Orientador: José Mauricio Barbanti Duarte / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Eveline dos Santos Zanetti / Banca: Denise Calisto Bongalhardo / Banca: Ricardo José Garcia Pereira / Resumo: O Brasil é o país com a maior diversidade de psitacídeos do mundo, abrigando 72 espécies reconhecidas, com 16 espécies presentes no "Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção". O papagaio-verdadeiro (Amazona aestiva) se destaca por sua popularidade como animal de estimação, sendo coletado na natureza em grande número para atender ao mercado ilegal de animais silvestres. Sua reprodução em cativeiro pode se tornar uma ferramenta para a conservação das populações na natureza, porém isso exige uma criação baseada em conhecimentos científicos e técnicas avançadas de reprodução. Esta tese teve como objetivos apresentar o perfil anual endócrino dos esteroides sexuais do Amazona aestiva e realizar um ensaio de estímulo hormonal através da aplicação de análogo de GnRH de liberação lenta na espécie. Utilizamos 10 casais e 4 machos adultos da espécie Amazona aestiva mantidos em viveiros suspensos, pertencentes ao Criadouro da Brisa, situado Jaboticabal/SP. As excretas foram coletadas ao menos uma vez por semana entre junho de 2011 e julho de 2012 para entendimento dos processos endócrinos que regem a reprodução da espécie e entre agosto de 2012 e dezembro de 2012 no ensaio de estímulo hormonal. O monitoramento da atividade gonadal foi feita de forma não invasiva por mensuração de metabólitos de andrógenos nas excretas dos machos e de progestágenos nas excretas de fêmeas. Foram coletadas amostras frescas de excretas, sempre no período entre 14h as 17h, e mantidas congeladas até o processamento. As amostras foram secas em estufa a 57oC, trituradas e os hormônios extraídos utilizando metanol a 80%. A dosagem hormonal foi realizada no Laboratório de Endocrinologia do NUPECCE (Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos) utilizando ensaio imunoenzimático com o anticorpo para andrógenos e progestágenos. No ensaio de estimulo hormonal exógeno com analago de GnRH foi aplicado ... / Abstract: Brazil is the country with the greatest diversity of parrots in the world , with to 72 recognized species , with 16 species in the " Red List of Endangered Brazilian Wild Animals " . The blue-fronted amazon parrot ( Amazona aestiva ) stands out for its popularity as a pet , being collected from the wild in large numbers to attend the illegal market for wildlife. His captive breeding can become a tool for the conservation of populations in nature , but this requires a creation based on scientific knowledge and advanced breeding techniques . This thesis aimed to present the annual endocrine profile of sex steroids of Amazona aestiva and a test of hormonal stimulation by applying GnRH analogue of the slow release. It was used 10 couples and 4 adult males of Amazona aestiva kept in suspended cages, properties of the commercial breeder "Criadouro da Brisa", located in Jaboticabal / SP. The droppings were collected at least once a week between June 2011 and July 2012 for the understanding of endocrine processes of the reproduction in this specie and between August 2012 and December 2012 for testing hormonal stimulation . The monitoring of gonadal activity was noninvasively by measuring androgen metabolites in droppings of males and females of droppings progestogens. Fresh droppings samples were collected , always in between 14h to 17h , and kept frozen until processing . The samples were dried at 57oC, crushed and hormones were extracted using 80% methanol . The hormone dosage was performed at the Laboratory of Endocrinology, NUPECCE ( Center for Research and Conservation of Deer ) using enzyme immunoassay with antibody to androgens and progestins . In exogenous hormone stimulation test with GnRH was applied analago buserelin slow release in 5 couples and 5 couples were used to control the following excreta collection , processing and hormonal dosage previously described . The results of the annual listing of androgens in males ... / Doutor

A lesão de isquemia e reperfusão pulmonar (LIRI) é a principal causa de disfunção precoce do enxerto após o transplante pulmonar. Diferentes substâncias têm sido utilizadas na tentativa de proteger o pulmão na fase inicial pós-transplante e melhorar o desempenho do enxerto com pouco resultado tanto a curto quanto em longo prazo. O peptídeo liberador gastrina (GRP) está envolvido na indução de respostas imunes inatas adaptativas por induzir a quimiotaxia de mastócitos, migração de macrófagos e proliferação de células T e fibroblastos. Este agente foi capaz de proteger o dano tecidual em outros modelos experimentais de inflamação, incluindo sepsis pós-isquemia e perfuração de ceco, artrite e colite induzidos por drogas. O efeito protetor foi atribuído ao bloqueio na liberação de citocinas pró-inflamatórias, como da interleucina -1 beta (IL-1G) e TNF- alfa (TNF-H), e inibição de migração de mononucleares. Nesta tese o efeito protetor do antagonista do receptor de peptídeo liberador de gastrina (GRPR), o RC-3095 (RC) endovenosamente administrado antes e depois da reperfusão foi estudado em modelo animal de LIRI. Vinte ratos Wistar foram randomizados em quatro grupos: (SHAM), Isquemia-reperfusão (IR), administração de RC Pré-IR (RC-Pré) e RC Pós-IR (RC-Pós). Após a reperfusão, os animais foram observados por 120 minutos. Foi realizada a análise histológica, com verificação de escala de lesão pulmonar, e imunohistoquímica para Caspase clivada - 9 e oxido nítrico sintetase endotelial (eNOS). Expressão de IL-1G e TNF-H foram quantificadas por Enzime-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Uma redução significativa na pressão arterial média foi observada nos grupos IR e RC - Pré quando comparado com seus valores antes da reperfusão (p < 0.001). No final do experimento o grupo RC-Pós apresentou uma redução significativa na pressão arterial de oxigênio em relação ao início (p=0.005). Observou-se maior expressão de Caspase - 9 clivada no grupo RC-Pós (p>0.013), quando comparado aos demais grupos. Não houve diferença significativa na captação da eNOS entre os grupos (p=0.206). Os grupos RC - Pré e Pós mostraram discreta redução, não atingindo significância estatística, da IL-1G (p=0.159) e TNF- H (p= 0.260), quando comparado com o grupo IR. Não houve diferença estatística entre as médias dos escores histológicos entre os diferentes grupos. e SHAM. Notavelmente, quando administrado após reperfusão parece potencializar dano celular estimulando a apoptose. Concluindo, a utilização do antagonista do peptídeo liberador de gastrina, RC-3095, não produziu efeito protetor significativo na resposta inflamatória em pulmões de ratos. Estudos adicionais devem ser implementados para confirmar estes achados. / Lung ischemia reperfusion injury (LIRI) is the main cause of early graft dysfunction and death after lung transplantation. Several methods and substances have been used as an attempt to protect the lung during the early phase after transplantation and improve graft performance at short and long term with limited results. The selective gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) antagonist RC-3095 (RC) was shown to protect from damage in various models of inflammation, including sepsis due to cecal ischemia and perforation, drug-induced arthritis and colitis, probably due to the inhibition in the release of proinflammatory cytokines, such as interleukin-1-beta and TNFalpha, as well as interference with mononuclear migration. In this thesis, the protective effect of the selective gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) antagonist RC-3095, administrated intravenous before and after reperfusion was studied in an animal model of LIRI. A total of 20 Wistar rats were randomized in four groups: (SHAM), Ischemia-reperfusion (IR), RC Pre-IR (RCPre) and the RC Post-IR (RC-Post) .The IR groups were submitted to a model of ischemia/reperfusion by clamping of the left pulmonary hilum for 45 minutes followed by reperfusion for 120 minutes. We recorded the hemodynamic parameters, blood gas analysis and histology. We analyzed Cleaved Caspase- 9 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) by immunohistochemistry. Expression of IL-1G and TNF-H was evaluated by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). We observed that the final mean arterial pressure significantly decreased in IR and RC Pre-IR compared to their values before reperfusion (p < 0.001).The RC-Post group showed significant decrease of partial pressure of arterial oxygen at the end of the observation compared to baseline (p=0.005). Caspase-9 activity was significantly higher in the RC-Post- IR as compared to the other groups (p < 0.013). No significant differences were observed of eNOS activity among the groups. The groups RC Pre-IR e RC Post-IR did not show a significant decrease of IL-1G (p=0.159) and TNF-H (p= 0.260), as compared to IR. The histological score showed no significant differences among the groups. Notably, its use after reperfusion seems to potentiate cell damage, stimulating apoptosis In conclusion, RC3095, a selective GRPR antagonist failed to demonstrate a significant protective effect in our LIRI model in male Wistar rats. Further studies to address this question are warranted.

Introdução e objetivo: Gastrin-releasing peptide (GRP) está envolvido em diversas funções cerebrais e gastrointestinais, incluindo secreção pancreática, liberação de hormônios peptídeos gastrointestinais e redução da ingestão alimentar. O objetivo deste estudo é testar os efeitos da injeção intraperitoneal do antagonista do receptor GRP sobre o peso, ingestão alimentar, parâmetros metabólicos e bioquímicos e composição corporal. Métodos: Foram utilizados 35 ratos Wistar adultos jovens, submetidos a uma perda ponderal mínima de 7%, divididos em quatro grupos: Grupo Controle (G0) que recebeu injeção de solução salina; Grupo 1 (G1) que recebeu 0,1 mg/kg de RC-3095; Grupo 2 (G2) que recebeu 0,3 mg/kg de RC-3095 e Grupo 3 (G3) que recebeu 1,0 mg/kg de RC-3095 durante 14 dias. Resultados: A variação da média diária de ingestão alimentar foi estatisticamente diferente entre os grupos (F: 3,139; df: 3; P = 0,039) e o G2, que recebeu a dose intermediária de 0,3 mg/kg de RC-3095, mostrou uma ingestão alimentar maior do que o G0 (P = 0,041). Houve um aumento similar do peso, de aproximadamente 22% (F: 0,572; df: 3; P = 0,638), assim como uma média de peso similar dos animais (F: 1,145; df: 9,685; P = 0,338) entre os grupos durante o período do estudo. Porém, a média de peso do G2 foi mais alta do que a média de peso dos animais do G0 (P = 0,042). Ao final do estudo, nenhuma diferença foi observada entre os grupos no total de massa magra ou de massa gorda da carcaça, fígado e pele dos animais. Comparando os níveis séricos de albumina, amilase, glicose, colesterol total, HDL-colesterol e interleucina-6 do Dia 1 (D1) para o Dia 14 (D14), não houve diferença estatisticamente relevante entre os grupos. Entretanto, o nível médio de triglicerídeos no G2 mostrou um aumento maior quando comparado ao G0 (P = 0,038). Conclusões: Neste estudo, a injeção da dose intermediária do antagonista do receptor GRP, o RC-3095 (0,3 mg/kg/dia), em ratos Wistar adultos jovens saudáveis submetidos a perda ponderal, interferiu na ingestão alimentar e no peso médio. Nenhum efeito sobre o ganho de peso, composição corporal ou parâmetros metabólicos e bioquímicos foi observado, exceto um aumento maior do nível sérico de triglicerídeos. Estes resultados demonstram alguns dos efeitos fisiológicos do GRP sobre a ingestão alimentar e peso, ampliando possibilidades de futuros estudos sobre fome, saciedade e metabolismo de macronutrientes ou em animais submetidos a uma condição de estresse maior, como o câncer. / Introduction and Objective: Gastrin-releasing peptide (GRP) is involved in several brain and gastrointestinal functions, including pancreatic secretion, gastrointestinal peptide hormone release, and reduction of food intake. We tested the effects of an intraperitoneal injection of the GRP receptor (GRPR) antagonist RC-3095 on weight, food intake, biochemical metabolic parameters, and body composition. Methods: Thirty-five young adult male Wistar rats, submitted to a minimal weight loss of 7%, were divided into four groups: the control group (G0) received saline; Group 1 (G1) received 0.1 mg/kg RC-3095; Group 2 (G2) received 0.3 mg/kg RC-3095; and Group 3 (G3) received 1.0 mg/kg RC-3095 for 14 days. Results: The mean daily variation of food intake was statistically different between the groups (F: 3.139; df: 3; P = 0.039); and G2, which received the intermediate dose of 0.3 mg/kg RC-3095, showed a greater food intake than G0 (P = 0.041). There was a similar increase in weight, approximately 22% (F: 0.572; df: 3; P = 0.638), as well as a similar mean animal weight (F: 1.145; df: 9.685; P = 0.338) between the groups during the study period. However, the mean weight of G2 animals was more than the mean weight of G0 animals (P = 0.042). At the end of the study, no difference was observed between the groups in terms of the total lean mass or fat mass from the rat carcass, liver, and skin. Comparing the serum levels of albumin, amylase, glucose, total cholesterol, high-density lipoprotein (HDL) cholesterol, and interleukin (IL)-6 from day 1 (D1) to D14, there were no statistically relevant differences between the groups. However, the mean triglyceride level in G2 compared to G0 showed a greater increase (P = 0.038). Conclusion: In this study, the injection of an intermediate dose of GRPR antagonist RC- 3095 (0.3 mg/kg/day) into healthy young adult Wistar rats submitted to weight loss affected food intake and the mean weight. No effects on weight gain, body composition, or biochemical metabolic parameters were observed, except for a great increase in the serum triglyceride levels. These results demonstrate some physiological effects of GRP on food intake and weight, expanding the possibilities of future studies on hunger/satiety and macronutrient metabolism as well as highly stressful conditions like cancer.

Mutações inativadoras do receptor de GnRH (GNRHR) são a causa genética mais frequente de hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) normósmico. Os genes envolvidos da patogênese do HHI, incluindo o GNRHR, estão associados a um amplo espectro fenotípico, variando de HHI parcial a completo. O atraso constitucional do crescimento e desenvovimento (ACCD) poderia constituir uma variante fenotípica leve do HHI. Neste estudo avaliamos a frequência de mutações no gene GNRHR em pacientes com HHI normósmico e ACCD, bem como correlacionamos o genótipo/fenótipo nesses pacientes. Além disso, avaliamos o efeito fundador de uma mutação do GNRHR (p.R139H) frequente na população brasileira com HHI normósmico. Para esse estudo, selecionamos 116 pacientes com HHI normósmico e 51 com ACCD. Um grupo de 130 indivíduos com desenvolvimento puberal normal foi utilizado como controle. A região codificadora do gene GNRHR foi amplificada por PCR e sequenciada. Análises in silico e in vitro foram realizadas nas duas novas variantes (p.V134G e p.Y283H). Três marcadores de microssatélites (D4S409, D4S2387, D4S3018) foram amplificados e analisados nos pacientes portadores da mutação p.R139H, familiares e controles. No grupo de HHI normósmico, nove mutações (p.N10K,p.Q11K, p.Q106R, p.R139H, p.C200Y, p.R262Q, p.Y284C, p.Y283H, p.V134G) foram identificadas em onze pacientes (9,5%). Entre as mutações identificadas no GNRHR, duas foram descritas pela primeira vez no estudo atual: p.Y283H e p.V134G, cuja análise in vitro demonstrou inativação completa do receptor. Em geral, uma boa correlação genótipo-fenótipo foi observada. Pacientes portadores de mutações inativadoras apresentavam HHI completo e mutações com perda parcial de função causavam HHI parcial, incluindo dois pacientes que evoluíram com reversão do hipogonadismo após reposição androgênica. Por outro lado, não houve diferença fenotípica entre os casos com e sem mutação do GNRHR. Análise de ancestralidade genética da mutação p.R139H demonstrou que todos os casos brasileiros apresentaram o mesmo haplótipo, sugerindo que a mutação p.R139H possui um ancestral comum na população brasileira. Por outro lado o caso familial proveniente da Polônia apresentou apenas um marcador em comum com as famílias brasileiras e estudos mais abrangentes seriam necessários para determinar a origem da mutação p.R139H em indivíduos não Brasileiros. Na casuística de ACCD apenas a mutação p.Q106R foi identificada no gene GNRHR em heterozigose em um paciente. Em conclusão, o GNRHR foi o gene mais comumente afetado, apresentando uma boa correlação genótipo-fenótipo, e deve ser o primeiro candidato para análise genética em HHI normósmico. Os resultados sugerem que a mutação p.R139H possui um ancestral comum na população brasileira. Mutações no GNRHR parecem não estar envolvidas na patogênese do ACCD / GnRH receptor (GNRHR) inactivating mutations are the most common genetic cause of normosmic IHH. The genes involved in the IHH, including GNRHR, have been associated with a large phenotypic spectrum, varying from partial to complete IHH. Constitutional delay of growth and puberty (CDGP) might represent a mild phenotypic variant of IHH. In this study we investigated novel variants and characterized the frequency and phenotype-genotype correlation of GNRHR mutations in normosmic IHH and CDGP patients. Additionally, we determined de cause of the recurrence of GNRHR p.R139H mutation in patients with normosmic IHH. We studied 116 patients with normosmic IHH and 51 with CDGP. The control group was composed by 130 adults with normal pubertal development. The coding region of GNRHR was amplified and automatically sequenced. The two novel variants identified (p.Y283H, p.V134G) were submitted to in silico and in vitro analysis. Three microsatellite markers (D4S409, D4S2387, D4S3018) were amplified by PCR and analyzed in the patients with the p.R139H mutation. In the CDGP group, the previously described mutation p.Q106R was identified in the heterozygous state in one boy. The p.Q106R mutation has been identified in heterozygous state in individuals with normal pubertal development and does not appear be involved on the CDGP phenotype in this patient. In the normosmic IHH group, nine variants were identified (p.N10K, p.Q11K, p.Q106R, p.R139H, p.C200Y, p.R262Q, p.Y284C, p.Y283H, p.V134G) in eleven patients (9.5%). In vitro analysis of the novel variants p.Y283H and the p.V134G demonstrated that both of them cause complete loss of function of the receptor. The founder effect study revealed that all the p.R139H affected Brazilian patients presented the same haplotype, suggesting that the this mutation has a common ancestor in the Brazilian population. Nevertheless the affected Polish family presented a different haplotype, with only one marker in common with the Brazilian families and further studies would be necessary to determine the origin of the p.R139H mutation in the European population. In conclusion this study demonstrated that GNRHR was the most commonly affected gene in normosmic IHH, with a good genotype-phenotype correlation, and should be the first candidate gene for genetic screening in this condition. The results of the founder effect study suggested that the p.R139H mutation has a common ancestor in the Brazilian population. Finally, mutations in the GNRHR do not appear to be involved in the pathogenesis of CDGP

A lesão de isquemia e reperfusão pulmonar (LIRI) é a principal causa de disfunção precoce do enxerto após o transplante pulmonar. Diferentes substâncias têm sido utilizadas na tentativa de proteger o pulmão na fase inicial pós-transplante e melhorar o desempenho do enxerto com pouco resultado tanto a curto quanto em longo prazo. O peptídeo liberador gastrina (GRP) está envolvido na indução de respostas imunes inatas adaptativas por induzir a quimiotaxia de mastócitos, migração de macrófagos e proliferação de células T e fibroblastos. Este agente foi capaz de proteger o dano tecidual em outros modelos experimentais de inflamação, incluindo sepsis pós-isquemia e perfuração de ceco, artrite e colite induzidos por drogas. O efeito protetor foi atribuído ao bloqueio na liberação de citocinas pró-inflamatórias, como da interleucina -1 beta (IL-1G) e TNF- alfa (TNF-H), e inibição de migração de mononucleares. Nesta tese o efeito protetor do antagonista do receptor de peptídeo liberador de gastrina (GRPR), o RC-3095 (RC) endovenosamente administrado antes e depois da reperfusão foi estudado em modelo animal de LIRI. Vinte ratos Wistar foram randomizados em quatro grupos: (SHAM), Isquemia-reperfusão (IR), administração de RC Pré-IR (RC-Pré) e RC Pós-IR (RC-Pós). Após a reperfusão, os animais foram observados por 120 minutos. Foi realizada a análise histológica, com verificação de escala de lesão pulmonar, e imunohistoquímica para Caspase clivada - 9 e oxido nítrico sintetase endotelial (eNOS). Expressão de IL-1G e TNF-H foram quantificadas por Enzime-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Uma redução significativa na pressão arterial média foi observada nos grupos IR e RC - Pré quando comparado com seus valores antes da reperfusão (p < 0.001). No final do experimento o grupo RC-Pós apresentou uma redução significativa na pressão arterial de oxigênio em relação ao início (p=0.005). Observou-se maior expressão de Caspase - 9 clivada no grupo RC-Pós (p>0.013), quando comparado aos demais grupos. Não houve diferença significativa na captação da eNOS entre os grupos (p=0.206). Os grupos RC - Pré e Pós mostraram discreta redução, não atingindo significância estatística, da IL-1G (p=0.159) e TNF- H (p= 0.260), quando comparado com o grupo IR. Não houve diferença estatística entre as médias dos escores histológicos entre os diferentes grupos. e SHAM. Notavelmente, quando administrado após reperfusão parece potencializar dano celular estimulando a apoptose. Concluindo, a utilização do antagonista do peptídeo liberador de gastrina, RC-3095, não produziu efeito protetor significativo na resposta inflamatória em pulmões de ratos. Estudos adicionais devem ser implementados para confirmar estes achados. / Lung ischemia reperfusion injury (LIRI) is the main cause of early graft dysfunction and death after lung transplantation. Several methods and substances have been used as an attempt to protect the lung during the early phase after transplantation and improve graft performance at short and long term with limited results. The selective gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) antagonist RC-3095 (RC) was shown to protect from damage in various models of inflammation, including sepsis due to cecal ischemia and perforation, drug-induced arthritis and colitis, probably due to the inhibition in the release of proinflammatory cytokines, such as interleukin-1-beta and TNFalpha, as well as interference with mononuclear migration. In this thesis, the protective effect of the selective gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) antagonist RC-3095, administrated intravenous before and after reperfusion was studied in an animal model of LIRI. A total of 20 Wistar rats were randomized in four groups: (SHAM), Ischemia-reperfusion (IR), RC Pre-IR (RCPre) and the RC Post-IR (RC-Post) .The IR groups were submitted to a model of ischemia/reperfusion by clamping of the left pulmonary hilum for 45 minutes followed by reperfusion for 120 minutes. We recorded the hemodynamic parameters, blood gas analysis and histology. We analyzed Cleaved Caspase- 9 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) by immunohistochemistry. Expression of IL-1G and TNF-H was evaluated by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). We observed that the final mean arterial pressure significantly decreased in IR and RC Pre-IR compared to their values before reperfusion (p < 0.001).The RC-Post group showed significant decrease of partial pressure of arterial oxygen at the end of the observation compared to baseline (p=0.005). Caspase-9 activity was significantly higher in the RC-Post- IR as compared to the other groups (p < 0.013). No significant differences were observed of eNOS activity among the groups. The groups RC Pre-IR e RC Post-IR did not show a significant decrease of IL-1G (p=0.159) and TNF-H (p= 0.260), as compared to IR. The histological score showed no significant differences among the groups. Notably, its use after reperfusion seems to potentiate cell damage, stimulating apoptosis In conclusion, RC3095, a selective GRPR antagonist failed to demonstrate a significant protective effect in our LIRI model in male Wistar rats. Further studies to address this question are warranted.

Introdução e objetivo: Gastrin-releasing peptide (GRP) está envolvido em diversas funções cerebrais e gastrointestinais, incluindo secreção pancreática, liberação de hormônios peptídeos gastrointestinais e redução da ingestão alimentar. O objetivo deste estudo é testar os efeitos da injeção intraperitoneal do antagonista do receptor GRP sobre o peso, ingestão alimentar, parâmetros metabólicos e bioquímicos e composição corporal. Métodos: Foram utilizados 35 ratos Wistar adultos jovens, submetidos a uma perda ponderal mínima de 7%, divididos em quatro grupos: Grupo Controle (G0) que recebeu injeção de solução salina; Grupo 1 (G1) que recebeu 0,1 mg/kg de RC-3095; Grupo 2 (G2) que recebeu 0,3 mg/kg de RC-3095 e Grupo 3 (G3) que recebeu 1,0 mg/kg de RC-3095 durante 14 dias. Resultados: A variação da média diária de ingestão alimentar foi estatisticamente diferente entre os grupos (F: 3,139; df: 3; P = 0,039) e o G2, que recebeu a dose intermediária de 0,3 mg/kg de RC-3095, mostrou uma ingestão alimentar maior do que o G0 (P = 0,041). Houve um aumento similar do peso, de aproximadamente 22% (F: 0,572; df: 3; P = 0,638), assim como uma média de peso similar dos animais (F: 1,145; df: 9,685; P = 0,338) entre os grupos durante o período do estudo. Porém, a média de peso do G2 foi mais alta do que a média de peso dos animais do G0 (P = 0,042). Ao final do estudo, nenhuma diferença foi observada entre os grupos no total de massa magra ou de massa gorda da carcaça, fígado e pele dos animais. Comparando os níveis séricos de albumina, amilase, glicose, colesterol total, HDL-colesterol e interleucina-6 do Dia 1 (D1) para o Dia 14 (D14), não houve diferença estatisticamente relevante entre os grupos. Entretanto, o nível médio de triglicerídeos no G2 mostrou um aumento maior quando comparado ao G0 (P = 0,038). Conclusões: Neste estudo, a injeção da dose intermediária do antagonista do receptor GRP, o RC-3095 (0,3 mg/kg/dia), em ratos Wistar adultos jovens saudáveis submetidos a perda ponderal, interferiu na ingestão alimentar e no peso médio. Nenhum efeito sobre o ganho de peso, composição corporal ou parâmetros metabólicos e bioquímicos foi observado, exceto um aumento maior do nível sérico de triglicerídeos. Estes resultados demonstram alguns dos efeitos fisiológicos do GRP sobre a ingestão alimentar e peso, ampliando possibilidades de futuros estudos sobre fome, saciedade e metabolismo de macronutrientes ou em animais submetidos a uma condição de estresse maior, como o câncer. / Introduction and Objective: Gastrin-releasing peptide (GRP) is involved in several brain and gastrointestinal functions, including pancreatic secretion, gastrointestinal peptide hormone release, and reduction of food intake. We tested the effects of an intraperitoneal injection of the GRP receptor (GRPR) antagonist RC-3095 on weight, food intake, biochemical metabolic parameters, and body composition. Methods: Thirty-five young adult male Wistar rats, submitted to a minimal weight loss of 7%, were divided into four groups: the control group (G0) received saline; Group 1 (G1) received 0.1 mg/kg RC-3095; Group 2 (G2) received 0.3 mg/kg RC-3095; and Group 3 (G3) received 1.0 mg/kg RC-3095 for 14 days. Results: The mean daily variation of food intake was statistically different between the groups (F: 3.139; df: 3; P = 0.039); and G2, which received the intermediate dose of 0.3 mg/kg RC-3095, showed a greater food intake than G0 (P = 0.041). There was a similar increase in weight, approximately 22% (F: 0.572; df: 3; P = 0.638), as well as a similar mean animal weight (F: 1.145; df: 9.685; P = 0.338) between the groups during the study period. However, the mean weight of G2 animals was more than the mean weight of G0 animals (P = 0.042). At the end of the study, no difference was observed between the groups in terms of the total lean mass or fat mass from the rat carcass, liver, and skin. Comparing the serum levels of albumin, amylase, glucose, total cholesterol, high-density lipoprotein (HDL) cholesterol, and interleukin (IL)-6 from day 1 (D1) to D14, there were no statistically relevant differences between the groups. However, the mean triglyceride level in G2 compared to G0 showed a greater increase (P = 0.038). Conclusion: In this study, the injection of an intermediate dose of GRPR antagonist RC- 3095 (0.3 mg/kg/day) into healthy young adult Wistar rats submitted to weight loss affected food intake and the mean weight. No effects on weight gain, body composition, or biochemical metabolic parameters were observed, except for a great increase in the serum triglyceride levels. These results demonstrate some physiological effects of GRP on food intake and weight, expanding the possibilities of future studies on hunger/satiety and macronutrient metabolism as well as highly stressful conditions like cancer.

As teneurinas (TENs) são de proteínas de transmembrana com significante expressão no sistema nervoso central (SNC). Foi verificado que o último éxon dos genes das TENs codifica um peptídeo com elevada identidade ao fator liberador de corticotropina (CRF) sendo este denominado de peptídeo associado ao terminal carboxila da teneurina (TCAP-1 a 4). Estudos mostram que TCAP-1 controla o comportamento emocional possivelmente por modular as ações mediadas pelo (CRF). A distribuição do TCAP-1 no SNC de primatas poderia subsidiar os seus efeitos funcionais e as possíveis aplicações terapêuticas. O presente trabalho analisou a imunorreatividade e a expressão do RNA mensageiro do TCAP-1 no encéfalo de primatas não-humanos. Cortes frontais do SNC de macacos da espécie Cebus apella (n=3) foram selecionados e utilizados nas técnicas de hibridização in situ e de imuno-histoquímica. Neurônios imunorreativos e que expressam o RNAm para TCAP-1 foram encontrados principalmente em áreas que estão direta ou indiretamente envolvidas na modulação da resposta ao estresse e ansiedade. / Teneurins are transmembrane proteins expressed mainly in the central nervous system (CNS). The last exon of the teneurins exhibits a peptide sequence with high homology to corticotrophin-releasing factor (CRF), named teneurin c-terminal associated peptide (TCAP-1 to 4). TCAP-1 effectively modulates stress induced by CRF. Studies have pointed tha TCAP-1 could have important therapeutic applications in stress disorders. The analysis of TCAP-1 distribution in the primate brain could also give anatomical support to the understanding of its functional effects and possible therapeutic use. Thus, the present study focused on the distribution of neurons exhibiting immunoreactivity and mRNA expression to TCAP-1 in the monkey brain (Cebus apella). Frontal brain sections of three young male Cebus apella monkeys were submitted to immunohistochemistry and in situ hybridization. Immunohistochemistry and in situ hybridization results showed that TCAP-1 is preserved in primate brain, mainly in areas directly or indirectly involved in the modulation of stress and anxiety.

A homeostase energética é controlada por fatores neurais, endócrinos, adipocitários e intestinais. O sistema nervoso central (SNC) recebe sinalização de fatores periféricos e exerce uma função fundamental no controle da homeostase energética, estando bem estabelecido que existem populações neuronais que expressam neuropeptídeos que medeiam efeitos específicos na ingestão e/ou gasto energético. O fator liberador de corticotrofina (CRF), além de seus efeitos no controle da atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, tem sido descrito como potente neuropeptídeo anorexígeno, modulando a ingestão alimentar e o gasto energético. Foi observado que a síntese de CRF é influenciada pela leptina, que atuaria aumentando a ativação de neurônios produtores de CRF no núcleo paraventricular (PVN). Os hormônios gonadais também participam na regulação da ingestão alimentar, do peso e da composição corporal. O efeito anorexígeno do estradiol é mediado pela ativação de receptores presentes nas áreas envolvidas no controle da homeostase energética. Em trabalho prévio de nosso laboratório foi observado que o menor ganho de peso e ingestão alimentar com o tratamento com estradiol em ratas ovariectomizadas está associado à maior expressão de RNAm de CRF no PVN. Dessa forma, este trabalho visa esclarecer a participação do CRF nos efeitos do estradiol no controle da homeostase energética. Para tanto, foram utilizadas ratas Wistar adultas, pesando entre 200-230g, provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto USP. Todos os animais foram submetidos à cirurgia de ovariectomia bilateral. Em todos os experimentos, houve três grupos de animais: ratas ovariectomizadas (OVX), ratas ovariectomizadas com reposição de estradiol (OVX+E) e ratas ovariectomizadas com dieta pareada ao grupo OVX+E (OVX+DP). Durante os oitos dias de cada experimento, estes animais receberam injeção subcutânea de cipionato de estradiol (10 g/Kg peso corporal, Grupo OVX+E) ou veículo (óleo de milho: 0,2 mL/rata, Grupos OVX e OVX+DP) entre 8h e 10h. Para avaliarmos a participação do CRF nos efeitos da leptina nos animais castrados com e sem reposição de estradiol, foi realizado o tratamento com injeção central de leptina (10g/5L) com e sem injeção central prévia de antagonista de CRF (antisauvagina-30). Observamos que o tratamento com cipionato de estradiol causa a redução na ingestão alimentar e no ganho de peso corporal. Ainda, quando realizamos a administração central de leptina há anorexia, perda de peso corporal, aumento na expressão de UCP-1 no BAT e na ativação neuronal no ARQ. Esses efeitos são revertidos quando realizamos administração central prévia do antagonista de CRF-R2. Os dados obtidos sugerem que o estradiol aumenta a sensibilidade à leptina, sendo este efeito mediado, pelo menos em parte, pelo receptor tipo 2 do CRF. / Energy homeostasis is controlled by neural, endocrine, adipocyte and gut factors. Central nervous system plays a key role in the control of energy homeostasis; it receives signals from peripheral factors and it is well established that the hypothalamus contains neuronal populations that express important neuropeptides to the control of food intake and energy expenditure. Besides its action in the control of hypothalamus-pituitary-adrenal axis, corticotropin releasing factor (CRF), has been described as an anorexigenic neuropeptide, modulating food intake and energy expenditure. It was shown that CRF synthesis is influenced by leptin, which would act increasing CRF neuron activation in the paraventricular nucleus (PVN). Gonadal hormones also participate in the regulation of food intake, body weight and body composition. Estradiol anorexigenic effect is mediated by specific receptors located in areas involved in the control of energy homeostasis. It was previously demonstrated that the reduction of food intake and body weight gain in ovariectomized treated rats is associated with an increase in CRF mRNA expression in the PVN. The present study aimed to investigate the role of CRF on estradiol regulation of energy homeostasis. Wistar female rats, weighing 200 230g, were bilaterally ovariectomized and divided into three groups: ovariectomized rats (OVX), ovariectomized rats treated with estradiol (OVX+E) and ovariectomized rats pair-fed with OVX+E rats (OVX+PF). The animals received daily subcutaneous injections of either estradiol cypionate (10 g/Kg bw, OVX+E) or vehicle (corn oil, OVX, OVX+PF) between 8 10 am, during 8 days. To evaluate the role of CRF on leptins effects we performed intracerebroventricular (icv) injection of recombinant leptin (10g/5L) with or without previous icv treatment with CRF-R2 antagonist (ansauvagin-30). We observed that estradiol replacement in OVX rats induced lower food intake and body weight gain. Leptin icv treatment reduced food intake, body weight gain and increased UCP-1 expression in brown adipose tissue and neuronal activation in the arcuate nucleus. These effects were abolished with previous icv administration of CRF-R2 antagonist. In conclusion, our data suggest that estradiol increases central sensitivity to leptin and this effect is mediated, at least in part, by CRF type 2 receptor.

Introdução: A obesidade pode se constituir como fator de risco para o uso de contraceptivos hormonais, especialmente aqueles contendo estrogênios, devido a possíveis efeitos metabólicos indesejados. As alterações metabólicas decorrentes do uso do sistema intrauterino liberador de levonorgestrel (SIU-LNG) foram bem descritas em mulheres com peso normal, mas não em mulheres obesas. Objetivo: Avaliar o efeito do sistema intrauterino liberador de levonorgestrel (SIU-LNG) sobre marcadores ultrassonográficos e laboratoriais de risco metabólico e doença cardiovascular em mulheres obesas. Casuística e Métodos: Estudo clínico randomizado aberto avaliando 106 mulheres obesas (30,0 Kg/m2 e <40 Kg/m2), com idade entre 18 e 40 anos, sem outras comorbidades. As pacientes foram avaliadas antes do início da contracepção e após um ano, sendo realizada randomização simples, para uso de SIU-LNG ou método não hormonal (a paciente poderia escolher entre dispositivo intrauterino de cobre ou preservativo). Foram avaliados: evolução ponderal; circunferência da cintura; volume uterino e ovariano; insulinemia e glicemia de jejum; perfil lipídico; testosterona; sex hormone binding globulin (SHBG); hemograma; aspartato aminotransferase (AST), a alanina aminotransferase (ALT), a fosfatase alcalina e gama glutamil transferase; índice de rigidez da carótida e espessura íntima-média (EIM); dilatação mediada por fluxo da artéria braquial (DMF) e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA). Resultados: Nenhuma diferença estatística foi observada na dilatação mediada por fluxo da artéria braquial entre as mulheres em uso de SIU-LNG e métodos não hormonais em um ano de observação. Observou-se uma redução do volume ovariano (-0,5&177;2,6 vs. 0,7&177;2,6 cm3, p=0,03). A hemoglobina aumentou nas usuárias de SIU-LNG (0,4&177;0,8 vs. -0,1&177;0,8 g/dL, p=0,00) juntamente com o hematocrito (1,8&177;2,2 vs. -0,0&177;2,3 %, p=0,00). Não houve alteração do perfil lipídico, glicêmico, da função hepática e doença hepática gordurosa não alcoolica no grupo das usuárias de SIU-LNG e nem das usuárias de métodos não hormonal. Conclusão: Concluiu-se que o SIU-LNG não apresentou efeito metabólico desfavorável comparado a métodos não hormonais após um ano, em mulheres obesas grau I e II, sem outras comorbidades. / Background: Obesity may be a risk factor for the use of hormonal contraceptives, especially those containing estrogens, due to possible unwanted metabolic effects. The metabolic effects of levonorgestrel-releasing intrauterine system (LNG-IUS) have been studied in normal-weight women but not in obese women. Objective: To evaluate the effect of levonorgestrel-releasing intrauterine system on multiple ultrasonographic and laboratorial markers of metabolic and cardiovascular disease risk in obese women. Methods: A randomized clinical trial study evaluating 106 obese women ( 30.0 kg/m2 and <40 kg/m2), aged between 18 and 40 years with desire contraception, without other co-morbidities. Patients were evaluated before the start of contraception and after a year, made simple randomization to use of LNG-IUS or nonhormonal method (the patient could choose between copper intrauterine device or condom). Were evaluated: weight gain; waist circumference; uterine and ovarian volumes; insulinemia and fasting glucose; lipid profile; testosterone; sex hormone binding globulin (SHBG); hemogram; aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase and gamma glutamyl transferase; stiffness index and carotid intima-media thickness (IMT); flow-mediated brachial artery dilatation (FMD) and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Results: No statistical difference was observed in flow-mediated brachial artery among women using the LNG-IUS and non-hormonal methods in one year of observation dilation. There was a volume reduction (-0.5 &177; 2.6 vs. 0.7 &177; 2.6 cm3, p=0.03). Hemoglobin increased in users of LNG-IUS (0.4 &177; 0.8 vs. -0.1 &177; 0.8 g/dL, p=0.00) together with the hematocrit (1.8 &177; 2.2 vs. -0.0 &177; 2.3%, p=0.00). There was no change in lipid profile, glucose, liver function and nonalcoholic fatty liver disease in the group of users of the LNG-IUS or the users of non-hormonal methods. Conclusion: We conclude that the LNG-IUS showed no adverse metabolic effect compared to non-hormonal methods after one year in grade I and II obese women without other comorbidities.

Philosophiae Doctor - PhD / In bacteria, nitrile hydratases and enzymes of nitrilase and signature amidase superfamilies hydrolyse nitriles and amides to their corresponding carboxylic acids releasing ammonia. Bacteria expressing these enzymes are typically isolated where a sole nitrogen and/or carbon source is used to support their growth. The majority of characterised enzymes of industrial potential have been identified for their stabilities at elevated temperatures. To date, no reports of such enzymes have been isolated from cold adapted bacteria.In this study, an extensive screening program of cold-active microbial isolates for enzymes of this group led to the selection and detailed characterisation of an aliphatic amidase from Nesterenkonia.Nesterenkonia AN1, a new psychrotrophic isolate of the genus, was isolated from soil samples collected from the Miers Valley, Antarctica. AN1 showed significant 16S rRNA sequence identity to known members of the genera, but this is the only strain that had optimal growth at approximately 21oC. AN1, similar to known members, is an obligately alkaliphilic (pH 9-10) and halotolerant (Na+ 0- 15% (w/v)) strain.The genome of Nesterenkonia AN1, sequenced in-house, revealed two ORFs encoding putative nitrilases, referred to as Nit1 and Nit2. Based on analysis of their deduced protein sequences, both belonged to the nitrilase superfamily. Both sequences showed conserved catalytic residues (EKEC), glycine residues and contained the characteristic áââá monomer fold. Homology modelling using known structures suggested that both genes could encode N-carbamoyl D-amino acid amidohydrolases, although neither showed conserved residues implicated in the hydrolysis of carbamoyls.Nit1 and Nit2 were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS as Cterminal and N-terminal hexahistidine tagged fusion proteins, and purified using Ni-chelation chromatography. Nit1 showed no activity towards nitrile, amide and carbamoyl substrates. This protein, unlike members of the multimeric enzymes of the nitrilase superfamily, was a monomer ~30 kDa protein. It is possible that the C-terminal hexahistidine tag might have prevented Nit1 from forming multimeric proteins.Nit2 showed substrate specificity similar to known aliphatic amidases with a preference for small amides. Nit2 had maximal activity at 30oC and between pH 6.5 and 7.5, properties compatible with its cold-adapted alkaliphilic origins. In addition, the enzyme was irreversibly inactivated at temperatures above 30oC and had a half-life of approximately 7 mins at 60oC. The crystal structure of Nit2 was solved to 1.66 Å. It revealed a ~45.5 kDa dimer, composed of two tightly bound ~30 kDa monomers. These monomers associated along the A surface forming a áââá-áââá sandwich architecture that is conserved in known structures of the nitrilase superfamily.Nit2 is distinct from known aliphatic amidases in both its structure and enzymic activity: the enzyme did not possess an extended C-terminal region; is active in dimeric form; has high affinity for 3C amides rather than 2C amides; and has a low overall catalytic rate. The short C-terminal region of Nit2 may have contributed to the low stability of the enzyme at elevated temperatures. A dendrogram composed of protein sequences of members of the nitrilase superfamily and Nit2 further supported evidence that this aliphatic amidase falls within a distinct group of enzymes.This is the first report of the enzymic characterisation and structural analysis of an aliphatic amidase from a psychrotolerant, alkaliphilic and halotolerant extremophile.