Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-α do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-α; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-α in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-α, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias que tem em comum a origem em células linforreticulares, sendo a forma anatômica gastrointestinal a mais prevalente na espécie felina. A maioria dos animais responde inicialmente ao tratamento, contudo, sabe-se que o desequilíbrio no sistema imune, de modo geral, pode facilitar a ocorrência e a disseminação das neoplasias. Para equilibrar a atividade do sistema imune, as células com função regulatória (Tregs) são fundamentais e por isso, alvo de diversas pesquisas isoladamente ou associadas a outros marcadores, como a IL-17A e o CD8, já que tanto as Tregs quanto os linfócitos Th17 originam-se de uma mesma célula T progenitora. Assim, alterações na relação Treg/Th17 podem levar à supressão na produção de linfócitos T CD8, invertendo a relação Tregs/CD8. Também há indícios de que as Tregs alterem a função efetora de células T contra neoplasias em seres humanos e em cães. Foram objetivos deste estudo avaliar as características do linfoma gastrointestinal em felinos, a proliferação celular por meio do índice mitótico e do marcador Ki-67, a expressão imunoistoquímica de CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 e IL-17A e correlacionar a expressão desses marcadores com o tipo celular, imunofenótipo, resposta ao tratamento e sobrevida global. Para análise estatística foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Quiquadrado de Pearson, de correlação de Spearman e a curva Kaplan-Meyer. Dos 47 gatos, 85% apresentaram a forma linfocítica de células T, com mediana de sobrevida de 24 meses; 15% apresentaram a forma linfoblástica de células B ou T, com mediana de sobrevida de 5 meses. A expressão de Ki-67 foi mais evidente naqueles pacientes com linfoma linfoblástico de células B ou T se comparado ao linfocítico de células T, com mediana de 40,5% e 8,2%, respectivamente e p=0,002. Na análise dos marcadores do sistema imune, não foi observada marcação de IL-2R. Não houve diferença significante na expressão de IL-17 e FOXP3 entre os tipos celulares e imunofenótipo, bem como não houve correlação entre FOXP3 e IL-17 e entre FOXP3 e CD8. Considerando somente os casos de linfoma linfocítico de células T, na análise do padrão de remissão parcial (n=12) versus completa (n=27), constatou-se diferença significante quanto à sobrevida (p&lt;0,0001) e CD8 (p&#61;0,015). Na análise de sobrevida, o tratamento com L-asparaginase, clorambucil e prednisolona, os níveis de albumina sérica iguais ou maiores que 2,5g/dL e o ganho de peso no início do tratamento foram preditores de maior tempo de sobrevida. Pode-se concluir que o linfoma linfocítico de células T foi o mais prevalente na espécie felina, envolvendo principalmente o intestino delgado e com um tempo mediano de sobrevivência de 24 meses; a expressão de ki-67 foi melhor marcador para determinar a proliferação celular se comparada ao índice mitótico; a expressão de FOXP3 foi baixa e não se relacionou à resposta terapêutica e ao tempo de sobrevida. Na análise específica dos casos de linfoma linfocítico de células T, não houve correlação entre FOXP3/IL-17 e FOXP3/CD8, enquanto que a baixa expressão de CD8 correlacionou-se a maior sobrevida naqueles pacientes em remissão completa / Lymphomas belong to a group of neoplasia that have in common the origin in lymphoreticular cells, and gastrointestinal is the most prevalent anatomical form in feline species. Most animals initially respond to treatment, however, it is known that the imbalance in the immune system generally may facilitate the occurrence and spread of tumors. To balance the activity of immune system, cells with regulatory function (Treg) are essential and therefore the target of many researches, alone or in combination with other markers such as IL-17A and CD8, as well Tregs as Th17 lymphocytes originate from a same progenitor T-cell. Thus, the relation between Treg / Th17 is important since changes in this relation can lead to suppressed production of CD8&#43; T lymphocytes, inverting the relation Treg/CD8. There is also evidence that Tregs alter the effector function of T cells against tumors in human beings and dogs. The objectives of this study was to evaluate the characteristics of gastrointestinal (GI) lymphoma in cats, cell proliferation by mitotic index and Ki-67 marker, immunohistochemical expression of CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 and IL-17A and correlate the expression of these markers on the cell-type, immunophenotype, response to treatment and overall survival. Statistical analysis was performed by Mann-Whitney test, Kruskal-Wallis test, Pearson\'s Chi-squared test, Spearman correlation and Kaplan-Meier curve. Of the 47 cats, 85% showed lymphocytic T cells, with a median survival of 24 months; and 15% had lymphoblastic B or T cells, with a median survival of 5 months. Ki-67 expression was most evident in patients with lymphoblastic B- or T-cell lymphoma compared to lymphocytic T cell lymphoma, with a median of 40.5% and 8.2%, respectively and p &#61 0.002. In the analysis of immune system markers, immunostaing was not observed IL-2R. There was no significant difference in IL-17A and FOXP3 expression between cell-type and immunophenotypes, as well as no correlation between FOXP3 and IL-17A and between FOXP3 and CD8. Considering only the cases of lymphocytic T-cell lymphoma, there was a significant difference in survival time (p <0.0001) and CD8 expression (p &#61; 0.015) considering partial (n &#61; 12) versus complete remission (n &#61; 27). In survival analysis, treatment A (L-asparaginase, chlorambucil and prednisolone), as well as serum albumin levels equal or higher than 2.5g/dL and weight gain after 30 days of treatment were predictive of increased survival time. As conclusion, lymphocytic T-cell lymphoma was more prevalent in feline species, mainly involving the small intestine and with a median survival of 24 months. Ki-67 expression was better marker to determine cell proliferation than mitotic index. FOXP3 expression was low and did not correlate to therapeutic response and survival time in GI lymphoma. In the specific analysis of lymphocytic T-cell lymphoma, there was no correlation between FOXP3/IL-17A and FOXP3/CD8, while low CD8 expression was correlated with increased survival in patients in complete remission

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias que tem em comum a origem em células linforreticulares, sendo a forma anatômica gastrointestinal a mais prevalente na espécie felina. A maioria dos animais responde inicialmente ao tratamento, contudo, sabe-se que o desequilíbrio no sistema imune, de modo geral, pode facilitar a ocorrência e a disseminação das neoplasias. Para equilibrar a atividade do sistema imune, as células com função regulatória (Tregs) são fundamentais e por isso, alvo de diversas pesquisas isoladamente ou associadas a outros marcadores, como a IL-17A e o CD8, já que tanto as Tregs quanto os linfócitos Th17 originam-se de uma mesma célula T progenitora. Assim, alterações na relação Treg/Th17 podem levar à supressão na produção de linfócitos T CD8, invertendo a relação Tregs/CD8. Também há indícios de que as Tregs alterem a função efetora de células T contra neoplasias em seres humanos e em cães. Foram objetivos deste estudo avaliar as características do linfoma gastrointestinal em felinos, a proliferação celular por meio do índice mitótico e do marcador Ki-67, a expressão imunoistoquímica de CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 e IL-17A e correlacionar a expressão desses marcadores com o tipo celular, imunofenótipo, resposta ao tratamento e sobrevida global. Para análise estatística foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Quiquadrado de Pearson, de correlação de Spearman e a curva Kaplan-Meyer. Dos 47 gatos, 85% apresentaram a forma linfocítica de células T, com mediana de sobrevida de 24 meses; 15% apresentaram a forma linfoblástica de células B ou T, com mediana de sobrevida de 5 meses. A expressão de Ki-67 foi mais evidente naqueles pacientes com linfoma linfoblástico de células B ou T se comparado ao linfocítico de células T, com mediana de 40,5% e 8,2%, respectivamente e p=0,002. Na análise dos marcadores do sistema imune, não foi observada marcação de IL-2R. Não houve diferença significante na expressão de IL-17 e FOXP3 entre os tipos celulares e imunofenótipo, bem como não houve correlação entre FOXP3 e IL-17 e entre FOXP3 e CD8. Considerando somente os casos de linfoma linfocítico de células T, na análise do padrão de remissão parcial (n=12) versus completa (n=27), constatou-se diferença significante quanto à sobrevida (p&lt;0,0001) e CD8 (p&#61;0,015). Na análise de sobrevida, o tratamento com L-asparaginase, clorambucil e prednisolona, os níveis de albumina sérica iguais ou maiores que 2,5g/dL e o ganho de peso no início do tratamento foram preditores de maior tempo de sobrevida. Pode-se concluir que o linfoma linfocítico de células T foi o mais prevalente na espécie felina, envolvendo principalmente o intestino delgado e com um tempo mediano de sobrevivência de 24 meses; a expressão de ki-67 foi melhor marcador para determinar a proliferação celular se comparada ao índice mitótico; a expressão de FOXP3 foi baixa e não se relacionou à resposta terapêutica e ao tempo de sobrevida. Na análise específica dos casos de linfoma linfocítico de células T, não houve correlação entre FOXP3/IL-17 e FOXP3/CD8, enquanto que a baixa expressão de CD8 correlacionou-se a maior sobrevida naqueles pacientes em remissão completa / Lymphomas belong to a group of neoplasia that have in common the origin in lymphoreticular cells, and gastrointestinal is the most prevalent anatomical form in feline species. Most animals initially respond to treatment, however, it is known that the imbalance in the immune system generally may facilitate the occurrence and spread of tumors. To balance the activity of immune system, cells with regulatory function (Treg) are essential and therefore the target of many researches, alone or in combination with other markers such as IL-17A and CD8, as well Tregs as Th17 lymphocytes originate from a same progenitor T-cell. Thus, the relation between Treg / Th17 is important since changes in this relation can lead to suppressed production of CD8&#43; T lymphocytes, inverting the relation Treg/CD8. There is also evidence that Tregs alter the effector function of T cells against tumors in human beings and dogs. The objectives of this study was to evaluate the characteristics of gastrointestinal (GI) lymphoma in cats, cell proliferation by mitotic index and Ki-67 marker, immunohistochemical expression of CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 and IL-17A and correlate the expression of these markers on the cell-type, immunophenotype, response to treatment and overall survival. Statistical analysis was performed by Mann-Whitney test, Kruskal-Wallis test, Pearson\'s Chi-squared test, Spearman correlation and Kaplan-Meier curve. Of the 47 cats, 85% showed lymphocytic T cells, with a median survival of 24 months; and 15% had lymphoblastic B or T cells, with a median survival of 5 months. Ki-67 expression was most evident in patients with lymphoblastic B- or T-cell lymphoma compared to lymphocytic T cell lymphoma, with a median of 40.5% and 8.2%, respectively and p &#61 0.002. In the analysis of immune system markers, immunostaing was not observed IL-2R. There was no significant difference in IL-17A and FOXP3 expression between cell-type and immunophenotypes, as well as no correlation between FOXP3 and IL-17A and between FOXP3 and CD8. Considering only the cases of lymphocytic T-cell lymphoma, there was a significant difference in survival time (p <0.0001) and CD8 expression (p &#61; 0.015) considering partial (n &#61; 12) versus complete remission (n &#61; 27). In survival analysis, treatment A (L-asparaginase, chlorambucil and prednisolone), as well as serum albumin levels equal or higher than 2.5g/dL and weight gain after 30 days of treatment were predictive of increased survival time. As conclusion, lymphocytic T-cell lymphoma was more prevalent in feline species, mainly involving the small intestine and with a median survival of 24 months. Ki-67 expression was better marker to determine cell proliferation than mitotic index. FOXP3 expression was low and did not correlate to therapeutic response and survival time in GI lymphoma. In the specific analysis of lymphocytic T-cell lymphoma, there was no correlation between FOXP3/IL-17A and FOXP3/CD8, while low CD8 expression was correlated with increased survival in patients in complete remission

O presente trabalho tem como pano de fundo a regulação de acesso a redes de telecomunicações e os problemas relacionados ao cumprimento das respectivas regras. A partir da descrição e conjugação de literaturas especializadas, a PRIMEIRA PARTE do texto delimita um conceito de estratégia regulatória, apontando seus elementos-chave as ferramentas e abordagens passíveis de escolha e combinações pelo regulador em suas tomadas de decisões , bem como as vantagens e desvantagens associadas a cada um deles. A SEGUNDA PARTE explora as características gerais do setor e da regulação das telecomunicações com vistas a facilitar a estruturação de um conceito de estratégia regulatória de compliance em regimes de acesso a redes. Na TERCEIRA PARTE o conceito proposto é aplicado ao caso brasileiro da regulamentação da EILD (Exploração Industrial de Linhas Dedicadas), uma modalidade de contratação de redes de operadores dominantes, como forma de identificar e avaliar criticamente as estratégias de compliance dos diferentes regimes de EILD já vigentes no país. Nesse processo são apontadas limitações das estratégias de compliance instituídas pelas normativas de EILD analisadas. Ainda nessa etapa o conceito proposto é aplicado a regimes internacionais de acesso a redes de telecomunicações, o que permite comparar a estratégia de compliance do atual regime brasileiro com as estratégias de compliance de regimes de acesso a redes de telecomunicações em países que também enfrentaram dificuldades para assegurar o cumprimento das regras de acesso. Conclui-se destacando a funcionalidade do uso do conceito para delimitação e análise das estratégias de compliance de regimes de acesso a redes de telecomunicações, o que auxilia o regulador em suas tomadas de decisão relacionadas à questão. / The thesis focuses on the regulation of telecom network access and the problems of compliance arising thereof. By describing and comparing some literature on the theme, PART ONE of the research defines a concept for regulatory strategy pointing out its main elements tools and approaches that might be selected and matched by the regulator , as well as the advantages and disadvantages related to it. PART TWO explores telecom´s sector and regulation basic features in order to facilitate the construction of a concept for compliance regulatory strategies applied to network access regimes. PART THREE presents a case study by means of which the proposed concept is applied to the regulation of leased lines (EILD) in Brazil a type of contracting network from dominant operators as a way to identify and discuss the compliance strategies of the different EILD regimes within the country. At this stage of the research some failures regarding the compliance strategies are underlined. Moreover the proposed concept is applied to international telecommunications network access regimes in a way to compare the compliance strategy within the current Brazilian access regime with the compliance strategies put in force by overseas regulators who faced many difficulties to deal with non-compliance problems. The conclusion underlines that the adoption of the proposed concept is helpful to identify and evaluate compliance strategies within the telecommunications network access regimes and therefore may facilitate the regulator task when deciding on the issue at hand.

A análise da expressão gênica através de dados gerados em experimentos de microarrays de DNA vem possibilitando uma melhor compreensão da dinâmica e dos mecanismos envolvidos nos processos celulares ao nível molecular. O aprimoramento desta análise é crucial para o avanço do conhecimento sobre as bases moleculares das neoplasias e para a identificação de marcadores moleculares para uso em diagnóstico, desenho de novos medicamentos em terapias anti-tumorais. Este trabalho tem como objetivos o desenvolvimento de modelos de análise desses dados, propondo uma nova forma de normalização de dados provenientes de microarrays e dois modelos para a construção de redes regulatórias de expressão gênica, sendo uma baseada na conectividade dinâmica entre diversos genes ao longo do ciclo celular e a outra que resolve o problema da dimensionalidade, em que o número de experimentos de microarrays é menor que o número de genes. Apresenta-se, ainda, um pacote de ferramentas com uma interface gráfica de fácil uso contendo diversas técnicas de análise de dados já conhecidas como também as abordagens propostas neste trabalho. / The analyses of DNA microarrays gene expression data are allowing a better comprehension of the dynamics and mechanisms involved in cellular processes at the molecular level. In the cancer field, the improvement of gene expression interpretation is crucial to better understand the molecular basis of the neoplasias and to identify molecular markers to be used in diagnosis and in the design of new anti-tumoral drugs. The main goals of this work were to develop a new method to normalize DNA microarray data and two models to construct gene expression regulatory networks. One method analyses the dynamic connectivity between genes through the cell cycle and the other solves the dimensionality problem in regulatory networks, meaning that the number of experiments is lower than the number of genes. We also developed a toolbox with a user-friendly interface, displaying several established statistical methods implemented to analyze gene expression data as well as the new approaches presented in this work.

Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-&#945; do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-&#945;; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-&#945; in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-&#945;, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que têm grande importância médica e veterinária devido ao efeito deletério direto causado por se fixarem e sugarem seus hospedeiros, como também por serem importantes vetores de doenças para o homem e para os animais domésticos. Sabendo que carrapatos permanecem fixos em seus hospedeiros por longos períodos de tempo sem serem rejeitados, é possível inferir que esses ácaros possuam um arsenal de mecanismos que atuem no controle da resposta imune do hospedeiro. De fato, diversos trabalhos têm demonstrado que carrapatos são capazes de modular a resposta imune de seus hospedeiros através de componentes presentes na saliva, que são inoculados durante o repasto sangüíneo. Assim, este trabalho procurou investigar se carrapatos exercem a modulação da resposta imune do hospedeiro através do recrutamento de células T regulatórias CD4+CD25+ (Tregs), com a intenção de conter uma resposta inflamatória / imune prejudicial à sua alimentação. Para isso, células isoladas de amostras de pele e linfonodos de camundongos BALB/c infestados com carrapatos Rhipicephalus sanguineus foram analisadas quanto à expressão das moléculas de superfície CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR e CD103 (fenótipo de células Tregs), por citometria de fluxo. Adicionalmente, as células obtidas dos linfonodos foram avaliadas quanto à expressão de mensagem para o fator de transcrição Foxp3 (característico da função regulatória), por PCR quantitativo. Paralelamente, saliva de R. sanguineus foi inoculada na orelha de animais da mesma linhagem, a fim de se comparar o infiltrado celular com o obtido na pele dos camundongos infestados com carrapatos. Os resultados mostraram que as infestações não alteraram a percentagem de células T CD4+CD25+ nem a expressão de moléculas associadas ao fenótipo de células Tregs nas células infiltradas na lesão de fixação dos carrapatos ou nos linfonodos em comparação a camundongos controles. Também não se verificou aumento da expressão do gene para Foxp3 nos linfonodos em nenhum dos grupos analisados. Por outro lado, a inoculação de saliva na orelha de camundongos induziu um aumento significativo da população de células T CD4+, porém estas também não apresentavam fenótipo regulatório, sugerindo que o mecanismo de imunomodulação exercido pelos carrapatos sobre seus hospedeiros não é mediado por essas células. Resultados adicionais mostraram que a saliva de carrapatos reduziu significativamente a percentagem de células dendríticas nas orelhas dos camundongos, sugerindo que carrapatos podem estar modulando a resposta imune de seus hospedeiros por diminuírem o repovoamento da pele com células dendríticas, as quais são essenciais na vigilância imune dos tecidos periféricos. / Ticks are bloodsucking arthropods that feed on vertebrates and are responsible for serious global economic losses both through the effects of blood sucking and as vectors of pathogens. A tick?s bloodmeal lasts for several days, during which it remains fixed to the host and avoids rejection by local inflammatory and immunological reactions. This status is achieved by the escape mechanisms ticks have evolved. In fact, many studies have demonstrated that ticks modulate the host immune response through salivary compounds inoculated during their bloodmeals. This study investigated if during bloodfeeding ticks can recruit regulatory T cells in an attempt to modulate the host immune response and to control inflammatory responses that could be harmful to tick feeding. BALB/c mice were infested with Rhipicephalus sanguineus, the skin at feeding sites and the regional lymph nodes were collected, and the cells forming the local infiltrates were analyzed by flow cytometry for simultaneous expression of CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR and CD103 molecules. Additionally, expression of mRNA for Foxp3 was measured in the lymph node cells. Tick saliva was also inoculated into the ears of BALB/c mice in order to compare the local cellular infiltrate with that elicited by artificial infestation. Control animals were sham infested. The results show that, relative to sham-infested tissues, tick infestations did not alter the percentage of CD4+CD25+ T cells present at the site of their attachment or in draining lymph nodes. Infestations also did not increase the expression of Foxp3 in skin and lymph nodes. On the other hand, saliva inoculated into the ear induced a significant increase in the number of CD4+ T lymphocytes recruited to the site of inoculation, although these cells did not express a regulatory phenotype. These results suggest that the modulation of the host immune response by ticks does not involve CD4+CD25+ T cells. Additional results showed that tick saliva reduced the percentage of dendritic cells in the skin of infested mice. This finding indicates that ticks may modulate the host immune response by diminishing the repopulation of skin with dendritic cells, which are essential for maintaining surveillance of peripheral tissues for incoming antigens.

A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 usada por séculos como a principal fonte de açúcar e mais recentemente para obtenção de etanol. Devido a sua grande importância no cenário econômico mundial, estudos em cana-de-açúcar são cada vez mais importantes no sentido de prover informações que possam levar ao aumento de produtividade para suprir tanto a demanda interna quanto externa. No entanto, a quantidade de dados moleculares e biotecnológicos disponíveis está muito aquém do necessário, e investimentos na obtenção de novos conhecimentos serão necessários se quisermos evoluir neste campo, assim como manter o nosso país como líder na produção de etanol. Neste trabalho, conduzimos experimentos em campo para comparar variedades contrastantes para a tolerância ao déficit hídrico e realizamos diagnósticos fisiológicos e moleculares para diferenciar as variedades. O estresse hídrico levou à diminuição do crescimento e desenvolvimento de todas as três variedades analisadas. A variedade RB855536 foi identificada como a menos produtiva das três, visto que em condições de déficit hídrico ela diminui mais seu crescimento, sofre mais efeitos do estresse oxidativo, acumula mais osmólitos e tem o ciclo de Calvin menos ativo. A variedade RB867515 teve um melhor desempenho, não acumulou osmólitos, não teve aumento na concentração de prolina, teve sinais menores de estresse oxidativo e um melhor funcionamento do ciclo de Calvin. Além disto, nós observamos a indução de transcritos na via de resposta do ABA e proteínas relacionadas com a fotossíntese, transporte de água e dobramento protéico. A variedade RB92579 teve um padrão similar ao encontrado para a RB867515, mas teve uma maior fotossíntese, um menor estresse oxidativo e uma menor perda de pigmentos. Nossos dados avançaram na identificação de genes envolvidos na resposta ao déficit hídrico em cana-de-açúcar assim como permitiram distinguir as variedades utilizadas no estudo. A partir de uma prospecção inicial de dados de transcriptoma previamente obtidos pelo grupo, foram selecionados fatores de transcrição associados a características agronômicas de interesse. Produzimos anticorpos para 5 TFs de cana-de-açúcar e padronizamos a metodologia de ChIP-Seq utilizando a plataforma de sequenciamento Roche 454. Uma análise dos dados de ChIP-Seq usando anticorpos para a RNA Polimerase II nos permitiu detectar contaminações com DNA humano, provavelmente pela utilização de gDNA como controle das reamplificações, assim como a detecção de mapeamento de muitas regiões repetitivas, o que pode ser normal, podendo indicar locais de ligação da Polimerase II ou então background. O mapeamento de praticamente todos os dados de sorgo em cana evidenciou a similaridade entre estes organismos, mas a maior quantidade de mapeamento em cana evidencia uma maior complexidade de seu genoma. Os resultados foram importantes por permitir o estabelecimento de uma metodologia de mapeamento de regiões regulatórias no genoma da cana-de-açúcar e significa um importante passo no estabelecimento de redes regulatórias associadas a características agronômicas de interesse / Sugarcane is a C4 grass used for centuries as the main source of sugar and more recently for ethanol production. We have seen an increasing interest in recent years to understand sugarcane to improve yield and supply the increasing world demand. However, the amount of molecular data available is far from ideal, and investments in acquiring new knowledge will be necessary to progress in this field if we want to maintain our country as a pioneer in ethanol production. In this work, we conducted field experiments to compare varieties contrasting to drought tolerance and performed physiological and molecular analysis. The stress condition led to reduced growth and development of all three varieties. The variety RB855536 was identified as the least productive, suffered more effects of oxidative stress, has accumulated more osmolytes and has the Calvin cycle less active. The variety RB867515 had a better performance, did not accumulate osmolytes, had no increase in the concentration of proline, had minor signs of oxidative stress and a better functioning of the Calvin cycle. In addition, we observed an induction of transcripts in the ABA response pathway and proteins related to photosynthesis, water transport and protein folding. The variety RB92579 had a pattern similar to that found in RB867515, but presented increased photosynthesis, lower oxidative stress and a lower loss of pigment. We succeded in identifying genes involved in the response to water stress in sugarcane as well as in distinguishing the varieties used in the study. We selected transcription factors associated with agronomical traits from the transcriptome data previously obtained by the group. We produced antibodies for 5 sugarcane TFs and standardized the methodology of ChIP-Seq using the 454 sequencing platform. Data analysis of ChIP-Seq using RNA Pol II antibody allowed us to detect contamination with the human genome, probably due to the use of gDNA in the reamplification control, as well as to map the detection repetitive regions, which may be binding sites of Pol II or background. The data reveals that sorghum and the sugarcane genome are similar despite the complexity of sugarcane. The results were important since they allow the beggining of studies to map regulatory regions in the sugarcane genome, as well as the uncovery of regulatory networks associated with agronomic traits of interest

This work presents a methodology to describe the dynamics and topology of biological regulatory networks through the application of graph theory. We model these networks using Boolean rules and simulations performed with algorithms implemented in MATHEMATICA 7.0. Through this methodology, we characterize the regulatory network of opening and closing of the stomata of a plant by abscisic acid (ABA), including the relationships between the network s elements during the dynamics and the description of the state-space by comparing each one of its elements. For the state of cellular replicative senescence in humans, the goal is to describe a regulatory network of proteins involving the mechanisms of Shelterin complex, DNA double-strand break signaling, and the cell cycle arrest in G1 phase. The network topology must involve a combination of pathways and modules to ensure the stability of the signal and the permanent cell-cycle arrest. The state senescent is also characterized by establishing a secretory phenotype (SASP) with both beneficial and harmful effects for the organism. Different pathways are identified along with the activation of NF-kB in the regulation of these phenotypes and in this sense, a regulatory network to regulate the SASP in replicative senescence is proposed and the main consequences of the SASP for human colon are identified via analysis of microarray data related to normal colon, inflamed colon, colonic adenoma and carcinoma of the colon. / Este trabalho apresenta uma metodologia para descrever a dinâmica e a topologia de redes biológicas regulatórias através da aplicação da teoria de grafos, da modelagem de redes a partir de regras booleanas e através do uso de simulações baseadas em algoritmos implementados no software MATHEMATICA 7.0. Por meio desta metodologia procurou-se caracterizar a rede de regulação de abertura e fechamento dos estômatos de uma planta pelo ácido abscísico (ABA), incluindo a relação entre os elementos da rede durante a dinâmica e a descrição do espaço de estados. No estudo do estado celular de senescência replicativa em humanos, o objetivo é descrever uma rede regulatória de proteínas envolvendo os mecanismos do complexo de Shelterin com a sinalização de duplas quebras no DNA e a sinalização da parada do ciclo celular na fase G1. Por meio desta rede, a topologia deve envolver a combinação de vias e módulos para garantir a estabilidade da sinalização e a parada permanente da célula no estado senescente. O estado senescente também é caracterizado pelo estabelecimento de um fenótipo secretor (SASP) com efeitos tanto benéficos quanto prejudiciais para o organismo. Diferentes vias estão identificadas juntamente com a ativação de NF-kB na regulação deste fenótipo e nesse sentido, uma rede regulatória do SASP em senescência replicativa é proposta e as principais consequências do SASP para o cólon humano são identificadas através da análise de dados de microarranjos que relacionam cólon normal, cólon inflamado, adenoma de cólon e carcinoma de cólon.

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