IIntrodução A utilização excessiva de antimicrobianos na medicina humana, veterinária e agricultura resultou no aparecimento da resistência bacteriana. Este fenômeno gera problemas de saúde pública que podem resultar na reemergência de doenças infecciosas. O uso de antibióticos, principalmente de forma profilática, tornou-se prática na aquicultura, como ocorre no Brasil, onde a regulamentação para o uso de medicamentos veterinários é ineficiente. Além disso, há evidências da transferência de organismos resistentes para humanos por meio do consumo de produtos de origem animal, quando, durante a fase de criação e produção destes foram administrados antibióticos. Objetivo Pesquisar a ocorrência de genes de resistência a antibióticos em filés de tilápia comercializados em supermercados do município de São Paulo SP. Material e Métodos Foram coletadas 10 amostras de filé de tilápia e realizada a pesquisa de coliformes termotolerantes como indicadores das condições higiênico-sanitárias do alimento. Em seguida, as amostras foram inoculadas em Caldo Lúria 0,5 por cento e o DNA total das bactérias cultivadas nesse meio foi extraído por meio de choque térmico para pesquisa de genes de resistência aos antibióticos -lactâmicos e tetraciclinas pela PCR. Os genes identificados pela PCR foram confirmados pelo sequenciamento. Resultados Em 100 por cento das amostras analisadas o resultado para coliformes termotolerantes foi < 3 NMP.g-1. Na pesquisa de genes de resistência a -lactâmicos, o gene blaOXY-5 foi detectado em 90 por cento das amostras, blaTEM-1b em 20 por cento , blaLEN-16 em 10 por cento , blaSHV-28 em 10 por cento , blaKPC-2 em 20 por cento , blaMOX-6 em 10 por cento e blaCphA em 60 por cento . Os genes de resistência a tetraciclinas identificados foram tetB em 10 por cento das amostras, tetC em 20 por cento , tetD em 80 por cento , tetE em 50 por cento , tetG em 60 por cento , tetO e tetS em 10 por cento cada e tetW em 20 por cento . Conclusões Em 90 por cento das amostras foi identificada a presença de genes de resistência aos antibióticos -lactâmicos e tetraciclinas, demonstrando uma grande circulação de resistência bacteriana na aquicultura e verificando a necessidade de legislação e fiscalização mais atuantes no controle do uso de antibióticos na aquicultura / IIntroduction The excessive use of antimicrobials in human medicine, veterinary medicine and agriculture has resulted in the emergence of bacterial resistance. This phenomenon creates public health problems that may result in the re-emergence of infectious diseases. The use of antibiotics, mainly prophylactically, has become a practice in aquaculture, including Brazil, where the legislation for the use of veterinary drugs is inefficient. Furthermore, there is evidence of transmission of resistant organisms to humans through consumption of animal products, especially when the antibiotics have been administered during the raising and production of these animals. Objective To search for the occurrence of antibiotics resistance genes in tilapia fillets commercialized in supermarkets in São Paulo city - SP. Material and Methods 10 tilapia fillet samples were collected and submitted to fecal coliform search as an indicator of the sanitary conditions of the food. Then, the samples were inoculated into Luria broth 0,5 per cent and the total DNA was extracted from growing bacteria by thermal shock for the search of resistance genes to -lactam and tetracyclines antibiotics by PCR. The genes identified by PCR were confirmed by sequencing. Results In 100 per cent of samples the result was < 3 NMP.g-1 for fecal coliform organisms. In the study of -lactam resistance genes, blaOXY-5 gene was detected in 90 per cent of samples, blaTEM-1b in 20 per cent , blaLEN-16 in 10 per cent , blaSHV-28 in 10 per cent , blaKPC-2 in 20 per cent , blaMOX-6 in 10 per cent and blaCphA in 60 per cent . The tetracyclines resistance genes identified were tetB in 10 per cent of samples, tetC in 20 per cent , tetD in 80 per cent , tetE in 50 per cent , tetG in 60 per cent , tetO and tetS in 10 per cent each and tetW in 20 per cent . Conclusions 90 per cent of the samples showed the presence of -lactam and tetracyclines resistance genes, demonstrating a high circulation of bacterial resistance in aquaculture and verifying the need for more active law and surveillance in controlling the use of antibiotics in aquaculture.

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-08-08T18:42:52Z No. of bitstreams: 1 Publico-20160808.pdf: 1416606 bytes, checksum: 61ffaff6596a702eeebabe55ae7c3578 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-08-08T18:43:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-20160808.pdf: 1416606 bytes, checksum: 61ffaff6596a702eeebabe55ae7c3578 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-08T18:43:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-20160808.pdf: 1416606 bytes, checksum: 61ffaff6596a702eeebabe55ae7c3578 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivos: Avaliar (i) o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e caracterizar os tipos de β-lactamases de espectro ampliado, entre isolados clínicos de Klebsiella spp. (KSP); (ii) os mecanismos de resistência em isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae (KPN) que apresentaram diminuição de sensibilidade aos carbapenens; (iii) a acurácia do teste de Hodge para detecção de carbapenemases Material e Métodos: Foram avaliadas 167 amostras de KSP isoladas do primeiro episódio de infecção de corrente sanguínea (ICS) de pacientes hospitalizados em 15 centros médicos de diferentes regiões do país, participantes do programa de vigilância SCOPE Brasil, entre junho de 2007 e dezembro de 2008. Todas as amostras foram submetidas a re-identificação e teste de sensibilidade pelo sistema automatizado BD Phoenix. As amostras foram classificadas em dois grupos de acordo com a sensibilidade in vitro aos agentes β-lactâmicos e detecção de ESβL: (i) KSP produtora de ESβL e (ii) KSP não produtora de ESβL. As amostras representativas do grupo KSP produtora de ESβL foram submetidas a testes fenotípicos e moleculares. Os principais tipos de β-lactamases foram caracterizados pela reação em cadeia da polimerase (PCR), seguido pelo sequenciamento dos produtos amplificados. Testes adicionais foram realizados para o subgrupo KPN produtora de ESβL e resistente a ertapenem (KPN-ESβL-RE). Resultados: As espécies mais comuns foram K. pneumoniae (n=158), seguida por K. oxytoca (n=8) e K. ozaenae (n=1). Altas taxas de resistência aos antimicrobianos foram constatadas, sendo que 56,3% das amostras foram classificadas como produtoras de ESβL. As ESβL mais frequentes foram CTXM-2, CTX-M-15, SHV-5 e SHV-12. Isolados clínicos contendo concomitantemente dois tipos de ESβL (CTX e SHV) foram detectados somente nas regiões Nordeste e Sudeste. O mecanismo de resistência detectado nas amostras KPN-ESβL-RE foi a produção de cefotaximase, associada à alteração das porinas OmpK35 e/ou OmpK36. O teste de Hodge apresentou baixa acurácia nessas amostras. Conclusões: Evidenciamos a disseminação de CTX-M-2 e a emergência de CTX-M-15, associada a alterações nas porinas OmpK35 e OmpK36 em amostras de KSP isoladas de ICS em hospitais brasileiros. Nenhuma carbapenemase foi detectada / Objectives: To evaluate (i) the antimicrobial susceptibility profile of Klebsiella spp. (KSP) clinical isolates and characterize the extended spectrum β-lactamases. (ii) the resistance mechanisms in Klebsiella spp. clinical isolates that showed decrease of carbapenem susceptibility. (iii) the accuracy of the Hodge Test for carbapenemase activity detection. Material and Methods: 167 KPS strains were evaluated in this study. The strains were isolated from the first bloodstream infection episode of patients hospitalized at 15 medical centers from different regions of the country participating of SCOPE Brazillian surveillance program, between June, 2007 and December, 2008. The isolates were re-identified and susceptibility tested by the automated system BD Phoenix and classified in two groups according antimicrobial susceptibility profile and ESβL detection: (i) KSP ESβL-producing and (ii) KSP ESβL-non-producing. KSP ESβL-producing were submitted to phenotypic and molecular tests. The β-lactamase types were characterized by PCR, followed by DNA sequencing. Additional tests were performed for ertapenem resistant K. pneumoniae ESβL-producing (KPN-ESβL-ER). Results: The most common species were K. pneumoniae (n=158), followed by K. oxytoca (n=8) and K. ozaenae (n=1). High rates of antimicrobial resistance were observed and 56.3% of isolates were classified as ESβL-producing. The most frequent ESβL were CTX-M-2, CTX-M-15, SHV-5 and SHV-12. Clinical isolates with two ESβL types (CTX and SHV) were only detected in the northeast and southeast regions. The resistance mechanism detected in the KPN-ESβL-ER isolates was the cefotaximase production associated with OmpK35 and/or OmpK36 porin alteration. The Hodge test showed low accuracy in these isolates. Conclusions: We showed the dissemination of CTX-M-2 and emergence of CTX-M-15, associated with OmpK35 and OmpK36 porin modification, in KSP strains isolated from bloodstream infection in Brazilian hospitals. No carbapenemase was detected. / FAPESP: 2006/57700-0

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eliza Marques di Primio.pdf: 1694142 bytes, checksum: 431b2dfc0ca5ca9c2aa311391e7dfddf (MD5) Previous issue date: 2012-03-23 / Este estudo teve como objetivo avaliar a presença de estafilococos coagulase positiva, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Klebsiella spp e Pseudomonas spp em duas linhas de produção de alimentos de um hospital da cidade de Rio Grande RS e determinar o perfil de resistência e sensibilidade das cepas isoladas a antibióticos de uso comum. A pesquisa foi realizada mediante autorização da direção do referido hospital e aprovação pelo comitê de ética. Foram analisados 23 pontos de amostragem, em 4 repetições, totalizando 92 amostras: 16 de ambientes, 20 de utensílios, 12 de equipamentos, 16 de mãos de manipuladores, 4 de dietas via oral padrão, 8 de fórmulas infantis, 8 de dietas enterais, 4 de mamadeiras e 4 de superfícies de sondas dos pacientes internados. Para as determinações microbiológicas foram adotadas as recomendações propostas por Downes & Ito (2001), e estas realizadas no Laboratório de Análises de Alimentos da Faculdade de Nutrição e no Laboratório Genética de Micro-organismos do Instituto de Biologia, ambos pertencentes à Universidade Federal de Pelotas - RS. Os testes de resistência/sensibilidade aos antibióticos foram realizados de acordo com protocolo proposto pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003) e Clinical end Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011). Entre as 92 amostras analisadas, estafilococos coagulase positiva (ECP) foram enumerados em 44 (47,8%) e bacilos gram negativos em ágar MacConkey em 60 (65,2%) amostras. Em 45 (48,9%) amostras foi possível isolar Klebsiella spp e em 6 (11,5%) Escherichia coli. Não foram isoladas Listeria monocytogenes e enumeradas Pseudomonas spp nas amostras analisadas. Os antimicrobianos de menor eficiência para ECP foram oxacilina e penicilina-G e para Klebsiella spp ampicilina e cefalotina. Cabe ressaltar que foram encontradas cepas multirresistentes de ECP, Klebsiella spp e E.coli, as quais variaram a resistência de 2 até 8 antibióticos de uso comum. Do total de cepas isoladas, 37,4% apresentaram multirresistência, 32,1% mostraram-se resistentes a 1 dos antibióticos avaliados e 30,5% foram sensíveis a todos os antimicrobianos avaliados.

Entre as ß-lactamases, as enzimas CTX-M têm despertado atenção especial pela alta incidência e grande capacidade de propagação. Eventos como recombinação gênica, transferência plasmideal e multirresistência podem ser a razão da manutenção e da ampla disseminação dos genes blaCTX-M. Este é um trabalho retrospectivo que teve como objetivo caracterizar genes blaCTX-M presentes em Klebsiella spp. Foram estudadas 27 linhagens de Klebsiella pneumoniae e 8 linhagens de Klebsiella oxytoca, produtoras de ?-lactamase de espectro estendido, isoladas de pacientes hospitalizados no período de janeiro a junho de 2000. A detecção e identificação dos genes blaCTX-M, assim como dos elementos relacionados com a mobilização destes genes, foi realizada por PCR e seqüenciamento. A localização genética e a mobilidade dos genes blaCTX-M foram pesquisadas por análise plasmideal e hibridação e por conjugação. Os perfis de sensibilidade das linhagens estudadas e das linhagens transconjugantes foram comparados pela determinação da concentração inibitória mínima de antibióticos das classes das cefalosporinas, cefamicinas, aminoglicosídeos e quinolonas. Foram encontrados genes blaCTX-M em plasmídeos conjugativos em 13 (37%) linhagens estudadas: blaCTX-M-9 em 4 K. oxytoca, e blaCTX-M-2 em 9 K. pneumoniae. Os genes blaCTX-M-9 estavam associados ao elemento de inserção ISEcp1, enquanto os genes blaCTX-M-2 estavam associados a integrons de classe I contendo ISCR1. O genes blaCTX-M-2, carreado por plasmídeo, pode estar relacionado com disseminação horizontal entre vários clones de K. pneumoniae, enquanto o gene blaCTX-M-9 foi encontrado sendo carreado por um único clone de K. oxytoca. Este estudo determinou a incidência e a diversidade de enzimas CTX-M no período estudado, além de fornecer dados epidemiológicos que podem explicar a sua prevalência no mundo e contribuir para o entendimento e controle da disseminação deste tipo de resistência. / CTX-M enzymes, the world\'s most prevalent ß-lactamases disseminate very easily. Genetic recombination, plasmid transference and multiresistance could be responsible for the wide spread of blaCTM-X genes. This retrospective study aims to characterize blaCTX-M genes found in Klebsiella spp. The strains were isolated in hospital patients from January to June 2000 and consisted of 27 ESBL-producing Klebsiella pneumoniae and 8 ESBL-producing Klebsiella oxytoca. PCR and sequencing were used in the detection and identification of blaCTX-M genes and genetic elements associated with their mobilization. Determination of genetic localization and mobility of blaCTX-M genes was by plasmid analyses, hybridization and transfer assays. The minimal inhibitory concentrations (MICs) of cephalosporins, cefamicins, aminoglycosides and quinolone antimicrobials evaluated the antibiotic susceptibility profile of transconjugants and strains in the study. The blaCTX-M genes were found in 13 strains (37%): blaCTX-M-9 in 4 K. oxytoca and blaCTX-M-2 in 9 K. pneumoniae. The insertion sequence ISEcp1 was associated with blaCTX-M-9 and blaCTX-M-2 was found in a class I integron bearing ISCR1. Plasmid blaCTX-M-2 genes dissemination was due to horizontal transfer among many K. pneumoniae clones, while blaCTX-M-9 dissemination was associated with a particular clone of K. oxytoca. The study characterized incidence and diversity of CTX-M enzymes during the period studied. Moreover it showed epidemiological data, which may explain CTX-M prevalence worldwide and contribute for the understanding and control of the resistance spread.

O reconhecimento da resistência antimicrobiana como um fenômeno emergente em saúde pública, tem constituído um problema em nível mundial. O abuso na utilização de antibióticos na medicina humana e veterinária, e na agricultura, tem originado incremento na diversidade de micro-organismos resistentes, refletindo em falha terapêutica. Os mecanismos de resistência a antibióticos em micro-organismos são mediados principalmente por genes adquiridos de DNA exógeno. A dinâmica da transferência horizontal é realizada por meio de elementos genéticos móveis que carregam genes de resistência. A ampla distribuição deste tipo de estruturas, como o elemento SXT, isolado inicialmente em V. cholerae, tem contribuído para a disseminação de complexos específicos clonais em determinadas áreas geográficas. Este estudo pioneiro no Brasil pesquisou a presença de elementos SXT, em espécies bacterianas do grupo das gama proteobactérias em espécies ambientais, determinou suas características estruturais e funcionais, incluindo genes de resistência a antibióticos, bem como a sensibilidade aos antibióticos dentre os isolados bacterianos que os abrigam. O resultado foi a classificação de 43 elementos SXT obtidos no Brasil, através da comparação com aqueles descritos na literatura. Dentre os elementos SXT obtidos, quatro são albergados por Morganella morganii, fato inédito na literatura. O conhecimento da evolução bacteriana constitui importante ferramenta para estabelecer estratégias eficazes de controle e tratamento de infecções, sem aumentar a pressão seletiva sobre os micro-organismos, bem como instrumento preciso e de grande importância para subsidiar estudos epidemiológicos. / Recognition of antimicrobial resistance as an emerging phenomenon in public health has been a problem worldwide. The abuse in the use of antibiotics in human and veterinary medicine, and agriculture, has caused an increase in the diversity of resistant microorganisms, reflecting in treatment failure. The mechanisms of antibiotic resistance in microorganisms are primarily mediated by genes acquired from exogenous DNA. The dynamics of the horizontal transfer is performed by mobile genetic elements which carry resistance genes. The wide distribution of these structures, such as the SXT element originally isolated from V. cholerae, has contributed to the spread of specific clonal complexes in certain geographical areas. This pioneering study in Brazil researched the presence of SXT elements in the group of bacterial species in environmental gamma-proteobacteria species, determined their structural and functional characteristics, including genes for resistance to antibiotics and the antibiotic susceptibility among bacterial isolates that harbor them. The result was the classification of 43 SXT elements found in Brazil, by comparison with those found in the literature. Among the SXT elements found, four are sheltered by Morganella morganii, unprecedented in the literature. Knowledge of bacterial evolution is an important to establish effective strategies to control and treat infections without increasing the selective pressure on microorganisms, as well as a precise instrument and very important tool to support epidemiological studies.

O reconhecimento da resistência antimicrobiana como um fenômeno emergente em saúde pública, tem constituído um problema em nível mundial. O abuso na utilização de antibióticos na medicina humana e veterinária, e na agricultura, tem originado incremento na diversidade de micro-organismos resistentes, refletindo em falha terapêutica. Os mecanismos de resistência a antibióticos em micro-organismos são mediados principalmente por genes adquiridos de DNA exógeno. A dinâmica da transferência horizontal é realizada por meio de elementos genéticos móveis que carregam genes de resistência. A ampla distribuição deste tipo de estruturas, como o elemento SXT, isolado inicialmente em V. cholerae, tem contribuído para a disseminação de complexos específicos clonais em determinadas áreas geográficas. Este estudo pioneiro no Brasil pesquisou a presença de elementos SXT, em espécies bacterianas do grupo das gama proteobactérias em espécies ambientais, determinou suas características estruturais e funcionais, incluindo genes de resistência a antibióticos, bem como a sensibilidade aos antibióticos dentre os isolados bacterianos que os abrigam. O resultado foi a classificação de 43 elementos SXT obtidos no Brasil, através da comparação com aqueles descritos na literatura. Dentre os elementos SXT obtidos, quatro são albergados por Morganella morganii, fato inédito na literatura. O conhecimento da evolução bacteriana constitui importante ferramenta para estabelecer estratégias eficazes de controle e tratamento de infecções, sem aumentar a pressão seletiva sobre os micro-organismos, bem como instrumento preciso e de grande importância para subsidiar estudos epidemiológicos. / Recognition of antimicrobial resistance as an emerging phenomenon in public health has been a problem worldwide. The abuse in the use of antibiotics in human and veterinary medicine, and agriculture, has caused an increase in the diversity of resistant microorganisms, reflecting in treatment failure. The mechanisms of antibiotic resistance in microorganisms are primarily mediated by genes acquired from exogenous DNA. The dynamics of the horizontal transfer is performed by mobile genetic elements which carry resistance genes. The wide distribution of these structures, such as the SXT element originally isolated from V. cholerae, has contributed to the spread of specific clonal complexes in certain geographical areas. This pioneering study in Brazil researched the presence of SXT elements in the group of bacterial species in environmental gamma-proteobacteria species, determined their structural and functional characteristics, including genes for resistance to antibiotics and the antibiotic susceptibility among bacterial isolates that harbor them. The result was the classification of 43 SXT elements found in Brazil, by comparison with those found in the literature. Among the SXT elements found, four are sheltered by Morganella morganii, unprecedented in the literature. Knowledge of bacterial evolution is an important to establish effective strategies to control and treat infections without increasing the selective pressure on microorganisms, as well as a precise instrument and very important tool to support epidemiological studies.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2017-08-04T12:08:26Z No. of bitstreams: 1 PDF - Andreza Costa Miranda.pdf: 41222812 bytes, checksum: 456e1b5a9095a0dce0875807e9b2d2b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2017-08-29T15:43:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Andreza Costa Miranda.pdf: 41222812 bytes, checksum: 456e1b5a9095a0dce0875807e9b2d2b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T15:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Andreza Costa Miranda.pdf: 41222812 bytes, checksum: 456e1b5a9095a0dce0875807e9b2d2b1 (MD5) Previous issue date: 2016-09-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Some micropollutants have been causing concern to health authorities with regard how they can be toxic to humans and if the conventional water treatment plants are effective for their removal. Among micropollutants currently present in the environment stand out microcystin-LR, organophosphorus pesticides (profenofos), veterinary drugs (Ivermectin) and antibiotic resistant bacteria. The low concentration of these micropollutants found in the environment requires efficient treatment and development of analytical techniques for the quantification and identification these compounds. This work was divided in two phase. In the first phase the Advanced Oxidation Processes (AOPs), namely H2O2/UV, TiO2 /UV and N-TiO2 /UV, have been compared with chlorination in the inactivation of an AR Escherichia coli (E. coli) strain in surface water.. Under the investigated conditions, chlorination (1.0 mg/L) was the faster process (2.5 min) to achieve total inactivation (6 Log). Among POA, H2O2/UV resulted in the best inactivation rate. Moreover, H2O2/UV and chlorination processes were evaluated in terms of cytotoxicity potential by means of MTT colorimetric test on a human-derived cell line and they similarly affected HepG2 cells viability. In the second phase, three fundamental aspects were evaluated: (1) degradation of micropollutants, profenofós (PFF), microcystin-LR (MC-LR) and ivermectin (IV) by H2O2/UV, H2O2 e UV; (2) validate the method for LC-MS/MS; (3) identification of oxidation by-products (OBPs) in finished water. The LC-MS/MS method for quantification of MC-LR and PFF showed good linearity with fitness coefficient (r) >0.99 and (r) >0.98, respectively. The precision, obtained was considered satisfactory. The limits of detection (LD) and quantification (LQ) were lower the Brazilian drinking water standard, suggesting the applicability of the method for the drinking water quality control .Among POA, H2O2/UV resulted in the best degradation of the micropollutants. / Alguns micropoluentes têm causado preocupações às autoridades no que diz respeito à quão tóxico podem ser a organismos humanos e os tratamentos convencionais utilizados nas estações de tratamento de água que não são eficientes em suas remoções. Dentre os micropoluentes, atualmente presentes no ambiente, destacam-se microcistina-LR, pesticidas organofosforados (profenofós), fármacos veterinários (Ivermectina) e bactérias resistentes a antibióticos. Os baixos níveis de concentração dos microcontaminantes encontrados no ambiente exigem etapas de tratamento eficientes e desenvolvimento de técnicas analíticos para quantificação e identificação segura desses compostos. Essa tese foi dividida em duas etapas. Na primeira etapa foi comparado os processos oxidativos avançados H2O2/UV, TiO2/UV e N-TiO2/UV com a cloração na inativação de cepas de Escherichia coli resistente a antibióticos presentes em água superficial. Sob estas condições, a cloração com concentração inicial de cloro em 1,0 mg/L foi o processo mais 6 eficiente a obter a inativação de uma população inicial de 10 UFC/100mL. Além disso, os processos de desinfecção com H2O2/UV e cloração foram avaliadas em termos de potencial de citotoxicidade por meio do teste colorimétrico MTT com linhagem de células derivadas dos seres humanos, os resultados mostraram que ambos os processos de desinfecção afetaram similarmente a viabilidade das células HepG2. Na segunda etapa do trabalho foram realizados estudos com três fases fundamentais: (1) Avaliar a degradação dos microcontaminantes (profenofós, microcistina-LR e ivermectina) por processo H2O2/UV, H2O2 e UV; (2) validar metodologia de técnicas analíticas para quantificação dos microcontaminantes em amostras de água por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (CLAE/MS) e; (3) Identificar os subprodutos formados com o auxílio do espectrômetro de massas com interface de ionização electrospray (ESI). A validação do método para identificação e quantificação dos microcontaminantes foi realizada por HPLC-ESI-MS/MS. Os resultados de validação calculados atenderam todas as exigências das normas consultadas e mostrou-se adequado para analisar amostras de água contendo os contaminantes estudados. Na etapa de degradação, dentre os processos utilizados, o processo H2O2/UV apresentou os melhores resultados de fotodegradação, seguido por radiação UV.

A resistência aos antibióticos é um problema de saúde pública global com sérias consequências para o tratamento de várias infecções bacterianas. Os fatores de transcrição da família MarR têm sido descritos controlando resistência a antibióticos e vários outros processos em bactérias. Neste trabalho, estudamos mecanismos de resistência a antibióticos em Chromobacterium violaceum, uma bactéria Gram-negativa ambiental que pode atuar como um patógeno oportunista em humanos. A estratégia envolveu a varredura de um painel de treze linhagens mutantes de fatores de transcrição da família MarR de C. violaceum disponíveis, por testes de susceptibilidade a 24 antibióticos. Estes ensaios revelaram que apenas o mutante ?emrR apresentou resistência aumentada ao antibiótico ácido nalidíxico em relação à linhagem selvagem. Esta resistência aumentada do mutante ?emrR ao ácido nalidíxico foi revertida em uma linhagem complementada deste mutante, conforme verificado por ensaios de viabilidade, ensaios de difusão em disco e concentração inibitória mínima (MIC). O fenótipo de diminuída produção de violaceína deste mutante, observado em meio líquido, também foi complementado. Além disso, foi realizado o isolamento de mutantes espontâneos de C. violaceum resistentes a ácido nalidíxico com mutação pontual em emrR. Os ensaios de microarranjo de DNA mostraram que EmrR reprime algumas dezenas de genes, incluindo o operon emrCAB, o qual codifica a bomba de efluxo EmrCAB. Os ensaios de Northern blot confirmaram que o EmrR reprime o operon emrCAB, e que a expressão desta bomba é induzida por salicilato, mas não outros compostos, como ácido nalidíxico ou brometo de etídeo. Os ensaios de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) mostraram que a proteína EmrR purificada se liga diretamente às 8 regiões promotoras de emrR, emrCAB e vários outros genes do regulon EmrR, para exercer uma regulação negativa direta sobre esses genes. Um mutante nulo ?emrCAB foi obtido, mas a ausência desta bomba de efluxo não tornou C. violaceum mais susceptível ao ácido nalidíxico, sugerindo que ela é importante somente em condições nas quais é induzida. Estas condições indutoras talvez incluam estresse oxidativo, uma vez que enzimas antioxidantes são parte do regulon de EmrR e a proteína EmrR formou dímeros covalentes na presença de agentes oxidantes in vitro. Portanto, nossos dados revelam que mutações pontuais ou moléculas como salicilato abolem a atividade repressora do fator de transcrição EmrR sobre o operon emrCAB, levando a superexpressão da bomba de efluxo EmrCAB e aumentando a resistência ao ácido nalidíxico em C. violaceum. / Antibiotic resistance is a global public health problem with serious consequences for the treatment of various bacterial infections. MarR family transcription factors have been described controlling antibiotic resistance and several other processes in bacteria. In this work, we studied mechanisms of antibiotic resistance in Chromobacterium violaceum, an environmental Gramnegative bacterium that can act as a human opportunistic pathogen. The strategy involved a screening of an available collection of thirteen C. violaceum mutant strains of MarR family transcription factors, by susceptibility testing for 24 antibiotics. These assays revealed that only the ?emrR mutant showed increased resistance to the antibiotic nalidixic acid in relation to the wild-type strain. This increased resistance of the ?emrR mutant to nalidixic acid was reversed in a complemented strain of this mutant, as verified by viability, disk diffusion, and minimal inhibitory concentration (MIC) assays. The phenotype of decreased violacein production of this mutant, observed in a liquid medium, was also complemented. In addition, it was performed the isolation of spontaneous mutants of C. violaceum resistant to nalidixic acid with a point mutation in emrR. DNA microarray assays showed that EmrR represses a few dozen of genes, including the emrCAB operon, which encodes the EmrCAB efflux pump. Northern blot assays confirmed that EmrR represses the emrCAB operon and that the expression of this pump is induced by salicylate, but not other compounds, such as nalidixic acid or ethidium bromide. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed that the purified EmrR protein binds directly to the promoter regions of emrR, emrCAB and several other genes of the EmrR regulon, to exert a direct negative regulation of these genes. A ?emrCAB null mutant strain was obtained, but the absence of this efflux pump did not make C. violaceum more susceptible to nalidixic acid, suggesting that it is important only under conditions in which it is induced. These inducing conditions may include 10 oxidative stress since antioxidant enzymes are part of the EmrR regulon and the EmrR protein has formed covalent dimers in the presence of oxidizing agents in vitro. Therefore, our data reveal that point mutations or molecules such as salicylate abolish the repressive activity of the EmrR transcription factor on the emrCAB operon, causing overexpression of the EmrCAB efflux pump and increasing the resistance to nalidixic acid in C. violaceum.

Recentemente, o bis-(3\',5\')-di-guanosina monofosfato cíclico (c-di-GMP) surgiu como uma importante molécula sinalizadora nas bactérias. Essa molécula foi identificada como uma das responsáveis pelo controle do comportamento bacteriano e está relacionada com a patogenicidade e a adaptação de diversas bactérias, coordenando a expressão de genes envolvidos com virulência, motilidade e formação de biofilme. O mecanismo pelo qual c-diGMP atua vem sendo motivo de estudo de vários grupos de pesquisa nos últimos anos. Já foi demonstrado o papel dessa molécula em diferentes etapas do controle da expressão gênica. Acredita-se que a manipulação dos níveis de c-di-GMP pode ser uma nova abordagem terapêutica contra bactérias patogênicas. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama, que atua como um patógeno oportunista, causando infecções em pacientes imunocomprometidos, sendo o maior causador de infecções crônicas em pacientes portadores de fibrose cística. O genoma de P. aeruginosa PA14 apresenta vários genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo e/ou ligação de c-di-GMP, o que pode indicar um amplo papel regulatório deste nucleotídeo nessa bactéria. Uma associação infundada entre níveis elevados de c-di-GMP e a resistência aos antibióticos é geralmente assumida, já que altos níveis de c-di-GMP levam à formação de biofilme, que é comprovadamente um modo de crescimento mais resistente. Nesse trabalho, utilizando uma abordagem proteômica, mostramos que Pseudomonas aeruginosa PA14 regula a expressão de cinco porinas em resposta a variações nos níveis de c-di-GMP, independentemente dos níveis de mRNA. Uma dessas porinas, OprD, é responsável pela entrada do antibiótico &#946;-lactâmico imipenem na célula e é menos abundante em condições de alto c-di-GMP. Também demonstramos que linhagens com altos níveis de c-di-GMP apresentam uma vantagem competitiva de crescimento em relação a linhagens com níveis mais baixo de c-di-GMP quando crescidas em meio contendo imipenem. Em contraste, observamos que células planctônicas com elevados níveis c-di-GMP são mais sensíveis a tobramicina. Em conjunto, estes resultados mostram que c-di-GMP pode regular a resistência a antibióticos em sentidos opostos, e independentemente do crescimento em biofilme / Following the genomic era, a large number of genes coding for enzymes predicted to synthesize and degrade 3\'-5\'-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) was found in most bacterial genomes and this dinucleotide emerged as an important intracellular signal molecule controlling bacterial behavior. Diverse molecular mechanisms have been described as targets for c-di-GMP, but several questions remain to be addressed. An association between high c-di-GMP levels and antibiotic resistance is largely assumed, since high c-di-GMP upregulates biofilm formation and the biofilm mode of growth leads to enhanced antibiotic resistance; however, a clear understanding of this correlation is missing. Pseudomonas aeruginosa is a versatile gamma-proteobacterium that behaves as an opportunistic pathogen to a broad range of hosts. The ability of P. aeruginosa to form biofilms contributes to its virulence and adaptation to different environments. The P. aeruginosa PA14 genome presents several genes encoding proteins involved in metabolism or binding to c-di-GMP, which may indicate a wide regulatory role of this nucleotide in this bacterium. Here, using a proteomic approach, we show that Pseudomonas aeruginosa PA14 regulates the amount of five porins in response to c-di-GMP levels, irrespective of their mRNA levels. One of these porins is OprD, decreased in high c-di-GMP conditions, which is responsible for the uptake of the &#946;-lactam antibiotic imipenem. We also demonstrate that this difference leads strains with high c-di-GMP to be more resistant to imipenem even when growing as planktonic cells, giving them a competitive advantage over cells with low c-di-GMP. Contrastingly, we found that planktonic cells with high c-di-GMP levels are more sensitive to aminoglycosides antibiotics. Together, these findings show that c-di-GMP levels can regulate the antibiotic resistance to different drugs in opposite ways and irrespective of a biofilm mode of growth.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeresaEPG_DISSERT.pdf: 731676 bytes, checksum: f024d9272492149e6edd0a0a8f38a28f (MD5) Previous issue date: 2010-12-22 / It evaluated the quality of carne-de-sol in the period from June to September of 2010 sold in five cities of Rio Grande do Norte - Mossoró, Apodi, Areia Branca, Baraúna and Grossos. It was collect 80 samples of carne-de-sol, of which 44 were from small establishments and 36 purchased in supermarkets and stores. The samples were subjected to microbiological testing - Salmonella, determining the most probable number of fecal coliform, halophilic bacteria and Staphylococcus aureus, the samples were positive for this bacteria were analyzed for resistance to antibiotics, and physical-chemical properties (pH, water activity, minerals and humidity). There was an interaction between intrinsic pH value (&#956; = 5.702) and Aa (&#956; = 0.868), , indicating a favorable environment for their multiplication, resulting in values that stood out significantly in what is expected legislation counting S. aureus (&#956; = 4.81 log UFC at 78.75%), Salmonella (25%) and fecal coliform (&#956; = 2.36 LogNMP / g, 63.75%). A significant correlation (p <0.05) between the number of halophilic bacteria (&#956; = 4.87 log UFC) and S. aureus, such conditions may be used as an indicator of contamination in the sun-dried meat. To the antibiotics, 22.5% of strains were resistant to gentamicin, whereas for penicillin G, chloramphenicol, tetraciclina were 100%, 67.5% and 46.26% respectively. It was found that the meat produced and marketed in the sun studied region is improper (96.25%) for consumption in accordance with Brazilian law / Foram avaliadas a qualidade da carne-de-sol no período de junho a setembro de 2010 comercializada em cinco cidades do Rio Grande do Norte Mossoró, Apodi, Areia Branca, Baraúna e Grossos. Sendo coletadas 80 amostras de carne-de-sol, as quais 44 foram provenientes de estabelecimentos de pequeno porte e 36 adquiridas em supermercados e frigoríficos. As amostras foram submetidas à análises microbiológicas Salmonella, determinação do número mais provável de coliformes termotolerantes, bactérias halofílicas e Staphylococcus aureus, as amostras positivas para esta bactéria foram submetidas à análise de resistência à antibióticos; e físico-químicas (pH, atividade de água, cinzas e umidade). Verificou-se interação dos fatores intrínsecos, pH (µ=5,702) e Aa (µ=0,868), do produto com a contagem bacteriana, indicando ambiente favorável para a sua multiplicação, resultando assim em valores que sobressaíram de maneira significativa o que está previsto na legislação para contagem de S. aureus (µ=4,81LogUFC, em 78,75%), Salmonella (presença em 25%) e coliformes termotolerantes (µ=2,36LogNMP/g, em 63,75%). Houve correlação significativa (p<0,05) entre a contagem de bactérias halofílicas (µ=4,87LogUFC) e a de S. aureus, podendo aquelas serem utilizadas como indicador de contaminação na carne-de-sol. Quanto à sensibilidade das cepas S. aureus aos antibióticos, 22,5% das cepas apresentaram resistência à gentamicina, enquanto para penicilina G, tetraciclina e cloranfenicol foram 100%, 67,5% e 46,26% respectivamente. Ficou constatado que a carne de sol produzida e comercializada na região estudada apresenta-se imprópria (96,25%) para o consumo de acordo com a legislação brasileira