóculo na superfície foliar. O processo de colonização do patógeno foi investigado por microscopia de luz, transmissão e confocal. Não foi observada colonização do patógeno em tecidos foliares. O peg de penetração proveniente dos apressórios penetrou a cutícula e ficou restrito numa camada péctica, acima da parede periclinal da epiderme. Diferentes métodos foram avaliados para a detecção e quantificação de C. acutatum e C. gloeosporioides em folhas de citros. Foi desenvolvida uma PCR em tempo real (qPCR) e uma PCR multiplex em tempo real (qPCR multiplex), ambas específicas e altamente sensíveis à detecção dos patógenos. O DNA da planta não influenciou na amplificação da qPCR. As qPCR foram muito mais sensíveis que a PCR convencional e Nested-PCR. Distintos métodos para processamento das amostras e para obtenção do DNA foram avaliados. O método do congelamento e a maceração do tecido foliar, foram os mais eficazes para o processamento da amostras e, a extração do DNA (CTAB ou Qiagen) foi melhor método de obtenção do DNA para quantificação dos patógenos. O spot e extração do DNA foram validados para a detecção dos patógenos tanto para a qPCR quanto para a qPCR multiplex. O monitoramento dos patógenos foi realizado em áreas localizadas em duas distintas regiões do Estado de São Paulo. Foi notado considerável aumento na quantidade de inóculo quando ocorreram chuvas regulares, com muitos dias com chuvas. O inóculo se concentrou no interior da copa em épocas com baixo volume de chuvas. A quantidade de inóculo de C. acutatum na área localizada em Santa Cruz do Rio Pardo foi consideravelmente maior que na área de Barretos e ambas apresentaram quantidades similares de C. gloeosporioides. / The migration of the citrus culture in São Paulo State from the northern and central regions to the south-western region submitted the culture to a wetter climate and, consequently, a higher incidence of postbloom fruit drop (PFD). PFD, whose causal agents are C. acutatum and C. gloeosporioides, induces the abscission of young fruits and can causes loss of 100% of the culture. Some monocycle components of this disease are still undetermined. The survival and colonization processes are supported by evidences from inconclusive experiments. To date, the detection methods have not been effective in detecting and quantifying the pathogen in asymptomatic citrus leaves. This study aimed to assess the survival period of C. acutatum on the surface of asymptomatic leaves between the flowering seasons, to verify whether the pathogen colonizes the tissues of citrus leaves of citrus, to establish a sensitive method for detection and quantification of C. acutatum and C. gloeosporioides on leaves surface and to monitor quantitatively the pathogens in citrus orchards in the State of São Paulo in Brazil. The survival of the pathogen was evaluated under controlled conditions, in a greenhouse and in environmental conditions. The pathogen survived for seven months under controlled conditions, ten months in a greenhouse and six months under environmental conditions. Regular rainfall associated with the prolonged leaf wetness favored the maintenance and survival of the inoculum on the leaf surface. The colonization process of the pathogen was investigated by light, confocal and transmission microscopy. Pathogen colonization was not observed on leaf tissues. The penetration peg from appressoria penetrated the cuticle and was restricted in a pectic layer on the periclinal epidermal wall. Different methods were evaluated for the detection and quantification of C. acutatum and C. gloeosporioides on leaves of citrus plants. It was developed a realtime PCR (qPCR) and a real-time multiplex PCR (qPCR multiplex), both specific and highly sensitive in the detection of pathogens. The plant DNA did not influence the qPCR amplification. The qPCRs were much more sensitive than the conventional PCR and Nested-PCR. Different methods for sample processing and for DNA extraction were evaluated. The freezing and maceration methods of foliar tissue were the most effective for sample processing and the DNA extraction (CTAB or Qiagen) was best method for extracting the DNA for pathogen quantification. The Spot and DNA extraction were validated for the detection of pathogens for both qPCR and multiplex qPCR. The monitoring of pathogens was carried out in two separate regions of the State of São Paulo in Brazil. It was observed a considerable increase in the number of inoculum when regular rainfall occurred, with many rainy days. The inoculum was concentrated within the tree canopy in seasons with low volume of rainfall. The number of inoculum of C. acutatum the at region of Santa Cruz do Rio Pardo was considerably higher than in the region of Barretos and both showed similar amounts of C. gloeosporioides.

O Brasil é o maior produtor de laranja doce do mundo, mas a história da citricultura brasileira é marcada por sucessivas perdas devido a pragas e doenças que atacam os pomares. Entre as doenças que afetam os pomares de citros, o huanglongbing (HLB) tem merecido destaque nos últimos anos. O HLB já é conhecido desde 1900 na China, mas no Brasil essa doença está presente desde 2004 e tem causado perdas significativas a citricultura. Essa doença é associada a três espécies de \"Candidatus Liberibacter\", mas no Brasil a espécie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) é a mais comum. Devido à ausência de plantas de laranja doce resistentes a essa doença, a busca por plantas transgênicas que apresentem resistência a essa doença têm se intensificado nos últimos anos. Uma estratégia para projetar uma construção gênica visando a CLas é a utilização de promotores floema-específico, pois a CLas coloniza o floema das plantas de citros infectadas. Entretanto, para provar que uma sequência promotora funciona é preciso desafiar a construção gênica na presnça da CLas. Portanto, conduziu-se este trabalho com o objetivo de multiplicar plantas de Citrus sinensis Osbeck (L.) cv. \'Hamlin\' transgênicas contendo o gene uidA sob controle dos promotores floema-específicos Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), Citrus phloem protein 2 (CsPP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSUC2), inocular com CLas por Diaphorina citri, avaliar a interdependência entre a expressão do transgene (gene uidA) e a concentração de CLas, para poder inferir sobre o controle da expressão dos promotores quando as plantas são inculadas com CLas. Para isso, cinco eventos de transformação de cada construção gênica, contendo apenas uma cópia do transgene foram selecionados, multiplicados e inoculados com CLas por Diaphorina citri, dezoito meses após a inoculação, o DNA e o RNA das plantas foram coletados. Foi realizada análise para verificar a concentração de CLas em todas as plantas inoculadas e a expressão do gene uidA foi realizada em uma linhagem transgênica de cada construção gênica. Com o auxílio da análise de coeficiente de correlação de Person, foi possível classificar qualitativamente a interdependência entre a concentração bacteriana e a expressão gênica. A frequência média de inoculação de CLas por Diaphorina citri foi de 30 %, demostrando que é possível incular CLas via Diaphorina citri. A análise de coeficiente de correlação de Person mostrou que nas construções com promotores AtPP2 e CsPP2 há baixa interdependência entre o controle da expressão gênica e a concentração de CLas. A construção sob controle do promotor AtSUC2 apresentou correlação forte e positiva, mostrando que quanto maior a concentração de CLas maior a expressão do transgene. / Brazil is the largest producer of sweet oranges in the world, however the Brazilian citrus history is marked by successive losses due to pests and diseases attacking orchards. Among the diseases affecting citrus groves, the huanglongbing (HLB) has been highlighted in recent years. The HLB is known in China since 1900, although in Brazil this disease has been present since 2004 and has caused significant losses to citrus industry. This disease is associated with three species of \"Candidatus Liberibacter\", however, in Brazil Candidatus Liberibacter asiaticus species (CLas) is the most common. Due to the absence of sweet orange plants resistant to this disease, the search for transgenic plants with resistance to this disease have intensified in recent years. One strategy to design a genetic construct targeting the CLas includes the use of phloem-specific promoters, because the CLas colonizes the phloem of infected citrus plants. On the other hand, to prove that a promoter sequence works it is necessary to challenge the genetic construct in the presence of CLas. Therefore, we conducted this study with the objectives of multiplying transgenic Citrus sinensis Osbeck (L.) cv. \'Hamlin\' bearing the uidA gene under the control of the phloem-specific promoters Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), Citrus phloem protein 2 (CsPP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSUC2), inoculate CLas with Diaphorina citri, and evaluate the interdependence between the expression of the transgene (uidA gene) and the concentration of CLas, to infer the promoter expression when the plants are inoculated with CLas. Five events processing of each gene construct, containing only one copy of the transgene, and inoculated with CLas by Diaphorina citri. The DNA and RNA of plants were collected after eighteen months of inoculation. The concentration of CLas in the inoculated plants and the expression of the uidA gene were performed in each transgenic line of each gene construct, with the aid of the analysis of Person correlation coefficient. Thus it was possible to classify qualitatively the interdependence between bacterial concentration and gene expression. The average frequency of CLas inoculation by Diaphorina citri was 30%, demonstrating that it was possible to inoculate CLas via Diaphorina citri. Person correlation coefficient values suggested low interdependence between the control of gene expression and the concentration of CLas in constructions with promoters AtPP2 and CsPP2. The construction under AtSUC2 promoter control showed strong positive correlation, indicating that the higher the concentration of CLas the greater is the transgene expression.

Na cidade de São Paulo, cerca de 50 mil pessoas são portadoras do HTLV-1. O HTLV-1 é o agente causador da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada com o HTLV-1 (TSP/HAM) e os mecanismos desta patogênese são obscuros. A TSP/HAM é considerada uma doença imuno-mediada e algumas citocinas, podem estar associadas, com a desmielinização da membrana de mielina da coluna espinhal, provavelmente, estimuladas pela presença de antígenos virais. A PCR em tempo real é uma técnica utilizada para a detecção de citocinas e apresenta maior sensibilidade na expressão de mRNA e carga proviral do HTLV-1. Objetivos: Detecção de citocinas pelas técnicas sorológicas e de biologia molecular (PCR em tempo real) que auxiliaram no aconselhamento e avaliação de pacientes infectados pelo HTLV-1, além de uma avaliação da carga proviral dos pacientes com infecção pelo HTLV-1. Casuística: Grupo I: indivíduos soronegativos para HCV, HIV-1 e HTLV-1 (Controle); Grupo II: pacientes HTLV-1 assintomáticos; Grupo III: pacientes com TSP/HAM. Observamos que o INF-<font face=\"symbol\">g apresenta-se alterado na infecção HTLV-1, sendo um dos fatores mais importantes da evolução para TSP/HAM, ambos os ensaios apresentaram o mesmo resultado. A carga proviral pode ser um marcador de progressão para a TSP/HAM. A interação complexa existente entre o HTLV-1 e as células responsáveis pela liberação de citocinas e <font face=\"symbol\">b-quimiocinas pró-inflamatórias, assim como elementos de ativação celular, resultam na ativação imunológica. Isto, lentamente, pode levar ao processo inflamatório crônico que atua diretamente no micro ambiente neuronal e/ou membrana de mielina da coluna espinhal, em alguns portadores de HTLV-1. Com a persistente ativação do sistema imunológico, este processo provocará destruição das células gliais e dos neurônios, dando início ao processo de desmielinização. / In São Paulo, about 50 thousand people are HTLV-1 carriers. HTLV-1 is the agent that causes tropical spastic paraparesis and HTLV-1 associated myelopathy (TSP/HAM) despite the mechanisms of this disease are still unclear. TSP/HAM is considered an immune mediated illness and some cytokines might be involved with axonal damage and demyelination, most pronounced in the midthoracic spinal cord, probably stimulated by the presence of viral antigens. Real Time PCR is a used technique to cytokine detection and shows higher sensitivity on mRNA expression and HTLV-1 proviral load. Objectives: cytokine detection through molecular biology (Real time PCR) and serologic techniques that helped on advising and assessment of HTLV-1 infected patients and also on their proviral load. Casuistic: Group I: seronegative individuals for HCV, HIV-1 and HTLV-1 (control); Group II: asymptomatic HTLV-1 infected patients; Group III: TSP/HAM patients. We\'ve been observed that <font face=\"symbol\">g-interferon presents changing on the HTLV-1 infection, being one of the most important factors to TSP/HAM progression, both essays showed the same results. The proviral load may be an important marker for TSP/HAM development.

A endometriose é uma doença ginecológica benigna, de etiologia complexa e multifatorial, caracterizada pela presença de estroma e tecido glandular tipo endométrio fora da cavidade uterina. Afeta de 10 a 15% da população feminina, que apresentam sintomatologia variada, incluindo dor pélvica e infertilidade. Para elucidar mecanismos potenciais que estejam envolvidos com a fisiopatologia complexa desta doença, analisamos o perfil de expressão gênico diferencial pela metodologia de hibridação subtrativa em tecido eutópico e ectópico (lesões peritoniais e endometrioma ovariano) de 17 mulheres com endometriose, no início da fase proliferativa do ciclo menstrual. Foram identificados 291 genes desregulados nas lesões endometrióticas, considerados como genes candidatos. Para a validação dos dados, utilizamos a metodologia de PCR em tempo real para os genes CTGF e SPARC, indicados como superexpressos; e MYC, MMP3, IGFBP1 e PAEP como menos expressos nas lesões. Diferenças significativas de expressão nas lesões peritoniais foram obtidas para os genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP e nos endometriomas ovarianos para os genes MMP3 e PAEP. Sugerimos que a desregulação dos genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI e PAEP seja responsável pela perda da homeostase celular nas lesões endometrióticas, contribuindo para a implantação e sobrevivência do tecido ectópico no ambiente extra-uterino. Este trabalho disponibilizou ao banco de dados da literatura, 291 genes com expressão gênica diferencial em lesões endometriótricas peritoniais e ovarianas como candidatos a investigações futuras. / Endometriosis is a benign gynecological disease, which presents a multifactorial and complex etiology, characterized by the presence of stromal and glandular endometrium tissue outside the uterine cavity. Ten to 15% of the female population is affected by the disease with a wideranging symptomatology including pelvic pain and infertility. To clarify the potential mechanisms involved in the complex physiopathology of this disease, we analyzed the differential gene expression profile by subtractive hybridization in eutopic and ectopic tissue (peritoneal lesions and ovarian endometriomas) from 17 women with endometriosis, in the early proliferative phase of the menstrual cycle. We identified 291 genes deregulated in the endometriotic lesions, considered as candidate genes. For data validation, Real Time PCR was applied for genes CTGF and SPARC, indicated as overexpressed; and for genes MYC, MMP3, IGFBP1 and PAEP, indicated as downregulated in the lesions. Significant differences in the peritoneal lesions expression were obtained for genes SPARC, MYC, IGFBP1, PAEP and in the ovarian endometriomas for genes MMP3 and PAEP. We suggest that the deregulation of genes SPARC, MYC, MMP3, IGFBPI and PAEP is responsible for loss of cellular homeostasis in the endometriotic lesions, contributing for the implantation and maintenance of the ectopic tissue in the extra-uterine environment. This study provided 291 genes with differential gene expression, in peritoneal and ovarian lesions, to the literature database as candidates for future investigations.